CN110373420A - 一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用 - Google Patents

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徐明文
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于丽珺
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Shanghai Ren Enzyme Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用，该催化剂可以在很温和的条件下将NB‑7转化为手性醇中间体，反应转化率可达90%甚至95%往上，产物的手性纯度值可达90%（针对不同的手性转化会有不一样的催化剂），甚至还可以让纯度达到95%往上，几乎没有副产物，而且反应时间可以控制在24小时以内，有很好的工业应用背景，使得奈必洛尔手性醇中间体的制备简易化，步骤也不复杂，而且能够大大降低环境污染。

Description

一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种酮还原酶涉及用于奈必洛尔手性醇中间体及类似物生产的新型应用，属于生物酶工程和微生物应用领域，具体涉及一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用。
背景技术
盐酸奈必洛尔【nebivolol hydrochloride， 双[2-(6-氟苯并二氢吡喃-2-基)-2-羟基乙基]胺盐酸盐】是由美国强生公司研发，是一种血管扩张活性的选择性β1肾上腺素受体拮抗剂，用于轻至中度高血压病人的治疗，亦可用于心绞痛和充血性心力衰竭的治疗，具有疗效显著、服用方便、不良反应小等特点。2016年全球销售额9.3亿美元，2017年全球销售额11.3亿美元。
盐酸奈必洛尔分子结构式
奈必诺尔具有16种手性对映异构体，研究发现以（S,R,R,R）疗效最佳，因而NB-8(S,S)/NB-8(R,S)/NB-8(R,R)/NB-8(S,R)四种构型手性醇中间体的制备是盐酸奈必洛尔合成的关键步骤。
目前S-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。盐酸奈必洛尔的专利将在2020年到期，原料药价格会一再下探，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。
酶法合成手性醇中间体的研究报道较少。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备手性醇中间体。然而国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种来源于赤红球菌菌属Rhodococcus ruber的酮还原酶Lk Kred基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法，以及该酶作为生物催化剂用于制备奈必洛尔手性中间体及其类似物的方法。
酮还原酶Lk Kred的核苷酸序列如附件所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为附件所示。
一种新酶菌株的制备方法，具体步骤为：
步骤一：在酮还原酶Lk Kred、葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、醇脱氢酶(TbADH)基因编码两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；
步骤二：在表达载体的基因编码两端添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；
步骤三：将步骤一中经过双酶切的Lk Kred与步骤二中双酶切的表达载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒；
步骤四：将步骤三中的阳性质粒转入宿主菌中，得到三种新酶菌株。
作为进一步的改进，其特征在于：所述步骤二中的表达载体为pET 或者pCW 或者pUC 或者pPIC9k。
作为进一步的改进，其特征在于：所述步骤四中的宿主菌为大肠杆菌或者毕赤酵母或者链霉菌。
一种酶催化剂的制备方法，其具体步骤为：
步骤一：将上述的三种菌株分别单独进行培养；
步骤二：在步骤一中的培养液中加入诱导剂，并在20-30℃诱导过夜；
步骤三：步骤三中的诱导液在8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于磷酸钠缓冲液中，用超声破碎；
步骤四：将步骤三中的液体在2-6℃、12000rpm条件下离心15-30min，收集，上层清液即为酶催化剂。
一种制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物的方法，具体步骤如下：
步骤一：将NB-7溶解于含有10%-20%异丙醇的磷酸钠缓冲液中，搅拌溶解；
步骤二：在步骤一中的溶液中加入NADP+、上述酶催化剂，并稀释；
步骤三：将步骤二中的混合液放置于30-40℃恒温水浴锅中，搅拌反应20-40h，即可得到奈必洛尔手性醇中间体。
作为进一步的改进，其特征在于：所述步骤二中，稀释至pH在7-11。
作为进一步的改进，其特征在于：所述步骤三中的水浴锅温度为35-40℃。
生物催化反应方程式如下：
(a)采用异丙醇和新型的功能性酮还原酶突变体（简写为Lk Kred）进行的反应
(b)采用异丙醇结合其他脱氢酶（简写为O Adh）或其他酮还原酶（简写为O Kred）进行的反应
(c)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶（简写为Gdh）进行的反应
反应体系为：酮还原酶Lk Kred，磷酸缓冲液，辅酶NADP，底物，辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖。反应后产物通过乙腈萃取后经高效液相色谱(HPLC)验证，反应转化率可达90%，或95%以上，产物的手性纯度值可达90%，或95%，或98%以上。从而可证明该酶突变体可用于原料NB-7(S)和NB-7(R)的生物不对称还原。并且针对其类似物也可以进行酶催化反应。
可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。
本发明所用的辅酶再生体系为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶体系或异丙醇-醇脱氢酶体系。其中葡萄糖脱氢酶体系采用的酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等的体外重组酶，优选为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)的基因重组酶。异丙醇-醇脱氢酶体系所用的酶主要来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜热菌(Thermoanaerobacter brockii)等的醇脱氢酶，优选为来源于嗜热菌(Thermoanaerobacter brockii)的体外重组醇脱氢酶(TbADH)。
本发明提供的酶催化剂，可以在很温和的条件下将NB-7转化为手性醇中间体，反应转化率可达90%甚至95%往上，产物的手性纯度值可达90%（针对不同的手性转化会有不一样的催化剂），甚至还可以让纯度达到95%往上，几乎没有副产物，而且反应时间可以控制在24小时以内，有很好的工业应用背景，使得奈必洛尔手性醇中间体的制备简易化，步骤也不复杂，而且能够大大降低环境污染。
附图说明
图1为实施例五中产物的高效液相色谱图；
图2为实施例六中产物的高效液相色谱图；
图3为实施例七中产物的高效液相色谱图；
图4为实施例八中产物的高效液相色谱图；
图5为实施例九中产物的高效液相色谱图；
图6为实施例十中产物的高效液相色谱图；
图7为实施例十一中产物的高效液相色谱图；
图8为实施例十二中产物的高效液相色谱图；
图9为实施例十三中产物的高效液相色谱图；
图10为实施例十四中产物的高效液相色谱图；
图11为实施例十五中产物的高效液相色谱图；
图12为实施例十六中产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对保护范围构成限定。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。
实施例一：原核表达体系的构建
酮还原酶Lk Kred基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并重组到pET21a载体上。将阳性重组质粒Lk Kred-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株Lk Kred-pET21a(+)/ BL21(DE3)，作为后续催化反应原代菌株。
用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)和醇脱氢酶(TbADH)基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同Lk Kred-pET21a(+)质粒的构建一样，转入BL21(DE3)中后分别得到BsGDH-pET21a(+)/ BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/ BL21(DE3)表达菌株。
实施例二：酶的发酵制备
上述构建的表达菌株Lk Kred-pET21a(+)/ BL21(DE3)、BsGDH-pET21a(+)/ BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/ BL21(DE3)在加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基【10g/L 胰蛋白胨(OXIOD)，5g/L 酵母粉(OXIOD)，10g/L 氯化钠（国药试剂）】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1%(V/V)比例接种于含有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的500mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在25℃诱导过夜。菌体在8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，10min)，4℃，12000rpm离心20min，取上清备用。
实施例三：酶的催化活性检测
将上述得到的酶液用于底物催化反应。将1g底物溶解于8mL 含有10%异丙醇的50mMpH7.0 磷酸钠缓冲液中，随后加入1.5g葡萄糖，待搅拌溶解后加入2mg NADP+、酶液2ml，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于37℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应过程中用1M氢氧化钠溶液将体系pH值维持在7.0。反应24h后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到96%，产物手性纯度值>98%。
利用醇脱氢酶进行辅酶再生：将1g底物溶解于8mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+、酶液2ml，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于37℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应24h后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到65%，产物手性纯度值>98%。
实施例四：HPLC检测方法建立
底物转化率的检测通过HPLC进行，检测的条件如下：仪器为安捷伦HPLC1100、液相柱为安捷伦Agllent 5 TC-C18(2) 250*4.6mm、流动相Buffer A为含0.1%甲酸水相、流动相Buffer B为含0.1%甲酸乙腈相，梯度程序：0~20min 80%A到10%A，20-25min 10%A到10%A，25min后 10%A到80%A。柱温箱温度30°C、流速1mL/min、检测波长282nm、进样量10uL。检测后将产物的峰面积除以产物和底物的峰面积之和，求得转化率。
产物手性纯度的检测通过超临界流体色谱(SFC) 检测。检测后将S型产物的峰面积除以S型产物和R型产物的峰面积之和，求得手性纯度。
上述检测样品均采用流动相稀释到合适浓度后，用0.22μm的滤膜过滤进仪器检测。
实施例五
将50g底物NB-7(S)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度>98%，色谱图如图1。
实施例六
将100g底物NB-7(S)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度值>98%，色谱图如图2。
实施例七
将150g底物NB-7(S)原料II溶解于800mL 含有20%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行SFC检测，底物转化率>95%,手性纯度值>98%，色谱图如图3。
实施例八
将50g底物NB-7(S)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、R型(ET016)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度>95%，色谱图如图4。
实施例九
将100g底物NB-7(S)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、R型(ET016)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度值>95%，色谱图如图5。
实施例十
将150g底物NB-7(S)溶解于800mL 含有20%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、R型(ET016)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行SFC检测，底物转化率>95%,手性纯度值>95%，色谱图如图6。
实施例十一
将50g底物NB-7(R)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度>98%，色谱图如图7。
实施例十二
将100g底物NB-7(R)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度值>98%，色谱图如图8。
实施例十三
将150g底物NB-7(R)溶解于800mL 含有20%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、S型(ET017)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行SFC检测，底物转化率>95%,手性纯度值>98%，色谱图如图9。
实施例十四
将50g底物NB-7(R)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、R型(ET031)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度>98%，色谱图如图10。
实施例十五
将100g底物NB-7(R)溶解于800mL 含有10%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.2g NADP+、R型(ET031)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，底物转化率>95%, 手性纯度值>98%，色谱图如图11。
实施例十六
将150g底物NB-7(R)原料II溶解于800mL 含有20%异丙醇的50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.1g NADP+、R型(ET031)酶液200ml，并用缓冲液将体积补充到1L。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应30h后进行SFC检测，底物转化率>95%,手性纯度值>98%，色谱图如图12。
序列表
<110> 南京趣酶生物科技有限公司
上海仁酶生物科技有限公司
<120> 一种新酶菌株和酶催化剂的制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> PRT
<213> 人工合成序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Ala Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Cys Gly Ala Thr
20 25 30
Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys
35 40 45
Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly
50 55 60
Cys Gly Ala Thr Thr Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Ala Gly Thr Thr
65 70 75 80
Cys Gly Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly
100 105 110
Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala
145 150 155 160
Cys Cys Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr
165 170 175
Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Gly
180 185 190
Ala Gly Cys Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Cys Thr
195 200 205
Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala
210 215 220
Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Thr Thr Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala
245 250 255
Cys Cys Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys
260 265 270
Gly Gly Gly Thr Ala Thr Thr Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys
275 280 285
Gly Thr Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala
290 295 300
Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly
305 310 315 320
Gly Cys Gly Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys
325 330 335
Gly Thr Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly
340 345 350
Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Cys Gly
355 360 365
Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Gly Thr
370 375 380
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys
385 390 395 400
Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Ala Thr
405 410 415
Thr Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr
420 425 430
Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly
435 440 445
Ala Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys
450 455 460
Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly
465 470 475 480
Gly Gly Thr Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Gly Thr Ala Thr Cys Ala
485 490 495
Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys
500 505 510
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly
515 520 525
Ala Ala Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys
530 535 540
Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Ala
545 550 555 560
Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Gly
580 585 590
Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr Cys Gly Ala
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<213> 人工合成序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
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<213> 人工合成序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
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Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250

Claims (7)

1.一种新酶菌株的制备方法，具体步骤为：
步骤一：在酮还原酶Lk Kred、葡萄糖脱氢酶(BsGDH)、醇脱氢酶(TbADH)基因编码两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；
步骤二：在表达载体的基因编码两端添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点；
步骤三：将步骤一中经过双酶切的Lk Kred与步骤二中双酶切的表达载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒；
步骤四：将步骤三中的阳性质粒转入宿主菌中，得到三种新酶菌株。
2.根据权利要求1所述的一种新酶体外异源表达体系的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的表达载体为pET 或者pCW 或者pUC 或者pPIC9k。
3.根据权利要求1所述的一种新酶体外异源表达体系的制备方法，其特征在于：所述步骤四中的宿主菌为大肠杆菌或者毕赤酵母或者链霉菌。
4.一种酶催化剂的制备方法，其具体步骤为：
步骤一：将权利要求1-3中的三种菌株分别单独进行培养；
步骤二：在步骤一中的培养液中加入诱导剂，并在20-30℃诱导过夜；
步骤三：步骤三中的诱导液在8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于磷酸钠缓冲液中，用超声破碎；
步骤四：将步骤三中的液体在2-6℃、12000rpm条件下离心15-30min，收集，上层清液即为酶催化剂。
5.一种制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物的方法，具体步骤如下：
步骤一：将NB-7溶解于含有10%-20%异丙醇的磷酸钠缓冲液中，搅拌溶解；
步骤二：在步骤一中的溶液中加入NADP+、权利要求4中的酶催化剂，并稀释；
步骤三：将步骤二中的混合液放置于30-40℃恒温水浴锅中，搅拌反应20-40h，即可得到奈必洛尔手性醇中间体。
6.根据权利要求5所述的一种制备奈必洛尔手性醇中间体的方法，其特征在于：所述步骤二中，稀释至pH在7-11。
7.根据权利要求5所述的一种制备奈必洛尔手性醇中间体的方法，其特征在于：所述步骤三中的水浴锅温度为35-40℃。
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