JP5489474B2 - 培地の殺菌方法および醗酵による１−ブタノール製造方法 - Google Patents

Description

本発明は醗酵により１−ブタノールを製造する方法において、あらかじめ培地中に存在する雑菌を殺菌する方法に関する。さらにその殺菌方法で得られた培地を用いて１−ブタノールを醗酵製造する方法に関する。

ブタノール醗酵は、嫌気性菌のクロストリジウムなどの細菌を利用し、主に糖質から１−ブタノールを作る醗酵である。ブタノール醗酵は古くから工業的に利用され、２０世紀初頭より英国等で工業生産が開始されている。日本においても１９３０年代に盛んに工業生産された。その後石油化学工業の発展に伴い醗酵によるブタノール生産は終息を迎えたが、近年の地球環境の悪化に伴い、よりクリーンな工業生産法として再び脚光を浴びている。このため、近年ではブタノール代謝遺伝子を大腸菌等に組み換えた醗酵菌株（特許文献１）や、変異処理により収率が向上した醗酵菌株、ブタノール耐性を高めた醗酵菌株等の開発が盛んに行なわれている（特許文献２）。製造方法としてもブタノールの生成と分離を組み合わせた連続的醗酵方法（特許文献３）が開示されている。

しかしながら、このブタノール発酵法においては雑菌汚染が最も大きな問題点となっている（非特許文献１、２）。醗酵液が雑菌に侵された場合、原料である栄養源を雑菌が浪費する、雑菌が醗酵生産物を分解する等により収率の低下を招く他、雑菌の生産する物質が醗酵をかく乱する等の事態を招く。また、雑菌の増殖が旺盛な場合、醗酵菌を凌いで生育し、特に連続醗酵においては醗酵菌に取って代わってしまう事態となる。このため醗酵においては雑菌の混入防止のため、培地の殺菌及び運転中の醗酵槽の無菌性保持が必要であることが開示されている（非特許文献３）。

従来、培地の殺菌方法としては加熱滅菌（非特許文献３）やフィルター除菌が広く用いられている（非特許文献４）。しかし、加熱滅菌の場合には醗酵スケールが大きくなると昇温、温度保持、冷却に必要なユーティリティーは膨大なものとなり、コスト的に不利である。フィルター除菌については、フィルター設置の費用がかかるのに加え、培地中に固形分が含まれていると目詰まりを起こすため、培地組成が水溶性のものに限定されるなどの制約がある。また、雑菌を含む培地中に殺菌剤として２−オクタノール、トルエン、ベンゼン等の抗菌性有機溶剤を用いた微生物の培養方法（特許文献４）が開示されているが、所望の微生物をゲルキャリアー中に固定化して保護する等の操作が必要であり、また別途有機溶剤の分離を行う必要とする等工程が煩雑となり工業的に不利である。

このように１−ブタノール醗酵において培地中に存在する雑菌を滅菌、除菌または殺菌する方法においては、培地組成の制限を受けない方法やコスト的に有利に簡便に行える方法が望まれている。

国際公開ＷＯ２００７／０４１２６９号公報 米国ＵＳ６，３５８，７１７号公報 特表平０１−５０２４７９号公報 米国ＵＳ５，１１２，７５０号公報

J Mol Microbiol Biotechnol vol.13, 12-14 (2007) 農化 第39巻,第7号,252-256 （1965） 醗酵工学の基礎 学会出版センター Fermentation a practical approach Oxford university press 生物物理化学ＩＩ 増訂第６版 共立全書

本発明の目的は、ブタノール醗酵において、雑菌が培養の栄養源となる原料を浪費し発酵生産物を分解することに起因した１−ブタノール収率の低下を抑制し、さらに培地組成に制約を受けない非常に簡便でかつコスト優位な培地の殺菌手段を提供することにある。また、前記方法により殺菌を施した培地を用いてブタノールを醗酵により製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、醗酵による１−ブタノール製造において、従来の培地の殺菌方法における上記問題を解決することを目的として検討したところ、醗酵生産物と同じ成分である１−ブタノールを用いて培地を処理するという非常に簡便な方法により、雑菌による栄養源を浪費や醗酵生産物の分解を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は醗酵による１−ブタノール製造において、１−ブタノールを用いて培地および／または醗酵設備を処理することを特徴とする培地の殺菌方法である。

本発明に寄れば、培地組成の制約を受けないためフィルター等の特別な設備投資が不要で、加熱滅菌のような他の滅菌工程の省略によるユーティリティー費用等の削減を図ることができ、１−ブタノールの生成収率を向上することが可能となる。

培地中に終濃度０〜１．２％の範囲で１−ブタノールを添加した際の醗酵菌株の比増殖速度を示した図である。

本発明は、ブタノール醗酵へ適用するものである。本発明の実施は、１−ブタノールを殺菌剤として用いて醗酵設備、培地、醗酵原料等を処理することで行われる。

本発明は以下の実施形態を包含するが、これに限定されるものではない。

（１）醗酵槽、送液ライン等の醗酵設備を１−ブタノール又は１−ブタノールを含む液を雑菌剤として洗浄処理する形態。１−ブタノールを含む液としては１−ブタノールの水溶液を用いることができる。殺菌剤を送液、噴霧等の方法で醗酵設備に供給することで醗酵設備を殺菌し、その後培地を醗酵設備に送液して醗酵を行うことができる。

（２）１−ブタノール醗酵を回分式で行う場合は、醗酵用培地に予め１−ブタノールを添加することで殺菌する形態。ここで、培地殺菌のために添加する殺菌剤の量は、培養に用いる細菌の種類によって異なるので必要とする殺菌の程度に応じて適宜調整して良いが、通常、培地中の１−ブタノール濃度が８％以下であれば良く、好ましくは０．０１〜３％であり、より好ましくは０．１〜２％、特に好ましくは０．３〜１％であるのが良い。必要とする殺菌の程度が高い場合には、高濃度で１−ブタノールを添加した後、醗酵用培地への種菌接種前に培地中の１−ブタノールを醗酵菌が生育できる濃度まで除去しても良い。
培地を殺菌するための処理時間は、培地の１−ブタノール濃度により異なるが、数秒から数日が採用される。１−ブタノール醗酵生産の生産性を考慮すると５分から２時間の間で行うことが好ましい。

（３）醗酵方法が半回分醗酵、流加醗酵、連続醗酵などの形態で行われる場合には、醗酵中に醗酵槽に供給される培地に対していくつかの方法を採用することができる。すなわち培地保管槽中の培地にあらかじめ殺菌剤を添加する方法、培地を醗酵槽に供給すると同時に殺菌剤も添加する方法、培地を醗酵槽に供給した後に殺菌剤を添加する方法である。

（４）醗酵中において雑菌混入が避けられない場合は、１−ブタノールを追加する。この場合、培地中の１−ブタノール濃度を醗酵菌が生育できる濃度にコントロールすることで、醗酵期間中において混入した雑菌の増殖を防止できる。

（５）醗酵原料の殺菌にも好適に用いることができる。最近では１−ブタノール醗酵用原料として、デンプン系バイオマス（トウモロコシ、サツマイモ等）やサトウキビ絞り汁、焼酎粕、廃糖蜜等の食品副産物、更には食料と競合しないセルロース系バイオマス（間伐材、稲藁、大鋸屑、等）の利用が盛んに試みられている。特にパーム油の原料である植物パームヤシは東南アジアを中心に大量に生産されており、パームヤシ由来バイオマス（パームヤシ古木、パーム空果房、パーム油廃液、更に殻、繊維、核油等のパーム油絞り粕等）の利用が注目されている。これらバイオマスをブタノール醗酵の原料に利用することもできるが、デンプンやセルロースを糖に一旦変換する工程を設けるのが一般的である。糖化の方法としては硫酸等を用いる化学糖化法と酵素を用いる酵素糖化法である。この酵素糖化法においても、ブタノール醗酵と同様、雑菌に汚染されると醗酵原料となる糖を雑菌が浪費する、雑菌が酵素を分解する等の深刻な事態が生じるため、雑菌の混入、増殖の防止のために本発明を用いることができる。一方、バイオマスを直接ブタノール醗酵原料に用いる場合は、あらかじめバイオマス自体に１−ブタノールを噴霧したり、バイオマスを１−ブタノール中に浸すなどの方法で殺菌する形態を採ることができる。１−ブタノールは糖化液に混入してしまうが、醗酵での生産物である１−ブタノール回収工程で分離される。

近年では育種により１−ブタノールに対する耐性を高めた醗酵菌株も知られている。このような醗酵菌株を用いる場合には、殺菌に用いる１−ブタノール濃度を高濃度で用いることができるため、本発明はより有効なものとなる。

本発明は、上記の方法により殺菌を施した培地を用いることを特徴とする醗酵による１−ブタノールの製造方法でもある。

本発明によれば、上記方法により殺菌処理する以外はブタノール醗酵の分野で公知の細菌や培養方法を使用できる。

本発明に用いる醗酵菌としては、嫌気性菌のクロストリジウム属微生物であるClostridium beijerinckii、Clostridium acetobutylicum、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、 Clostridium butylicum等を用いることができるが、特にClostridium beijerinckiiが好適である。また１−ブタノール代謝遺伝子を大腸菌等に組み換えた醗酵菌株等も用いることができる。

本発明に用いる培地及び培養条件も公知のものが使用でき、培養は、通常、炭素源、窒素源及び無機イオンを含む。

炭素源としては、でんぷんや糖類、好ましくはグルコースを用いる。グルコースとともに、ラクトース、ガラクトース、フラクトース等の六炭糖類、キシロース等の五炭糖類、若しくはでんぷんの加水分解物などの糖類、ソルビトールなどのアルコール類、又はフマル酸、クエン酸若しくはコハク酸、酪酸、酢酸等の有機酸類を、併用してもよい。

窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、酢酸アンモニウム等の有機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。

無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が添加される。有機微量栄養素としては、ビオチン、ビタミンＢ１などの要求物質又は酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。

培養は、通常、嫌気条件下で５時間以上実施するのがよく、培養温度は通常２５〜４０℃に、培養中ｐＨは通常３〜８に制御する。ｐＨ調整には無機又は有機の酸性又はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。

培養終了後の培地液からの発酵生成物、特に１−ブタノールの採取は、本発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、従来周知となっているイオン交換樹脂法、その他の方法を組み合わせることにより実施できる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

（実施例１及び比較例１）１−ブタノールを添加することによる醗酵用培地の殺菌
方法
醗酵用培地：表１に示す醗酵培地を調製した。調製に使用した水はイオン交換水（０．２μｍ孔径のフィルターで除菌した後、未滅菌のポリ容器にて常温で１ヶ月以上保管した物）および水道水とした。調製後加熱、フィルター濾過などによる滅菌操作は実施しなかった。

醗酵槽：未滅菌の５００ｍＬ坂口フラスコ醗酵用培地を用いた。

殺菌の確認：上記醗酵槽にイオン交換水または水道水を用いた未滅菌の醗酵用培地１００ｍＬをいれたものを、それぞれ５本ずつ作成した。これに１−ブタノールを終濃度０．３％、０．５％、１％、３％となるように添加した。比較として１−ブタノール未添加の物も作成した。坂口フラスコ上部にはシリコン栓が設置された。このように調製した醗酵液を３７℃、１２０ｒｐｍの速度で４５時間往復振盪した。適宜サンプリングを行い、波長６６０ｎｍでの培地濁度（ＯＤ）測定を行い、各１−ブタノール濃度下での雑菌の汚染度合いを確認した。サンプリングはクリーンベンチ内ではなく、開放系で行った。

結果
各振盪時間においての培地ＯＤを表２に示した。

この結果、発酵用培地に１−ブタノールを添加しないものではＯＤの増加が認められたが、０．３％および０．５％添加したものにおいては、未添加の物と比較してＯＤの増加が遅かった。さらに発酵用培地に１−ブタノールを１％以上添加したものにおいては４５時間経過後もＯＤは増加しなかった。従って本実施例に用いた発酵用培地組成および調製方法では、１−ブタノールを０．３−０．５％の範囲で添加した場合雑菌の増殖を遅らせることが可能となり、１％以上添加すれば雑菌が生育できないことが示された。

（実施例２）１−ブタノールが添加された醗酵用培地を用いた１−ブタノール醗酵
方法
醗酵用培地：前培養、本培養共に実施例１と同様の醗酵培地を用いた。但し調製にはイオン交換水を用いた。更に雑菌の混入により醗酵菌の生育が正確に測定できないため、１２１℃、１５分の加熱により培地を滅菌した。培地は加熱後、嫌気ボックス内で冷却した。
醗酵槽：培地調製と同様の理由から滅菌済みの２０ｍＬ容蓋付試験管を用いた。
使用菌株：以下の二種類の醗酵菌株が用いられた。
Clostridium beijerinckii NCIMB8052 ATCC51743
Clostridium acetobutylicum ATCC824
醗酵条件：醗酵菌株の保存液それぞれ１ｍＬを醗酵培地９ｍＬに接種し、温水バス中で８０℃、１０分間のヒートショックを行った後、直ちに氷水中で２分間の冷却した。嫌気ボックス内で冷却後３５℃、２４時間静置で前培養した。前培養液２００μＬを、新しい醗酵培地１０ｍＬ（それぞれの醗酵菌に対し５本ずつ）に接種し、３５℃で静置培養した。１８時間後に１−ブタノールを終濃度０．４％、０．６％、０．８％、１．２％で添加し、培地のＯＤを測定した。比較として１−ブタノール未添加のものも作成した。１−ブタノール添加後４時間後に再びOD測定を行い、これらのＯＤ測定結果から１−ブタノール添加期間中の醗酵菌株の比増殖速度を算出した。比増殖速度算出法は非特許文献５に開示されている方法に従った。

結果
算出された比増殖速度を１−ブタノール未添加のものと比較した結果を図１に示した。１−ブタノール未添加で得られる比増殖速度を１００％として表示した。

この結果、本実施例で用いられた醗酵菌株であれば１−ブタノールが終濃度０．６％までの範囲であれば未添加の条件とほぼ同様の速度で生育できることが示された。従って本実施例で用いられた醗酵菌株の場合、１−ブタノールが終濃度０．６％までの範囲であれば醗酵用培地への種菌接種前に培地中の１−ブタノールを醗酵菌が生育できる濃度まで除去する必要は無いことが示された。

醗酵による１−ブタノール製造において、培地および／または醗酵設備を醗酵生産物と同じ成分である１−ブタノール用いて処理するという簡便な方法で培地の雑菌を除去することにより、雑菌による栄養源を浪費や醗酵生産物の分解を抑制できる。また、別途殺菌剤の回収工程を設ける必要が無いため、殺菌工程の省力化、省コスト化が可能となり、１−ブタノール醗酵生産を効率的に行うことが可能となる。

Claims (3)

1. 醗酵による１−ブタノール製造において、１−ブタノール醗酵用培地に予め１−ブタノールを添加することにより培地を殺菌する殺菌方法。
2. １−ブタノール醗酵菌がクロストリジウム属である請求項1に記載の殺菌方法。
3. 請求項１記載の方法で得られた１−ブタノール醗酵用培地を用いることを特徴とする１−ブタノールの製造方法。

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