JPH07222591A - Manifestation system, integration vector and cell transformed by integration vector - Google Patents
Manifestation system, integration vector and cell transformed by integration vectorInfo
- Publication number
- JPH07222591A JPH07222591A JP7011429A JP1142995A JPH07222591A JP H07222591 A JPH07222591 A JP H07222591A JP 7011429 A JP7011429 A JP 7011429A JP 1142995 A JP1142995 A JP 1142995A JP H07222591 A JPH07222591 A JP H07222591A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- glucose oxidase
- aspergillus
- strain
- expression system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 34
- 230000010354 integration Effects 0.000 title claims description 13
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims abstract description 136
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims abstract description 136
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims abstract description 136
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims abstract description 112
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 53
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 13
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 5
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 4
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 4
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 3
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 101000904208 Aspergillus niger Glucose oxidase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 2
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- WDGFFVCWBZVLCE-UHFFFAOYSA-N purpurogallin Chemical compound C1=CC=C(O)C(=O)C2=C1C=C(O)C(O)=C2O WDGFFVCWBZVLCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 101000604770 Aspergillus niger Acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241001246273 Endothia Species 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000425347 Phyla <beetle> Species 0.000 description 1
- 241000221945 Podospora Species 0.000 description 1
- 241000231139 Pyricularia Species 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 239000006787 czapek-dox agar Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 125000000422 delta-lactone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、グルコースオキシダー
ゼの生産に使用できる発現系に関し、更に詳細には、グ
ルコースオキシダーゼの細胞外生産を達成することがで
きる発現系に関する。本発明は、また、その発現系を含
む組込みベクター及びその組込みベクターで形質転換さ
れた細胞に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to an expression system that can be used for the production of glucose oxidase, and more particularly to an expression system that can achieve extracellular production of glucose oxidase. The invention also relates to an integration vector containing the expression system and cells transformed with the integration vector.
【０００２】[0002]
【従来の技術】グルコースオキシダーゼは、国際方式に
おいて参照 E.C.1.1.3.4. 又はβ−Ｄ−グルコース：酸
素１−オキシドレダクターゼとして分類されている。こ
の酵素は、β−Ｄ−グルコースの、その後グルコン酸に
加水分解されるＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化反
応を触媒する。この反応は、野生型アスペルギルス株に
よって産生されるカタラーゼの作用によって酸素と水に
変換される過酸化水素を生成する。グルコースオキシダ
ーゼは、糸状菌株、特にアスペルギルス(Aspergillus)
株によって天然に産生される。残念ながら、これらのア
スペルギルス株によって産生されたグルコースオキシダ
ーゼはこれらの菌株の培養基にほとんど分泌されず、グ
ルコースオキシダーゼは細胞壁を通過しない(WITTE-VEE
N C.F.B.ら, Applied and Environmental Microbiolog
y, 1992, 58 (4), p. 1190-1194) 。従って、工業的に
は、グルコースオキシダーゼは細胞内酵素として処理さ
れる。アスペルギルス細胞は、グルコースオキシダーゼ
の回収及び精製前に切断されなければならない。収集が
拘束を課す前の細胞切断の追加段階は工業的に実施が困
難であり、更に、収量の著しい低下を生じる。実際に、
細胞の切断後、得られた水性懸濁液はグルコースオキシ
ダーゼを溶解したものを他の酵素及びポリペプチドと共
に、多少可溶性の多くの細胞も共に含んでいる。従っ
て、純粋な又は工業的に使用できるグルコースオキシダ
ーゼを得るためには、いくつかの分離操作を必要とする
精製段階が不可欠である。このために、グルコースオキ
シダーゼの細胞外生産、即ち、酵素の培養基への分泌が
長い間探索されてきた。Glucose oxidase is classified in the international system as reference EC 1.1.3.4. Or β-D-glucose: oxygen 1-oxidoreductase. This enzyme catalyzes the oxidation reaction of β-D-glucose to D-glucono-δ-lactone, which is subsequently hydrolyzed to gluconic acid. This reaction produces hydrogen peroxide which is converted to oxygen and water by the action of catalase produced by the wild-type Aspergillus strain. Glucose oxidase is a filamentous fungus strain, especially Aspergillus.
Produced naturally by the strain. Unfortunately, glucose oxidase produced by these Aspergillus strains is scarcely secreted into the culture medium of these strains and glucose oxidase does not cross the cell wall (WITTE-VEE
N CFB et al., Applied and Environmental Microbiolog
y, 1992, 58 (4), p. 1190-1194). Therefore, industrially, glucose oxidase is treated as an intracellular enzyme. Aspergillus cells must be cleaved before recovery and purification of glucose oxidase. The additional step of cell cleavage before the collection imposes constraints is industrially difficult to perform and further results in a significant reduction in yield. actually,
After cleaving the cells, the resulting aqueous suspension contains glucose oxidase lysate, along with other enzymes and polypeptides, as well as many more or less soluble cells. Therefore, in order to obtain a pure or industrially usable glucose oxidase, a purification step which requires several separation operations is essential. For this reason, the extracellular production of glucose oxidase, ie the secretion of the enzyme into the culture medium, has long been sought.
【０００３】更に、カタラーゼが培地中に最少量でしか
存在しないグルコースオキシダーゼの生産方法が長い間
探索されてきた。この目的は、グルコースオキシダーゼ
触媒反応で形成された過酸化水素が培地中に存在するカ
タラーゼによって酸素と水に分解されないように防止す
るためである。このような関係において、酵母をプラス
ミドで形質転換する提案が国際特許出願第 89/12,675号
でなされている。このプラスミドは、酵母デヒドロゲナ
ーゼ（ＡＤＨ２−ＧＡＰ）のプロモーター配列、アスペ
ルギルス・ニガー(Aspergillusniger) グルコースオキ
シダーゼ分泌シグナル配列又はサッカロミセス・セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)α交配因子分泌シグナ
ル配列、アスペルギルス・ニガー グルコースオキシダ
ーゼ成熟配列及び酵母デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のタ
ーミネーターを含んでいる。形質転換酵母（サッカロミ
セス・セレビシエ）は、グルコースオキシダーゼを分泌
する。欧州特許出願第 0,357,127号には、ウシキモシン
の生産に使用できる発現系が記載されている。この発現
系は、アスペルギルス・ニガー グルコアミラーゼプロ
モーター配列、アスペルギルス・ニガー グルコアミラ
ーゼシクナルペプチド配列、ウシキモシンコード配列及
びアスペルギルス・ニガー グルコアミラーゼターミネ
ーター配列を含んでいる。この発現系を含む形質転換ア
スペルギルス・ニガー株は、ウシキモシンを得ることを
可能にする。現在、発現系を含む形質転換糸状菌株によ
ってグルコースオキシダーゼの発現及び有効な分泌を得
ることを可能にする発現系は知られていない。Furthermore, a method for producing glucose oxidase in which catalase is present in the medium in a minimum amount has been searched for for a long time. The purpose is to prevent the hydrogen peroxide formed by the glucose oxidase catalyzed reaction from being decomposed into oxygen and water by the catalase present in the medium. In this context, a proposal for transforming yeast with a plasmid has been made in International Patent Application No. 89 / 12,675. This plasmid comprises a promoter sequence for yeast dehydrogenase (ADH2-GAP), an Aspergillus niger glucose oxidase secretion signal sequence or a Saccharomyces cerevisiae alpha mating factor secretion signal sequence, an Aspergillus niger glucose oxidase mature sequence and yeast. It contains a dehydrogenase (GAP) terminator. Transformed yeast (Saccharomyces cerevisiae) secretes glucose oxidase. European Patent Application No. 0,357,127 describes expression systems that can be used for the production of bovine chymosin. This expression system contains an Aspergillus niger glucoamylase promoter sequence, an Aspergillus niger glucoamylase cyclinal peptide sequence, a bovine chymosin coding sequence and an Aspergillus niger glucoamylase terminator sequence. A transformed Aspergillus niger strain containing this expression system makes it possible to obtain bovine chymosin. At present, no expression system is known which makes it possible to obtain the expression and effective secretion of glucose oxidase by the transformed filamentous fungal strain containing the expression system.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
発現系を含む形質転換株が培養される培養基中でグルコ
ースオキシダーゼを得ることを可能にする発現系を提供
することである。本発現系は、グルコースオキシダーゼ
の実質的な細胞外生産を得ることを可能にする。更に、
本発現系は、カタラーゼをほとんど含まずにグルコース
オキシダーゼを含む酵素組成物を得ることを可能にす
る。グルコースオキシダーゼは、β−Ｄ−グルコース
の、その後グルコン酸に加水分解されるＤ−グルコノ−
δ−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素を意味すると
理解されるものである。この酵素は、国際方式において
参照 E.C.1.1.3.4. 又はβ−Ｄ−グルコース：酸素１−
オキシドレダクターゼとして分類されている。この定義
には、天然酵素及びヌクレオチド又はアミノ酸配列が遺
伝子工学手法又は突然変異誘発手法によって修飾された
酵素のような修飾酵素が含まれる。本発明の目的は、ま
た、組込みベクター及び上記の発現系を含むプラスミド
を提供することである。本発明の目的は、また、グルコ
ースオキシダーゼを発現するとともにその培養基に高レ
ベルの生産性で分泌する上記の組込みベクター又はプラ
スミドによって形質転換された菌株、特に形質転換アス
ペルギルス株、特に形質転換アスペルギルス・ホエチダ
ス(Aspergillus foetidus)株を提供することである。本
形質転換株によるグルコースオキシダーゼの分泌は、実
質的に細胞外である。本発明の目的は、また、大量のグ
ルコースオキシダーゼを産生するとともにそれをほとん
ど完全に細胞外に分泌する糸状菌株を用いるグルコース
オキシダーゼの生産方法を提供することである。The main object of the present invention is to:
It is to provide an expression system which makes it possible to obtain glucose oxidase in a culture medium in which a transformant containing the expression system is cultured. This expression system makes it possible to obtain a substantial extracellular production of glucose oxidase. Furthermore,
The present expression system makes it possible to obtain an enzyme composition containing glucose oxidase with almost no catalase. Glucose oxidase is D-glucono- which is hydrolyzed of β-D-glucose and then to gluconic acid.
It is understood to mean an enzyme that catalyzes the oxidation reaction to δ-lactone. This enzyme is referred to in the international system as EC1.1.3.4. Or β-D-glucose: oxygen 1-
It is classified as oxidoreductase. This definition includes native enzymes and modified enzymes such as those in which the nucleotide or amino acid sequences have been modified by genetic engineering or mutagenesis techniques. The object of the present invention is also to provide a plasmid comprising the integration vector and the expression system described above. The object of the present invention is also a strain transformed by the above-mentioned integrative vector or plasmid which expresses glucose oxidase and secretes it into the culture medium at a high level of productivity, in particular a transformed Aspergillus strain, in particular transformed Aspergillus foetidas. (Aspergillus foetidus) strain. Secretion of glucose oxidase by this transformant is substantially extracellular. It is also an object of the present invention to provide a method for producing glucose oxidase using a filamentous fungal strain which produces a large amount of glucose oxidase and secretes it almost extracellularly.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】これを目的として、本発
明は、グルコースオキシダーゼの細胞外生産に使用でき
る発現系であって、少なくともプロモーター配列、グル
コースオキシダーゼ分泌シグナル配列、及びグルコース
オキシダーゼ成熟配列、を含むことを特徴とする発現系
に関する。一般に、発現系は、更に、ターミネーター配
列を含む。好ましい態様においては、プロモーター配列
はグルコアミラーゼプロモーター配列である。本発明
は、グルコースオキシダーゼの細胞外生産に使用できる
発現系であって、少なくともアスペルギルス・ホエチダ
ス グルコアミラーゼプロモーター配列、アスペルギル
ス・ホエチダス グルコースオキシダーゼ分泌シグナル
配列、アスペルギルス・ホエチダス グルコースオキシ
ダーゼ成熟配列、及びアスペルギルス・ホエチダス グ
ルコアミラーゼターミネーター配列、を含むことを特徴
とする発現系に関する。To this end, the present invention provides an expression system that can be used for extracellular production of glucose oxidase, which comprises at least a promoter sequence, a glucose oxidase secretion signal sequence, and a glucose oxidase mature sequence. To an expression system characterized in that Generally, the expression system further comprises a terminator sequence. In a preferred embodiment, the promoter sequence is the glucoamylase promoter sequence. The present invention is an expression system that can be used for extracellular production of glucose oxidase, which comprises at least an Aspergillus foetidas glucoamylase promoter sequence, an Aspergillus foetidas glucose oxidase secretion signal sequence, an Aspergillus foetidas glucose oxidase mature sequence, and Aspergillus foetidas gluco. An expression system comprising an amylase terminator sequence.
【０００６】発現系は、糸状菌のゲノムに組込まれかつ
この菌にグルコースオキシダーゼの生合成に必要とされ
る遺伝情報を与えることができる分子単位を意味すると
理解されるものである。プロモーターは、転写プロモー
ターを意味すると理解されるものである。強力な転写活
性を示すＤＮＡ配列からなるプロモーターは、転写を促
進するＤＮＡ配列、例えば『エンハンサー』又は『上流
活性化配列』の名称で知られる配列が先行する。プロモ
ーターは、融合コードＤＮＡの発現に影響する転写調節
配列を含む。遺伝子プロモーター配列は、転写を調節し
かつ遺伝子発現で関与する配列を含む。An expression system is understood to mean a molecular unit which is integrated into the genome of a filamentous fungus and is able to give this fungus the genetic information required for the biosynthesis of glucose oxidase. Promoter is understood to mean a transcriptional promoter. A promoter consisting of a DNA sequence exhibiting strong transcription activity is preceded by a DNA sequence that promotes transcription, for example, a sequence known as "enhancer" or "upstream activation sequence". The promoter contains transcriptional regulatory sequences that affect the expression of the fusion coding DNA. Gene promoter sequences include sequences that regulate transcription and are involved in gene expression.
【０００７】一般に、プロモーター配列は糸状菌に由来
する。通常はアスペルギルス株に由来する。好ましく
は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、ア
スペルギルス・ホエチダス(Aspergillus foetidus)、ア
スペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) 又はア
スペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)株に由来す
る。特に好ましくは、アスペルギルス・ニガー株又はア
スペルギルス・ホエチダス株に由来する。グルコアミラ
ーゼプロモーター配列が由来するアスペルギルス・ニガ
ー株及びアスペルギルス・ホエチダス株は、例えばアス
ペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３（アグリカルチュラル
・リサーチ・サービス・カルチュア・コレクション（Ｎ
ＲＲＬ）,1815 ノースユニバーシティストリート, ペオ
リア, イリノイ 61604, 米国) 、アスペルギルス・ニガ
ー株ＡＴＣＣ１３４９６（アメリカン・タイプ・カルチ
ュア・コレクション, 12301 パークラウンドライブ，ロ
ックビル，メリーランド 20852-1776,米国) 、アスペル
ギルス・ニガー株ＡＴＣＣ２２３４３、アスペルギルス
・ニガー株ＡＴＣＣ４６８９０、アスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１０２５４及びアスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１４９１６が既知である。好ましく
は、グルコアミラーゼプロモーター配列はアスペルギル
ス・ホエチダス株に由来する。特に好ましくは、アスペ
ルギルス・ホエチダス株ＳＥ４に由来する。配列番号７
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子は、アスペルギル
ス・ホエチダス株ＳＥ４プロモーターをコードする。In general, the promoter sequence is derived from filamentous fungi. Usually derived from Aspergillus strains. Preferably, it is derived from Aspergillus niger, Aspergillus foetidus, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae strain. Particularly preferably, it is derived from the Aspergillus niger strain or the Aspergillus foetidas strain. Aspergillus niger strains and Aspergillus foetidas strains from which the glucoamylase promoter sequence is derived are, for example, Aspergillus niger strain NRRL3 (Agricultural Research Service Culture Collection (N
RRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA), Aspergillus niger strain ATCC13496 (American Type Culture Collection, 12301 Park Round Live, Rockville, MD 20852-1776, USA), Aspergillus niger The strains ATCC22343, Aspergillus niger strain ATCC 46890, Aspergillus foetidas strain ATCC10254 and Aspergillus foetidas strain ATCC14916 are known. Preferably, the glucoamylase promoter sequence is from the Aspergillus foetidas strain. Particularly preferably, it is derived from Aspergillus foetidas strain SE4. Sequence number 7
A DNA molecule containing the nucleotide sequence of E. coli encodes the Aspergillus foetidas strain SE4 promoter.
【０００８】本発明は、また、アスペルギルス・ホエチ
ダス グルコアミラーゼプロモーターに関する。更に詳
細には、本発明は、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーターをコードする配列番号７
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列は、勿論グルコース
オキシダーゼ成熟配列のアミノ末端に操作的に結合され
るアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を意味すると理解
されるものである。グルコースオキシダーゼをコードす
る遺伝子はクローン化及び配列決定されており、この研
究から推論されたアミノ酸配列はより複雑である以外は
シグナルペプチドの特徴を有する前配列の存在を示して
いる (WHITTINGTON H.ら, Curr. Genet., 18 (1990),
p. 531-536)。このために、本明細書においては、仮定
のシグナルペプチドをコードする構造遺伝子部分を『グ
ルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列』と称し、グル
コースオキシダーゼだけをコードする構造遺伝子部分を
『グルコースオキシダーゼ成熟配列』と称する。The present invention also relates to the Aspergillus foetidas glucoamylase promoter. More specifically, the present invention relates to Aspergillus hoetidas SE4.
SEQ ID NO: 7 encoding glucoamylase promoter
DNA molecule comprising the nucleotide sequence of Glucose oxidase secretion signal sequence is of course understood to mean the DNA sequence corresponding to the amino acid sequence operably linked to the amino terminus of the glucose oxidase mature sequence. The gene encoding glucose oxidase has been cloned and sequenced, and the amino acid sequence deduced from this study indicates the presence of a presequence that is characteristic of the signal peptide but is more complex (WHITTINGTON H. et al. , Curr. Genet., 18 (1990),
p. 531-536). For this reason, in the present specification, the structural gene portion encoding a hypothetical signal peptide is referred to as "glucose oxidase secretory signal sequence", and the structural gene portion encoding only glucose oxidase is referred to as "glucose oxidase mature sequence".
【０００９】一般に、グルコースオキシダーゼ分泌シグ
ナル配列は糸状菌株に由来する。通常はアスペルギルス
株又はペニシリウム株に由来する。好ましくは、アスペ
ルギルス株、特にアスペルギルス・ニガー、アスペルギ
ルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又はアス
ペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましくは、ア
スペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホエチダ
ス株に由来する。アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３
（アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチュ
ア・コレクション（ＮＲＲＬ）,1815 ノースユニバーシ
ティストリート, ペオリア, イリノイ 61604, 米国) の
グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列を用いて良好
な結果が得られた。この配列は、The Journal of Biolo
gical Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802 に発表
されている。アスペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１
４９１６（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ
ョン 12301パークラウンドライブ, ロックビル, メリー
ランド 20852-1776,米国)のグルコースオキシダーゼ分
泌シグナル配列でも良好な結果が得られた。Generally, the glucose oxidase secretion signal sequence is derived from a filamentous fungal strain. Usually derived from Aspergillus strains or Penicillium strains. It is preferably derived from an Aspergillus strain, in particular an Aspergillus niger, Aspergillus foetidas, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae strain. Particularly preferably, it is derived from the Aspergillus niger strain or the Aspergillus foetidas strain. Aspergillus niger strain NRRL3
Good results have been obtained with the glucose oxidase secretion signal sequence (Agricultural Research Services Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, USA). This sequence is from The Journal of Biolo
gical Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802. Aspergillus foetidas strain ATCC1
Good results were also obtained with the glucose oxidase secretion signal sequence of 4916 (American Type Culture Collection 12301 Percrown Drive, Rockville, MD 20852-1776, USA).
【００１０】本発明による発現系は、グルコースオキシ
ダーゼ成熟配列を含んでいる。グルコースオキシダーゼ
成熟配列は、活性タンパク質、即ち、分泌シグナル配列
なしのグルコースオキシダーゼ構造遺伝子に対応するグ
ルコースオキシダーゼコード配列に翻訳される配列部分
を意味すると理解されるものである。コード配列（構造
遺伝子）は、分泌シグナル配列とグルコースオキシダー
ゼ成熟配列を含む。一般に、グルコースオキシダーゼ成
熟配列は糸状菌株に由来する。通常は、アスペルギルス
株又はペニシリウム株に由来する。好ましくは、アスペ
ルギルス株、特にアスペルギルス・ニガー、アスペルギ
ルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又はアス
ペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましくは、ア
スペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホエチダ
ス株に由来する。アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３
のグルコースオキシダーゼ成熟配列を用いて良好な結果
が得られた。この配列は、The Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265(7), p.3793-3802 に発表されて
いる。アスペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１
６（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション）
のグルコースオキシダーゼ成熟配列でも良好な結果が得
られた。The expression system according to the present invention comprises a glucose oxidase mature sequence. Glucose oxidase mature sequence is understood to mean the active protein, ie the part of the sequence which is translated into the glucose oxidase coding sequence corresponding to the glucose oxidase structural gene without the secretory signal sequence. The coding sequence (structural gene) contains a secretory signal sequence and a glucose oxidase mature sequence. Generally, the glucose oxidase mature sequence is derived from a filamentous fungal strain. Usually derived from Aspergillus or Penicillium strains. It is preferably derived from an Aspergillus strain, in particular an Aspergillus niger, Aspergillus foetidas, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae strain. Particularly preferably, it is derived from the Aspergillus niger strain or the Aspergillus foetidas strain. Aspergillus niger strain NRRL3
Good results have been obtained with the glucose oxidase mature sequence of. This sequence is from The Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802. Aspergillus foetidas strain ATCC 1491
6 (American Type Culture Collection)
Good results were also obtained with the glucose oxidase mature sequence of.
【００１１】本発明の好ましい態様においては、グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列とグルコースオキシ
ダーゼ成熟配列は同一糸状菌に由来する。アスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６のグルコースオキ
シダーゼ分泌シグナル配列及びアスペルギルス株ＡＴＣ
Ｃ１４９１６のグルコースオキシダーゼ成熟配列を含む
本発明による発現系を用いて優れた結果が得られた。ア
スペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３のグルコースオキシ
ダーゼ分泌シグナル配列及びアスペルギルス・ニガー株
ＮＲＲＬ３のグルコースオキシダーゼ成熟配列を含む本
発明による発現系でも優れた結果が得られた。ターミネ
ーターは、転写ターミネーターであると理解されるもの
である。遺伝子のターミネーター配列は、この遺伝子の
転写を終結するように作用するＤＮＡ配列である。ター
ミネーターは、ｍＲＮＡを安定化するポリアデニル化シ
グナルも含む。In a preferred embodiment of the present invention, the glucose oxidase secretion signal sequence and the glucose oxidase mature sequence are derived from the same filamentous fungus. Glucose oxidase secretion signal sequence of Aspergillus foetidas strain ATCC14916 and Aspergillus strain ATC
Excellent results have been obtained with the expression system according to the invention containing the glucose oxidase mature sequence of C14916. Excellent results were also obtained with the expression system according to the invention containing the glucose oxidase secretion signal sequence of Aspergillus niger strain NRRL3 and the glucose oxidase mature sequence of Aspergillus niger strain NRRL3. Terminator is understood to be a transcription terminator. The terminator sequence of a gene is a DNA sequence that acts to terminate transcription of this gene. The terminator also contains a polyadenylation signal that stabilizes the mRNA.
【００１２】一般に、ターミネーターは糸状菌に由来す
る。本出願においては、糸状菌内で機能するターミネー
ターが適している。ターミネーターは当業者に既知であ
る。菌類由来の既知のターミネーターの例としては、ｔ
ｒｐＣターミネーター、グルコアミラーゼターミネータ
ー、アミラーゼターミネーター、α−アミラーゼターミ
ネーター、アスパラギン酸プロテアーゼターミネータ
ー、酸ホスファターゼターミネーター、リパーゼターミ
ネーター、セルラーゼターミネーター、解糖酵素ターミ
ネーター、グルカナーゼターミネーター、ヒドロラーゼ
ターミネーター及びデヒドロゲナーゼターミネーター、
特にアスペルギルス・ニドュランス(Aspergillus nidul
ans)ｔｒｐＣターミネーター、アスペルギルス・ニガー
グルコアミラーゼターミネーター、アスペルギルス・
ニガー α−アミラーゼターミネーター、ムコール・ミ
エヘイ(Mucor miehei)アスパラギン酸プロテアーゼター
ミネーター、アスペルギルス・ニガー 酸ホスファター
ゼターミネーター及びアスペルギルス・ニドュランス
アルコールデヒドロゲナーゼターミネーターが言及され
る。通常、ターミネーター配列はアスペルギルス株に由
来する。好ましくは、アスペルギルス・ニガー、アスペ
ルギルス・ホエチダス、アスペルギルス・アワモリ又は
アスペルギルス・オリゼ株に由来する。特に好ましく
は、アスペルギルス・ニガー株又はアスペルギルス・ホ
エチダス株に由来する。好ましい態様においては、ター
ミネーター配列はグルコアミラーゼターミネーター配列
である。好ましくは、グルコアミラーゼターミネーター
配列はアスペルギルス・ホエチダス株に由来する。特に
好ましくは、アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４に由
来する。配列番号８のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分
子は、アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４ターミネー
ターをコードする。[0012] Generally, the terminator is derived from a filamentous fungus. Terminators that function in filamentous fungi are suitable in the present application. Terminators are known to those skilled in the art. Examples of known terminators of fungal origin include t
rpC terminator, glucoamylase terminator, amylase terminator, α-amylase terminator, aspartic acid protease terminator, acid phosphatase terminator, lipase terminator, cellulase terminator, glycolytic enzyme terminator, glucanase terminator, hydrolase terminator and dehydrogenase terminator.
Especially Aspergillus nidul
ans) trpC terminator, Aspergillus niger glucoamylase terminator, Aspergillus
Niger α-amylase terminator, Mucor miehei Aspartic protease terminator, Aspergillus niger acid phosphatase terminator and Aspergillus nidulans
Alcohol dehydrogenase terminators are mentioned. Usually the terminator sequence is from an Aspergillus strain. It is preferably derived from Aspergillus niger, Aspergillus foetidus, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae strains. Particularly preferably, it is derived from the Aspergillus niger strain or the Aspergillus foetidas strain. In a preferred embodiment, the terminator sequence is a glucoamylase terminator sequence. Preferably, the glucoamylase terminator sequence is from the Aspergillus foetidas strain. Particularly preferably, it is derived from Aspergillus foetidas strain SE4. A DNA molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 encodes the Aspergillus foetidas strain SE4 terminator.
【００１３】本発明は、また、アスペルギルス・ホエチ
ダス グルコアミラーゼターミネーターに関する。更に
詳細には、本発明は、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ
４グルコアミラーゼターミネーターをコードする配列番
号８のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。本
発明の好ましい態様においては、グルコアミラーゼプロ
モーター配列とグルコアミラーゼターミネーター配列は
同一糸状菌に由来する。アスペルギルス・ホエチダス株
グルコアミラーゼプロモーター配列及びアスペルギルス
・ホエチダス株グルコアミラーゼターミネーター配列を
含む本発明による発現系を用いて、良好な結果が得られ
た。アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４グルコアミラ
ーゼプロモーター配列及びアスペルギルス・ホエチダス
株ＳＥ４グルコアミラーゼターミネーター配列を含む本
発明による発現系を用いて、優れた結果が得られた。本
発明の発現系においては、プロモーター配列は、成熟配
列の上流に位置する分泌シグナル配列の上流に位置する
ことが好ましく、この成熟配列はターミネーター配列の
上流に位置する。これらの位置は、適切な条件下、転写
シグナル、即ちプロモーター及びターミネーターの調節
によってグルコースオキシダーゼを発現させるようにし
て選択される。The present invention also relates to Aspergillus foetidas glucoamylase terminator. More specifically, the present invention relates to Aspergillus hoetidas SE
It relates to a DNA molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 which codes for a 4 glucoamylase terminator. In a preferred embodiment of the present invention, the glucoamylase promoter sequence and the glucoamylase terminator sequence are derived from the same filamentous fungus. Good results have been obtained with the expression system according to the invention which comprises an Aspergillus foetidas strain glucoamylase promoter sequence and an Aspergillus foetidas strain glucoamylase terminator sequence. Excellent results have been obtained with the expression system according to the invention which comprises an Aspergillus foetidas strain SE4 glucoamylase promoter sequence and an Aspergillus foetidas strain SE4 glucoamylase terminator sequence. In the expression system of the present invention, the promoter sequence is preferably located upstream of the secretory signal sequence located upstream of the mature sequence, which mature sequence is located upstream of the terminator sequence. These positions are chosen such that under appropriate conditions, transcription signals, ie, promoter and terminator regulation, allow expression of glucose oxidase.
【００１４】発現系に含められる配列は操作的に結合さ
れることが好ましい。プロモーター配列は、グルコース
オキシダーゼ分泌シグナル配列に操作的に結合される。
グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列は、グルコー
スオキシダーゼ成熟配列に操作的に結合される。グルコ
ースオキシダーゼ成熟配列は、ターミネーター配列に操
作的に結合される。本発明は、また、少なくともプロモ
ーター配列、グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配
列、グルコースオキシダーゼ成熟配列及びターミネータ
ー配列を含む発現系の調製方法に関する。本方法は下記
のことを含んでいる。グルコースオキシダーゼを産生す
る微生物のゲノムＤＮＡからグルコースオキシダーゼ分
泌シグナル配列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列を
単離し、グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列及び
グルコースオキシダーゼ成熟配列をプロモーター配列及
びターミネーター配列を含むベクター内に導入する、な
お、この導入は配列の配置が該プロモーター及び該ター
ミネーターの調節によってグルコースオキシダーゼを発
現させるようにして選択された位置に行われる。The sequences included in the expression system are preferably operably linked. The promoter sequence is operably linked to the glucose oxidase secretion signal sequence.
The glucose oxidase secretion signal sequence is operably linked to the glucose oxidase mature sequence. The glucose oxidase mature sequence is operably linked to the terminator sequence. The present invention also relates to a method for preparing an expression system containing at least a promoter sequence, a glucose oxidase secretion signal sequence, a glucose oxidase mature sequence and a terminator sequence. The method includes: Glucose oxidase secretory signal sequence and glucose oxidase mature sequence are isolated from the genomic DNA of a glucose oxidase-producing microorganism, and the glucose oxidase secretory signal sequence and glucose oxidase mature sequence are introduced into a vector containing a promoter sequence and a terminator sequence. This introduction is carried out at a position selected such that the arrangement of the sequences allows glucose oxidase to be expressed by the regulation of the promoter and the terminator.
【００１５】本発明は、また、上記で定義された発現系
を含みかつグルコースオキシダーゼを発現させることが
できる組込みベクターに関する。本発明の原理は、ま
た、上記で定義された発現系を含みかつグルコースオキ
シダーゼを発現させることができる発現ベクターに適用
される。組込みベクターは、完全遺伝子発現単位を含む
ＤＮＡ配列を意味すると理解されるものである。完全遺
伝子発現単位は、構造遺伝子及びプロモーター領域及び
転写及び翻訳に必要とされる調節領域を意味すると理解
されるものである。構造遺伝子は、ＲＮＡへの転写に用
いられかつ宿主がタンパク質を合成することを可能にす
るコード配列を意味すると理解されるものである。本組
込みベクターはプラスミドであることが好ましい。プラ
スミドｐＦＧＯＤを用いて良好な結果が得られた。本発
明は、また、上記で定義された組込みベクターによって
形質転換された形質転換細胞（宿主細胞）に関する。本
形質転換細胞は、発現系に含められたプロモーター配列
及びターミネーター配列が本形質転換細胞によって認識
される、即ち、それらが本形質転換細胞に適合及び機能
するようにして選択され、発現系に含められたプロモー
ター配列及びターミネーター配列が形質転換細胞の各々
プロモーター及びターミネーターとしてそれらの各転写
シグナル機能を行う。The invention also relates to an integrating vector containing the expression system defined above and capable of expressing glucose oxidase. The principles of the present invention also apply to expression vectors containing the expression system defined above and capable of expressing glucose oxidase. An integrating vector is understood to mean a DNA sequence which comprises a complete gene expression unit. A complete gene expression unit is understood to mean the structural gene and promoter regions and the regulatory regions required for transcription and translation. Structural gene is understood to mean the coding sequence used for transcription into RNA and allowing the host to synthesize the protein. The integration vector is preferably a plasmid. Good results have been obtained with the plasmid pFGOD. The present invention also relates to transformed cells (host cells) transformed with the integration vector defined above. The transformed cells are selected such that the promoter sequences and terminator sequences included in the expression system are recognized by the transformed cells, that is, they are selected and adapted for the transformed cells and included in the expression system. The resulting promoter and terminator sequences perform their respective transcription signal functions as promoters and terminators of transformed cells, respectively.
【００１６】通常、形質転換細胞は糸状菌の細胞であ
る。一般に、形質転換細胞はアスペルギルス細胞に由来
する。特に好ましくは、形質転換細胞はアスペルギルス
・ニガー、アスペルギルス・ホエチダス、アスペルギル
ス・アワモリ又はアスペルギルス・オリゼ細胞に由来す
る。形質転換アスペルギルス・ニガー細胞、特に形質転
換アスペルギルス・ニガー株ＮＲＲＬ３細胞を用いて良
好な結果が得られた。形質転換アスペルギルス・ホエチ
ダス細胞、特に形質転換アスペルギルス・ホエチダス株
ＳＥ４細胞を用いて優れた結果が得られた。本発明の好
ましい態様においては、組込みベクターによって形質転
換された細胞はプロモーター配列及び／又はターミネー
ター配列、発現系に含められた配列が由来する菌株に由
来する。形質転換アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４
細胞を用いて優れた結果が得られた。組込みベクターに
よって形質転換されたその細胞は本発明による発現系を
含み、その発現系はアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
プロモーター配列及びアスペルギルス・ホエチダスＳＥ
４ターミネーター配列、特にアスペルギルス・ホエチダ
スＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター配列及びアスペ
ルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼターミネ
ーター配列を含んでいる。組込みベクターｐＦＧＯＤに
よって形質転換された細胞を用いて最良の結果が得られ
た。Usually, the transformed cells are filamentous fungal cells. Generally, transformed cells are derived from Aspergillus cells. Particularly preferably, the transformed cells are derived from Aspergillus niger, Aspergillus foetidas, Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae cells. Good results were obtained using transformed Aspergillus niger cells, especially transformed Aspergillus niger strain NRRL3 cells. Excellent results have been obtained with transformed Aspergillus foetidas cells, especially transformed Aspergillus foetidas strain SE4 cells. In a preferred embodiment of the invention, the cells transformed by the integrating vector are derived from the strain from which the promoter and / or terminator sequences, sequences included in the expression system, are derived. Transformation Aspergillus foetidas strain SE4
Excellent results have been obtained with cells. The cell transformed by the integrating vector comprises an expression system according to the invention, which expression system is Aspergillus foetidas SE4.
Promoter sequence and Aspergillus foetidas SE
4 terminator sequences, in particular the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter sequence and the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator sequence. Best results were obtained with cells transformed with the integration vector pFGOD.
【００１７】糸状菌は、真菌植物門の糸状体をすべて含
む真菌微生物を意味すると理解されるものである。この
門においては、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類及び叢生
菌類のような不完全菌類群が含まれる。その定義には次
の属：アスペルギルス属、トリコデルマ(Trichoderma)
属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ポドスポラ(Podos
pora) 属、エンドチア(Endothia)属、ムコール(Mucor)
属、コキオボラス(Cochiobolus) 属、ピリキュラリア(P
yricularia) 属、ペニシリウム(Penicillium)属及びフ
ミコーラ(Humicola)属が含まれる。本発明は、また、精
製及び単離アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４ｔｒに
関する。本形質転換株ＳＥ４ｔｒは株ＳＥ４から得られ
る。これは、ゲノムに組込まれたプラスミドｐＦＧＯＤ
を１コピー以上含む点でその株ＳＥ４と異なる。アスペ
ルギルス・ホエチダスＳＥ４は、アスペルギルス・ホエ
チダス株ＡＴＣＣ１４９１６から突然変異誘発によって
得られ、改良されたグルコアミラーゼ生産に基づいて選
ばれる。アスペルギルス・ホエチダスの名称は、アスペ
ルギルス・シトリカス(Aspergillus citricus)（アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクションによって発表
された工業的菌類のＡＴＣＣ名, 1994, p.120)と同義で
ある。Filamentous fungi are understood to mean fungal microorganisms which include all filamentous bodies of the phylum Fungal Plants. In this phyla there are imperfect fungal groups such as zygotes, ascomycetes, basidiomycetes and crowding fungi. The definition includes the following genera: Aspergillus, Trichoderma
Genus, Neurospora, Podos
pora), Endothia, Mucor
Genus, genus Cochiobolus, pyricularia (P
genus yricularia, genus Penicillium and genus Humicola. The invention also relates to purified and isolated Aspergillus foetidas strain SE4tr. This transformant strain SE4tr is obtained from strain SE4. This is the plasmid pFGOD integrated in the genome.
Differs from the strain SE4 in that it contains one or more copies of. Aspergillus foetidas SE4 was obtained by mutagenesis from Aspergillus foetidas strain ATCC 14916 and was selected on the basis of improved glucoamylase production. The name Aspergillus foetidas is synonymous with Aspergillus citricus (ATCC name for industrial fungi published by the American Type Culture Collection, 1994, p. 120).
【００１８】本発明は、また、グルコースオキシダーゼ
の細胞外生産方法であって、下記工程：グルコースオキ
シダーゼを発現及び分泌させる条件下、上記で定義され
た発現系を含む組込みベクターで細胞を形質転換する工
程、形質転換細胞を適切な培養基中で培養する工程、及
び分泌グルコースオキシダーゼを回収する工程を含むこ
とを特徴とする方法に関する。形質転換細胞を培養した
後得られた発酵培地は、ほとんどのグルコースオキシダ
ーゼを含んでいる。実際に、グルコースオキシダーゼは
実質的に形質転換株によって培養基に分泌される。本発
明の方法によって得られたグルコースオキシダーゼは細
胞外である。形質転換細胞を培養した後得られた発酵培
地は、カタラーゼをほとんど含まない。これは、実質的
にカタラーゼなしでグルコースオキシダーゼを含む酵素
組成物が得られることを可能にする。本発明は、また、
上記で定義された形質転換細胞によって産生されたグル
コースオキシダーゼに関する。The present invention also provides a method for extracellular production of glucose oxidase, which comprises the following steps: transforming cells with an integrative vector containing the expression system defined above under conditions for expressing and secreting glucose oxidase. And a step of culturing the transformed cell in a suitable culture medium, and a step of recovering secreted glucose oxidase. The fermentation medium obtained after culturing the transformed cells contains most of the glucose oxidase. In fact, glucose oxidase is essentially secreted by the transformants into the culture medium. The glucose oxidase obtained by the method of the present invention is extracellular. The fermentation medium obtained after culturing the transformed cells contains almost no catalase. This allows an enzyme composition comprising glucose oxidase to be obtained substantially without catalase. The present invention also provides
It relates to glucose oxidase produced by transformed cells as defined above.
【００１９】グルコースオキシダーゼは、例えば、食品
工業、医薬工業及び化学工業において多くの工業的応用
がある。特に、血液グルコースレベルを測定するのに用
いられ、その適用の場合診断用キットに組込まれる。本
発明により得られたグルコースオキシダーゼは、カタラ
ーゼで汚染されないので、その適用において有利であ
る。グルコース及び酸素濃度を測定するために、グルコ
ースオキシダーゼを用いることができる。グルコースオ
キシダーゼは、特に食品又は飲料において酸素又はグル
コースを除去するために酸化防止剤として用いられる。
グルコースオキシダーゼは、また、むし歯を予防するた
めに錬歯磨に加えられる。グルコースオキシダーゼは、
腐食を防止するために塗料に混合されてきた。本発明の
図面において用いられる記号及び略号を表１に説明す
る。Glucose oxidase has many industrial applications, for example in the food, pharmaceutical and chemical industries. In particular, it is used to measure blood glucose levels and, for that application, is incorporated into diagnostic kits. The glucose oxidase obtained according to the present invention is not contaminated with catalase, which is advantageous in its application. Glucose oxidase can be used to measure glucose and oxygen concentrations. Glucose oxidase is used as an antioxidant to remove oxygen or glucose, especially in foods or beverages.
Glucose oxidase is also added to toothpastes to prevent cavities. Glucose oxidase
It has been incorporated into paints to prevent corrosion. The symbols and abbreviations used in the drawings of the present invention are described in Table 1.
【００２０】[0020]
【表１】 表１ 記号略号 意味 ──────────────────────────────────── AMPR アンピシリン耐性を与える遺伝子 ORI 大腸菌中の複製起点 GOD アスペルギルス・ホエチダス ATCC 14916 グルコースオキシダーゼコ ード配列 5′GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼプロモーター 3′GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼターミネータ ー GA アスペルギルス・ホエチダス SE4 グルコーアミラーゼコード配列 ────────────────────────────────────[Table 1] Table 1 Symbol Abbreviation Meaning ──────────────────────────────────── AMPR Provides ampicillin resistance Gene ORI Origin of replication in Escherichia coli GOD Aspergillus foetidas ATCC 14916 Glucose oxidase code sequence 5′GA Aspergillus foetidas SE4 Glucoamylase promoter 3′GA Aspergillus foetidas SE4 Glucoamylase terminator GA Aspergillus foetidas SE4 Glucoamyl ───────────────────────────────────
【００２１】本発明は、下記実施例によって具体的に説
明される。The invention is illustrated by the examples below.
【００２２】[0022]
【実施例１】 アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコ
ースオキシダーゼコード配列の単離 麦芽エキス２％（重量／容量）、ペプトン(DIFCO) 0.１
％（重量／容量）及びグルコース２％（重量／容量）を
含有するＡＣＭ("アスペルギルス完全培地")液体栄養培
地上でアスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６
培養を調製する。３２℃で４８時間インキュベートした
後、菌糸体を収集する。GARBER, R.C.,YODER, O.L., An
al. Biochem. 135 (1983), p.416-422 に記載されてい
る方法に従って、アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ
１４９１６ゲノムＤＮＡを単離する。下記混合液を調製
する。 蒸留水 62 μl ＰＣＲバッファー（１０×） 10 μl ｄＮＴＰｓ（各2.５mM） 8 μl オリゴヌクレオチド配列番号１（２０μM) 5 μl オリゴヌクレオチド配列番号２（２０μM) 5 μl ゲノムＤＮＡ（１０-1〜１０-4希釈液) 10 μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl) 0.2 μl Example 1 Isolation of Aspergillus foetidas ATCC14916 glucose oxidase coding sequence Malt extract 2% (weight / volume), peptone (DIFCO) 0.1
% Aspergillus foetidas ATCC 14916 on ACM ("Aspergillus complete medium") liquid nutrient medium containing 2% w / v glucose and 2% w / v glucose.
Prepare the culture. After incubating at 32 ° C. for 48 hours, mycelium is collected. GARBER, RC, YODER, OL, An
al. Biochem. 135 (1983), p.416-422, according to the method described in Aspergillus hoetidas ATCC.
14916 genomic DNA is isolated. Prepare the following mixture. Distilled water 62 [mu] l PCR buffer (10 ×) 10 μl dNTPs (each 2.5 mM) 8 [mu] l oligonucleotide SEQ ID NO: 1 (20μM) 5 μl oligonucleotide SEQ ID NO: 2 (20μM) 5 μl genomic DNA (10 -1 ~10 - 4 diluted solution) 10 μl Taq polymerase (5 U / μl) 0.2 μl
【００２３】"(１０×）反応バッファー組成物”と呼ば
れるＰＣＲバッファー、ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰをすべて意味する略号ｄＮＴ
Ｐｓ及び産物Ｔａｑポリメラーゼは、名称"GENEAMP DNA
AMPLIFICATION REAGENT KITwith AMPLITAQ Recombinan
t Taq DNA Polymerase"(PERKIN ELMER CETUS)として販
売されているキットの小冊子に記載されている。アスペ
ルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６から単離さ
れたゲノムＤＮＡは、その混合液中１μg/μl の濃度で
用いられる。アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４
９１６グルコースオキシダーゼコード配列は、ＰＣＲ法
(SAIKI, R.K.ら, SCIENCE, 239 (1988), p.487-491に記
載されている“ポリメラーゼ連鎖反応" 法) に従って単
離した。本実験において用いられた合成オリゴヌクレオ
チド配列は次の通りである。PCR buffer, nucleotides dATP, dTT, referred to as "(10x) reaction buffer composition"
Abbreviation dNT meaning all P, dGTP and dCTP
Ps and the product Taq polymerase have the name "GENEAMP DNA
AMPLIFICATION REAGENT KIT with AMPLITAQ Recombinan
t Taq DNA Polymerase "(PERKIN ELMER CETUS) described in a booklet of the kit. Genomic DNA isolated from Aspergillus foetidas strain ATCC 14916 is used at a concentration of 1 μg / μl in the mixture. . Aspergillus hoetidas ATCC14
The 916 glucose oxidase coding sequence was determined by the PCR method.
(SAIKI, RK, et al., SCIENCE, 239 (1988), p.487-491, "Polymerase chain reaction" method). The synthetic oligonucleotide sequences used in this experiment are as follows.
【００２４】 配列番号１ 5′-TGATGATCAGGATCCG GCGGCCGCACCTCAGCAATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTT BamHI NotI GTG- 3′ 配列番号２ 5′-TCGATGAAGCTTCACTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATC - 3′ 配列番号３ 5′-GATGCTATCTTGGAAGATTATGCTTCCATGCAGTGAGTGAAGCTTCATCGA - 3′ HindIII 配列番号２の配列は、配列番号３の配列の補体である。
配列番号１のオリゴヌクレオチド配列は、ＢａｍＨＩ及
びＮｏｔＩ制限部位の情報、アスペルギルス・ホエチダ
スＳＥ４グルコアミラーゼの５′非翻訳領域及びグルコ
ースオキシダーゼコード配列の開始の情報を含む。配列
番号２のオリゴヌクレオチド配列及びその補体、配列番
号３のオリゴヌクレオチド配列は、グルコースオキシダ
ーゼコード配列の末端に対応するヌクレオチド及びＨｉ
ｎｄＩＩＩ制限部位の追加情報を含む。β−シアノエチ
ルホスホルアミダイトを用いてバイオサーチサイクロン
シンセサイザー装置で合成オリゴヌクレオチドを構築す
るために用いられる方法は、BEAUCAGE, S.L.ら (1981),
Tetrahedron Letters, 22, p.1859-1882 に記載されて
いる。[0024] SEQ ID NO: 1 5'-TGATGATCA GGATCC G GCGGCCGC ACCTCAGCAATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTT BamHI NotI GTG- 3 ' SEQ ID NO: 2 5'-TCGATGAAGCTTCACTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATC - 3' SEQ ID NO: 3 5'-GATGCTATCTTGGAAGATTATGCTTCCATGCAGTGAGTG AAGCTT CATCGA - 3 ' sequence of HindIII SEQ ID NO: 2, It is the complement of the sequence of SEQ ID NO: 3.
The oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 contains information for the BamHI and NotI restriction sites, the 5'untranslated region of Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase and the start of the glucose oxidase coding sequence. The oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and its complement, and the oligonucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 contain nucleotides and Hi corresponding to the end of the glucose oxidase coding sequence.
Contains additional information on the ndIII restriction site. The method used to construct synthetic oligonucleotides on a Biosearch Cyclone Synthesizer using β-cyanoethyl phosphoramidite is described in BEAUCAGE, SL et al. (1981),
Tetrahedron Letters, 22, p. 1859-1882.
【００２５】ＰＣＲに伴う条件は次の通りである：９５
℃で２分、次に９５℃で１分、６０℃で１分及び７２℃
で２分を含む連続３０サイクル、次に７２℃で１０分、
次に２０℃の温度が維持される。このＰＣＲに用いられ
る他のパラメーターはすべて名称"GENEAMP DNA AMPLIFI
CATION REAGENT KIT with AMPLITAQ Recombinant TaqDN
A Polymerase"(PERKIN ELMER CETUS)として販売されて
いるキットの小冊子に記載されているものに対応する。
約1.８kbのＤＮＡ断片（１kg＝１０００塩基対）を上記
のように単離した。これをThe Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802 に発表されて
いる配列と制限分析法(Molecular Cloning - a laborat
ory manual - MANIATIS ら, (Cold Spring Harbor Labo
ratory) 1982, p.374-379 に記載されている分析) を用
いて比較した。本質的な差異は見出されなかった。得ら
れたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、次いで前もってＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位で消化されたプラスミドｐＵＣ１８(CLONTECH
Laboratories, No. 6110-1) とMolecular Cloning - a
laboratolry manual - SAMBROOK ら, 2 ed., 1989, p.
1.68-1.69に記載されている連結法に従って連結する。
そのことによりベクターｐＵＣＧＯＤ（図１）が得られ
る。The conditions involved in PCR are as follows: 95
2 minutes at ℃, then 1 minute at 95 ℃, 1 minute at 60 ℃ and 72 ℃
30 cycles including 2 minutes at 72 ° C, then 10 minutes at 72 ° C,
Then a temperature of 20 ° C. is maintained. All other parameters used in this PCR are named "GENEAMP DNA AMPLIFI
CATION REAGENT KIT with AMPLITAQ Recombinant TaqDN
Corresponds to those listed in the kit booklet sold as A Polymerase "(PERKIN ELMER CETUS).
A DNA fragment of approximately 1.8 kb (1 kg = 1000 base pairs) was isolated as described above. This is The Journal of Biological
Chemistry, 1990, 265 (7), p.3793-3802, Sequence and Restriction Analysis (Molecular Cloning-a laborat
ory manual-MANIATIS et al., (Cold Spring Harbor Labo
ratory) 1982, p.374-379)). No essential difference was found. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and HindII.
Digested with I, then BamHI and HindI beforehand
The plasmid pUC18 (CLONTECH
Laboratories, No. 6110-1) and Molecular Cloning-a
laboratolry manual-SAMBROOK et al., 2 ed., 1989, p.
Connect according to the connection method described in 1.68-1.69.
This gives the vector pUCGOD (Fig. 1).
【００２６】[0026]
【実施例２】プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴの構築 プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴ（図４）は、ＮｏｔＩクロ
ーン化部位がグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターと
コード部分との間に作成され、ＨｉｎｄＩＩＩクローン
化部位がグルコアミラーゼ遺伝子のコード部分とターミ
ネーターとの間に作成されているアスペルギルス・ホエ
チダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子を含む。これらの
２つのクローン化部位、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩは
下記のように突然変異誘発によって作成される。下記の
説明に従って、アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グル
コアミラーゼ遺伝子を単離する。実施例１で記載したGA
RBERらの方法に従って、アスペルギルス・ホエチダス株
ＳＥ４染色体ＤＮＡを単離する。この単離染色体ＤＮＡ
を制限酵素ＳａｕＩＩＩＡで部分的に消化し、サイズが
８〜１０kbの断片を AUSUBEL, F.M.ら (1989), Current
Protocols in Molecular Biology (John WILLEY & Son
s), p.5.3.2-5.3.8 に記載されている方法に従ってショ
糖勾配を用いて単離及び精製する。これらの単離及び精
製断片を、前もって制限酵素ＢａｍＨＩで消化されたプ
ラスミドｐＢＲ３２２ (CLONTECH LABORATORIES カタロ
グ No.6210-1) に導入する。次いで大腸菌株ＤＨ５α(H
ANAHAN, D., J. Mol. Biol. (1983) 166, p.557-580 に
記載され、BETHESDA RESEARCH LABORATORIES (BRL), B.
R.L. Focus (1986) 8, p.9で販売されている) を形質転
換する。Example 2 Construction of Plasmid pFGA2MUT In the plasmid pFGA2MUT (FIG. 4), the NotI cloning site was created between the promoter and the coding part of the glucoamylase gene, and the HindIII cloning site was the coding part and terminator of the glucoamylase gene. And the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase gene which has been created between These two cloning sites, NotI and HindIII, are created by mutagenesis as described below. The Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase gene is isolated as described below. GA described in Example 1
Aspergillus foetidas strain SE4 chromosomal DNA is isolated according to the method of RBER et al. This isolated chromosomal DNA
Was partially digested with the restriction enzyme SauIIIA, and a fragment with a size of 8 to 10 kb was digested with AUSUBEL, FM et al.
Protocols in Molecular Biology (John WILLEY & Son
s), isolation and purification using a sucrose gradient according to the method described in p.5.3.2-5.3.8. These isolated and purified fragments are introduced into the plasmid pBR322 (CLONTECH LABORATORIES Catalog No. 6210-1) which had been digested with the restriction enzyme BamHI in advance. Then E. coli strain DH5α (H
ANAHAN, D., J. Mol. Biol. (1983) 166, p. 557-580, BETHESDA RESEARCH LABORATORIES (BRL), B.
RL Focus (1986), sold on page 9).
【００２７】約１5,０００の形質転換大腸菌クローン
を、下記合成オリゴヌクレオチド（配列番号４）を用い
てハイブリッド形成法 (SAMBROOKら, p.9.52-9.55)によ
ってスクリーンする。 5′-GATTCATGGTTGAGCAACGAAGCGA - 3′ 選択は、BOELら, EMBO J. 3 (1984), p.1097-1102 に発
表されたグルコアミラーゼヌクレオチド配列に基づく。
このオリゴヌクレオチドを用いてハイブリッド形成する
コロニーを単離する。制限部位を分析し、この株が完全
グルコアミラーゼ遺伝子、即ちプロモーター、ターミネ
ーター及びコード領域並びに分泌シグナルを含むことが
わかる。8.７kbの断片をＢａｍＨＩ部位のプラスミドｐ
ＢＲ３２２に上記のように導入した。そのことにより、
8.７kbのアスペルギルスＤＮＡ挿入断片を含むベクター
ｐＦＧＡ１（図２）が作成される。この挿入断片はプラ
スミドｐＢＲ３２２とベクターｐＦＧＡ１との間の唯一
の相違である。Approximately 15,000 transformed E. coli clones are screened by the hybridization method (SAMBROOK et al., P. 9.52-9.55) using the synthetic oligonucleotide (SEQ ID NO: 4) below. The 5'-GATTCATGGTTGAGCAACGAAGCGA-3 'selection is based on the glucoamylase nucleotide sequence published in BOEL et al., EMBO J. 3 (1984), p.1097-1102.
Colonies that hybridize with this oligonucleotide are isolated. Analysis of the restriction sites reveals that this strain contains the complete glucoamylase gene, namely the promoter, terminator and coding regions and the secretion signal. The 8.7 kb fragment was used as a plasmid p at the BamHI site.
Introduced into BR322 as described above. By that,
A vector pFGA1 (FIG. 2) containing the 8.7 kb Aspergillus DNA insert is created. This insert is the only difference between plasmid pBR322 and vector pFGA1.
【００２８】ベクターｐＦＧＡ１由来でありかつベクタ
ーｐＦＧＡ１より小さな挿入断片を含むプラスミドは次
のように構築される。ベクターｐＦＧＡ１を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、次いでこの消化物からアスペルギル
ス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター、
コード領域及びターミネーターを含むサイズが約５kbの
ＥｃｏＲＩ断片を ZHUら, 1985によって記載された方法
に従って単離する。次いでこのＥｃｏＲＩ断片を、前も
って制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１
８に挿入する。そのことによりベクターｐＦＧＡ２（図
３）が作成される。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーターのヌ
クレオチド配列をSANGERら (1977) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, p.5463-5467のジデオキシヌクレオチド鎖
終結法によって求めた。この配列の分析により、プロモ
ーター及びターミネーターの存在が示される。アスペル
ギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモター
をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）が同定さ
れる。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラ
ーゼターミネーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号８）が同定される。A plasmid derived from the vector pFGA1 and containing an insert smaller than the vector pFGA1 is constructed as follows. Restriction enzyme E for vector pFGA1
digested with coRI and then from this digest the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter,
An EcoRI fragment of about 5 kb in size containing the coding region and terminator is isolated according to the method described by ZHU et al., 1985. This EcoRI fragment was then digested with the plasmid pUC1 previously digested with the restriction enzyme EcoRI.
Insert in 8. This creates the vector pFGA2 (Fig. 3). Aspergillus hoetidas SE4
The nucleotide sequences of the glucoamylase promoter and terminator are described in SANGER et al. (1977) Proc. Natl. Acad.
Determined by the dideoxynucleotide chain termination method of Sci. USA 74, p.5463-5467. Analysis of this sequence shows the presence of promoters and terminators. The nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter is identified. The nucleotide sequence encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator (SEQ ID NO: 8) is identified.
【００２９】図６及び図７は、アスペルギルス・ホエチ
ダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモターをコードするヌ
クレオチド配列を示すものである。図８は、アスペルギ
ルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼターミネータ
ーをコードするヌクレオチド配列を示すものである。Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼによる伸長配列を開始するために
用いられる合成オリゴヌクレオチドは、BEAUCAGEら (19
81) Tetrahedron letters 22, p.1859-1882の方法によ
って合成された。配列決定は、配列決定キット(PHARMAC
IA) の供給会社によって作成されたプロトコールに従っ
て行い、ＮａＯＨ処理によって二本鎖ＤＮＡの変性を行
った。配列決定法は、SAMBROOK, 1989, p.13.15 & 13.1
7 に記載されている。SAMBROOK, 1989, p.13.45-13.58
に記載されている方法に従ってポリアクリルアミド配列
決定ゲルを調製した。FIGS. 6 and 7 show the nucleotide sequence encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter. FIG. 8 shows the nucleotide sequence encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator. T
Synthetic oligonucleotides used to initiate extension sequences by 7 DNA polymerase are described by BEAUCAGE et al.
81) Tetrahedron letters 22, synthesized by the method of p. 1859-1882. Sequencing is performed using the sequencing kit (PHARMAC
The double-stranded DNA was denatured by NaOH treatment according to the protocol prepared by the supplier of IA). Sequencing method is SAMBROOK, 1989, p.13.15 & 13.1
It is described in 7. SAMBROOK, 1989, p.13.45-13.58
A polyacrylamide sequencing gel was prepared according to the method described in.
【００３０】プラスミドｐＦＧＡ２に由来しかつプロモ
ーター及びターミネーターがＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限部位によってコード部分から離れているアスペル
ギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子を含
むプラスミドを下記のように構築する。そのことによ
り、プロモーターとターミネーターを含むプラスミドｐ
ＦＧＡ２内に２つの制限部位、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩが作成される。アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４
グルコアミラーゼプロモーター及びターミネーターは、
突然変異誘発キット(BIORAD)"MUTA-GENE PHAGEMID in v
itro MutagenesisKit" の技術的小冊子に記載されてい
る手順による２つの特定突然変異誘発によって作成され
たＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によって分けら
れる。この手順で用いられる合成オリゴヌクレオチド
は、各々次の配列番号５及び配列番号６である。 5′- GCCTGAGCTTCATCCCCAGCGCGGCCGCATCATTACACCTCAGCAATGT - 3′ NotI 5′- TGACTGACACCTGGCGGTGAAAGCTTCAATCAATCCATTTCGCTATAGTT - 3′ HindIII そのことにより、グルコアミラーゼ遺伝子の５′非翻訳
領域の始めにＮｏｔＩ制限部位及び停止コドンの後かつ
グルコアミラーゼの３′非翻訳領域にＨｉｎｄＩＩＩ切
断部位を含むベクターｐＦＧＡ２ＭＵＴが得られる。Derived from the plasmid pFGA2 and contains promoters and terminators NotI and HindII.
A plasmid containing the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase gene separated from the coding portion by an I restriction site is constructed as follows. As a result, a plasmid p containing a promoter and a terminator
Two restriction sites in FGA2, NotI and HindI
II is created. Aspergillus hoetidas SE4
The glucoamylase promoter and terminator are
Mutagenesis kit (BIORAD) "MUTA-GENE PHAGEMID in v
It is divided by NotI and HindIII restriction sites created by two specific mutagenesis procedures described in the technical booklet "itro Mutagenesis Kit". The synthetic oligonucleotides used in this procedure are SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 5'-GCCTGAGCTTCATCCCCAGC GCGGCCGC ATCATTACACCTCAGCAATGT -3 'NotI 5'-TGACTGACACCTGGCGGTGA AAGCTT CAATCAATCCATTTCGCTATAGTT-3'HindIII Therefore, a NotI restriction site at the beginning of the 5'untranslated region of the glucoamylase gene and a NotI restriction site. Moreover, a vector pFGA2MUT containing a HindIII cleavage site in the 3'untranslated region of glucoamylase is obtained.
【００３１】[0031]
【実施例３】組込みベクターの構築 実施例１で得られたプラスミドｐＵＣＧＯＤを２つの制
限酵素ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、グル
コースオキシダーゼコード配列及びアスペルギルス・ホ
エチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子の５′非翻訳領
域を含む断片をZHU, J.D.ら, BIO/TECHNOLOGY, 3, 198
5, p.1014-1016に記載されている方法に従って単離す
る。制限酵素によるプラスミドの部分及び完全消化は、
SAMROOKら, 1989, Chap.5.28-5.32 に記載されている
方法に従って行った。この断片を実施例２で得られたプ
ラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
クローン化部位に導入する。このプラスミドは、特定部
位突然変異誘発で作成されたＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩ
Ｉクローン化部位によって分かれたアスペルギルス・ホ
エチダスＳＥ４グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター
とターミネーターを含む。従って、グルコアミラーゼコ
ード部分はグルコースオキシダーゼコード部分に置き換
わる。Example 3 Construction of Integrating Vector After digesting the plasmid pUCGOD obtained in Example 1 with two restriction enzymes NotI and HindIII, the glucose oxidase coding sequence and the 5 ′ untranslated region of the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase gene were removed. Fragments containing ZHU, JD et al, BIO / TECHNOLOGY, 3, 198
5, isolated according to the method described in p.1014-1016. Partial and complete digestion of plasmids with restriction enzymes
It was performed according to the method described in SAMROOK et al., 1989, Chap. 5.28-5.32. This fragment was used for NotI-HindIII of the plasmid pFGA2MUT obtained in Example 2.
Introduce into the cloning site. This plasmid contains NotI and HindII generated by site-directed mutagenesis.
It contains the promoter and terminator of the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase gene separated by the I cloning site. Therefore, the glucoamylase coding portion replaces the glucose oxidase coding portion.
【００３２】そのことにより、ベクターｐＦＧＯＤ（図
５）が得られる。このベクターｐＦＧＯＤは、アスペル
ギルス・ホエチダスグルコアミラーゼ転写シグナルの調
節によって、それ自体の分泌シグナルを含むグルコース
オキシダーゼコード配列を含んでいる。このベクターは
下記配列を含む発現系を含んでいる。アスペルギルス・
ホエチダスＳＥ４グルコアミラーゼプロモーター配列、
アスペルギルス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコ
ースオキシダーゼ分泌シグナル配列、成熟アスペルギル
ス・ホエチダスＡＴＣＣ１４９１６グルコースオキシダ
ーゼ配列、及びアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グル
コアミラーゼターミネーター配列。This gives the vector pFGOD (FIG. 5). This vector pFGOD contains a glucose oxidase coding sequence which contains its own secretory signal by regulation of the Aspergillus foetidas glucoamylase transcription signal. This vector contains an expression system containing the following sequences. Aspergillus
Foetidas SE4 glucoamylase promoter sequence,
Aspergillus foetidas ATCC14916 glucose oxidase secretion signal sequence, mature Aspergillus foetidas ATCC14916 glucose oxidase sequence, and Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator sequence.
【００３３】[0033]
【実施例４】アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４の形質転換 アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４は、アスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６に由来する。アス
ペルギルス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６をまず P
ONTECORVO, G., ROPER, J.A., HEMMONS, L.M., MACDONA
LD, K.D., BUFTON, A.W.J., Advances inGenetics 5 (1
953), p.141-238に記載されている方法に従って紫外線
による突然変異誘発処理に供する。デンプン（５％重量
／容量）を加えた寒天栄養培地 POTATO DEXTROSE AGAR
(DIFCO)上にこの処理株を播く。３２℃で４８時間イン
キュベートした後、デンプン加水分解の最大ハロを示す
コロニーを取り出し、寒天栄養培地で継代培養する。大
量のグルコアミラーゼを生産する菌株を単離する。ＳＥ
４と称するこの菌株は薄茶色の分生子を有する。次い
で、ベクターｐＦＧＯＤを、CARREZら, GENE, 94 (199
0), p.147-154に記載されている方法による共形質転換
でアスペルギルス・ホエチダスＳＥ４に導入する。アス
ペルギルス・ニドゥランス アセトアミダーゼ遺伝子
（ａｍｄＳ）を含むプラスミドｐ３ＳＲ２を選択マーカ
ーとして用いる。Example 4 Transformation of Aspergillus foetidas Strain SE4 Aspergillus foetidas strain SE4 is derived from Aspergillus foetidas strain ATCC14916. Aspergillus hoetidas strain ATCC14916 first P
ONTECORVO, G., ROPER, JA, HEMMONS, LM, MACDONA
LD, KD, BUFTON, AWJ, Advances inGenetics 5 (1
953), p.141-238. Agar nutrient medium POTATO DEXTROSE AGAR supplemented with starch (5% weight / volume)
This treated strain is plated on (DIFCO). After incubating at 32 ° C. for 48 hours, the colonies showing the maximum halo of starch hydrolysis are picked and subcultured on an agar nutrient medium. A strain producing a large amount of glucoamylase is isolated. SE
This strain, designated 4, has light brown conidia. The vector pFGOD was then added to CARREZ et al., GENE, 94 (199
0), p.147-154 and introduced into Aspergillus foetidas SE4 by cotransformation. The plasmid p3SR2 containing the Aspergillus nidulans acetamidase gene (amdS) is used as a selectable marker.
【００３４】プラスミドｐ３ＳＲ２は、Hynes, M.J., C
orrick, C.M., King, J.A., Mol. Cell. Biol., 3 (198
3), p.1430-1439 に記載されている。形質転換は、KELL
Y, J.M., HYNES, M.J., EMBO J. 4 (1985), p.475-479
に記載されている方法に従ってこのプラスミドを用いて
行われる。アスペルギルス・ホエチダス株ＳＥ４を等モ
ル量のプラスミドｐ３ＳＲ２及びｐＦＧＯＤで形質転換
した。約３５０の形質転換株が得られる。これらの形質
転換株をＡＢＴＳ(BOEHRINGER)を含有する寒天培地Ａに
選択してグルコースオキシダーゼの生産を検出する。グ
ルコースオキシダーゼを培養基に分泌する形質転換株の
コロニーは、３２℃で２時間インキュベートした後、グ
リーンハロに囲まれている。培地Ａは、グルコース１０
％（重量／容量）、ＡＢＴＳ（2,２′−アジノビス（３
−エチルベンズチアゾリンスルホネート))(BOEHRINGER)
0.０５％（重量／容量）及びホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（プルプロガリン４６単位／mg,SIGMA)を加
える CZAPEK DOX AGAR培地(DIFCO) から構成されてい
る。約４０％の形質転換株がグルコースオキシダーゼを
分泌する。従って、それらのゲノムに選択しうるベクタ
ーｐ３ＳＲ２及び組込みベクターｐＦＧＯＤが組込まれ
た。The plasmid p3SR2 contains Hynes, MJ, C
orrick, CM, King, JA, Mol. Cell. Biol., 3 (198
3), p.1430-1439. Transformation is KELL
Y, JM, HYNES, MJ, EMBO J. 4 (1985), p.475-479
This plasmid is used according to the method described in. Aspergillus foetidas strain SE4 was transformed with equimolar amounts of plasmids p3SR2 and pFGOD. About 350 transformants are obtained. These transformants are selected on agar medium A containing ABTS (BOEHRINGER) to detect the production of glucose oxidase. Colonies of transformants that secrete glucose oxidase into the culture medium are surrounded by green halo after incubation at 32 ° C. for 2 hours. Medium A is glucose 10
% (Weight / volume), ABTS (2,2'-azinobis (3
-Ethylbenzthiazoline sulfonate)) (BOEHRINGER)
It is composed of CZAPEK DOX AGAR medium (DIFCO) supplemented with 0.05% (weight / volume) and horseradish peroxidase (46 units / mg of purpurogallin, SIGMA). About 40% of the transformants secrete glucose oxidase. Therefore, the selectable vector p3SR2 and the integration vector pFGOD were integrated into their genome.
【００３５】[0035]
【実施例５】形質転換株の単離及び精製 最大ハロを示す形質転換株を単離し、寒天培地 POTATO
DEXTROSE AGAR(DIFCO)上で継代培養する。胞子形成が行
われるまでこの培地上３２℃で５０の形質転換株を培養
する。胞子を収集し、生理的溶液に希釈し、次いで個々
のコロニーが得られるようにして寒天培地Ａ上に播く。
単一胞子に由来しかつ幅広いハロを示すコロニーを寒天
培地 POTATO DEXTROSE AGAR 上で継代培養する。これら
のコロニーを、胞子形成が行われるまでこの寒天培地上
３２℃で培養する。形質転換株の精製分生子を回収及び
保存する。これらのアスペルギルス・ホエチダス形質転
換株をＳＥ４ｔｒと称する。Example 5 Isolation and Purification of Transformant A transformant showing the maximum halo was isolated and agar medium POTATO.
Subculture on DEXTROSE AGAR (DIFCO). 50 transformants are cultivated on this medium at 32 ° C. until sporulation takes place. Spores are harvested, diluted in physiological solution and then plated on agar A so that individual colonies are obtained.
Colonies derived from a single spore and showing a broad halo are subcultured on the agar medium POTATO DEXTROSE AGAR. These colonies are cultivated at 32 ° C. on this agar until sporulation occurs. Purified conidia of the transformant are collected and stored. These Aspergillus foetidas transformants are called SE4tr.
【００３６】[0036]
【実施例６】 形質転換部アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４ｔｒによ
るグルコースオキシダーゼの生産 実施例５で得られた精製分生子を麦芽エキス(DIFCO)(２
重量％）、ペプトン(DIFCO)(0.１重量％）、加水分解デ
ンプン（１０重量％）及び炭酸カルシウム（3.５重量
％）を含有する豊富な液体培地中で培養する。培養基の
ｐＨをアンモニアを加えてｐＨ６に調整する。３２℃で
攪拌しながら培養し、５日間モニターする。次いで、得
られた培養を5,０００rpm で１５分間遠心する(BECKMAN
JA-10) 。細胞を液体窒素で凍結したバイオマスを粉砕
することにより破壊及び切断した後のバイオマス（いわ
ゆる細胞内生産）及び上清（いわゆる細胞外生産）につ
いてFIEDUREK, J.ら, Enzyme Microb. Technol. 8 (198
6), p.734-736 に記載されている方法に従って酵素（グ
ルコースオキシダーゼ）活性を測定する。EXAMPLE 6 Transformation unit Aspergillus foetidus SE4tr by glucose oxidase production obtained in Example 5 Purification conidia malt extract (DIFCO) (2
%), Peptone (DIFCO) (0.1% by weight), hydrolyzed starch (10% by weight) and calcium carbonate (3.5% by weight). The pH of the culture medium is adjusted to pH 6 by adding ammonia. Incubate at 32 ° C. with agitation and monitor for 5 days. The resulting culture is then centrifuged at 5,000 rpm for 15 minutes (BECKMAN
JA-10). Regarding the biomass (so-called intracellular production) and the supernatant (so-called extracellular production) after breaking and cutting by crushing the biomass in which cells are frozen with liquid nitrogen, FIEDUREK, J. et al., Enzyme Microb. Technol. 8 (198
6), Enzyme (glucose oxidase) activity is measured according to the method described in p.734-736.
【００３７】得られた酵素活性の結果をアスペルギルス
・ホエチダス（ＳＥ４株）の非形質転換株と比較する。
形質転換株（ＳＥ４株）の細胞内グルコースオキシダー
ゼ生産は非形質転換株（ＳＥ４株）と比べて５〜１０倍
であり、細胞外生産は５０００〜１0,０００倍である。
細胞外グルコースオキシダーゼ生産の大きな増加が認め
られる。実際に、形質転換株は培養基に産生するグルコ
ースオキシダーゼのほとんど全部を分泌する。非形質転
換株によって産生されたグルコースオキシダーゼは、ほ
とんど培養基に分泌されない。即ち、非形質転換株の細
胞の切断段階はグルコースオキシダーゼを回収するため
に必須であるが、本発明による形質転換株にとっては必
要でない。形質転換株ＳＥ４ｔｒによるグルコースオキ
シダーゼ生産は、実質的に細胞外である。更に、形質転
換株ＳＥ４ｔｒを培養した後に得られた発酵培地の上清
にはカタラーゼがほとんど検出されない。The obtained enzyme activity results are compared with those of non-transformed Aspergillus foetidas (SE4 strain).
The intracellular glucose oxidase production of the transformed strain (SE4 strain) is 5 to 10 times higher than that of the non-transformed strain (SE4 strain), and the extracellular production is 5000 to 10,000 times higher.
A large increase in extracellular glucose oxidase production is observed. In fact, the transformants secrete almost all of the glucose oxidase produced in the culture medium. Glucose oxidase produced by the non-transformed strain is scarcely secreted into the culture medium. That is, the cell cleavage step of the non-transformed strain is essential for recovering glucose oxidase, but is not necessary for the transformed strain according to the present invention. Glucose oxidase production by the transformant SE4tr is substantially extracellular. Furthermore, catalase is hardly detected in the supernatant of the fermentation medium obtained after culturing the transformant SE4tr.
【００３８】[0038]
【実施例７】 形質転換株ＳＥ４ｔｒによって産生されたグルコースオ
キシダーゼ活性の、ｐＨの関数としてのプロファイル グルコースオキシダーゼの酵素活性を、バッファー中２
５℃の温度の種々のｐＨ値（3.５〜9.０）で測定する。
適用条件は実施例６で記載したものである。実施例６で
得られた上清を使用する。この上清をｐＨ及び酵素活性
に応じて蒸留水に、次にｐＨ範囲3.５〜5.５の場合0.１
M クエン酸塩／リン酸塩バッファーに及びｐＨ6.０〜9.
０の場合0.１M ＫＨ2 ＰＯ4/Ｋ2 ＨＰＯ4 バッファーに
希釈する。2.５mlの基質水溶液を５０μl の希釈上清に
２５℃において加える。基質水溶液は、グルコース１０
％（重量／容量）、ＡＢＴＳ0.０５％（重量／容量）及
びホースラディッシュペルオキシダーゼ１２mg/lを含有
する。基質水溶液のｐＨを、ｐＨ範囲3.５〜5.５の場合
0.１M クエン酸塩／リン酸塩バッファーで又はｐＨ6.０
〜9.０の場合0.１M ＫＨ2 ＰＯ4/Ｋ2 ＨＰＯ4 バッファ
ーで調整する。２分間インキュベートした後、４２０nm
の吸光度を測定する。結果を表２に示す。この試験で、
ｐＨ約5.５及び温度２５℃に置いた試料の最大酵素活性
を測定した。定義上この試料を相対活性１００％とし
た。本実施例は、約4.０〜約7.０のｐＨ範囲において約
２５℃の温度で測定したグルコースオキシダーゼの酵素
活性が最適であることを示すものである。Example 7 Profile of Glucose Oxidase Activity Produced by Transformant SE4tr as a Function of pH
It is measured at various pH values (3.5 to 9.0) at a temperature of 5 ° C.
The applicable conditions are as described in Example 6. The supernatant obtained in Example 6 is used. This supernatant was added to distilled water depending on pH and enzyme activity, and then 0.1 for pH range 3.5-5.5.
M citrate / phosphate buffer and pH 6.0-9.
In case of 0, it is diluted with 0.1M KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 buffer. Add 2.5 ml of aqueous substrate solution to 50 μl of diluted supernatant at 25 ° C. The substrate aqueous solution is glucose 10
% (Weight / volume), ABTS 0.05% (weight / volume) and horseradish peroxidase 12 mg / l. When the pH of the aqueous substrate solution is in the pH range of 3.5 to 5.5
With 0.1M citrate / phosphate buffer or pH 6.0
For ~ 9.0 Adjust with 0.1 M KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 buffer. After incubating for 2 minutes, 420nm
The absorbance of is measured. The results are shown in Table 2. In this test,
The maximum enzyme activity of a sample placed at a pH of about 5.5 and a temperature of 25 ° C. was measured. By definition, this sample had a relative activity of 100%. This example demonstrates that the enzymatic activity of glucose oxidase measured at a temperature of about 25 ° C. in the pH range of about 4.0 to about 7.0 is optimal.
【００３９】[0039]
【表２】 表２ 産生グルコースオキシダーゼの相対活性 % pH 非形質転換株 形質転換株 ──────────────────────────────────── 3.5 47 43 4.0 69 66 5.0 98 99 5.5 100 100 6.0 98 98 6.5 88 86 7.0 67 63 8.0 34 30 8.5 14 14 9.0 9 8 ────────────────────────────────────[Table 2] Table 2 Relative activity of glucose oxidase produced% pH Non-transformed strain Transformed strain ────────────────────────────── ─────── 3.5 47 43 4.0 69 66 5.0 98 99 5.5 100 100 6.0 98 98 6.5 88 86 7.0 67 63 8.0 34 30 8.5 14 14 9.0 9 8 ────────────── ───────────────────────
【００４０】形質転換株によって産生されたグルコース
オキシダーゼ活性の、ｐＨの関数としてのプロファイル
は、非形質転換株によって産生されたグルコースオキシ
ダーゼ、即ち未変性酵素と同じである。The profile of glucose oxidase activity produced by the transformed strains as a function of pH is the same as the glucose oxidase produced by the non-transformed strains, ie the native enzyme.
【００４１】[0041]
【実施例８】 形質転換株ＳＥ４ｔｒによって産生されたグルコースオ
キシダーゼ活性の、温度の関数としてのプロファイル グルコースオキシダーゼの酵素活性を、0.１M ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4/Ｋ2 ＨＰＯ4 バッファー中ｐＨ6.０において種々の
温度（２０〜５０℃）で測定する。適用条件は実施例６
で記載したものである。実施例６で得られた上清を使用
する。この上清をｐＨ及び酵素活性に応じて蒸留水に、
次に0.１M ＫＨ2 ＰＯ4/Ｋ2 ＨＰＯ4 バッファーに希釈
する。2.５mlの基質水溶液を５０μl の希釈上清に２５
℃において加える。基質水溶液は、グルコース１０％
（重量／容量）、ＡＢＴＳ0.０５％（重量／容量）及び
ホースラディッシュペルオキシダーゼ１２mg/lを含有す
る。基質水溶液のｐＨを、ｐＨ6.０に0.１M ＫＨ2 ＰＯ
4/Ｋ2 ＨＰＯ4 バッファーで調整する。混合する前に、
基質水溶液と希釈上清を所望の温度に加熱する。２分間
インキュベートした後、４２０nmの吸光度を測定する。
結果を表３に示す。この試験で、ｐＨ約6.０及び温度３
５℃に置いた試料の最大酵素活性を測定した。定義上こ
の試料を相対活性１００％とした。本実施例は、約２０
〜約５０℃の温度範囲においてｐＨ約6.０で測定したグ
ルコースオキシダーゼの酵素活性が最適であることを示
すものである。Example 8 Profile of Glucose Oxidase Activity Produced by Transformant SE4tr as a Function of Temperature The enzymatic activity of glucose oxidase was determined to be 0.1 M KH 2 P.
It is measured at various temperatures (20 to 50 ° C.) in O 4 / K 2 HPO 4 buffer at pH 6.0. Application conditions are Example 6
It was described in. The supernatant obtained in Example 6 is used. This supernatant is added to distilled water according to pH and enzyme activity,
Then dilute in 0.1 M KH 2 PO 4 / K 2 HPO 4 buffer. 25 ml of 2.5 ml aqueous substrate solution is added to 50 μl of diluted supernatant.
Add at ° C. Substrate aqueous solution is 10% glucose
(Weight / volume), ABTS 0.05% (weight / volume) and horseradish peroxidase 12 mg / l. The pH of the substrate aqueous solution was adjusted to pH 6.0 with 0.1 M KH 2 PO.
Adjust with 4 / K 2 HPO 4 buffer. Before mixing
The aqueous substrate solution and diluted supernatant are heated to the desired temperature. After incubating for 2 minutes, the absorbance at 420 nm is measured.
The results are shown in Table 3. In this test, a pH of about 6.0 and a temperature of 3
The maximum enzyme activity of the sample placed at 5 ° C was measured. By definition, this sample had a relative activity of 100%. In this embodiment, about 20
It shows that the enzyme activity of glucose oxidase measured at a pH of about 6.0 in the temperature range of about 50 ° C. is optimum.
【００４２】[0042]
【表３】 表３ 産生グルコースオキシダーゼの相対活性 % 温度 非形質転換株 形質転換株 ──────────────────────────────────── 20 79 82 30 99 99 35 100 100 40 99 97 50 83 76 ────────────────────────────────────Table 3 Relative activity of glucose oxidase produced% Temperature Non-transformed strain Transformed strain ────────────────────────────── ─────── 20 79 82 30 99 99 35 100 100 40 99 97 50 83 76 ──────────────────────────── ────────
【００４３】形質転換株によって産生されたグルコース
オキシダーゼ活性の、温度の関数としてのプロファイル
は、非形質転換株によって産生されたグルコースオキシ
ダーゼ、即ち未変性酵素と同じである。実施例７及び８
は、形質転換株によって産生されたグルコースオキシダ
ーゼの特徴が非形質転換株によって産生されたグルコー
スオキシダーゼと同じであることを示すものである。The profile of glucose oxidase activity produced by the transformed strains as a function of temperature is the same as the glucose oxidase produced by the non-transformed strains, ie the native enzyme. Examples 7 and 8
Indicates that the glucose oxidase produced by the transformed strain has the same characteristics as the glucose oxidase produced by the non-transformed strain.
【００４４】[0044]
配列番号：１ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TGATGATCAG GATCCGGCGG CCGCACCTCA GCAATGCAGA CTCTCCTTGT GAGCTCGCTT 60 GTG 63 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 63 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence TGATGATCAG GATCCGGCGG CCGCACCTCA GCAATGCAGA CTCTCCTTGT GAGCTCGCTT 60 GTG 63
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TCGATGAAGC TTCACTCACT GCATGGAAGC ATAATCTTCC AAGATAGCAT C 51SEQ ID NO: 2 Sequence length: 51 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence TCGATGAAGC TTCACTCACT GCATGGAAGC ATAATCTTCC AAGATAGCAT C 51
【００４６】配列番号：３ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GATGCTATCT TGGAAGATTA TGCTTCCATG CAGTGAGTGA AGCTTCATCG A 51SEQ ID NO: 3 Sequence length: 51 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence GATGCTATCT TGGAAGATTA TGCTTCCATG CAGTGAGTGA AGCTTCATCG A 51
【００４７】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GATTCATGGT TGAGCAACGA AGCGA 25SEQ ID NO: 4 Sequence length: 25 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence GATTCATGGT TGAGCAACGA AGCGA 25
【００４８】配列番号：５ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 GCCTGAGCTT CATCCCCAGC GCGGCCGCAT CATTACACCT CAGCAATGT 49SEQ ID NO: 5 Sequence length: 49 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence GCCTGAGCTT CATCCCCAGC GCGGCCGCAT CATTACACCT CAGCAATGT 49
【００４９】配列番号：６ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列 TGACTGACAC CTGGCGGTGA AAGCTTCAAT CAATCCATTT CGCTATAGTT 50SEQ ID NO: 6 Sequence length: 50 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic oligonucleotide Sequence TGACTGACAC CTGGCGGTGA AAGCTTCAAT CAATCCATTT CGCTATAGTT 50
【００５０】配列番号：７ 配列の長さ：２０４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 GAATTCCCGA CATCGGTCAT TGGCCTCCTC GCTGATCTCC CTTTGGTACA GTCGGCTACC 60 AATGCTCTCG AGGATTGCCT GAACATTGAC ATTCGGCGTC CGGCCGGGAC CACCGCGGAC 120 TCGAAGCTGC CTGTGCTGGT CTGGATCTTT GGCGGAGGCT TTGAACTTGG TTCAAAGGCG 180 ATGTATGATG GTACAACGAT GGTATCATCG TCGATAGACA AGAACATGCC TATCGTGTTT 240 GTAGCAATGA ATTATCGCGT GGGAGGTTTC GGGTTCTTGC CCGGAAAGGA GATCCTGGAG 300 GACGGGTCCG CGAACCTAGG GCTCCTGGAC CAACGCCTTG CCCTGCAGTG GGTTGCCGAC 360 AACATCGAGG CCTTTGGTGG AGACCCGGAC AAGGTGACGA TTTGGGGAGA ATCAGCAGGA 420 GCCATTCGTT TGACTAGATG ACTTGTACGA CGGAAACATC ACTTACAAGG ATAAGCCCTT 480 GTTCCGGGGG GCCATCATGG ACTCCGGTAG TGTTGTTCCC GCAGACCCCG TCGATGGGGT 540 CAAGGGACAG CAAGTATATG ATGCGGTAGT GGAATCTGCA GGCTGTTCCT CTTCTAACGA 600 CACCCTAGCT TGTCTGCGTG AACTAGACTA CACCGACTTC CTCAATGCGG CAAACTCCGT 660 GCCAGGCATT TTAAGCTACC ATTCTGTGGC GTTATCATAT GTGCCTCGAC CGGACGGGAC 720 GGCGTTGTCG GCATCACCGG ACGTTTTGGG CAAAGCAGGG AAATATGCTC GGGTCCCGTT 780 CATCGTGGGC GACCAAGAGG ATGAGGGGAC CTTATTCGCC TTGTTTCAGT CCAACATTAC 840 GACGATCGAC GAGGTGGTCG ACTACCTGGC CTCATACTTC TTCTATGACG CTAGCCGAGA 900 GCAGCTTGAA GAACTAGTGG CCCTGTACCC AGACACCACC ACGTACGGGT CTCCGTTCAG 960 ACAGCGCGGC CAACAACTGG TATCCGCAAT TTAAGCGATT GGCCGCCATT CTCGGCGACT 1020 TGGTCTTCAC CATTACCGGC GGGCATTCCT CTCGTATGCA GAGGAAATCT CCCCTGATCT 1080 TCCGAACTGG TCGTACCTGG CGACCTATGA CTATGGCACC CCAGTTCTGG GGACCTTCCA 1140 CGGAAGTGAC CTGCTGCAGG TGTTCTATGG GATCAAGCCA AACTATGCAG CTAGTTCTAG 1200 CCACACGTAC TATCTGAGCT TTGTGTATAC GCTGGATCCG AACTCCAACC GGGGGGAGTA 1260 CATTGAGTGG CCGCAGTGGA AGGAATCGCG GCAGTTGATG AATTTCGGAG CGAACGACGC 1320 CAGTCTCCTT ACGGATGATT TCCGCAACGG GACATATGAG TTCATCCTGC AGAATACCGC 1380 GGCGTTCCAC ATCTGATGCC ATTGGCGGAG GGGTCCGGAC GGTCAGGAAC TTAGCCTTAT 1440 GAGATGAATG ATGGACGTGT CTGGCCTCGG AAAAGGATAT ATGGGATCAT GATAGTACTA 1500 GCCATATTAA TGAAGGGCAT ATACCACGCG TTGGACCTGC GTTATAGCTT CCCGTTAGTT 1560 ATAGTACCAT CGTTATACCA GCCAATCAAG TCACCACGCA CGACCGGGGA CGGCGAATCC 1620 CCGGGAATTG AAAGAAATTG CATCCCAGGC CAGTGAGGCA GCGATTGGCC ACCTCTCCAA 1680 GGCACAGGGC CATTCTGCAG CGCTGGTGGA TTCATCGCAA TTTCCCCCGG CCCGGCCCGA 1740 CACCGCTATA GGCTGGTTCT CCCACACCAT CGGAGATTCG TCGCCTAATG TCTCGTCCGT 1800 TCACAAGCTG AAGAGCTTGA AGTGGCGAGA TGTCTCTGCA GGAATTCAAG CTAGATGCTA 1860 AGCGATATTG CATGGCAATA TGTGTTGATG CATGTGCTTC TTCCTTCAGC TTCCCCTCGT 1920 GCAGATGAGG TTTGGCTATA AATTGAAGTG GTTGGTCGGG GTTCCGTGAG GGGCTGAAGT 1980 GCTTCCTCCC TTTTAGACGC AACTGAGAGC CTGAGCTTCA TCCCCAGCAT CATTACACCT 2040 CAGCA 2045 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 2045 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA sequence GAATTCCCGA CATCGGTCAT TGGCCTCCTC GCTGATCTCC CTTTGGTACA GTCGGCTACC 60 AATGCTCTCG AGGATTGCCT GAACATTGAC ATCCGGGATCTCGGGGTCCGG 120 TCGAAGCTGC CTGTGCTGGT CTGGATCTTT GGCGGAGGCT TTGAACTTGG TTCAAAGGCG 180 ATGTATGATG GTACAACGAT GGTATCATCG TCGATAGACA AGAACATGCC TATCGTGTTT 240 GTAGCAATGA ATTATCGCGT GGGAGGTTTC GGGTTCTTGC CCGGAAAGGA GATCCTGGAG 300 GACGGGTCCG CGAACCTAGG GCTCCTGGAC CAACGCCTTG CCCTGCAGTG GGTTGCCGAC 360 AACATCGAGG CCTTTGGTGG AGACCCGGAC AAGGTGACGA TTTGGGGAGA ATCAGCAGGA 420 GCCATTCGTT TGACTAGATG ACTTGTACGA CGGAAACATC ACTTACAAGG ATAAGCCCTT 480 GTTCCGGGGG GCCATCATGG ACTCCGGTAG TGTTGTTCCC GCAGACCCCG TCGATGGGGT 540 CAAGGGACAG CAAGTATATG ATGCGGTAGT GGAATCTGCA GGCTGTTCCT CTTCTAACGA 600 CACCCTAGCT TGTCTGCGTG AACTAGACTA CACCGACTTC CTCAATGCGG CAAACTCCGT 660 GCCAGGCATT TTAAGCTACC ATTCTGTGGC GTTATCATAT GTGCCTCGAC CGGACGGGAC 720 GGCGTTGTCG GCATCACCGG ACGTTTTGGG CAAAGCAGGG AAATATGCTC GGGTCCCGTT 780 CATCGTGGGC GACCAAGAGG ATGAGGGGAC CTTATTCGCC TTGTTTCAGT CCAACATTAC 840 GACGATCGAC GAGGTGGTCG ACTACCTGGC CTCATACTTC TTCTATGACG CTAGCCGAGA 900 GCAGCTTGAA GAACTAGTGG CCCTGTACCC AGACACCACC ACGTACGGGT CTCCGTTCAG 960 ACAGCGCGGC CAACAACTGG TATCCGCAAT TTAAGCGATT GGCCGCCATT CTCGGCGACT 1020 TGGTCTTCAC CATTACCGGC GGGCATTCCT CTCGTATGCA GAGGAAATCT CCCCTGATCT 1080 TCCGAACTGG TCGTACCTGG CGACCTATGA CTATGGCACC CCAGTTCTGG GGACCTTCCA 1140 CGGAAGTGAC CTGCTGCAGG TGTTCTATGG GATCAAGCCA AACTATGCAG CTAGTTCTAG 1200 CCACACGTAC TATCTGAGCT TTGTGTATAC GCTGGATCCG AACTCCAACC GGGGGGAGTA 1260 CATTGAGTGG CCGCAGTGGA AGGAATCGCG GCAGTTGATG AATTTCGGAG CGAACGACGC 1320 CAGTCTCCTT ACGGATGATT TCCGCAACGG GACATATGAG TTCATCCTGC AGAATACCGC 1380 GGCGTTCCAC ATCTGATGCC ATTGGCGGAG GGGTCCGGAC GGTCAGGAAC TTAGCCTTAT 1440 GAGATGAATG ATGGACGTGT CTGGCCTCGG AAAAGGATAT ATGGGATCAT GATAGTACTA 1500 GCCATATTAA TGAAGGGCAT ATACCACGCG TTGGACCTGC GTTATAGCTT CCCGTTAGTT 1560 ATAGTACCAT CGTTATACCA GCCAATCAAG TCACCACGCA CGACCGGGGA CGGCGAATCC 1620 CCGGGAATTG AAAGAAATTG CATCCCAGGC CAGTGAGGCA GCGATTGGCC ACCTCTCCAA 1680 GGCACAGGGC CATTCTGCAG CGCTGGTGGA TTCATCGCAA TTTCCCCCGG CCCGGCCCGA 1740 CACCGCTATA GGCTGGTTCT CCCACACCAT CGGAGATTCG TCGCCTAATG TCTCGTCCGT 1800 TCACAAGCTG AAGAGCTTGA AGTGGCGAGA TGTCTCTGCA GGAATTCAAG CTAGATGCTA 1860 AGCGATATTG CATGGCAATA TGTGTTGATG CATGTGCTTC TTCCTTCAGC TTCCCCTCGT 1920 GCAGATGAGG TTTGGCTATA AATTGAAGTG GTTGGTCGGG GTTCCGTGAG GGGCTGAAGT 1980 GCTTCCTCCC TTTTAGACGC AACTGAGAGC CTGAGCTTCA TCCCCAGCAT CATTACACCT 2040 CAGCA 2045
【００５１】配列番号：８ 配列の長さ：１０３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 CAATCAATCC ATTTCGCTAT AGTTAAAGGA TGGGGATGAG GGCAATTGGT TATATGATCA 60 TGTATGTAGT GGGTGTGCAT AATAGTAGTG AAATGGAAGC CAGTCATGTG ATTGTAATCG 120 ACCGACGGAA TTGAGGATAT CCGGAAATAC AGACACCGTG AAAGCCATGG TCTTTCCTTC 180 GTGTAGAAGA CCAGACAGAC AGTCCCTGAT TTACCCTTGC ACAAAGCACT AGAAAATTAG 240 CATTCCATCC TTCTCTGCTT GCTCTGCTGA TATCACTGTC ATTCAATGCA TAGCCATGAG 300 CTCATCTTAG ATCCAAGCAC GTAATTCCAT AGCCGAGGTC CACAGGTGAG CAGCAACATT 360 CCCCATCATT GCTTTCCCAG GGCCTCCCAA CGACTAAATC AAGAGTATAT CTCTACCGTC 420 CAATAGATCG TCTTCGCTTC AAAATCTTTG ACAATTCCAA GAGGGTCCCC ATCCATCAAA 480 CCCAGTTCAA TAATAGCCGA GATGCATGGT GGAGTCAATT AGGCAGTATT GCTGGAATGT 540 CGGGGCCAGT TCCGGTGGTC ATTGGCCGCC TGTGATGCCA TCTGCCACTA AATCCGATCA 600 TTGATCCACC GCCCACGAGG CGCGTCTTTG CTTTTTGCGC GGCGTCCAGG TTCAACTCTC 660 TCTGCAGCTC CAGTCCAACG CTGACTGACT AGTTTACCTA CTGGTCTGAT CGGCTCCATC 720 AGAGCTATGG CGTTATCCCG TGCCGTTGCT GCGCAATCGC TATCTTGATC GCAACCTTGA 780 ACTCACTCTT GTTTTAATAG TGATCTTGGT GACGGAGTGT CGGTGAGTGA CAACCAACAT 840 CGTGCAAGGG AGATTGATAC GGAATTGTCG CTCCCATCAT GATGTTCTTG CCGGCTTTGT 900 TGGCCCTATC GTGGGATCGG ATGCCCTCGC TGTGCAGCAG CAGGTACTGC TGGATGAGGA 960 GCCATCGGTC TCTGCACGCA AACCCAACTT CCTCTTCATT CTCACGGATG ATCAGGATCT 1020 CCGGATGAAG AATTC 1035SEQ ID NO: 8 Sequence length: 1035 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: genomic DNA sequence CAATCAATCC ATTTCGCTAT AGTTAAAGGA TGGGGATGAG GGCAATTGGT TATATGATCA 60 TGTATGTAGT GGGTGTGCAT AATAGTAGATCATTGATGGAAGGATG 120 ACCGACGGAA TTGAGGATAT CCGGAAATAC AGACACCGTG AAAGCCATGG TCTTTCCTTC 180 GTGTAGAAGA CCAGACAGAC AGTCCCTGAT TTACCCTTGC ACAAAGCACT AGAAAATTAG 240 CATTCCATCC TTCTCTGCTT GCTCTGCTGA TATCACTGTC ATTCAATGCA TAGCCATGAG 300 CTCATCTTAG ATCCAAGCAC GTAATTCCAT AGCCGAGGTC CACAGGTGAG CAGCAACATT 360 CCCCATCATT GCTTTCCCAG GGCCTCCCAA CGACTAAATC AAGAGTATAT CTCTACCGTC 420 CAATAGATCG TCTTCGCTTC AAAATCTTTG ACAATTCCAA GAGGGTCCCC ATCCATCAAA 480 CCCAGTTCAA TAATAGCCGA GATGCATGGT GGAGTCAATT AGGCAGTATT GCTGGAATGT 540 CGGGGCCAGT TCCGGTGGTC ATTGGCCGCC TGTGATGCCA TCTGCCACTA AATCCGATCA 600 TTGATCCACC GCCCACGAGG CGCGTCTTTG CTTTTTGCGC GGCGTCCAGG TTCAACTCTC 660 TCTGCAGCTC CAGTCCAACG CTGACTGACT AGTTTACCTA CTGGTCTGA T CGGCTCCATC 720 AGAGCTATGG CGTTATCCCG TGCCGTTGCT GCGCAATCGC TATCTTGATC GCAACCTTGA 780 ACTCACTCTT GTTTTAATAG TGATCTTGGT GACGGAGTGT CGGTGAGTGA CAACCAACAT 840 CGTGCAAGGG AGATTGATAC GGAATTGTCG CTCCCATCAT GATGTTCTTG CCGGCTTTGT 900 TGGCCCTATC GTGGGATCGG ATGCCCTCGC TGTGCAGCAG CAGGTACTGC TGGATGAGGA 960 GCCATCGGTC TCTGCACGCA AACCCAACTT CCTCTTCATT CTCACGGATG ATCAGGATCT 1020 CCGGATGAAG AATTC 1035
【図１】プラスミドｐＵＣＧＯＤの制限地図を示す。FIG. 1 shows a restriction map of plasmid pUCGOD.
【図２】プラスミドｐＦＧＡ１の制限地図を示す。FIG. 2 shows a restriction map of plasmid pFGA1.
【図３】プラスミドｐＦＧＡ２の制限地図を示す。FIG. 3 shows a restriction map of plasmid pFGA2.
【図４】プラスミドｐＦＧＡ２ＭＵＴの制限地図を示
す。FIG. 4 shows a restriction map of plasmid pFGA2MUT.
【図５】プラスミドｐＦＧＯＤＮＯ制限地図を示す。FIG. 5 shows a plasmid pFGODNO restriction map.
【図６】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号７）を示す。FIG. 6 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter.
【図７】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列（配
列番号７）の図６のつづきを示す。FIG. 7 shows the continuation of FIG. 6 of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter.
【図８】アスペルギルス・ホエチダスＳＥ４グルコアミ
ラーゼターミネーターをコードするヌクレオチド配列
（配列番号８）を示す。FIG. 8 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:66） Ｃ１２Ｒ 1:66） Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI Technical display part // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:66) (C12N 1/15 C12R 1:66) (C12N 9/04 C12R 1:66) C12R 1:66)
Claims (21)
使用できる発現系であって、 プロモーター配列、 グルコースオキシダーゼ分泌シグナル配列、 グルコースオキシダーゼ成熟配列、及びターミネーター
配列、を含むことを特徴とする発現系。1. An expression system that can be used for extracellular production of glucose oxidase, comprising: a promoter sequence, a glucose oxidase secretory signal sequence, a glucose oxidase mature sequence, and a terminator sequence.
ロモーター配列であり、ターミネーター配列がグルコア
ミラーゼターミネーター配列であり、これらの配列が糸
状菌株に由来することを特徴とする請求項１記載の発現
系。2. The expression system according to claim 1, wherein the promoter sequence is a glucoamylase promoter sequence, the terminator sequence is a glucoamylase terminator sequence, and these sequences are derived from a filamentous fungal strain.
列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列が糸状菌株に由
来することを特徴とする請求項１又は２記載の発現系。3. The expression system according to claim 1 or 2, wherein the glucose oxidase secretion signal sequence and the glucose oxidase mature sequence are derived from a filamentous fungal strain.
s) 株であることを特徴とする請求項２又は３記載の発
現系。4. The filamentous fungal strain is Aspergillu.
s) strain, The expression system according to claim 2 or 3, characterized in that it is a strain.
エチダス(Aspergillus foetidus)株であることを特徴と
する請求項４記載の発現系。5. The expression system according to claim 4, wherein the Aspergillus strain is an Aspergillus foetidus strain.
グルコアミラーゼターミネーター配列がアスペルギルス
・ホエチダス株ＳＥ４に由来することを特徴とする請求
項１記載の発現系。6. The expression system according to claim 1, wherein the glucoamylase promoter sequence and the glucoamylase terminator sequence are derived from Aspergillus foetidas strain SE4.
列及びグルコースオキシダーゼ成熟配列がアスペルギル
ス・ホエチダス株ＡＴＣＣ１４９１６に由来することを
特徴とする請求項１記載の発現系。7. The expression system according to claim 1, wherein the glucose oxidase secretory signal sequence and the glucose oxidase mature sequence are derived from Aspergillus foetidas strain ATCC14916.
現系を含み、グルコースオキシダーゼを発現させること
ができる組込みベクター。8. An integrative vector comprising the expression system according to claim 1 and capable of expressing glucose oxidase.
項８記載の組込みベクター。9. The integration vector according to claim 8, which is a plasmid.
又は請求項１０記載のプラスミドによって形質転換され
た細胞。11. A cell transformed with the integration vector according to claim 8 or 9 or the plasmid according to claim 10.
請求項１１記載の形質転換細胞。12. The transformed cell according to claim 11, which is a filamentous fungal cell.
あることを特徴とする請求項１２記載の形質転換細胞。13. The transformed cell according to claim 12, wherein the filamentous fungal cell is an Aspergillus cell.
・ホエチダス細胞であることを特徴とする請求項１３記
載の形質転換細胞。14. The transformed cell according to claim 13, wherein the Aspergillus cell is an Aspergillus foetidas cell.
方法であって、下記工程：グルコースオキシダーゼを発
現及び分泌させる条件下、請求項１〜７のいずれか１項
に記載の発現系を含む組込みベクターで細胞を形質転換
する工程、 形質転換細胞を適切な培養基中で培養する工程、及び分
泌グルコースオキシダーゼを回収する工程を含むことを
特徴とする方法。15. A method for extracellular production of glucose oxidase, which comprises the following steps: cell integration with an integration vector containing the expression system according to any one of claims 1 to 7 under conditions for expressing and secreting glucose oxidase. And a step of culturing the transformed cells in an appropriate culture medium, and a step of recovering secreted glucose oxidase.
ダス株ＳＥ４ｔｒ。16. An isolated and purified Aspergillus foetidas strain SE4tr.
アミラーゼプロモーター。17. An Aspergillus foetidas glucoamylase promoter.
ルコアミラーゼプロモーターをコードする配列番号７の
ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。18. A DNA molecule comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 encoding the Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase promoter.
アミラーゼターミネーター。19. An Aspergillus foetidas glucoamylase terminator.
ルコアミラーゼターミネーターをコードする配列番号８
のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。20. SEQ ID NO: 8 encoding Aspergillus foetidas SE4 glucoamylase terminator
A DNA molecule comprising the nucleotide sequence of
ずれか１項に記載の形質転換細胞によって生産されたグ
ルコースオキシダーゼ。21. Glucose oxidase produced by the transformed cell according to any one of claims 11, 12, 13 and 14.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE09400102 | 1994-01-28 | ||
| BE9400102A BE1008267A3 (en) | 1994-01-28 | 1994-01-28 | Expression system, integration vector and cell transformed by saidintegration vector |
| BE9400586A BE1009488A4 (en) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | Expression system, integration vector and cell converted by said integration vector |
| BE09400586 | 1994-06-17 | ||
| BE09500014 | 1995-01-09 | ||
| BE9500014A BE1008737A3 (en) | 1994-01-28 | 1995-01-09 | Expression system, integration and vector cell transformed by the vector integration. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07222591A true JPH07222591A (en) | 1995-08-22 |
Family
ID=27159828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7011429A Pending JPH07222591A (en) | 1994-01-28 | 1995-01-27 | Manifestation system, integration vector and cell transformed by integration vector |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5783414A (en) |
| EP (1) | EP0665291A1 (en) |
| JP (1) | JPH07222591A (en) |
| AU (1) | AU1027995A (en) |
| BE (1) | BE1008737A3 (en) |
| BR (1) | BR9500368A (en) |
| CA (1) | CA2140698A1 (en) |
| FI (1) | FI950321A (en) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE1009650A5 (en) * | 1995-10-12 | 1997-06-03 | Genencor Int | Expression system, and cell transformed by vector vector ec. |
| US5879921A (en) * | 1996-11-07 | 1999-03-09 | Novo Nordisk A/S | Recombinant expression of a glucose oxidase from a cladosporium strain |
| CN1675355A (en) * | 2002-08-19 | 2005-09-28 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | Novel lipases and uses thereof |
| US20090104165A1 (en) * | 2004-09-22 | 2009-04-23 | Bioworks, Inc. | Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol |
| GB2423928B (en) * | 2004-11-16 | 2008-04-09 | Efflux Technology Inc | Methods and compositions for treating pain |
| US7919295B2 (en) | 2005-10-21 | 2011-04-05 | Danisco Us Inc. | Polyol oxidases |
| EP2426199A3 (en) * | 2006-10-20 | 2012-08-22 | Danisco US Inc. | Polyol oxidases |
| WO2009156851A1 (en) | 2008-06-25 | 2009-12-30 | Danisco A/S | Anti-fouling composition comprising a first enzyme and an encapsulated second enzyme |
| GB0901966D0 (en) | 2009-02-05 | 2009-03-11 | Danisco | Composition |
| KR101320059B1 (en) * | 2011-10-18 | 2013-10-18 | 주식회사 글루칸 | Recombinant vector, recombinant yeast containing the vector, and mass-producing method of glucose oxidase using the yeast |
| CN102936585B (en) * | 2012-12-10 | 2014-11-26 | 江南大学 | Method for producing glucose oxidase via fermentation |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO840200L (en) * | 1983-01-28 | 1984-07-30 | Cefus Corp | GLUCOAMYLASE CDNA. |
| DK122686D0 (en) * | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | PREPARATION OF PROTEINS |
| FI872102A (en) * | 1986-06-06 | 1987-12-07 | Panlabs Inc | EXPRESSIONSSYSTEM HOS FILAMENTALA FUNGI. |
| US5266688A (en) * | 1988-06-21 | 1993-11-30 | Chiron Corporation | Polynucleotide sequence for production of glucose oxidase in recombinant systems |
| US5094951A (en) * | 1988-06-21 | 1992-03-10 | Chiron Corporation | Production of glucose oxidase in recombinant systems |
| CA1341226C (en) * | 1988-08-16 | 2001-05-01 | Wim Van Hartingsveldt | Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains |
| US5360732A (en) * | 1992-03-04 | 1994-11-01 | Genecor International, Inc. | Production of Aspergillus niger catalase-R |
| US5360901A (en) * | 1992-03-04 | 1994-11-01 | Genencor International, Inc. | Gene sequence encoding Aspergillus niger catalase-R |
| CA2131161C (en) * | 1992-03-04 | 2004-10-26 | Randy M. Berka | Production of aspergillus niger catalase-r |
| EP0570075A3 (en) * | 1992-05-15 | 1995-02-15 | Quest Int | Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having rhamnogalacturonase activity. |
-
1995
- 1995-01-09 BE BE9500014A patent/BE1008737A3/en not_active IP Right Cessation
- 1995-01-18 AU AU10279/95A patent/AU1027995A/en not_active Abandoned
- 1995-01-19 EP EP95200129A patent/EP0665291A1/en not_active Withdrawn
- 1995-01-20 CA CA002140698A patent/CA2140698A1/en not_active Abandoned
- 1995-01-25 FI FI950321A patent/FI950321A/en unknown
- 1995-01-27 BR BR9500368A patent/BR9500368A/en active Search and Examination
- 1995-01-27 JP JP7011429A patent/JPH07222591A/en active Pending
- 1995-01-27 US US08/379,926 patent/US5783414A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2140698A1 (en) | 1995-07-29 |
| AU1027995A (en) | 1995-08-10 |
| EP0665291A1 (en) | 1995-08-02 |
| FI950321A (en) | 1995-07-29 |
| BR9500368A (en) | 1995-10-17 |
| FI950321A0 (en) | 1995-01-25 |
| BE1008737A3 (en) | 1996-07-02 |
| US5783414A (en) | 1998-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU567031B2 (en) | Glucoamylase cdna | |
| EP0956338B1 (en) | Host cells and methods of producing proteins | |
| JP2002539793A (en) | Promoters for expressing genes in fungal cells | |
| JPH08280388A (en) | Preparation of different kind of polypeptide expressed in fibrous fungus | |
| CA2205411A1 (en) | Lysophospholipase produced from aspergillus by recombinant methods | |
| EP0815200B1 (en) | Host cell expressing reduced levels of a metalloprotease and methods using the host cell in protein production | |
| US5783414A (en) | Expression system, integration vector and cell transformed by this integration vector | |
| JP2002536993A5 (en) | ||
| JP2002515252A (en) | Methods for producing polypeptides in filamentous fungal mutant cells | |
| EP3674403A1 (en) | Recombinant oxalate decarboxylase expressed by filamentous fungi host cells | |
| JPS62228282A (en) | Dna chain coding alpha-acetolactic acid decarboxylase and yeast transformed by said dna chain | |
| US6218157B1 (en) | Haloacetoacetate reductase, method for producing said enzyme, and method for producing alcohols using said enzyme | |
| BE1008738A3 (en) | Expression system, integration and vector cell transformed by the vector integration. | |
| JP2000513588A (en) | DNA sequences, expression of these DNAs, thermophilic laccase encoded by said DNAs and uses thereof | |
| BE1009488A4 (en) | Expression system, integration vector and cell converted by said integration vector | |
| BE1008435A3 (en) | Expression system, integration vector and cell transformed by saidintegration vector | |
| JP3541949B2 (en) | Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast. | |
| BE1008267A3 (en) | Expression system, integration vector and cell transformed by saidintegration vector | |
| AU776922B2 (en) | D-gluconolactone oxidase gene and method for producing recombinant D-gluconolactone oxidase | |
| WO1995001444A1 (en) | Glycolate oxidase production | |
| JP2009296958A (en) | High expression promoter | |
| KR100219732B1 (en) | A process for mass roduction of glucose oxidase using yeast mutant cells | |
| KR100328639B1 (en) | Method of mass production for glucose oxidase | |
| CN118909799A (en) | Aspergillus niger recombinant strain for producing L-asparaginase and application thereof | |
| JP2001275669A (en) | New catalase gene and method for producing new catalase using the gene |