CN1594546A - 一种添加甲萘醌提高微生物法制备过氧化氢酶产量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种添加甲萘醌提高微生物法制备过氧化氢酶产量的方法，涉及金黄色嗜热子囊菌发酵制备过氧化氢酶。本发明是采用购自日本NBRC(原日本“阪发酵研究所”)的一株金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862作为出发菌株，经液体深层发酵制备的过氧化氢酶。通过在发酵过程中添加甲萘醌或进行H2O2与甲萘醌的混合添加，实现了过氧化氢酶的高表达，发酵终了时培养基中过氧化氢酶水平为1725U/mL。本发明所用甲萘醌价格低廉，用量少，可显著提高过氧化氢酶的产量。
Description
技术领域
一种添加甲萘醌提高微生物法制备过氧化氢酶产量的方法，涉及金黄色嗜热子囊菌发酵制备过氧化氢酶。
背景技术
过氧化氢酶(catalase，简称CAT)作为一种高效生物催化剂，自1950年就开始广泛应用于生物、医药、临床和食品中的某些分析测定。它可与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌。在医药方面，可用于隐形眼镜消毒过程中残留过氧化氢的分解。过氧化氢酶还与H2O2同时使用，用于橡胶成型，塑料及多泡性粘合剂。近年来随着H2O2在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求呈大幅增长趋势。其中在织物染整工艺中，采用过氧化氢酶去除漂白废液中残余H2O2，不仅能避免给后续染色工序带来问题，大幅度提高过氧化氢去除率从而确保染色的良好可再现性，还能使漂染同浴，节省大量的水、电、汽的消耗并显著提高生产效率。
现有纺织用商品过氧化氢酶基本由丹麦诺维信公司垄断，它来源于经基因改性后的黑曲霉。国内用微生物生产过氧化氢酶尚停留在研究阶段，研究用菌种有溶壁微球菌、黑曲霉、嗜热链霉菌，生产水平较低。
用金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862作为出发菌株，经液体深层发酵制备过氧化氢酶，在本申请人申请号200310106371.X的申请中已有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种添加甲萘醌提高微生物法制备耐热耐碱性过氧化氢酶产量的方法。
本发明的技术方案
菌种
金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862，购自日本NBRC(原日本“大阪发酵研究所”)。
培养基
斜面培养基PDA(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂16，pH6.0。
种子培养基(g/L)：酵母膏4，玉米淀粉15，K2HPO4 1，Na2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，pH6.8。
发酵培养基(g/L)：糊精10～30，蛋白胨5～20，K2HPO4 5，KH2PO4·3H2O3，MgSO4·7H2O 2，pH7.0.
培养方法
将成熟的孢子接种到PDA斜面上，45℃下培养6-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用无菌水制成孢子悬液接种于种子培养基中，45℃摇床培养至对数生长后期。吸取种子培养液，按5-12％的接种量接种于发酵培养基中，45℃摇床培养84h。
过氧化氢酶活性测定
发酵液经真空抽滤后的清液直接用于过氧化氢酶活力的分析。
过氧化氢酶活力采用分光光度法在25℃下测定。反应总体积为3mL，含0.1mL酶液和2.9mL含有10mmol/L H2O2的50mmol/L的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)。过氧化氢的分解速率用752型紫外-可见光分光光度计在240nm下测定。酶活定义为：在25℃下，每分钟分解1μmol H2O2所需的酶量为一个酶活单位。
本发明的提高过氧化氢酶产量的培养方式
在发酵初始添加外源的H2O2可以诱导过氧化氢酶的合成，但是在发酵过程中添加的H2O2会立刻被发酵液中的过氧化氢酶所分解，不能进入细胞内部给细胞以有效的刺激，无法促进过氧化氢酶的合成。可以设想如果能添加一些外源物质使细胞产生内源的H2O2，就有可能刺激细胞进行过氧化氢酶的过量合成。甲萘醌(menadione，又称维生素K3)可以进入细胞经单电子还原成半醌自由基，后者可以进入呼吸链与O2作用产生O2 -。胞内的超氧化物歧化酶(superoxidase，简称SOD)是O2 -的专一清除剂，可以将O2 -转变为内源的H2O2。
在发酵过程中添加甲萘醌或进行H2O2与甲萘醌的混合添加，可提高过氧化氢酶的高表达。通过在发酵过程中添加甲萘醌：发酵至36-48h添加1-2μmol/L的甲萘醌，或在发酵过程中进行H2O2与甲萘醌的混合添加：在发酵开始时添加80-90mmol/L的H2O2，再在发酵至48h添加1μmol/L的甲萘醌，实现了过氧化氢酶的高表达，发酵终了时培养基中过氧化氢酶水平为1725U/mL。
本发明的有益效果：本发明选用的金黄色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus IFO9862)合成的过氧化氢酶为胞外酶，并且是迄今为止已报道过的热、碱稳定性最好的过氧化氢酶，用于高温和碱性的织物染整工艺具有很大的潜力。所用的甲萘醌价格低廉，用量少，显著提高了过氧化氢酶的产量，摇瓶培养的实验水平达国内领先水平。
具体实施方式
实施例1
在发酵的48h添加1μmol/L的甲萘醌，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1244U/mL，比不加甲萘醌的对照提高了23.1％。不添加甲萘醌的发酵液中过氧化氢酶的产量为1010U/mL。
实施例2
在发酵的36h和48h各添加1μmol/L的甲萘醌，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量为1386U/mL。
实施例3
在发酵0h添加80mmol/L的H2O2，再在48h添加1μmol/L的甲萘醌，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量达到1612U/mL。
实施例4
在发酵0h添加88mmol/L的H2O2，再在48h添加1μmol/L的甲萘醌，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量达到1725U/mL。
实施例5
在发酵0h添加90mmol/L的H2O2，再在48h添加1μmol/L的甲萘醌，发酵结束时，发酵液中过氧化氢酶的产量达到1702U/mL。
Claims (3)
1.一种提高微生物法制备耐热耐碱性过氧化氢酶产量的方法，采用购自日本NBRC的一株金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862作为出发菌株，经液体深层发酵制备过氧化氢酶，其特征是通过在发酵过程中添加甲萘醌或进行H2O2与甲萘醌的混合添加，实现了过氧化氢酶的高表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在发酵过程中添加甲萘醌：发酵至36-48h添加1-2μmol/L的甲萘醌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是在发酵过程中进行H2O2与甲萘醌的混合添加：在发酵开始时添加80-90mmol/L的H2O2，再在发酵至48h添加1μmol/L的甲萘醌。
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