KR101795781B1 - 뿌리혹선충에 대해 살선충 효과를 가지는 혼합 균주 및 이의 용도 - Google Patents

뿌리혹선충에 대해 살선충 효과를 가지는 혼합 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 토양 작물에 기생하는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대해 살선충 효과가 우수한 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주를 분리하였다. 따라서 상기 3종의 균주를 혼합하여 제조한 혼합 균주는 상호 생육 억제능이 없으며, 상기 균주를 단독으로 사용하였을 때보다 뿌리혹선충의 알 부화 및 생육을 억제하는 시너지 효과를 나타냄으로써 작물의 생육을 원활히 할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 3종의 혼합 균주는 미생물 자체, 액상, 입상 또는 분상으로 제조되어 종자, 식물체, 모판, 토양 등에 여러 가지 방법으로 처리될 수 있으며, 화학합성농약을 대체할 수 있는 미생물 제제로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

뿌리혹선충에 대해 살선충 효과를 가지는 혼합 균주 및 이의 용도{Mixed strain having nematicidal effect against root knot nematode and uses thereof}
본 발명은 뿌리혹선충에 대해 살선충 효과를 가지는 혼합 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)은 1850년대 영국의 온실에서 재배중인 오이 뿌리혹에서 처음 발견되었으며, 세계적으로는 78종이 분포하고 있다. 국내에는 모두 6종의 뿌리혹선충이 서식하고 있으며, 작물 재배에 문제가 되는 뿌리혹선충은 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 및 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 3종으로 알려져 있다. 이들 선충은 가지, 감자, 수박, 딸기 등 다양한 작물을 기주로 가지고 있으며, 특히 시설재배단지에 큰 피해가 되고 있다. 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)은 길이 0.1~1mm 정도의 작은 동물로 지구상 모든 곳에 서식하며 토양 1m2 당 약 40만 마리로 토양생태계에 중요한 역할을 한다. 그 중 식물에 기생하는 선충류는 10%이고 나머지 90%는 자유생활선충이다. 또한, 선충 감염으로 인한 작물의 피해규모의 절반을 야기하는 것으로 알려져 있으며 전 세계 약 700여 종의 작물의 뿌리, 줄기, 잎 등에 기생하여 양분의 이동통로를 막고 양분을 탈취해 피해를 준다. 특히 시설원예지에 연작으로 인한 선충 피해가 많은데 20~30%의 수확량 감소를 가져오기도 하며 진균, 세균, 바이러스 등의 2차 감염으로 인하여 많은 피해를 주기도 한다.
뿌리혹선충의 생활사는 여섯 단계로 나뉘며 알에서 부화된 제 2기 유충이 식물의 뿌리의 골무를 뚫고 침입하여, 뿌리 조직의 중심주에 정착하고 식물의 영양분을 흡수함으로써 피해를 준다. 기생 부위의 식물 세포는 세포수가 증가되고, 비대 증상이 일어나 혹모양을 형성한다. 거대세포는 정상세포보다 더 크며, 감수분열 없이 염색체가 증대되는 내재복제(endoreduplication)로 대략 100개의 핵을 갖고 있다. 선충의 생활사는 2령 유충의 뿌리혹선충이 뿌리로 침입하여 세포 사이를 이동하여 유관속주에 이르게 되면 식도와 연결되어 있는 구침을 이용하여 식물의 세포벽을 뚫고 식도분비물을 방출하여 5-7개의 유조직(parenchymatous) 세포들을 이용하여 영양분을 섭취한다. 완전히 분화된 거대세포(giant cells)는 정상세포보다 더 크며, 감수분열없이 염색체가 증대되는 내재복제로 대략 100개의 핵(multinucleate)을 갖고 있다. 선충은 정주하여 3번의 탈피를 한다. 가끔 수컷으로 발달된 후 뿌리 밖으로 나가기도 하지만 이것은 번식에 영향을 미치지 않는다. 배모양의 암컷은 알을 낳으며 뿌리 표면으로 방출된다. 선충 감염에 의한 작물 피해를 줄이거나 방제하기 위해서 윤작, 토양훈증, 토양 과습화, 유기물 사용, 유묘기관리, 조기 파종 및 정식 등이 있으나 이런 방법들은 식물체에 영향을 미치며 완전한 방제는 불가능하여 좋은 방법이라 볼 수 없으며 저항성 품종 또한 드물다. 또한, 알디카브(aldicarb), 페나미포스(fenamiphos) 및 메틸 브로마이드(methyl bromide)를 이용한 화학적 방제를 하는 경우가 있으나, 이는 인체 및 환경오염의 문제점이 있다. 따라서, 선충 구제를 위한 새로운 방법의 일환으로 미생물을 이용한 연구가 활발히 진행 중이다.
한편, 한국공개특허 제2003-0094540호에는 '살선충 활성을 갖는 신규한 균주를 포함하는 미생물살선충제, 그 제조방법 및 처리방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0791983호에는 아쓰로보트리스속 미생물 및 이를 포함하는 식물 기생성선충 방제용 미생물 제제에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 뿌리혹선충에 대해 살선충 효과를 가지는 혼합 균주 및 이의 용도에 대해서는 아직 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토양 작물에 기생하는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대해 살선충 효과가 우수한 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주를 분리하였다. 따라서 본 발명의 상기 3종의 균주를 혼합하여 제조한 혼합 균주는 상호 생육 억제능이 없었으며, 상기 균주를 단독으로 사용하였을 때보다 뿌리혹선충의 알 부화 및 생육을 억제하는 시너지 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) 균주로 이루어진 뿌리혹선충 방제용 혼합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액과 농약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뿌리혹선충 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액과 농약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충의 감염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 토양 작물에 기생하는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대해 살선충 효과가 우수한 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주를 분리하였다. 따라서 상기 3종의 균주를 혼합하여 제조한 혼합 균주는 상호 생육 억제능이 없으며, 상기 균주를 단독으로 사용하였을 때보다 뿌리혹선충의 알 부화 및 생육을 억제하는 시너지 효과를 나타냄으로써 작물의 생육을 원활히 할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 3종의 혼합 균주는 미생물 자체, 액상, 입상 또는 분상으로 제조되어 종자, 식물체, 모판, 토양 등에 여러 가지 방법으로 처리될 수 있으며, 화학합성농약을 대체할 수 있는 미생물 제제로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주의 계통학적 위치를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주의 계통학적 위치를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주의 계통학적 위치를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주(a), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주(b) 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주(c)의 상호 생육 억제능이 없음을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주, 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주 및 이를 혼합하여 제조한 3종의 혼합 균주에 의한 뿌리혹선충의 알 부화 억제효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 본 발명의 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주, 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주 및 이를 혼합하여 제조한 3종의 혼합 균주에 의한 뿌리혹선충의 생육 억제효과를 나타낸 결과이다. control value는 방제가(%)를 나타낸 것이다.
본 발명을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) 균주로 이루어진 뿌리혹선충 방제용 혼합 균주를 제공한다.
본 발명의 뿌리혹선충 방제용 혼합 균주에서, 상기 아스로보트리스 올리고스포라 균주는 기탁번호가 KCTC12879BP인 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주이고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 기탁번호가 KCTC12846BP인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermilitis) KKY-0217 균주이고, 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) 균주는 기탁번호가 KCTC12880BP인 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주인 것이 바람직하다.
상기 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주는 뿌리혹선충이 발병된 토양으로부터 분리하였으며, 뿌리혹선충의 알 부화 및 생육 억제능이 우수한 균주로 선발되었다. 상기 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주는 한국생명공학연구원에 2015년 8월 11일자(KCTC12879BP), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주는 한국생명공학연구원에 2015년 6월 16일자(KCTC12846BP) 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주는 한국생명공학연구원에 2015년 8월 11일자(KCTC12880BP)로 기탁하였다.
본 발명에 따른 상기 혼합 균주에서, 살선충 활성은 일반적으로 식물 병원성을 나타내는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.); 헤테로데라(Heterodera sp.), 글로보데라(Globodera sp.) 등과 같은 시스트선충; 뿌리썩이선충(Pratylenchus.); 감귤선충(Tylenchulus semipenetrans); 감귤뿌리 선충(Radopholus); 줄기구근선(Ditylenchus); 밀알선충(Anguina); 잎선충(Aphelenchoides)에 대한 살선충 활성이며, 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대한 살선충 활성이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 혼합 균주에서, 상기 뿌리혹선충 원인균은 멜로이도기네 하플라(Meloidogyne hapla), 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도기네 아레나리아(Meloidogyne arenaria), 멜로이도기네 자바니카(Meloidogyne javanica) 또는 멜로이도기네 팔락스(Meloidogyne fallax)일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액과 농약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 뿌리혹선충 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 뿌리혹선충 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 뿌리혹선충 방제용 조성물은 관수용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 뿌리혹선충 방제용 조성물은 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 뿌리혹선충 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 뿌리혹선충을 방제하는 방법으로는 상기 뿌리혹선충 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 분무 또는 살포하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 뿌리혹선충을 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상 수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상 수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010cfu/㎖으로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액과 농약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충의 감염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 뿌리혹선충의 감염 예방 또는 치료용 조성물은 특히 연작을 수행하는 시설재배지 등의 토양에 고밀도로 서식하며, 작물의 뿌리에 침입하여 작물의 성장을 둔화시키고 수확을 감소시켜 결국에는 작물을 고사하게 만드는 식물 병원성 토양선충 방제에 이용될 수 있기 때문에, 특히 무엇보다도 무공해, 안전 농산물에 대한 관심이 높아지고 수요가 늘어나고 있으며 농약사용에 의한 잔류독성, 환경오염에 대한 경각심이 높아지고 있는 시점에서 무공해 안전농산물의 생산에 매우 크게 기여할 수 있다.
본 발명의 뿌리혹선충의 감염 예방 또는 치료용 조성물은, 식물이나 재배 토양에 선충이 나타나기 시작하거나 나타나기 전 예방보호 조치로, 선충의 피해를 받는 곡물(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리, 쌀, 사탕수수 및 관련 작물), 사탕무(예컨대, 사탕무 및 사료 사탕무), 오이 식물(예컨대, 오일, 서양호박, 멜론), 야채(예컨대, 시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추 및 브라시카, 당근, 양파, 토마토, 감자), 감귤류 과일(예컨대, 오렌지, 레몬, 자몽, 중국종 귤), 과일(예컨대, 사과, 배, 자두, 복숭아, 알몬드, 체리, 딸기, 라즈베리 및 블랙베리), 콩과 식물(예컨대, 알팔파, 강낭콩, 렌즈콩, 완두콩, 대두), 유성식물(예컨대, 평지씨, 겨자씨, 양귀비, 올리브, 해바라기씨, 코코넛, 카스터 오일식물, 코코아씨, 땅콩), 섬유 식물(예컨대, 면화, 아마, 대마, 황마), 라우라세(예컨대, 아보카도, 계피, 캄퍼), 낙엽성 나무와 침엽수(예컨대, 주목나무, 밤나무, 오리나무, 포플라, 자작나무, 전나무, 낙엽송, 소나무) 또는 식물(예컨대, 옥수수, 잔디식물, 담배, 견과, 커피, 사탕 수수, 차나무, 포도나무, 홉, 바나나 및 천연 고무나무) 등(그러나, 이에 제한되지 않는다)에 또는 이들 식물의 재배토양이나 종자에 전달 또는 살포하여 선충에 의한 피해를 억제하거나 줄일 수 있다. 한편, 식물부위, 토양, 종자 등에 선충감염에 대한 예방 또는 치료가 필요한 경우나 경작전 선충 제거를 통한 토양 정화가 필요한 곳에 본 발명의 살선충 활성을 갖는 미생물 및/또는 기타 항선충 활성을 갖는 혼합 미생물과 화학 살충제를 동시에 투여하여 선충에 의한 피해를 억제시킬 수도 있을 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 뿌리혹선충( Meloidogyne sp.)의 확보 및 동정
뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)의 알 분리는 해당 선충을 60일 동안 증식시킨 토마토 뿌리를 조심스럽게 씻은 후 500㎖의 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액과 1cm로 자른 뿌리 100g을 호모게나이저(Nihonseiki Kaisha LTD.)를 이용하여 2000rpm으로 3분간 균질화시켰다. 그 후 200 메쉬(mesh) 체를 이용하여 뿌리를 제거하고 500 메쉬 체에 모인 알을 광학현미경하에서 알 밀도(㎖당 알 갯수)를 조사하여 하기 실시예에 사용하였다.
식물로부터 뿌리혹선충 암컷 5마리를 마이크로핀셋을 이용하여 분리한 후에 증류수로 3회 세척하였다. 이를 현미경하에서 실험용 바늘을 이용하여 마쇄한 후, DNeasy Blood and tissue kit(QIAGEN-Inc)를 이용하여 뿌리혹선충의 유전자만을 분리하고, 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자 분석을 통해 뿌리혹선충을 동정하였다.
뿌리혹선충 종류별 분석용 프라이머
프라이머
이름		 서열번호 프라이머 염기서열(5'-3') 특이성 및 소스
MI-F 1 GTGAGGATTCAGCTCCCCAG M. incognita-specific SCAR
MI-R 2 ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC
Far 3 TCGGCGATAGAGGTAAATGAC M. arenaria-specific SCAR
Rar 4 TCGGCGATAGACACTACAAACT
Fjav 5 GGTGCGCGATTGAACTGAGC M. javanica-specific
Rjav 6 CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC
JMV1 7 GGATGGCGTGCTTTCAAC M. hapla , M. chitwoodi and
M. fallax specific IGS-SCAR
JMV2 8 TTTCCCCTTATGATGTTTACCC
JMV halpa 9 AAAAATCCCCTCGAAAAATCCACC
2. 선충 포식성 미생물의 확보 및 동정
선충 포식성 미생물은 뿌리혹선충이 발병된 시설재배 단지 지역 중 뿌리혹선충의 기생이 확인된 밭의 작물 뿌리 주변의 흙을 2kg 정도 채집한 후, 100g의 토양을 2mm 채로 거른 후 걸러진 토양 중 1g을 1.5% 아가 배지 중앙부위에 놓고 얇게 펴고 선충 50마리를 아가 배지 위에 첨가한 후 25℃에서 배양하며 실체 현미경하에서 포식성 미생물의 출현을 관찰하였다. 포식 구조를 형성하는 균사체 및 미생물을 선충 포식성 미생물로 간주하고 배지 위에 생성된 포자와 미생물을 따로 분리하여 100ppm의 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 CMA(Corn Meal Agar) 배지에 계대배양하였다.
3. 분리된 선충 포식성 미생물의 상호간의 생육에 대한 조사
상기 분리된 뿌리혹선충에 대한 방제효과를 가지는 3종의 미생물들이 상호간의 생육에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주(a), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주(b) 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주(c)를 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 각각 30℃에서 5일간 배양한 후, 이를 1cm2의 크기로 잘라내어 새로운 PDA 배지에 상기 3종의 균주 조합으로 접종하여 30℃에서 3일간 배양하여 각 균주의 상호간의생육 억제력을 확인하였다.
실시예 1. 뿌리혹선충에 대한 방제효과를 가지는 3종의 미생물의 동정
뿌리혹선충에 방제 효과를 가지는 3종의 미생물을 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 3~5일간 배양한 후, 멸균한 거즈로 PDB 배지에서 자란 균사를 거른 후 균사의 배지 성분을 제거하기 위해 멸균수로 2~3회 세척한 후 균사를 1.5㎖ 튜브에 옮겨 동결 건조하였다. 동결건조된 3종의 미생물의 균사를 마쇄한 후 각각의 유전자만을 뽑아낸 후, 하기 표 2에 개시된 프라이머를 이용하여 특정 유전자를 증폭하여 동정하였다. 각각의 미생물 균주에 해당되는 유전자 염기서열은 NCBI 블라스트를 통해 유사도를 분석하여, 계통학적 위치를 확인하였으며, 3종의 미생물은 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주로 동정되었다(도 1 내지 3).
본 발명에 사용된 프라이머
프라이머 이름 서열정보(5'-3')
정방향 역방향
ITS4 CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A (서열번호 10) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
(서열번호 11)
실시예 2. 본 발명의 3종 균주의 상호간의 생육 확인
도 4에 개시된 바와 같이 본 발명의 3종의 균주인 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주(a), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주(b) 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주(c)는 같은 배지 내에서 성장하면서 상호 억제력을 나타내지 않았으며, 이는 상기 3종의 균주 조합이 배양 및 제제화 공정과정과 토양에 살포 후에도 서로 생육을 억제하지 않음으로써 3종의 균주를 제품화하는데 있어서 문제가 없는 것으로 사료된다.
실시예 3. 본 발명의 혼합 균주의 뿌리혹선충의 알 부화 억제효과 확인
포식성 미생물의 뿌리혹선충의 알에 대한 포식력을 확인하기 위해, 1.5% 워터 아가 배지 가운데에 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 토양에서 분리한 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 500개의 알(Egg)을 올려놓고 25℃에서 배양 후 10일 후 선충의 알을 해부현미경으로 관찰하였다. 이 때 사용된 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주는 각각 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 3일간 배양하였다. 본 실시예에서는 배양된 각각의 미생물 세포 수가 1×108CFU/㎖이 되도록 제조하여 3㎖을 사용하였고, 혼합 균주는 1×108CFU/㎖의 미생물을 각각 1㎖씩 혼합하여 3㎖을 사용하였다. 대조군(control)은 뿌리혹선충 방제용 균주처리 없이 선충의 알만 비교 분석하였다. 그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 배양 10일 후 선충의 알 수는 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주를 혼합하여 처리하였을 때 가장 적게 나타남으로써, 상기 균주를 단독으로 처리하였을 때보다 3종의 균주를 혼합하여 사용하는 것이 뿌리혹선충의 알 부화 억제능이 우수함을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명의 혼합 균주의 뿌리혹선충의 생육 억제효과 확인
뿌리혹선충 방제효과를 가지는 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주 및 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주는 각각 PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에서 3일간 배양하였다. 배양된 각각의 미생물 세포 수가 1×108CFU/㎖이 되도록 제조하였다. 각각의 시험 포트에 배양된 미생물 300㎖을 사용하였고, 혼합 균주는 1×108CFU/㎖의 미생물을 각각 100㎖씩 혼합하여 300㎖을 시험에 사용하였다. 30일 후 뿌리혹 형성을 확인해 본 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 3종의 균주 중에는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) KKY-0217 균주가 가장 좋은 방제율(69.32%)을 나타내었으며, 그 다음으로는 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주(39.06%) 및 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주(25.36%) 순으로 나타내었다. 접종 균주에 따른 방제율에 큰 차이가 있었으며, 3종의 균주를 혼합하여 제조한 혼합균주를 접종한 실험구에서 가장 높은 뿌리혹선충 방제율(82.16%)을 나타내는 것을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12879BP 20150811 한국생명공학연구원 KCTC12846BP 20150616 한국생명공학연구원 KCTC12880BP 20150811
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Mixed strain having nematicidal effect against root knot nematode and uses thereof <130> PN15248 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtgaggattc agctccccag 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgaggaaca tacttctccg tcc 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcggcgatag aggtaaatga c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcggcgatag acactacaaa ct 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtgcgcgat tgaactgagc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caggcccttc agtggaacta tac 23 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatggcgtg ctttcaac 18 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttcccctta tgatgtttac cc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaaaatcccc tcgaaaaatc cacc 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cttggtcatt tagaggaagt aa 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (7)

  1. 기탁번호가 KCTC12879BP인 아스로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora) NT-21 균주, 기탁번호가 KCTC12846BP인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermilitis) KKY-0217 균주 및 기탁번호가 KCTC12880BP인 패실로마이세스 리라시너스(Paecilomyces lilacinus) NE-86 균주로 이루어진 뿌리혹선충 방제용 혼합 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 멜로이도기네 하플라(Meloidogyne hapla), 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도기네 아레나리아(Meloidogyne arenaria), 멜로이도기네 자바니카(Meloidogyne javanica) 또는 멜로이도기네 팔락스(Meloidogyne fallax)인 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 혼합 균주.
  4. 제1항 또는 제3항의 혼합 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액과 농약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 뿌리혹선충 방제용 조성물.
  5. 제4항에 따른 뿌리혹선충 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충을 방제하는 방법.
  6. 제1항 또는 제3항의 혼합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충 방제용 조성물의 제조 방법.
  7. 삭제
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