CN115667487A - 来自酒精饮料制造业副产物的用途 - Google Patents
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Abstract
一种来自酒精饮料制造过程的副产物可以用于培养破囊壶菌。该副产物可以包括来自用于麦芽威士忌制造的蒸馏步骤的残余物，如酒糟。该培养可以用于提供脂质、油或包括ω‑3脂肪酸的脂肪酸的量增加的产品。
Description
技术领域
本发明涉及使用酒精饮料制造业的副产物培养微生物，并通过这种培养生产有用的化合物，包括例如油和脂肪酸。
背景技术
酒精饮料的生产会产生副产物。这些副产物通常被简单地作为废品对待，或者需要以对环境负责且成本有效性的方式处置，或者需要为它们找到用途。
例如，麦芽威士忌的制造会产生几种这样的副产物。主要的威士忌副产物之一是酒糟(pot ale)，这是在罐式蒸馏器中进行的第一次蒸馏后留下的残留物。
酿酒厂生产的酒糟量约为罐式蒸馏器装料量的三分之二。通常每生产一升威士忌，就会产生八升酒糟。因此，会产生非常大量的这种富含营养的副产物液体而需要处置。
威士忌的制造涉及两次蒸馏，第一次蒸馏的产品进行第二次蒸馏。威士忌制造过程中第二次蒸馏后留下的残渣称为废酒渣(spent lees)。废酒渣的量通常是第二次蒸馏的初始装料体积的三分之一。产生的废酒渣的量大大少于酒糟的量，但其仍然是威士忌制造过程中需要处理的重要副产物。
另一个富含营养的副产物的实例是啤酒的制造过程。啤酒的酿造会产生湿的胶状碎片，通常被称为冷却残渣(trub)。就酿造过程而言，冷却残渣是麦汁煮沸并转移用于酿造后留下的物料。冷却残渣还描述了发酵后留在发酵罐底部的沉淀物。这与啤酒制造过程中的洗涤水和其他工业用水一样，提供了通常不能无代价地简单排放到市政污水系统中的富含营养的污水。
酒精饮料制造的副产物本身往往经济价值低。它们目前以多种方式处置或使用。例如，酒糟可以用作反刍动物饲料的基料。酒糟也可以用作田野铺洒，酒厂流出废水同样也能。每种这些处置方法都需要成本。饲料的生产需要大量的能量。例如，酒糟需要显著降低含水量，而这会消耗能源。通常在饲料生产过程中要去除酒糟中90％以上的水分。副产物运送到处理或处置场所所涉及的不可避免的成本也可能相当可观。威士忌酒厂通常位于偏远地区，而这是任何运输或运输成本的一个因素。
由于来自酒精饮料制造的大量副产物以及由于这些副产物中存在大量有机材料，因此寻求经济和环境成本降低的替代处置途径。
酒糟的一种最近用途是作为生产丁醇和/或丙酮的发酵过程的营养源(WO 2012/001416)。
发明内容
本发明解决了寻找用于酒精饮料制造的副产物的替代且有用的处置途径的问题。
在本发明的第一方面中，提供了组合物用于培养破囊壶菌(thraustochytrid)的用途，其中所述组合物包含来自酒精饮料制造过程的副产物。
我们发现，与其他微生物相比，破囊壶菌在处理酒精饮料副产物方面特别有效。
破囊壶菌是异养微生物，这意味着它们需要复杂有机化合物中所含的外部能量供应以维持其存在。破囊壶菌可以作为有机物质的清除者和分解者，从中获得生存所需的复杂有机化合物。在其自然栖息之所中，破囊壶菌通常生活于海洋(盐水)环境中。
通过以酒精饮料副产物为食，破囊壶菌会积累大量有用的物质，包括脂质、油、脂肪酸，例如ω-3脂肪酸，包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)和抗氧化剂。这些是或可以引入用于人类、动物或鱼类的食品、补充剂或营养物中。
本发明特别有用的一个领域是水产养殖领域。养鱼业使用大量的ω-3食品。与从远洋鱼类或其他不可持续来源获取鱼粉和鱼油的一些常规方法相比，本发明提供了一种安全且可持续的食品。
对本发明提供的用于人类消费的ω-3产品和其他有益营养物的需求也日益增长。
本发明不仅将酿酒厂和啤酒厂的废弃副产物转化为有用的材料，而且还清理了所述废弃副产物，而使它们可以安全地排放回环境中。
在本发明中产生的物料可以从破囊壶菌培养物中提取或纯化，或另外可以将包含破囊壶菌本身的组合物以及所产生的物质直接用于某些应用。破囊壶菌和所耗尽的培养基以及副产物残留物可以进行离心和脱水(例如，在烘箱中干燥或喷雾干燥)。
当根据“检测水和废水的标准方法”中的标准化测试方法5210B(Clesceri etal.，2005，2005,Washington DC:American Public Health Association,American WaterWorks Association,and the Water Environment Association；www.standardmethods.org)测量时，用于培养破囊壶菌的组合物可以具有1-50g/L，可选地1-40g/L，可选地5-30g/L，可选地10-20g/L范围内的BOD5。
根据上述测试方法的BOD5值是量化用于培养破囊壶菌的物料的生化需氧量的一种方法。它提供了存在的可生物降解有机物质的量的指示：它是好氧生物有机体在特定时间段内在特定温度下分解给定含水样品中存在的有机物质所需的溶解氧量。未受污染的河流的BOD通常低于1毫克/升。中度污染的河流为2-8毫克/升。未经处理的生活污水平均为200-600毫克/升，而有效处理过的市政污水为20毫克/升或更低。
因此可以看出，本发明可以出乎意料地处理具有非常高的生化需氧量而否则通常需要一些其他处理或处置的废弃副产物。
定义用于培养破囊壶菌的组合物的另一种方法是根据其化学需氧量(COD)。这是在使用强氧化剂氧化存在的物质时消耗的氧气量的量度。给定样品的COD值可能高于BOD值，因为前者取决于总有机物含量，而后者取决于在某些生物条件下可消耗的有机物含量。测定COD的标准测试方法是ASTM D1252-06(012)e1，测试方法B，水的化学需氧量(重铬酸盐需氧量)的标准测试方法，ASTM International，West Conshohocken，PA，2012，www.astm.org)。根据本发明的用于培养破囊壶菌的组合物可以具有根据该测试方法处于1-100g/L，可选地1-50g/L，可选地1-40g/L，可选地5至30g/L，可选地10-20g/L，可选地2-100g/L，可选地2-80g/L，可选地10-60g/L，可选地20-40g/L范围内的COD。
本发明可以出乎意料地处理具有非常高的化学需氧量而否则通常需要一些其他处理或处置的废弃副产物。
本发明中用于培养破囊壶菌的组合物可以是或可以包含酿酒副产物。这可以可选地选自糟粕、酒糟、酒糟糖浆、废酒渣、大麦暗酒糟(barley dark grain)、酒糟水(spentwash)、酒糟水糖浆、废水或小麦或玉米暗酒糟中的一种或多种。
蒸馏副产物可以来自麦芽蒸馏过程或谷物蒸馏过程。
酿酒厂副产物可以是威士忌副产物，例如，麦芽威士忌副产物，例如苏格兰威士忌副产物。威士忌副产物可以是酒糟。
本发明还可以利用来自其他来源的酒糟，即来自酒精生产过程的酒糟，而不仅仅是在威士忌生产过程中产生的酒糟。
通过包括可选地在铜蒸馏容器中蒸馏洗涤物的方法，可以提供酒糟，而生产低度酒馏出物(其是通过进一步蒸馏和其他步骤进一步加工以生产酒精饮料的材料)和所述酒糟。包含酒精和水以及其他物质的所述酒糟水可以通过之前的发酵步骤提供，该发酵步骤包括使用酵母发酵麦芽汁。所述麦芽汁包含一种或多种碳水化合物，例如，葡萄糖和/或其他糖。麦芽汁可以通过已知的方法，例如，通过威士忌制造领域中众所周知的麦芽化和糖化而获得。
本发明中用于培养破囊壶菌的组合物可以是，或可以包含酿酒副产物。酿酒副产物可以是酿酒废水。酿酒副产物可以是冷却残渣。冷却残渣是麦汁中不可发酵的产物形成的沉淀物。酿酒副产物可以是酿造废水。
在蒸馏期间，已经通过发酵过程生产酒精的液体被加热，由此将乙醇与水等稀释组分分离。其他挥发性组分，通常是有机物，也在蒸馏过程中从发酵液中提取出来。作为酒精饮料制造一部分的任何蒸馏都会留下残余的液体和/或固体副产物。这种残留的副产物含有有机物质，其中可能包括酵母或发酵产生的酵母残留物，并且可以充当破囊壶菌的营养源。
用于培养破囊壶菌的组合物的固含量可以可选地为至多30％w/w，可选地至多20％w/w，可选地至多15％w/w，可选地至多10％w/w，可选地至多5％w/w，可选地高达3％w/w，可选地高达1％w/w。用于培养破囊壶菌的组合物的固含量可以可选地为至少0.1％w/w，可选地至少0.5％w/w，可选地至少1％w/w，可选地至少3％w/w。例如，该范围可以为1％-15％。本发明的一个优点来自于破囊壶菌处理酒糟或其他可能具有一些固体含量的酒精工业副产物的能力。然而，本发明不要求存在固体，并且不具有或具有最少固体含量的废弃副产物，包括通过诸如过滤或其他除固体的步骤的那些废弃副产物，也会被破囊壶菌有效处理。
用于培养破囊壶菌的组合物可以包含酵母或酵母残渣。可选地，存在的酵母或酵母残渣的量为0.1wt％-20wt％，例如，1wt％-15wt％。
用于培养破囊壶菌的组合物可以包含碳水化合物。可选地，该碳水化合物含量为5-100g/L，例如，10-70g/L，例如，20-50g/L，例如，5-40g/L，例如，50-100g/L。
用于培养破囊壶菌的组合物可以包含硝酸盐。可选地，该硝酸盐含量处于500-1,500mg/L，或750-1,000mg/L，或500-750mg/L，或1,000-1,500mg/L的范围内。
用于培养破囊壶菌的组合物可以包含磷酸盐。可选地，该磷酸盐含量处于100-250mg/L，或150-200mg/L，或100-150mg/L，或200-250mg/L的范围内。
用于培养破囊壶菌的组合物可以包含蛋白质。可选地，该蛋白质含量为1-100g/L，或5-75g/L，或8-50g/L。
该组合物可以包含盐，例如，0.1M-0.8M范围内的氯化钠。
该组合物可以包含盐，例如，0.13M-0.6M范围内的人造海盐。人造海盐可以包含氯化钠作为主要组分，例如，超过60mol％，或60-90mol％，或65-70mol％，或约66mol％的量的氯化钠。人造海盐具有以下组成：
该组合物可以包含盐，例如，5-50g/L，或10-40g/L，或15-30g/L，或5-20g/L，或25-50g/L，或8.5-43g/L，或8.75-42.5g/L范围内的盐。
用于培养破囊壶菌的组合物可以具有5-9，可选地6-8，可选地6.5-7.8，可选地6.8-7.5的pH。
副产物(例如，酒糟)可以例如用水稀释，例如用自来水稀释，从而提供用于培养破囊壶菌的组合物。这种稀释可以导致该组合物达到本文概述的特征，例如BOD值、COD值、固体含量或其他特性。酒糟可以可选地稀释2-5倍。可选地，酒糟可以经过稀释而使其占用于培养破囊壶菌的组合物体积的15％-60％，可选地20％-50％，可选地25％-37.5％，可选地25％-35％。
我们曾认为有必要将酒糟稀释到显著更大的程度。本发明的方法处理具有显著COD和BOD值的相对高度浓缩的组合物的能力是出乎意料的。
我们还曾认为，酒糟需要某种形式的纯化，如离心或过滤以去除固体和潜在的微生物抑制剂。出乎意料的是，本发明的方法足够稳健以处理整个副产物。因此，本发明提供了用于培养破囊壶菌的组合物的用途，其中该组合物包含来自酒精饮料制造过程的副产物而无需纯化。
酒糟也可以适当地使用洗涤水或来自酿酒厂的其他水稀释。这在影响组合物的pH值方面会带来进一步的优势，而由此减少对要使用的其他组分的需要。来自酿酒厂的洗涤水可能是碱性的，而碱性洗涤水可能有助于纠正酒糟的酸性。废酒渣也可以用于为酒糟提供所需的稀释度。废酒渣是威士忌生产过程的第二次蒸馏的残留物，与酒糟相比，其营养成分较低。在根据本发明的生长之后与破囊壶菌分离的水也可以用于稀释酒糟。
本发明中使用的副产物，例如酒糟，可能含有大量的铜。这可能是由于容器，例如罐式蒸馏器是由铜制成，或由于存在铜设备所致。铜的含量使得基于酒糟的饲料不能用于对饮食中过量铜敏感的绵羊。就本发明而言，可能曾经认为酒糟中的铜含量会抑制微生物生长的效率。然而，发明人已经发现，破囊壶菌在本发明的浓度水平下出乎意料地并不受此影响。
可以添加其他物质到副产物中而产生用于培养破囊壶菌的组合物。
尽管副产物例如酒糟可能营养丰富，但它可能缺乏足够的碳水化合物含量以实现异养破囊壶菌的最佳生长。因此，生长培养基可以包含额外量的碳水化合物。
用于另外添加的合适碳水化合物可以包括单糖，如葡萄糖、果糖或半乳糖，或这些的寡糖。其他合适的碳水化合物可以包括二糖，如乳糖、麦芽糖或蔗糖。其他复杂的碳或碳水化合物源如甘油也可能适合包含于生长培养基中。其他可能的组分是来自生物柴油生产的化合物(例如，粗甘油)、乙酸钠、果糖和马铃薯淀粉。其他可能的组分是纤维素生物质、羧酸及其盐、脂肪酸、氨基酸、醇、酯和其他衍生物。这些化学品可以提供破囊壶菌生长所需的碳源。
培养破囊壶菌的过程可以包括：
(i)第一阶段，其中由少量破囊壶菌或破囊壶菌接种物增殖破囊壶菌；和
(ii)第二阶段，其中营养供应不同于第一阶段，使得破囊壶菌的应激反应增强一种或多种ω-3油或其他有用产品的积累。
我们已经发现，虽然本发明允许积累ω-3油和其他有用物质而不需要这样的两阶段过程，但使用这样的两阶段过程可以带来更多的优点并且可以增加有用产品的量及其生产效率。
可选地，第一阶段本身可以认为包括两个阶段：孢子形成阶段和增殖阶段。在孢子形成阶段，可以选择条件，例如营养供应，以增强、促进或优化孢子生产。在增殖阶段，可以选择条件，例如营养供应，以增强、促进或优化破囊壶菌的增殖。
第一阶段可以使用包含酒精饮料加工副产物的组合物(例如，包含酒糟的组合物)和可选的其他物质，如其他碳水化合物(例如，葡萄糖)和溶解的氧和盐。
第一阶段内的孢子形成阶段可以使用包含定义的培养基的组合物，该培养基包含碳水化合物源(例如，葡萄糖)、盐和无机硝酸盐源而促进孢子形成。
第一阶段内的增殖阶段可以使用包含酒精饮料加工副产物的组合物(例如，包含酒糟的组合物)和可选地的其他物质，如有利于细胞生长的其他碳水化合物(例如，葡萄糖)和溶解氧和盐。
第二阶段与第一阶段的区别在于至少一些来自酒精饮料加工副产物(例如，包含酒糟的组合物)的营养物被耗尽，并且可选地其中在第二阶段开始时进一步加入一定量的碳水化合物(例如，葡萄糖)。破囊壶菌在营养物耗尽条件下可以利用该进一步的一定量的碳水化合物而生产脂肪酸，例如ω-3油。
在第一阶段中加入的碳水化合物(例如，葡萄糖)的量可以可选地为5-60g/L，可选地5-50g/L，可选地10-40g/L，可选地10-30g/L，可选地15-25g/L。在第二阶段中添加的碳水化合物(例如，葡萄糖)的量可以可选地相同。当使用一系列酒精性副产物，例如，酒糟(例如，稀释至20vol％-55vol％，例如，30vol％-45vol％，例如，35vol％-40vol％的酒糟)时，这些量是适用的。
根据本发明，最初可以给予破囊壶菌属微生物时间，通常在几天的时间段(例如，1-5天，例如，2-4天，例如，3-4天，例如，78-90小时)在选择的温度下(例如，室温或环境温度或略高于该温度，例如，20-40℃，例如，25-35℃，例如，约30℃)生长以优化生长。添加的无机硝酸盐的量可以可选地为1-10g/L。这可以最大化孢子生产，而容许在发酵期间获得更高的细胞密度。
在该初始生长期之后，细胞可以转移到由酒精饮料加工副产物(例如，包含酒糟的组合物)组成的培养基中生长。几天后(这可以可选地为3-7天)，可以添另外量的其他碳水化合物。这可以帮助微生物最大限度地消耗由酒糟或其他副产物提供的营养物质。在这个阶段添加的碳源的量取决于已形成的破囊壶菌的数量或密度。还又有可能在初始生长期之后的这个时候降低操作温度，例如降低至约5-20℃，例如10-15℃。
在开始培养几天(这可以可选地为3-4天)之后引入的对生长条件的改变旨在诱导微生物中的应激反应，从而导致破囊壶菌的脂肪酸产量增加。营养物的消耗可能有助于引起这种应激反应。温度降低也可能有助于促进应激反应。
生长条件可以包括：温度、生长培养基的盐度、生长培养基的pH、生长培养基中存在的其他碳水化合物的量。在培养破囊壶菌时，可以对生长条件进行以下一项或多项调整：
·可以升高或降低温度；
·可以调节生长培养基盐度(例如，增加)；
·可以调节生长培养基的pH值；
·可以在生长培养基中添加其他碳水化合物。
在生长期间可以向培养容器供应空气，通常是无菌的。空气可以通过喷雾器供应。该空气可以被过滤。
可选地，来自酒精饮料制造过程的副产物可以进行酶预处理步骤。不希望受到理论的束缚，在高密度(即添加碳源)培养期间，部分酿酒副产物的有机物质可能生物利用度较低且未充分利用。这部分可以包括完整的酵母细胞和谷物蛋白，以及未能水解成酵母可发酵形式的碳水化合物。副产物的酶预处理可以将这些化合物转化为更简单和更容易吸收的物质。使用的酶可以包括以下市售的酶：淀粉葡糖苷酶、脯氨酰内肽酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和裂解酶。
已发现，本申请中公开的生长破囊壶菌的方法在某些情况下会导致酒糟或其他副产物的初始BOD值或COD值降低约50％-95％，例如，约75％-95％，例如，约90％。
培养完成后，可以将培养的破囊壶菌微生物从所述生长培养基溶液中分离出来。这种分离可以通过例如离心、沉降、化学絮凝、生物絮凝、浮选或膜过滤而实现。该生长过程的产品的脱水可以使其体积减少5％-20％，例如，8％-10％，而产生富含ω-3的藻泥(algalpaste)。最终产品可以含有破囊壶菌和分离出的酒糟固体。该产品可以为藻泥的形式。
由该分离步骤产生的水溶液可以重复使用而稀释新鲜量的酒糟或其他副产物以生产新鲜的生长培养基。在随后的破囊壶菌培养中使用这种分离的水可以有助于促进生长速度。
对藻泥可以进行进一步加工而产生油或粉末。油或粉末也富含ω-3，并可以用作水产养殖饲料。
在本发明的进一步的方面中，提供了一种聚集由如本文所述培养的破囊壶菌产生的脂质的方法。
在本发明的进一步的方面中，提供了一种从如本文所述培养的破囊壶菌中聚集脂肪酸，例如，ω-3油的方法。
在本发明的进一步的方面中，提供了一种从如本文所述培养的破囊壶菌生产用于水产养殖的饲料的方法。
在本发明的进一步的方面中，提供了一种在包含含有来自酒精饮料制造过程的副产物的组合物的容器中培养破囊壶菌的方法，如上文关于第一方面定义的。
本发明的优点是，即使该方法可以用于生产适合鱼类、动物和鱼类食用的食品，该容器也不需要是额定压力的，也不需要是医药级的容器。标准酿造容器(例如，不锈钢酿造容器)都可以使用。这带来了可观的成本节约。这也是方便的。该过程可以可选地在生产酒精性加工副产物的酿酒厂或啤酒厂或其附近进行，并且其已经易于检修并供应酿造容器。该容器可以是改进的酿造发酵罐。在使用中，容器可以曝气。
该方法可以包括对容器进行消毒的前序步骤。此外，可以对连接到容器的端口和管线，而特别是用于将各组分装入容器或从容器释放出来的端口和管线进行消毒。该消毒可以包括一个或多个用清水冲洗的步骤。该灭菌可以包括一个或多个可选地在升高的温度(例如，高于40℃，例如，高于50℃，例如，约50-70℃，例如，约60℃)下用碱(例如，氢氧化钠溶液)清洗的步骤。该灭菌可以包括一个或多个施加抗微生物剂，例如过氧化物如过乙酸，并使其干燥并涂覆内表面的步骤。该灭菌可以包括多于一个或所有这些步骤。例如消毒可以包括用碱清洗、用水冲洗和施用抗微生物剂。可选地，在用碱清洗的步骤之前可以有一个冲洗或清洗(例如，用清水冲洗)的步骤。在消毒期间，可以通过例如通过容器底部的喷雾器向该容器中注入惰性气体，例如无菌空气使容器保持于正压下。
这种消毒工序可以在培养设备处于组装状态时进行。这种就地清洗(CIP)方法确保了高卫生标准，而我们发现这在培养破囊壶菌时是有利的。该消毒可以使它确保可以使用酒精饮料加工副产物例如酒糟培养破囊壶菌的环境。
本发明的消毒工序的另一个优点是它不需要进行蒸汽消毒，而蒸汽消毒可能需要更昂贵的压力相关容器。
接种微生物可以取自破囊壶菌的单一培养物。在这个阶段从培养皿中进行继代培养和液体培养生长都是可能的。每种方法都有其优点：从培养皿中进行继代培养会最小化污染风险；液体培养生长通常更快。在任何情况下，在使用前都可能要测试接种物纯度。
根据本发明，容器装入破囊壶菌和包含来自酒精饮料制造过程的副产物并将用于实现破囊壶菌培养的组合物。所述组合物可以在进入容器之前进行巴氏消毒。出乎意料的是，尽管副产物可能已经经过大量热处理(例如，作为威士忌制备过程的一部分，酒糟可能已经煮沸约3小时)，但我们发现巴氏消毒可以带来额外的优点，并可以提高效率和可靠性。不希望受到理论的束缚，这可能是因为当从蒸馏或酿造设备中去除酒糟或其他副产物时，例如，如果这种产孢生物存在于端口或管线上时(例如，从产孢子生物)引入了污染物。
巴氏消毒可以包括将该组合物加热到足以消除病原体和酵母以外的其他生物的温度和时间。
巴氏消毒可以包括将该组合物加热至例如70-125℃或更高的温度，例如，70-110℃，可选地80-100℃，可选地80-90℃，可选地90-100℃，可选地85-95℃。该组合物可以加热至该温度并持续一段时间，该时间段可选地为10秒-120秒或更长，可选地10秒-90秒，可选地20秒-60秒，可选地20秒-40秒，可选地25-35秒。可选地，该热处理可以是阶梯式热处理，由此该组合物在前序步骤中和/或在随后的步骤中在较低温度下进行加热。
该巴氏消毒可以是在线巴氏消毒。该巴氏消毒可以通过热交换方法进行，由此通过凭借热水或热油回路的热板或热交换器将热量传递于组合物。
附图说明
以下实施例总结了一些实施的实验和本发明一些实施方式的特征，并且应当理解的是，本发明的范围不限于这些细节。参考附图，其中：
图1显示了使用各种碳源的破囊壶菌菌株的生长；
图2-4显示了非破囊壶菌菌株的生长；
图5-8显示了在分别包含12.5％、25％、37.5％和50％(按体积计)酒糟的接种破囊壶菌裂殖壶菌属(Aurantiochytrium sp)的样品的生长培养基中溶解氧含量和pH值随时间的变化；
图9和10显示了在含有25％(按体积计)酒糟的接种破囊壶菌裂殖壶菌属(Aurantiochytrium sp)的样品并添加了额外葡萄糖的生长培养基中溶解氧含量和pH随时间的变化；和
图11显示了破囊壶菌裂殖壶菌(Aurantiochytrium)在包含酒糟和葡萄糖并在接种后进一步添加葡萄糖的培养基中培养期间的细胞计数和干细胞重量的变化。
具体实施方式
实施例1—利用原料研究各种微生物生长的实验，表明破囊壶菌的性能优越
在含有盐、硝酸盐、酵母提取物和碳源(葡萄糖、甘油、蛋白胨或乙酸盐)的基础培养基(也称为基础淡水或淡水基础培养基)中培养各种微生物。从高通量实验获得的生长数据总结于图1-4的图表中。与葡萄糖、甘油、蛋白胨或乙酸盐相关的百分比值是指相对于40g/L标准溶液的浓度；因此，例如200％葡萄糖表示每升80克葡萄糖。图1-4中的垂直轴表示生长速率，通过光学测量评价并通过NADH生产进行近似。图1显示了使用破囊壶菌菌株(裂殖壶菌)的结果。这些菌株来自日本生物资源中心(Japanese Biological ResourceCentre)NBRC(www.nite.go.jp/en/nbrc/index.html)。它们包括裂殖壶菌(NBRCno.102614)和裂壶藻(Schizochytrium)(NBRC no.102617)。对照图2-4分别显示了以下非破囊壶菌藻类菌株的结果：衣藻(Chlamydomonas sp)、球形梭菌(N.coccoides)和小球藻(C.protethecoides)。
破囊壶菌菌株本身独特之处在于在接种后约24小时内达到最大生长速率(图1)，相比之下其他菌株则需要60-80小时(图2-4)。在大规模分批补料发酵中，这可以有效地将批次的总运行时间减少两天。破囊壶菌也能有效地在一系列废弃有机物材料和其他材料(包括果糖和马铃薯淀粉)上生长。与其他菌株相比，破囊壶菌菌株具有优异的生长速率，并且可以利用更广泛的碳源和废物物流。
进一步的实验集中于使用食品和饮料行业的副产物培养微生物，并据发现，破囊壶菌在使用发酵和相关过程的产品(包括酒糟)时表现特别好。
实施例2–使用酒糟的破囊壶菌裂殖壶菌属生长
通过观察容器中溶解氧(DO)含量的变化来监测微生物的生长。图5显示了在包含12.5％(按体积)酒糟的接种破囊壶菌裂殖壶菌属样品的生长培养基中溶解氧含量的进展(100％表示饱和)。当破囊壶菌以酒糟提供的营养为食时，其会生长而消耗氧气。这反映于溶解氧的下降。一旦所有的营养物质都被消耗掉，破囊壶菌就不再可以消耗氧气。随着溶解于培养基中的氧气与大气中的氧气平衡，DO值会上升。
pH值的变化被认为是由于发酵过程中发生的不同代谢反应所致。最初的pH值降低被认为是由于有机酸的产生。随着发酵的进行，在酒糟中使用复杂的氮源可能会增加氨的浓度，这反过来可能会稳定或升高pH值。
图6-8与图5的不同之处在于它们分别涉及使用25vol％、37.5vol％和50vol％的酒糟初始浓度。
在所有情况下，可以看出，酒糟是破囊壶菌的有效有机物原料。然而，20vol％-55vol％的范围特别有效，因为这会导致持续增长。
添加进一步的营养物质，例如葡萄糖会带来进一步的增强。图9显示了使用最初含有10g/L葡萄糖的25％酒糟生长培养基的裂殖壶菌属生长。可以看出，破囊壶菌在接种的前24小时内利用了碳源，如溶解氧读数的下降所示。相比之下，图10显示了使用25％酒糟生长培养基，最初存在20g/L葡萄糖，3天后进一步添加20g/L葡萄糖的裂殖壶菌属的生长：可以看出，由于碳源量更多，生长在最高水平持续长达144小时。
进一步的实验研究了在接种后添加更多葡萄糖的影响。使用裂殖壶菌属采用定义的培养基和浓度为25％的酒糟培养基进行了两个实验。第一个实验的葡萄糖浓度设定为20g/L，而第二个实验的菌株最初接种于含有20g/L葡萄糖的培养基中并在接种后3天注射另外的20g/L葡萄糖。前者每100mL的质量变化为2.52g，后者为4.48g。因此，在接种后另外添加20g/L葡萄糖的情况下，生产率为44.8g/L。下表和图11进一步示出了这一点。
使用血细胞计数器按照标准方案进行细胞计数测量：
1.在盖玻片和计数室之间加入10μL已适当稀释的发酵培养基样品。
2.按照标准计数模式，对细胞进行计数。
3.根据使用的血细胞计数器的类型，使用标准公式计算细胞密度(这考虑了平均细胞、稀释系数和腔室体积，这取决于血细胞计数器的类型)。
细胞密度＝平均细胞×稀释倍数/平方体积
细胞干重表示发酵的生产力。它是在发酵过程中测量的，并且是用于细胞定量的其他方法。以下方法用于测量干重：
1.称量容器并记录其质量。
2.将规定量的样品放入容器中称重并记录其质量。
3.将样品干燥至重复干燥/称重之后其质量没有变化。
4.连同干燥样品称重容器并记录其质量。
计算如下：
1.从10mL样品连同容器中减去容器重量＝湿重
2.从干燥样品连同容器中减去容器重量＝干重
3.干重/湿重×100＝干重(％)
所有干重计算一式两份或一式三份进行，并取平均值以允许误差。
细胞计数和干重不是线性相关的。干重还包括酒糟固体的质量，而细胞计数仅代表样品中存在的细胞。随着发酵的进行，酒糟固体被耗尽，而同时细胞数量增加，但与酒糟固体相比，其对总干重的贡献仍然不同。因此，一个值落后于另一个。
已经确定破囊壶菌与其他测试的菌株相比表现出出乎意料大地生长速率，对破囊壶菌进行进一步测试以优化生长条件。具体而言，检测了破囊壶菌的盐度要求。破囊壶菌是海洋菌株，自然生活在盐环境中。然而，高盐浓度可能是不利的，因为这会促进金属部件例如容器腐蚀。在一系列实验中，确定了破囊壶菌可以在25％-50％的标准海水浓度下生长，而不会显著降低生长速率。然而，如果需要，可以使用更高的盐浓度。破囊壶菌的生长通过使用溶解氧传感器进行监测。
实施例3-示例性实施方式的详细描述
使用来自酿酒厂的不锈钢酿造容器作为培养破囊壶菌的容器。首先通过位于容器顶部的喷球或类似入口装置用清水冲洗酿造容器。然后用2％氢氧化钠在60℃温度下清洗容器10分钟，然后再次用清水冲洗。然后用0.1％的过乙酸涂覆容器内部，使其在表面上干燥。在整个清洁和消毒过程中，无菌空气通过容器底部的喷雾器注入容器中，使容器保持于正压下。对连接到容器的每个端口和管线进行清洁和消毒处理。这包括与生长培养基接触的在线巴氏消毒设备。
为了制备破囊壶菌的生长培养基，将来自苏格兰威士忌酒厂的酒糟稀释至含有25％-37.5％的酒糟。化学需氧量为13.75g/L-20.63g/L。通过添加氢氧化钠将pH值调节至6.8-7.5。然后将以下物质添加到经过pH调节的稀释酒糟溶液中：
20g/L葡萄糖；
10.4g/L人造海盐(例如，包含66％的氯化钠、16％的硫酸镁、13％的氯化镁，以及更少量的氯化钙和氯化钾)。
根据密度，在第3天或第4天额外添加20g/L-40g/L的葡萄糖。
将以上述方式制备的生长培养基通过板式换热器形式的快速巴氏消毒器进料到容器中。板式热交换器用于将生长培养基加热至70-125℃的温度。生长培养基在这个升高的温度下保持10秒-120秒。然后将介质冷却至30℃。这分两个阶段完成。在第一阶段内，来自培养基的热量在另一个热交换器中回收并转移到进入巴氏消毒器的进入培养基中，将该进入培养基进行预热。然后，另一个热交换器将巴氏消毒培养基的温度进一步降低到30℃的初始生长温度。然后将巴氏消毒的生长培养基通入到培养容器中。
破囊壶菌的接种物通过在平板培养物上培养显微镜证实的微生物单培养物4或5天而制备。精确的时间取决于生长条件，并且本领域技术人员在正确判断这一点上没有困难。接着将该初始接种物转移到具有三通软管盖的合适灭菌硼硅酸盐玻璃容器中。玻璃容器包括一段连接用于将接种物无菌转移到培养容器中的蠕动软管部分。玻璃注射器连接到一个连接到玻璃容器上的止回阀，允许在接种物进入培养容器之前对其进行无菌取样。
培养容器中存在破囊壶菌接种物和巴氏消毒培养基(高营养培养基，由37.5％的酒糟、20g/L的葡萄糖和10.4g/L的人造海盐和高水平的溶解氧组成)的混合物。在30℃左右的生长温度下保持3-4天，在此期间破囊壶菌迅速增殖。这会导致达到最大细胞数量和营养耗尽。在下一阶段，细胞进入生长的积累阶段：在这个阶段，将另外20g/L的葡萄糖加入容器中，容器温度降至10-15℃。这种条件变化被认为会在破囊壶菌中引起应激反应，从而促进ω-3油的生产。然后将破囊壶菌再培养2天。
在适当的阶段进行质量控制，以确定发酵剂培养物的纯度、在线巴氏消毒功效、空气过滤器功能和容器灭菌质量。
在生长过程结束时，使用常规脱水技术对所得破囊壶菌进行脱水。脱水进行至原始体积的约10％。这会产生富含ω-3的藻泥。这种糊状物可以进一步加工而产生油或粉末。
实施例4–酒厂副产物的酶促预处理
在一些实验中发现，对酒糟副产物进行酶促预处理可以使葡萄糖浓度提高480％。平均而言，在用酶预处理进行的几次发酵过程期间，发现破囊壶菌的葡萄糖利用率提高了20％，产率提高了至少25％。
为了实现酶的最大转化效率，在添加酶之前，将酒糟培养基的pH值调节至pH 6-7，而酶添加的浓度范围为0.01％-0.05％v/v。
藻(破囊壶菌)在层流柜内以2％v/v由现有原液培养物进行无菌接种。在酶处理实验之前，将藻瓶培养物在30℃下振荡(95rpm)培养至少2天。
酶预处理在50mL锥形瓶中进行，该锥形瓶中装有25mL新鲜酒糟，pH值根据所使用的酶调节至pH 6-7。所有实验均在一式三份烧瓶和一式三份对照烧瓶中进行。在添加酶之前，使用标准消毒温度和持续时间对酒糟瓶进行高压灭菌。
酶原液以0.02％v/v无菌添加到灭菌酒糟瓶中，添加到对照瓶中的水进行过滤灭菌。添加酶后，将烧瓶重新密封并在30℃下摇动(95rpm)培养20小时。
表：每个烧瓶中使用的调整后的pH值，基于对每种酶的最佳pH值和工作范围报告的最佳拟合进行选择。
在酶处理步骤之前和之后测量可溶性葡萄糖水平的酶预处理验证。在培养步骤之前，从每个消毒烧瓶中无菌取出一式三份样品，并在培养期结束时进行一式三份样品的最后后处理。为了进行葡萄糖测量，将样品以13,000rpm离心10分钟，并使用无SD Code葡萄糖监测仪和相应的葡萄糖试纸条测量葡萄糖。
对于藻类生长的量化，在5天的培养期之后，在发酵开始和结束时对藻类培养瓶进行三次取样而测量葡萄糖。对于藻类生产率计算，从每个烧瓶中无菌取出1mL样品，用于前面详述的细胞计数测量。
Claims (17)
1.组合物用于培养破囊壶菌的的用途，其中，所述组合物包含来自酒精饮料制造过程的副产物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组合物包含来自蒸馏过程的残余物。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组合物包含来自用于麦芽威士忌制造的蒸馏步骤的残余物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物包括酒糟。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述组合物包含稀释至20％至50％v/v的酒糟。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物包含酿酒废水。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，当根据标准化测试方法ASTM D1252-06(2012)e1(测试方法B)测量时，所述组合物具有5至30g/L的化学需氧量。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物具有1至5g/L的酵母含量、20至50g/L范围内的碳源和8.75至42.5g/L范围内的盐(例如人造海盐)。
9.一种用于在含有包含来自酒精饮料制造过程的副产物的组合物的容器中培养破囊壶菌的方法，其中，所述组合物是前述权利要求中任一项中限定的。
10.根据权利要求9所述的方法，包括在将所述破囊壶菌和所述组合物装入容器之前对所述容器进行消毒的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述消毒包括用碱清洗，然后用水冲洗，然后施加抗微生物剂以涂覆所述容器的内表面。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，包括在将所述组合物或所述副产物装入所述容器之前对所述组合物或所述副产物进行巴氏消毒的步骤。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，所述培养产生包含脂质、油或脂肪酸中的一种或多种的产物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述产物包含ω-3脂肪酸。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中，所述培养包括：第一阶段，其中由破囊壶菌的接种物增殖破囊壶菌；第二阶段，其中营养供应不同于第一阶段，使得破囊壶菌的应激反应增强一种或多种ω-3油或其他有用产物的积累。
16.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中，所述培养包括：第一阶段，其中在促进孢子形成的培养基中由破囊壶菌接种物增殖破囊壶菌；第二阶段，其中营养供应不同于第一阶段，使得酒精性副产物被用作细胞生长的碳源，和第三阶段中，其中发酵参数不同于前两个阶段以引发破囊壶菌的应激反应，以增强一种或多种ω-3油或其他有用产物的积累。
17.一种通过根据权利要求9至16中任一项所述的方法获得的或可获得的产物，包含脂质、油、脂肪酸、ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸和/或二十二碳六烯酸中的一种或多种。
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