MX2015001823A - Metodo para usar alfa-amilasa a partir de aspergillus clavatus e isoamilasa para sacarificacion. - Google Patents

Metodo para usar alfa-amilasa a partir de aspergillus clavatus e isoamilasa para sacarificacion.

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Abstract

Se proporciona una alfa-amilasa fúngica de Aspergillus clavatus (AcAmy1). La AcAmy1 tiene un pH óptimo de 4.5 y es operable a 30 - 75 °C, lo cual permite que la enzima se use en combinación con una glucoamilasa y una isoamilasa en una reacción de sacarificación. Esto obvia la necesidad de ejecutar una reacción de sacarificación como un proceso discontinuo, en donde el pH y la temperatura deben reajustarse para un uso óptimo de la alfa-amilasa o glucoamilasa. La AcAmy1 cataliza, además, la sacarificación de sustratos de almidón a una composición de oligosacáridos enriquecidos significativamente en DP2 y (DP1 + DP2) en comparación con los productos de sacarificación catalizados por una alfa-amilasa de Aspergillus kawachii. Esto facilita el uso de la composición de oligosacáridos por un organismo fermentativo en un proceso de sacarificación y fermentación simultáneas, por ejemplo.

Description

MÉTODO PARA USAR ALFA-AMILASA A PARTIR DE ASPERGILLÜS CLAVATUS E ISOAMILASA PARA SACARIFICACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Métodos para usar (1) una isoamilasa y (2) una a-amilasa a partir de Aspergillus clavatus (AcAmyl) o una variante de esta en la sacarificación de almidón, por ejemplo, sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El almidón consiste en una mezcla de amilosa (15-30 % p/p) y amilopectina (70-85 % p/p). La amilosa consiste en cadenas lineales de unidades de glucosa a-1,4-enlazadas con un peso molecular (MW, por sus siglas en inglés) de aproximadamente 60,000 a aproximadamente 800,000. La amilopectina es un polímero ramificado que contiene puntos de ramificación OÍ-1,6 cada 24-30 unidades de glucosa; Su peso molecular puede ser tan alto como 100 millones.
Los azúcares del almidón, en forma de jarabes de dextrosa concentrada se producen, actualmente, por un proceso catalizado por enzimas que incluye: (1) licuación (o reducción de la viscosidad) del almidón sólido con una a-amilasa en dextrinas con un grado de polimerización promedio de aproximadamente 7-10, y (2) sacarificación del almidón liquidificado resultante (por ejemplo hidrolizado de almidón) Ref. 252274 con amiloglucosidasa (denominada, además, glucoamilasa o GA). El jarabe resultante tiene un contenido alto de glucosa. Gran parte de la jarabe de glucosa que se produce comercialmente se isomeriza posteriormente enzimáticamente a una mezcla dextrosa/fructosa conocida cono isojarabe. El jarabe resultante puede, además, fermentarse con microorganismos, tales como levadura, para producir productos finales comerciales. El producto final puede ser alcohol u, opcionalmente, etanol. El producto final puede ser, además, ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato calcico, gluconato potásico, ácido itacónico y otros ácidos carboxílíeos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel. La fermentación y sacarificación pueden conducirse simultáneamente (por ejemplo, un proceso SSF) para alcanzar una economía y eficacia superiores.
Las o¡-amilasas hidrolizan el almidón, glucógeno, y polisacáridos relacionados mediante la escisión interna de los enlaces a-1,4-glucosídicos al azar. Las a-amilasas, particularmente de Bacilli, se han usado para una variedad de propósitos diferentes, que incluyen licuación y sacarificación del almidón, desaprestado de textiles, modificación de almidón en la industria del papel y la pulpa, fermentación de cerveza, horneado, producción de jarabes para la industria de alimentos, producción de materias primas para los procesos de fermentación, y en la alimentación animal para aumentar la digestibilidad. Estas enzimas pueden usarse, además, para eliminar la suciedad de almidón y manchas durante el lavado de vajillas y lavado de ropa.
Muchas especies de Aspergillus, que incluyen A. clavatus, muestran un fuerte comportamiento amilolítico, que se conserva en condiciones ácidas. Ver Nahira et al. (1956) "Taxonomic studies on the genus Aspergillus. VIII. The relation between the morphological characteristics and the amylolytic properties in the Aspergillus" , Hakko Kogaku Zasshi 34: 391-99, 423-28, 457-63. A. clavatus, por ejemplo, secreta una actividad amilasa entre otras enzimas degradantes de polisacáridos, que permite que este hongo digiera los carbohidratos complejos en su medio ambiente. Ver Ogundero et al. (1987) "Polysaccharide degrading enzymes of a toxigenic strain of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds", Die Nahrung 10: 993-1000. Cuando se determinó el efecto del pH sobre la capacidad de A. clavatus para degradar alimento molido, se demostró que A. clavatus degrada los alimentos en todos los valores de pH probados de 3.2 a 7.8. Ver Ogundero (1987) "Toxigenic fungí and the deterioration of Nigerian poultry feeds", Mycopathologia 100: 75-83. Estudios posteriores mostraron un máximo de la actividad amilasa de A. clavatus a pH 7 - 8, cuando A. clavatus se cultivó en medio de extracto de levadura de maíz o en medio de extracto de levadura de trigo. Adisa (1994) "Mycoflora of post-harvest maize and wheat grains and the implications of their contamination by molds", Die Nahrung 38(3): 318-26.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Una a-amilasa de A spergillus clavatus (AcAmyl) cataliza la sacarificación por períodos extendidos a temperaturas moderadas y un pH ácido. Se proporciona un ejemplo de una a-amilasa conocida de Aspergillus clavatus NRRL1 (sec. con núm. de ident.: 1), una variante de la a-amilasa, que codifica ácidos nucleicos, y células hospederas que expresan los polinucleótidos. La AcAmyl tiene un intervalo de trabajo ácido y contribuye a un alto rendimiento de etanol y bajo almidón residual en una sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), por ejemplo, particularmente cuando se usa junto con una glucoamilasa. A pesar de la descripción de Adisa 1994 que reporta que el máximo de la actividad amilasa de A. clavatus se produce a pH 7 - 8 a 25-30 °C, la AcAmyl tiene un pH óptimo a pH 4.5 a 50 °C. La AcAmyl muestra una actividad alta a temperaturas elevadas y a un pH bajo, por lo que AcAmyl puede usarse eficientemente en un proceso de sacarificación en presencia de glucoamilasas fúngicas, tales como glucoamilasa de Aspergillus niger (AnGA) o glucoamilasa de Trichoderma (TrGA). Ventajosamente, la AcAmyl cataliza la sacarificación de almidón a una composición de oligosacáridos enriquecida significativamente en DPI y DP2 (es decir, glucosa y maltosa) en comparación con los productos de sacarificación catalizados por la alfa-amilasa de Aspergillus kawachii (AkAA). La AcAmyl puede usarse en una dosificación más baja que AkAA para producir niveles comparables de etanol La AcAmyl puede usarse en combinación con enzimas derivadas de plantas (por ejemplo, de cereales y granos). La AcAmyl puede usarse, además, en combinación con enzimas secretadas por, o endógena de, una célula hospedera. Por ejemplo, la AcAmyl puede agregarse a un proceso de fermentación o SSF durante el cual una o más amilasas, glucoamilasas, celulasas, hemicelulasas, proteasas, lipasas, fitasas, esterasas, enzimas de redox, transferasas u otras enzimas son secretadas por el huésped de producción. La AcAmyl puede trabajar, además, en combinación con enzimas no secretadas de producción endógena del hospedero. En otro ejemplo, la AcAmyl puede secretarse por una célula hospedera de producción sola o con otras enzimas durante la fermentación o SSF. Además, la amilasa AcAmyl puede ser eficaz en la hidrólisis directa del almidón para jarabe y/o productos bioquímicos (por ejemplo, alcoholes, ácidos orgánicos, aminoácidos, otros productos bioquímicos y biomateriales), en donde la temperatura de reacción es menor que la temperatura de gelatinización del sustrato. La AcAmyl puede ser secretada por una célula hospedera con otras enzimas durante la fermentación o SSF.
Por lo tanto, se proporciona un método para sacarificar una composición que puede comprender almidón para producir una composición que comprende glucosa, en donde el método puede comprender (i) poner en contacto la composición que comprende almidón con una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o con (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1; y (ii) sacarificar la composición que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; en donde la isoamilasa y la AcAmyl aislada o variante de esta sola o en combinación con otras enzimas cataliza la sacarificación de la composición de almidón a glucosa, DP2, DP3, DP4, etc., o a otros oligosacáridos o polisacáridos.
La AcAmyl o variante de esta pueden dosificarse a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones. La AcAmyl o variante de esta pueden dosificarse, además, a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones.
En algunas modalidades, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 1.7 hasta aproximadamente 10 mg de proteína/g de sólido. En otras modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 1.7 hasta aproximadamente 6.6 pg de proteína/g de sólido. En otras modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 3.3 pg de proteína/g de sólido.
La composición que comprende glucosa puede estar enriquecida en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con una segunda composición que comprende glucosa producida por AkAA con isoamilasa bajo las mismas condiciones.
En algunas modalidades, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa. En modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa. En otras modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
La AcAmyl o variante de esta pueden comprender una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. La AcAmyl o variante de esta pueden comprender, además, (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir, además, en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
La composición de almidón pueden comprender almidón liquidificado, almidón gelatinizado o almidón granular. La sacarificación puede realizarse en un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C. El intervalo de temperatura puede ser, además, 47 °C-74 °C. La sacarificación puede realizarse en un intervalo de pH de pH 2.0-pH 7.5. El intervalo de pH puede ser, además, pH 3.5-pH 5.5. El intervalo de pH puede ser, además, pH 3.5-pH 4.5.
El método puede comprender, adicionalmente, fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF, por sus siglas en inglés). La fermentación puede ser una reacción simultánea de sacarificación y fermentación (SSF). La fermentación puede realizarse por 24-70 horas a pH 2-8 y en un intervalo de temperatura de 25 °C-70 °C. El producto de EOF puede comprender 8 %-18 % (v/v) de etanol. El producto de EOF puede comprender un metabolito. El producto final puede ser alcohol u, opcionalmente, etanol. El producto final puede ser, además, ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itacónico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel.
Se proporciona, además, el uso de AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa en la producción de una bebida fermentada, así como un método para preparar una bebida fermentada que puede comprender: poner en contacto un puré y/o un mosto con AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa. Un método de preparar una bebida fermentada; el método puede comprender: (a) preparar un puré; (b) filtrar el puré para obtener un mosto; y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, en donde la AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa se agregan a: (i) el puré de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c). Se proporciona, además, una bebida fermentada producida por los métodos descritos.
La bebida fermentada o producto final de la fermentación puede seleccionarse del grupo que consiste en una cerveza seleccionada tal como malteada de cerveza completa, cerveza elaborada bajo el marco de "Reinheitsgebot", Ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido en alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, y licor de malta sin alcohol; o bebidas de maltas o de cereales tales como bebidas de malta con sabor a frutas, bebidas de malta con sabor a licor, y bebidas de malta con sabor a café.
El método puede comprender, además, agregar glucoamilasa, trehalasa, hexocinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa que no sea AcAmyl, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa u otras hidrolasas, o una combinación de estas, en la composición de almidón. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/099783. La glucoamilasa puede añadirse a 0.1-2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds.
La AcAmyl aislada o una variante de esta pueden expresarse y segregarse por una célula hospedera. La composición de almidón puede ponerse en contacto con la célula hospedera. La célula hospedera puede, además, expresar y secretar una glucoamilasa y/u otras enzimas. En modalidades preferidas, la otra enzima es una isoamilasa. La célula hospedera puede, además, tener la capacidad de fermentar la composición de glucosa.
Por lo tanto, se proporciona una composición para usar para sacarificar una composición que comprende almidón, que puede comprender una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. La AcAmyl o variante de esta puede comprender una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
La composición puede ser un material celular cultivado. La composición puede comprender, además, una glucoamilasa. La AcAmyl o variante de esta y/o isoamilasa puede ser, además, purificada.
La AcAmyl o variante de esta y/o isoamilasa puede ser expresada y secretada por una célula hospedera. La célula hospedera puede ser una célula fúngica filamentosa, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de alga. La célula hospedera puede ser una célula de Aspergillus sp. o Trichoderma reesei .
Por lo tanto, se proporciona un método para hornear que comprende agregar una composición para hornear a una sustancia a hornear y hornear la sustancia para producir un producto horneado, en donde la composición para hornear comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la AcAmyl aislada o variante de esta cataliza la hidrólisis de los componentes de almidón presentes en la sustancia para producir moléculas derivadas de almidón más pequeñas. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:l. La composición para hornear puede comprender adicionalmente harina, una amilasa contra el enranciamiento, una fosfolipasa, y/o un fosfolípido.
Por lo tanto, se proporciona, además, un método para producir una composición alimenticia; el método comprende combinar (i) uno o más ingredientes alimenticios y (ii) una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o con (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la isoamilasa y la AcAmyl aislada o variante de esta catalizan la hidrólisis de los componentes de almidón presentes en los ingredientes alimenticios para producir glucosa. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. El método puede comprender, adicionalmente, hornear la composición alimenticia para producir un producto horneado. El método puede comprender, adicionalmente, (i) proporcionar un medio de almidón; (ii) agregar al medio de almidón la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta; y (iii) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.
La composición alimenticia puede estar enriquecida en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con un segundo producto horneado producido por AkAA con una isoamilasa bajo las mismas condiciones. La composición alimenticia puede seleccionarse del grupo que consiste en un producto alimenticio, una composición para hornear, un aditivo para los alimentos, un producto alimenticio animal, un producto de alimentación, un aditivo alimenticio, un aceite, una carne, y una manteca. La composición alimenticia puede comprender una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesada.
El uno o más ingredientes alimenticios puede comprender un ingrediente de horneado o un aditivo. El uno o más ingredientes alimenticios puede seleccionarse, además, del grupo que consiste en harina; una amilasa contra el enranciamiento; una fosfolipasa; un fosfolípido; una alfa- amilasa maltogénica o una variante, homólogo, o mutantes de ella que tiene actividad alfa-amilasa maltogénica; una xilanasa de panadería (EC 3.2.1.8); y una lipasa. El uno o más ingredientes alimenticios pueden seleccionarse adicionalmente del grupo que consiste en (i) una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, (ii) una xilanasa de panadería es de Bacillus , Aspergillus, Thermomyces o Trichoderma, (iii) una glicolipasa de Fusarium heterosporum.
Por lo tanto, se proporciona, además, una composición para usar para producir una composición alimenticia; la composición comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o con (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1 y uno o más ingredientes alimenticios. Se proporciona, además, un uso de la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-78 para preparar una composición alimenticia. La composición alimenticia puede comprender una masa o un producto de masa, que incluyen un producto de masa procesado. La composición alimenticia puede ser una composición de panadería. La AcAmyl o variante de esta pueden usarse en un producto de masa para retardar o reducir el enranciamiento, preferentemente, retrogradación perjudicial, del producto de masa.
Por lo tanto, se proporciona un método para eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos o textiles; el método puede comprender incubar una superficie de la ropa sucia, platos o textiles en presencia de una composición acuosa que comprende una cantidad efectiva de una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec con núm. de ident.:1 y que permite que la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta hidrolicen los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas derivadas de almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie para eliminar la mancha de almidón de la superficie. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
Por lo tanto, se proporciona una composición para usar para eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos o textiles, la cual puede comprender una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec con núm. de ident.:1 y un tensioactivo. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident 1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm de ident.:1. La composición puede ser un detergente para lavandería, un aditivo de detergente para lavandería, o un detergente para lavado de vajillas manual o automático.
Por lo tanto, se proporciona, además, un método de desaprestado de textiles; el método puede comprender poner en contacto una composición de desaprestado con un textil durante el tiempo suficiente para desaprestar el textil, en donde la composición de desaprestado puede comprender una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1 y que permite que la AcAmyl o variante de esta quite el apresto de los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas derivadas de almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie para eliminar la mancha de almidón de la superficie. La AcAmyl o variante de esta pueden consistir en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
Por lo tanto, se proporciona, además, el uso de una isoamilasa y AcAmyl o variante de esta en la producción de una composición de glucosa. Se proporciona, además, la composición de glucosa producida por los métodos descritos. Se proporciona, además, el uso de una isoamilasa y AcAmyl o variante de esta en la producción de un almidón liquidificado Y se describe, además, un almidón liquidificado preparado por los métodos descritos.
Además, se describe el uso de una composición de desaprestado que puede comprender una isoamilasa y AcAmyl o variante de esta para el desaprestado de textiles, así como el uso de una composición para hornear que puede comprender AcAmyl o variante de esta en la producción de un producto horneado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras adjuntas se incorporan en esta descripción y constituyen una parte de esta, e ilustran varios métodos y composiciones descritos en la presente descripción. En las figuras: La Fig.1A y Fig. IB representan una alineación ClustalW del núcleo catalítico de la AcAmyl, región enlazadora, y dominio de unión a carbohidratos (residuos 20-497, 498-528, y 529-636 de la sec. con núm. de ident.: 1, respectivamente), o toda la longitud, con los residuos correspondientes de a-amilasas de: T. stipitatus ATCC 10500 (residuos 20-497 y 520-627 de la sec. con núm. de ident.: 4, respectivamente); A. nidulans FGSC A4 (residuos 20-497 y 516-623 de la sec. con núm. de ident.: 5, respectivamente); A. fumigatus Af293 (residuos 24-502 y 523-630 de la sec. con núm. de ident.: 12, respectivamente); y A. terreus N1H2624 (residuos 21-497 y 500-607 de la sec. con núm. de ident.: 13, respectivamente). Los residuos designados por un asterisco en la Fig. 1 son residuos de AcAmyl correspondientes a residuos conservados en las sec. con núms. de ident.: 4-5 y 12-13.
La Fig. 2 representa un mapa de un vector de expresión pJG153 que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de AcAmyl, pJG153 (Tex3gM-AcAmyl).
La Fig.3A representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de la oí-amilasa de Aspergillus kawachii (AkAA) con el pH. La Fig. 3B representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de AcAmyl con el pH. La actividad a-amilasa se basó en 2 ppm de enzima y se probó mediante la liberación de azúcar reductor a partir del sustrato de amilopectina de la papa a 50 °C.
La Fig.4A representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de AkAA con la temperatura. La Fig. 4B representa la dependencia de la actividad a-amilasa (unidades relativas) de AcAmyl con la temperatura. La actividad a-amilasa se basó en 2 ppm de enzima y se probó mediante la liberación de azúcar reductor a partir de un sustrato de amilopectina de la papa a pH 4.0 (AkAA) o pH 4.5 (AcAmyl).
La Fig. 5A representa la actividad a-amilasa residual (unidades relativas) de AkAA después de una incubación a pH 3.5 o 4.8 para los periodos de tiempo mostrados. La Fig.5B representa la actividad a-amilasa residual (unidades relativas) de AcAmyl a pH 3.5 o 4.8 para los periodos de tiempo mostrados. La actividad a-amilasa se basó en 2 ppm de enzima y se probó mediante la liberación de azúcar reductor a partir de un sustrato de amilopectina de la papa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporciona una a-amilasa fúngica a partir de Aspergillus clavatus (AcAmyl). La AcAmyl tiene un pH óptimo de pH 4.5 y al menos 70 % de actividad en un intervalo de pH 3 a pH 7. La enzima tiene una temperatura óptima de 66 °C y al menos 70 % de actividad en un intervalo de temperatura de 47°-74 °C, cuando se prueba a pH 4.5. Estas propiedades permiten que la enzima se use en combinación con una glucoamilasa y/u otras enzimas bajo las mismas condiciones de reacción. En modalidades preferidas, la otra enzima es una isoamilasa. Esto obvia la necesidad de ejecutar una reacción de sacarificación como un proceso discontinuo, en donde el pH y la temperatura deben ajustarse para el uso óptimo de la a-amilasa o la glucoamilasa.
La AcAmyl y una isoamilasa catalizan, además, la sacarificación de una composición que comprende almidón a glucosa. Por ejemplo, después de dos horas de sacarificación a 50 °C, pH 5.3, mediante el uso de un sustrato de DP7, amilopectina, o maltodextrina, se produce una composición de oligosacáridos. La composición está enriquecida en DPI, DP2 y (DPI + DP2 ), en comparación con los productos de sacarificación catalizada por isoamilasa y por AkAA bajo las mismas condiciones. Esto facilita el uso de la composición de oligosacáridos por parte de un organismo fermentador en un proceso SSF, por ejemplo. En este papel, la AcAmyl puede producir el mismo rendimiento de etanol que la AkAA con una dosificación menor de la enzima, mientras que reduce el almidón residual insoluble y minimiza cualquier efecto negativo del almidón residual insoluble sobre la calidad del producto final.
En algunas modalidades, la AcAmyl o variante de esta en presencia de isoamilasa se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa. En otras modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta en presencia de isoamilasa se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa. En otras modalidades adicionales, la AcAmyl o variante de esta en presencia de isoamilasa se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
Las aplicaciones ilustrativas para AcAmyl y variantes de estas amilasas están en un proceso de sacarificación de almidón, por ejemplo, SSF, la preparación de composiciones de limpieza, tales como composiciones detergentes para la limpieza de lavandería, vajillas, y otras superficies, para el procesamiento textil (por ejemplo, el desaprestado). 1. Definiciones SeAbreviaturas De conformidad con esta descripción detallada se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Note que las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales enzimas y la referencia a "la dosificación" incluye referencia a una o más dosificaciones y equivalentes de estas conocidas para las personas con experiencia en la materia, etc.
A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los términos científicos y téenicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la materia. A continuación se proporcionan las definiciones de los términos. 1.1. Abreviaturas y acrónimos Las siguientes abreviaturas/acrónimos tienen los siguientes significados a menos que se especifique claramente de cualquier otra manera ABTS ácido 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico AcAmyl a-amilasa de Aspergillus clavatus AE etoxilato de alcohol AEO etoxilato de alcohol AEOS etoxisulfato de alcohol AES etoxisulfato de alcohol AkAA a-amilasa de Aspergillus kawachii AnGA glucoamilasa de Aspergillus niger A0S a-olefinsulfonato AS sulfato de alquilo ADN complementario CMC carboximetilcelulosa DE equivalente de dextrosa DNA ácido desoxirribonucleico DPn grado de polimerización de sacáridos que tienen n subunidades ds o DS sólidos secos DTMPA ácido dietilentriaminapentaacético EC Comisión de enzimas EDTA ácido etilendiaminatetraacético EO óxido de etileno (fragmento del polímero) EOF fin de la fermentación FGSC Fungal Genetics Stock Center GA glucoamilasa GAU/g ds unidad de la actividad de glucoamilasa/gramo de sólidos secos HFCS jarabe de maíz con alto contenido de fructosa HgGA glucoamilasa de Humicola grísea IPTG isopropil b-D-tiogalactosida IRS almidón residual insoluble ISO isoamilasa kDa kiloDalton LAS alquilbencenosulfonato lineal MW peso molecular MWU unidad de Wohlgemuth modificada; 1.6xl05 mg/MWU = unidad de actividad NCBI National Center for Biotechnology Information NOBS nonanoiloxibencenosulfonato NTA ácido nitriloacético OxAm Purastar HPAM 5000L (Danisco US Inc.) PAHBAH hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico PEG polietilenglicol P1 punto isoeléctrico pptn partes por millón, por ejemplo, mg de proteína por gramo de sólido seco PVA poli(alcohol vinílico) PVP poli(vinilpirrolidona) RNA ácido ribonucleico SAS alcanosulfonato SDS-PAGE dodecil sulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamina SSF sacarificación y fermentación simultáneas SSU/g de unidad de almidón soluble/gramo de sólidos secos sólido sp· especies TAED tetraacetiletilendiamina TrGA glucoamilasa de Trichoderma reesei p/v peso/volumen p/p peso/peso 5 , v/v volumen/volumen %p por ciento en peso °C grados centígrados H2 O agua dH20 o DI agua desionizada d1H20 agua desionizada, filtración en Milli-Q 10 g o gm gramos mg microgramos mg miligramos kg kilogramos ml y ml microlitros -L5 ml y ml mililitros mm milímetros mp\ micrómetro M molar mM milimolar mM micromolar 20 u unidades s segundos min (s) minuto/minutos h hora/horas DO oxígeno disuelto Ncm newton centímetro EtOH etanol eq. equivalentes N normal 1.2. Definiciones Los términos "amilasa" o "enzima amilolítica" se refieren a una enzima que es, entre otras cosas, capaz de catalizar la degradación del almidón. Las a-amilasas son hidrolasas que escinden los enlaces a-D-(l4) O-glucosídicos en el almidón. Generalmente, las a-amilasas (EC 3.2.1.1; a-D-(14) -glucano glucanohidrolasa) se definen como endoenzimas que escinden enlaces a-D-(14) O-glucosídicos dentro de la molécula de almidón de una manera aleatoria lo que produce polisacáridos que contienen tres o más unidades de D-glucosa con enlace (1-4)-a. En contraposición, las exoenzimas amilolíticas, tales como las b-amilasas (EC 3.2.1.2; a-D-(14) glucano maltohidrolasa) y algunas amilasas específicas de productos como la a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) escinden la molécula del polisacárido a partir del extremo no reductor del sustrato. Las b-amilasas, oí-glucosidasas (EC 3.2.1.20; a-D-glucósido glucohidrolasa), glucoamilasa (EC 3.2.1.3; a-D-(14) glucano glucohidrolasa), y amilasas específicas de productos, como las maltotetraosidasas (EC 3.2.1.60) y las maltohexaosidasas (EC 3.2.1.98) pueden producir malto-oligosacáridos de una longitud específica o jarabes enriquecidos de malto-oligosacáridos específicos.
El término "pululanasa" (E.C. 3.2.1.41, pululano 6-glucanohidrolasa) se refiere a una clase de enzimas que tienen la capacidad de hidrolizar los enlaces a-l,6-D-glucosídicos presentes en amilopectina. La pululanasa hidroliza los enlaces OÍ-1,6-D-glucosídicos en pululano para obtener la trisacárido maltotriosa.
El término "isoamilasa", como se usa en la presente descripción, se refiere a una enzima desramificante (E.C. 3.2.1.68) con la capacidad de hidrolizar los enlaces a-l,6-D-glucosídicos de almidón, glucógeno, amilopectina, glucógeno, beta dextrinas límite y oligosacáridos derivados de estos. No puede hidrolizar pululano.
En la presente descripción "unidades enzimáticas" se refiere a la cantidad de producto formado en un tiempo bajo las condiciones especificadas del ensayo. Por ejemplo, una "unidad de actividad glucoamilasa" (GAU, por sus siglas en inglés) se define como la cantidad de enzima que produce 1 g de glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble (4 % DS) a 60 °C, pH 4.2. Una "unidad de almidón soluble" (SSU, por sus siglas en inglés) es la cantidad de enzima que produce 1 mg de glucosa por minuto a partir de un sustrato de almidón soluble (4 % DS) a pH 4.5, 50 °C. DS se refiere a "sólidos secos." Como se usa en la presente descripción, el término "almidón" se refiere a cualquier material que comprende los carbohidratos polisacáridos complejos de las plantas que comprenden amilosa y amilopectina con la fórmula (CeHioOslx, en donde X puede ser cualquier número. El término incluye materiales de origen vegetal, tales como granos, cereales, hierbas, tubérculos y raíces y, más específicamente, materiales obtenidos a partir de trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, papa, batata, y tapioca. El término "almidón" incluye almidón granular. El término "almidón granular" se refiere a almidón crudo, es decir, no cocido, por ejemplo, almidón que no se ha sometido a gelatinización.
Los términos, "en estado natural", "parental", o "referencia", con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido que ocurre naturalmente que no incluye una sustitución hecha por el hombre, inserción o supresión en una o más posiciones de aminoácido. De manera similar, los términos "en estado natural", "parental", o "referencia", con respecto a un polinucleótido, se refieren a un polinucleótido que ocurre naturalmente que no incluye un cambio de nucleósido hecho por el hombre. Sin embargo, debe observarse que un polinucleótido que codifica un polipéptido en estado natural, parental o de referencia no está limitado a un polinucleótido que ocurre naturalmente, y abarca los polinucleótidos que codifican el polipéptido en estado natural, parental o de referencia.
Se entiende que una referencia a la proteína silvestre incluye la forma madura de la proteína. Un polipéptido "maduro" se refiere a un polipéptido de AcAmyl o variante de este en donde una secuencia señal está ausente. Por ejemplo, la secuencia señal puede escindirse durante la expresión del polipéptido. La AcAmyl madura es de 617 aminoácidos de longitud que cubren las posiciones 20-636 de la sec. con núm. de ident.: 1, en donde las posiciones se cuentan a partir del extremo N-terminal. La secuencia señal de la AcAmyl silvestre es de 19 aminoácidos de longitud y tiene la secuencia expuesta en la sec. con núm. de ident.: 3. Una AcAmyl madura o variante de esta pueden comprender una secuencia señal tomada a partir de diferentes proteínas. La proteína madura puede ser una proteína de fusión entre el polipéptido maduro y un polipéptido de secuencia señal.
El "núcleo catalítico" de AcAmyl abarca los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.: 1. El "enlazador" o "región enlazadora" de AcAmyl abarca los residuos 498-528. Los residuos de aminoácidos 529-636 constituyen el "dominio de unión a carbohidrato" de AcAmyl.
El término "variante", con respecto a un polipéptido, se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido silvestre específico, parental, o de referencia en que incluye una o más sustituciones, inserciones, o supresiones de un aminoácido de origen natural o producidas por el hombre Similarmente, el término "variante", con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que difiere en la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido silvestre específico, parental, o de referencia. La identidad del polinucleótido o polipéptido silvestre, parental, o de referencia será evidente a partir del contexto. Una "variante" de AcAmyl y una "variante de polipéptido de a-amilasa" son sinónimos en la presente descripción.
En el caso de las presentes a-amilasas, "actividad" se refiere a la actividad a-amilasa, que puede medirse como se describe en la presente descripción.
El término "recombinante", cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector sujetos, indica que el sujeto se ha modificado a partir de su estado nativo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a diferentes niveles o bajo diferentes condiciones que las encontradas en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes difieren de una secuencia nativa en uno o más nucleótidos y/o están unidos operativamente a secuencias heterólogas, por ejemplo, un promotor heterólogo en un vector de expresión. Las proteínas recombinantes pueden diferir de una secuencia nativa en uno o más aminoácidos y/o se fusionan con secuencias heterólogas. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o una variante de esta es un vector recombinante.
Los términos "recuperado", "aislado", y "separado", se refieren a un compuesto, proteína (polipéptidos), célula, ácido nucleico, aminoácido, u otro material o componente específico que se retira de al menos otro material o componente al que está asociado de manera natural tal como se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, una AcAmyl aislada a partir de una célula de A. clavatus sp. Una AcAmyl o variante de esta "aislada" incluye, pero no se limita a, un caldo de cultivo que contiene AcAmyl o polipéptidos variantes secretados y AcAmyl o polipéptidos variantes expresados en una célula hospedera heteróloga (es decir, una célula hospedera que no es A. clavatus) .
Como se usa en la presente descripción, el término "purificado" se refiere al material (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido aislados) que está en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % de pureza, al menos aproximadamente 95 % de pureza, al menos aproximadamente 98 % de pureza, o incluso al menos aproximadamente 99 % de pureza.
Los términos "termoestable" y "termoestabilidad, " con referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad después de una exposición a una temperatura elevada. La termoestabilidad de una enzima, tal como una enzima amilasa, se mide por su vida media (ti/2) dada en minutos, horas, o días, durante los que se pierde la mitad de la actividad enzimática bajo condiciones definidas. La vida media puede calcularse al medir la actividad a-amilasa residual después de una exposición a (es decir, reto con) una temperatura elevada.
Un "intervalo de pH", con referencia a una enzima, se refiere a un intervalo de valores de pH en que la enzima exhibe actividad catalítica.
Como se usa en la presente descripción, los términos "estable en pH" y "estabilidad en pH" con referencia a una enzima, se refieren a la capacidad de la enzima de conservar la actividad en un amplio intervalo de valores de pH por un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 15 min, 30 min, 1 hora).
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo de los términos "polipéptido", "proteína", y "péptido", y se usan indistintamente. En donde las secuencias de aminoácido muestran actividad, pueden mencionarse como una "enzima." Los códigos de una letra o tres letras para residuos de aminoácido se usan con secuencias de aminoácido que se presentan en la orientación terminal estándar amino a carboxi (es decir, N C).
El término "ácido nucleico" abarca ADN, ARN, heterodúplexes, y moléculas sintéticas que puedan codificar un polipéptido. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenario o bicatenario, o pueden ser modificaciones químicas. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente. Dado que el código genético es redundante, más de un codón puede usarse para codificar un aminoácido específico y las presentes composiciones y métodos abarcan secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácido específico. A menos que se indique de cualquier otra manera, las secuencias de ácido nucleico se presentan en una orientación de 5' a 3'.
Como se usa en la presente descripción, "hibridación" se refiere al proceso mediante el que una hebra de ácido nucleico forma un dúplex con, es decir, pares de bases con, una cadena complementaria, como ocurre durante las téenicas de hibridación con transferencia y las técnicas de PCR. Las condiciones de hibridación rigurosas se ejemplifican mediante la hibridación bajo las siguientes condiciones: 65 °C y 0.IX SSC (en donde IX SSC = NaCl 0.15 M, citrato de Na30.015 M, pH 7.0) . Los ácidos nucleicos dúplexes, hibridados se caracterizan por una temperatura de fusión (Tm), en donde una mitad de los ácidos nucleicos hibridados no están apareados con la cadena complementaria. Los nucleótidos con error de apareamiento dentro del dúplex bajan la Tm. Un ácido nucleico que codifica una variante de a-amilasa puede tener una Tm reducida en 1 °C - 3 °C o más en comparación con un dúplex formado entre el nucleótido de la sec. con núm. de ident.: 2 y su complemento idéntico.
Como se usa en la presente descripción, una molécula "sintética" se produce por síntesis química o enzimática in vitro en lugar de por un organismo.
Como se usa en la presente descripción, los términos "transformado", "transformado de manera estable", y "transgénico", usados con referencia a una célula significa que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.
El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa "transfección", "transformación" o "transducción", como se conoce en la materia.
Una "cepa huésped" o "célula hospedera" es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, AcAmyl o una variante de esta). Las cepas huéspedes ilustrativas son células de microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos filamentosos, y levadura) capaces de expresar el polipéptido de interés y/o sacáridos de fermentación. El término "célula hospedera" incluye protoplastos creados a partir de células.
El término "heterólogo(a) ", con referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína que no es de origen natural en una célula hospedera.
El término "endógeno(a) ", con referencia a un polinucleótido o proteína, se refiere a un polinucleótido o proteína de origen natural en la célula hospedera.
Como se usa en la presente descripción, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido en base a una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye la transcripción y la traducción.
Una "marcador selectivo" o "marcador seleccionable" se refiere a un gen capaz de expresarse en un huésped para facilitar la selección de células hospederas que portan el gen. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, antimicrobianos (por ejemplo, higromicina, bleomicina, o cloranlenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional, en la célula hospedera.
Un "vector" se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos celulares. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fagos, casetes y similares.
Un "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés, cuya secuencia codificante está unida operativamente a una secuencia control adecuada capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Las secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia del operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión del ribosoma adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción.
El término "unido operativamente" significa que los componentes específicos están en una relación (que incluye, pero no se limita a la yuxtaposición) que les permite funcionar de una manera prevista. Por ejemplo, una secuencia amortiguadora está unida operativamente a una secuencia codificante de manera que la expresión de la secuencia codificante está bajo el control de las secuencias amortiguadoras.
Una "secuencia señal" es una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de una proteína, lo que facilita la secreción de la proteína fuera de la célula. La forma madura de una proteína extracelular carece de la secuencia señal que es cortada durante el proceso de secreción.
Como se usa en la presente descripción, "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una actividad biológica específica, tal como una actividad enzimática.
Como se usa en la presente descripción, una "muestra" es una pieza de material, tal como una tela, en la que se aplicó una mancha. El material puede ser, por ejemplo, telas hechas de algodón, poliéster o mezclas de fibras naturales y sintéticas. La muestra puede ser adicionalmente papel, tal como papel de filtro o nitrocelulosa, o una pieza de un material duro, tal como cerámica, metal o vidrio. Para las amilasas, la mancha es de base de almidón, pero puede incluir sangre, leche, tinta, pasto, té, vino, espinaca, salsa de carne, chocolate, huevo, queso, arcilla, pigmento, aceite o mezclas de estos compuestos.
Como se usa en la presente descripción, una "muestra más pequeña" es una sección de la muestra que se cortó con un dispositivo perforador de un solo orificio, o que se cortó con un dispositivo perforador de 96-orificios fabricado en forma personalizada, en donde el patrón del perforador de orificios múltiples coincide con las placas de microtitulación de 96 pocilios estándar, o la sección se extrajo de cualquier otra manera de la muestra. La muestra puede ser de tela, papel, metal u otro material adecuado. La mancha en la muestra más pequeña se puede fijar antes o después de que se coloca en el pocilio de una placa de microtitulación de 24, 48 o 96 pocilios. La muestra más pequeña puede elaborarse, además, mediante la aplicación de una mancha en una pieza pequeña de material. Por ejemplo, la muestra más pequeña puede ser una pieza de tela con una mancha de 1.59 cm o 0.64 cm (5/8" o 0.25") de diámetro. El perforador fabricado personalizado se diseña de tal forma que suministre 96 muestras simultáneamente a todos los pocilios de una placa de 96 pocilios. El dispositivo permite el suministro de más de una muestra por pocilio con solo cargar la misma placa de 96 pocilios varias veces. Los dispositivos perforadores de orificios múltiples pueden pensarse de manera que suministren simultáneamente muestras a una placa de cualquier formato que incluyen, pero no se limitan a, las placas de 24, 48 y 96 pocilios. En otro método posible, la plataforma de prueba sucia puede ser una cuenta hecha de metal, plástico, vidrio, cerámica u otro material adecuado recubierto con el sustrato de suciedad. Después, la o las cuentas recubiertas se colocan en placas de 96, 48 o 24 pocilios o formatos más grandes que contienen amortiguador y enzima adecuados.
Como se usa en la presente descripción, "un material celular cultivado que comprende una AcAmyl o variante de esta" o un lenguaje similar, se refiere a un lisado celular o sobrenadante (que incluye los medios) que incluyen una AcAmyl o variante de esta como un componente. El material celular puede ser de un huésped heterólogo que se cultiva en cultivo para el propósito de producir la AcAmyl o variante de esta.
El "porcentaje de identidad de secuencia" significa que una variante tiene al menos un cierto porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos a una AcAmyl silvestre, cuando se alinean mediante el uso del algoritmo CLUSTAL W con parámetros preestablecidos. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son: penalización de apertura de interrupción: 10.0 penalización de extensión de interrupción: 0.05 matriz de peso de proteínas: serie BLOSUM matriz de peso del ADN: IUB % de secuencias divergentes con retardo: 40 distancia de la separación de 8 interrupción: peso de transiciones de ADN: 0.50 lista de residuos hidrófilos: GPSNDQEKR uso de matriz negativa: desactivado penalizaciones de residuos específicos activado cambiados : penalizaciones de hidrofílicos cambiados: activado penalización por separación de Desactivado. interrupción final cambiada Las supresiones se cuentan como residuos no idénticos en comparación con una secuencia de referencia. Se incluyen las supresiones que ocurren en cualquiera de los extremos terminales. Por ejemplo, una variante con cinco supresiones de aminoácidos del C-terminal del polipéptido maduro de AcAmyl de sec. con núm. de ident.: 1 tendría un por ciento de identidad de secuencia de 99 % (612 / 617 residuos idénticos x 100, redondeado al número entero más cercano) con relación al polipéptido maduro. Tal variante se abarcaría por una variante que tiene "al menos 99 % de identidad de secuencia" con un polipéptido AcAmyl maduro.
Las secuencias de polipéptidos "fusionadas" están conectadas, es decir, unidas operativamente, a través de un enlace peptídico entre las dos secuencias de polipéptidos.
El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina.
El término "grado de polimerización" (DP, por sus siglas en inlglés) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Los ejemplos de DPI son los monosacáridos glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 son los disacáridos maltosa y sacarosa. El término "DE", o "equivalente de dextrosa", se define como el porcentaje de azúcar reductor, por ejemplo, D-glucosa, como una fracción del carbohidrato total en un jarabe.
Como se usa en la presente descripción, el término "contenido de sólidos secos" (ds, por sus siglas en inlglés) se refiere al total de sólidos de una suspensión en base al por ciento en peso seco. El término "suspensión" se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.
La frase "sacarificación y fermentación simultáneas (SSF)" se refiere a un proceso en la producción de productos bioquímicos en que un organismo microbiano, tal como un microorganismo etanologénico, y al menos una enzima, tal como AcAmyl o una variante de esta, están presentes durante la misma etapa del proceso. SSF incluye la hidrólisis simultánea de sustratos de almidón (granular, licuado, o solubilizado) a sacáridos, que incluyen la glucosa, y la fermentación de los sacáridos a alcohol u otro producto bioquímico o biomaterial en el mismo recipiente reactor.
Como se usa en la presente descripción, "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol.
El término "bebida fermentada" se refiere a cualquier bebida producida mediante un método que comprende un proceso de fermentación, tal como una fermentación microbiana, por ejemplo, una fermentación bacteriana y/o por levadura.
La "cerveza" es un ejemplo de tal bebida fermentada, y el término "cerveza" pretende comprender cualquier mosto fermentado producido por fermentación/elaboración de cerveza de un material vegetal que contiene almidón. Frecuentemente, la cerveza se produce exclusivamente a partir de malta o agente adicional, o cualquier combinación de malta y agente adicional. Los ejemplos de cervezas incluyen: cerveza malteada completa, cerveza fermentada bajo el marco de la "Reinheitsgebot", Ale, IPA, lager, bitter, Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido en alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, stout, licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares, pero, además, bebidas alternativas de cereales y de malta tales como bebidas de malta con sabor a frutas, por ejemplo, bebidas de malta con sabor a cítrico, tal como con sabor a limón, naranja, lima, o baya, bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron, o tequila, o bebidas de malta con sabor a café, tal como el licor de malta con sabor a cafeína, y similares.
El término "malta" se refiere a cualquier grano de cereal malteado, tal como la cebada o el trigo malteados.
El término "agente adicional" se refiere a cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar que no es malteado, tal como la cebada o el trigo malteados. Los ejemplos de agentes adicionales incluyen sémola de maíz común, sémola de maíz refinado, levadura molida de cerveza, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereales torrefactados, hojuelas de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, mandioca y jarabes, tales como jarabe de maíz, jarabe de caña de azúcar, jarabe de azúcar invertido, jarabes de trigo y/o cebada, y similares.
El término "puré" se refiere a una suspensión acuosa de cualquier material vegetal que contiene almidón y/o azúcar, tal como material para moler, por ejemplo, que comprende cebada malteada aplastada, cebada aplastada, y/u otro agente adicional o una combinación de estos, mezclados con agua después de ser separados en mosto y granos gastados.
El término "mosto" se refiere al licor no fermentado derramado tras la extracción del material para moler durante la maceración.
El "almidón con yodo positivo" o "IPS" se refiere a (1) amilosa que no se hidroliza después de la licuación y sacarificación, o (2) un polímero de almidón retrogradado. Cuando se prueba el almidón sacarificado o el licor de sacáridos con yodo, la amilosa con un DPn alto o el polímero de almidón retrogradado se une al yodo y produce un color azul característico. Así el licor de sacáridos se denomina "sacárido positivo al yodo", "sacárido azul," o "sac. azul".
Los términos "almidón retrogradado" o "retrogradación del almidón" se refieren a los cambios que se producen espontáneamente en una pasta de almidón o en el gel durante el envejecimiento.
El término "aproximadamente" se refiere a ± 15 % del valor de referencia. 2. ot-Amilasa de Aspergillus clavatus (AcAmyl) y variantes de esta Se proporciona un polipéptido aislado y/o purificado de AcAmyl de A. clavatus sp. o una variante de esta que tiene actividad a-amilasa. El polipéptido de AcAmyl puede ser el polipéptido maduro de AcAmyl que comprende los residuos 20-636 de la secuencia de polipéptidos representada en la sec. con núm. de ident.: 1. Los polipéptidos pueden fusionarse con secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal y/o C- terminal. Las secuencias adicionales N-terminal pueden ser un péptido señal, que puede tener la secuencia mostrada en la sec. con núm. de ident.: 3, por ejemplo. Otras secuencias de aminoácidos fusionados en cualquiera de los extremos terminales incluyen polipéptidos parejas de fusión útiles para marcar o purificar la proteína.
Por ejemplo, una a-amilasa conocida de A. clavatus es la a-amilasa de NRRL1 de A. clavatus. El precursor de NRRL1 a-amilasa de A. clavatus, es decir, que contiene un péptido señal tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (sec. con núm. de ident.: 1): MKLLALTTAFALLGKGVFGLTPAEWRGQSIYFLITDRFARTDGSTTAPCDLSQRAYCGGSW QGIIKQLDY IQGMGFTAIWITPITEQIPQDTAEGSAFHGYWQKDIYNVNSHFGTADDIRALSKALHDRGM YLMIDW AN HMGYNGPGASTDFSTFTPFNSASYFHSYCPINNYNDQSQVENCWLGDNTVALADLYTQHSD VRNIWYSWI KEIVGNYSADGLRIDTVKHVEKDFWTGYTQAAGVYTVGEVLDGDPAYTCPYQGYVDGVLNY PIYYPLLRA FESSSGSMGDLYNMINSVASDCKDPTVLGSFIENHDNPRFASYTKDMSQAKAVISYVILSD GIPIIYSGQ EQHYSGGNDPYNREAIWLSGYSTTSELYKFIATTNKIRQLAISKDSSYLTSRNNPFYTDSN TIAMRKGSG GSQVITVLSNSGSNGGSYTLNLGNSGYSSGA LVEVYTCSSVTVGSDGKIPVPMASGLPRV LVPASWMSG SGLCGSSSTTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGSCKTATTVPW LEESVRTSYGENI FISGSIPQL GSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYKFLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVP EACAGTSQK VDSSWR.
Ver número de referencia de NCBI XP_001272245.1 (alfa amilasa >gi |121708778|ref|XP_001272245.1|, putativa [Aspergillus clavatus NRRL 1]).
Los aminoácidos en negritas anteriores constituyen un dominio C-terminal de unión a carbohidrato (CBM) (sec. con núm. de ident: 10). Una región enlazadora glicosilada (aminoácidos resaltados, en negritas arriba; sec. con núm. de ident.: 11) conecta el núcleo catalítico N-terminal con el dominio CBM. El dominio CBM en AcAmyl se conserva con un dominio CBM20 encontrado en un gran número de enzimas degradantes de almidón, que incluyen alfa-amilasas, beta-amilasas, glucoamilasas, y ciclodextrina glucanotransferasas. El CBM20 se pliega como una estructura en barril beta antiparalela con dos sitios 1 y 2 de unión al almidón. Se cree que estos dos sitios difieren funcionalmente: el sitio 1 puede actuar como el sitio de reconocimiento inicial del almidón, mientras que el sitio 2 puede estar implicado en el reconocimiento específico de regiones apropiadas del almidón. Ver Sorimachi et al. (1997) "Solution structure of the almidón granular binding domain of Aspergillus niger glucoamylase bound to beta-cyclodextrin, " Structure 5(5): 647-61. Los residuos en el dominio CBM de AcAmyl que se conservan con los sitios de unión al almidón 1 y 2 se indican en la secuencia más abajo por los números 1 y 2, respectivamente: CKTATTVPWLEESVRTSYGENIFISGSIPQLGSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYK 222222 1 1 lili 2 2222 22 FLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVPEACAGTSQKVDSSWR (sec. connúm. de ident.: 10). 1 Una variante de AcAmyl puede comprender algunos o ninguno de los residuos de aminoácidos del dominio CBM de la sec. con núm. de ident.: 10 o el enlazador de la sec. con núm de ident.: 11. Una variante puede comprender, alternativamente, un dominio CBM con al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 98 % de identidad de secuencia con el dominio CBM de la sec. con núm. de ident.: 10. Una variante puede comprender un dominio CBM20 heterólogo o diseñado por ingeniería genética.
La AcAmyl o variante de esta pueden expresarse en una célula hospedera eucariota, por ejemplo, una célula fúngica filamentosa, que permite una glicosilación apropiada de la secuencia enlazadora, por ejemplo.
Un polinucleótido representativo que codifica AcAmyl es la secuencia de polinucleótidos que se expone en la sec. con núm. de ident. : 2. El número de referencia del NCBI ACLA_052920 describe tal polinucleótido. La secuencia de polipéptidos, MKLLALTTAFALLGKGVFG (sec. con núm. de ident.: 3), mostrada en cursiva anteriormente, es un péptido señal N-terminal que se escinde cuando la proteína se expresa en una célula hospedera apropiada.
La secuencia de polipéptidos de la AcAmyl es similar a otras alfa-amilasas fúngicas. Por ejemplo, la AcAmyl tiene una identidad de secuencias alta con las siguientes a-amilasas fúngicas: 77 % de identidad de secuencia con la a-amilasa putativa de Talaromyces stipitatus ATCC 10500 (XP_00248703.1; sec. con núm. de ident.: 4); y 72 % de identidad de secuencia con la proteína AN3402.2 de Aspergí llus nidulans FGSC A4 (XP_661006.1; sec. con núm. de ident.: 5).
La identidad de secuencia se determinó mediante un alineamiento BLAST, mediante el uso de la forma madura de la AcAmyl de la sec. con núm. de ident.: 1 (es decir, los residuos 20-636) como la secuencia de consulta. Ver Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol .215: 403-410.
Se proporciona una variante de un polipéptido AcAmyl. La variante puede consistir en o comprender un polipéptido con al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de los residuos 20-636 o residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la variante comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de una sustitución, inserción, o supresión de uno o más aminoácidos correspondientes en la sec. con núm. de ident.: 4, 5, 12, y/o 13. Por ejemplo, una variante que consiste en un polipéptido con al menos 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 puede tener uno a seis sustituciones, inserciones, o supresiones de aminoácidos, comparado con la AcAmyl de la sec con núm. de ident.: 1. En comparación, una variante que consiste en un polipéptido con al menos 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de los residuos 20-497 de la sec con núm. de ident.: 1 tendría hasta cinco modificaciones de aminoácidos. Las inserciones o supresiones pueden estar en cualquiera de los terminales del polipéptido, por ejemplo.
Alternativamente, la variante puede "comprender" un polipéptido que consiste en un polipéptido con al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de los residuos 20-636 o 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1. En una variante tal, pueden fusionarse residuos de aminoácidos adicionales a cualquiera de los extremos terminales del polipéptido. Por ejemplo, la variante puede comprender la secuencia señal de la sec. con núm. de ident.: 3 fusionada en el marco con un polipéptido con una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos en comparación con el polipéptido de los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.: 1. La variante puede estar glicosilada, independientemente de si la variante "comprende" o "consiste" en una secuencia determinada de aminoácidos.
Un alineamiento ClustalW entre AcAmyl (sec. con núm. de ident.:1) y las a-amilasas a partir de ATCC 10500 de T. stipitatus (sec. con núm. de ident.: 4), A. nidulans FGSC A4 (sec. con núm. de ident.: 5), A. fumigatus Af293 (sec. con núm. de ident.: 12), y A. terreus N1H2624 (sec. con núm. de ident.: 13) se muestran en la Fig. 1. Ver Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Como regla general, el grado en que se conserva un aminoácido en un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas es proporcional a la importancia relativa de la posición del aminoácido con respecto a la función de la proteína. Es decir, los aminoácidos que son comunes en todas las secuencias relacionadas probablemente juegan un papel funcional importante y no pueden sustituirse fácilmente. Igualmente, las posiciones que varían entre las secuencias probablemente pueden sustituirse con otros aminoácidos o modificarse de cualquier otra manera, mientras se mantenga la actividad de la proteína.
Se ha determinado la estructura cristalina de la a-amilasa de A. niger, que incluye un complejo de la enzima con una maltosa unida a su sitio activo. Ver, por ejemplo, Vujicic-Zagar et al. (2006) "Monoclinic crystal form of Aspergillus niger oí-amilasa in complex with maltose at 1.8 Á resolution", Acta Crystallogr. Sect . F: Struct . Biol . Cryst . Commun. 62(8):716-21. La a-amilasa de A. niger descrita en Vujicic-Zagar (2006) se conoce, además, como TAKA-amilasa, un homólogo de la a-amilasa de A. oryzae. La secuencia de aminoácidos de TAKA-amilasa (sec. con núm. de ident.: 6) tiene un 68 % de identidad de secuencia con AcAmyl sobre los residuos 21-497 de AcAmyl, cuando se alinea con el uso del algoritmo BLAST. Dada la relativamente alta conservación de la secuencia de aminoácidos entre la TAKA-amilasa y AcAmyl, se espera que AcAmyl adopte muchas de las estructuras secundarias y posea relaciones estructura/función similares a la TAKA-amilasa. Por ejemplo, se espera que la AcAmyl tenga un sitio de unión a Ca2+ de alta afinidad y una hendidura de unión a la maltosa como TAKA-amilasa. Consistente con esta expectativa, los tres aminoácidos ácidos que participan en la reacción de hidrólisis catalizada por la TAKA-amilasa, D206, E230, y D297, todos se conservan en la AcAmyl silvestre. Las posiciones Y155, L166, D233, y D235, localizadas cerca de la hendidura de unión, también se conservan en AcAmyl. Otras posiciones conservadas de AcAmyl corresponden a N121, E162, D175, y H210 de la TAKA-amilasa, que constituyen el sitio de unión a Ca2+ de alta afinidad. Ver Vujicic-Zagar (2006).
Las alineaciones mostradas en la Fig.1 y las relaciones estructurales comprobadas a partir de la estructura cristalina de la TAKA-amilasa, por ejemplo, pueden guiar la construcción de polipéptidos variantes de AcAmyl que tienen actividad a-amilasa. Los polipéptidos variantes de AcAmyl incluyen, pero no se limita a, aquellos con una modificación de aminoácidos seleccionada de una sustitución, inserción, o supresión de un aminoácido correspondiente en la sec. con núm de ident.: 4, 5, 12, y/o 13. La correspondencia entre las posiciones en AcyAmyl y las oí-amilasas de las sec. con núms. de ident.: 4, 5, 12, y 13 se determina con referencia a la alineación mostrada en la Fig.1. Por ejemplo, un polipéptido variante de AcAmyl puede tener la sustitución de G27S, en donde la serina es el aminoácido correspondiente en las sec. con núms. de ident.: 4, 5, 12, y 13, con referencia a la alineación en la Fig.1. Los polipéptidos variantes de AcAmyl, además, incluyen, pero no se limitan a, aquellos con 1, 2, 3, o 4 modificaciones de aminoácidos seleccionadas al azar. Las modificaciones de aminoácidos pueden producirse mediante el uso de metodologías muy conocidas, tales como la mutagénesis oligo-dirigida.
Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de AcAmyl o variante de esta. Un ácido nucleico que codifica AcAmyl puede ser ADN genómico. 0, el ácido nucleico puede ser un ADNc que comprende la sec. con núm. de ident.: 2. Como entiende un experto en la materia, el código genético es redundante, lo que significa que múltiples codones en algunos casos pueden codificar el mismo aminoácido. Los ácidos nucleicos incluyen todas las secuencias de ADN genómico, ARNm y ADNc que codifican una AcAmyl o variante de esta.
La AcAmyl o variantes de estas puede ser "precursoras", "inmaduras", o "de longitud total", en cuyo caso incluyen una secuencia señal, o "maduras", en cuyo caso, carecen de una secuencia señal. Las variantes de oí-amilasas, además, pueden estar truncadas en los extremos N- o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes conserven la actividad a-amilasa . 2.1. Caracterización de una variante de AcAmyl Los polipéptidos variantes de AcAmyl conservan la actividad a-amilasa. Pueden tener una actividad específica mayor o menor que el polipéptido de AcAmyl silvestre. Las características adicionales de la variante de AcAmyl incluyen estabilidad, intervalo de pH, estabilidad de oxidación y termoestabilidad, por ejemplo. Por ejemplo, la variante puede tener un pH estable por 24-60 horas desde pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, pH 3.0-7.5; pH 3.5-5.5; pH 3.5-5.0; pH 3.5-4.8; pH 3.8-4.8; pH 3.5, pH 3.8, o pH 4.5. Una variante de AcAmyl puede expresarse en niveles más altos que la AcAmyl silvestre, mientras que conserva las características de rendimiento de la AcAmyl silvestre. Las variantes de AcAmyl pueden tener, además, una estabilidad a la oxidación modificada en comparación con la a-amilasa parental. Por ejemplo, una disminución de la estabilidad a la oxidación puede ser favorable en una composición para la licuación del almidón. La variante de AcAmyl puede tener una termoestabilidad alterada en comparación con la a-amilasa silvestre. Tales variantes de AcAmyl son favorables para usarse en el horneado u otros procesos que requieren temperaturas elevadas. Los niveles de expresión y actividad enzimática pueden evaluarse mediante el uso de ensayos estándar conocidos para el experto en este campo, que incluyen los descritos más abajo. La variante de AcAmyl puede tener una o más propiedades bioquímicas, físicas y/o de rendimiento alteradas en comparación con la enzima silvestre. 3. Producción de AcAmyl y variantes de esta La AcAmyl o variante de esta pueden aislarse a partir de una célula hospedera, por ejemplo, mediante la secreción de la AcAmyl o una variante a partir de la célula hospedera. Un material celular cultivado que comprende una AcAmyl o variante de esta puede obtenerse después de la secreción de la AcAmyl o una variante a partir de la célula hospedera. La AcAmyl o variante se purifica opcionalmente antes del uso. El gen AcAmyl puede clonarse y expresarse de conformidad con métodos conocidos en la materia. Las células hospederas adecuadas incluyen células de bacterias, de plantas, de levadura, de algas o de hongos, por ejemplo, células de hongos filamentosos. Las células hospederas particularmente útiles incluyen Aspergillus clavatus o Trichoderma reesei u otros huéspedes fúngicos. Otras células hospederas incluyen células hospederas de bacterias, por ejemplo, Bacillus subtilis o B. licheniformis, de plantas, de algas y de animales.
La célula hospedera puede expresar, además, un ácido nucleico que codifica una glucoamilasa homologa o heteróloga, es decir, una glucoamilasa que no es de la misma especie que la célula hospedera, o una o más enzimas. La glucoamilasa puede ser una variante de glucoamilasa, tal como una de las variantes de glucoamilasa descritas en la patente de los Estados Unidos núm.8,058,033 (Danisco US Inc.), por ejemplo.
Adicionalmente, el huésped puede expresar una o más enzimas, proteínas, péptidos accesorios. Estos pueden beneficiar los procesos de tratamiento previo, licuación, sacarificación, fermentación, SSF, almacenamiento, etc. Además, la célula hospedera puede producir productos bioquímicos además de las enzimas usadas para digerir las diversas materias primas. Tales células hospederas pueden ser útiles para los procesos de fermentación o de sacarificación y fermentación simultáneos para reducir o eliminar la necesidad de adicionar enzimas.
La célula hospedera puede expresar, además, un ácido nucleico que codifica una isoamilasa homologa o heteróloga, es decir, una isoamilasa que no es de la misma especies o género que la célula hospedera, o uno o más enzimas adicionales. La isoamilasa puede ser una variante de isoamilasa o un fragmento de isoamilasa, tal como uno de los descritos en la patente de los Estados Unidos núm.5,352,602, por ejemplo. Adicionalmente, el huésped puede expresar una o más enzimas, proteínas y/o péptidos accesorios. Estos pueden beneficiar los procesos de licuación, sacarificación, fermentación, SSF, almacenamiento, etc. Además, la célula hospedera puede producir productos bioquímicos y/o enzimas que se usan en la producción de un producto bioquímico, además de las enzimas usadas para digerir la o las materias prima de carbono. Tales células hospederas pueden ser útiles para los procesos de fermentación o de sacarificación y fermentación simultáneos para reducir o eliminar la necesidad de adicionar enzimas. 3.1. Vectores Un constructo de ADN que comprende un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o variante de esta puede construirse para expresarse en una célula hospedera. Los ácidos nucleicos representativos que codifican AcAmyl incluyen la sec. con núm de ident.: 2. Debido a la conocida degeneración del código genético, pueden diseñarse variantes de polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos idéntica y pueden fabricarse con experiencia rutinaria. Además, se conoce en la materia el optimizar el uso de codones para una célula hospedera particular. Los ácidos nucleicos que codifican una AcAmyl o variante de esta pueden incorporarse en un vector. Los vectores pueden transferirse a una célula hospedera mediante el uso de téenicas de transformación muy conocidas, tales como las descritas más abajo.
El vector puede ser cualquier vector que puede transformarse a una célula hospedera y puede replicarse dentro de ella. Por ejemplo, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o variante de esta puede transformarse y replicarse en una célula hospedera bacteriana como un medio de propagar y amplificar el vector. Además, el vector puede transformarse en un huésped de expresión, de manera que los ácidos nucleicos codificantes puedan expresarse como una AcAmyl o variante de esta funcionales. Las células hospederas que sirven como huéspedes de expresión pueden incluir hongos filamentosos, por ejemplo. El Catálogo de Cepas del Centro Fungal Genetics Stock Center (FGSC) enumera vectores adecuados para la expresión en células hospederases fúngicas. Ver FGSC, Catalogue of Strains, Universidad de Missouri, en www.fgsc.net (última modificación, 17 de enero de 2007). La Fig. 2 muestra un mapa de un plásmido de un vector representativo, pJG153 (Tex3gM-AcAmyl). pJG153 es un vector de expresión de Cre sin promotor que puede replicarse en un huésped bacteriano. Ver Harrison et al. (junio 2011) Applied Environ. Microbiol . 77: 3916-22. pJG153(Tex3gM-AcAmyl) es un vector de pJG153 que comprende un ácido nucleico que codifica una AcAmyl y que puede expresar el ácido nucleico en una célula hospedera fúngica. pJG153(Tex3gM-AcAmyl) puede modificarse con experiencia rutinaria para comprender y expresar un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o variante.
Un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o una variante de esta puede estar unido operativamente a un promotor adecuado, lo que permite la transcripción en la célula hospedera. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad de transcripción en la célula hospedera elegida y puede derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas a la célula hospedera. Los promotores ilustrativos para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una AcAmyl o variante de esta, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E coli, el gen agarasa de Streptomyces coelicolor los promotores dagA o celA, los promotores del gen a-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los promotores de la a-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la a-amilasa neutra de Aspergillus niger, la a-amilasa estable ácida de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae, o la acetamidasa de A. nidulans . Cuando un gen que codifica una AcAmyl o variante de esta se expresa en una especie bacteriana tal como E. coli, puede seleccionarse un promotor adecuado, por ejemplo, de un promotor bacteriófago que incluye un promotor T7 y un promotor lambda del fago. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura inclúyen, pero no se limitan a, los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores A0X1 o A0X2 de Pichia pastoris. El vector pJG153 representado en la Fig.2, por ejemplo, contiene un promotor cbhl unido operativamente a AcAmyl . cbhies un promotor endógeno, inducible de T. reesei . Ver Liu et al. (2008) "Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene (cbhl) promoter optimization", Acta Biochim. Biophys. Sin ( Shanghai ) 40(2): 158-65.
La secuencia codificante puede unirse operativamente a una secuencia señal. El ADN que codifica la secuencia señal puede ser la secuencia de ADN asociada naturalmente con el gen AcAmyl a expresar. Por ejemplo, el ADN puede codificar la secuencia señal de AcAmyl de la sec. con nú . de ident.: 3 unida operativamente a un ácido nucleico que codifica una AcAmyl o una variante de esta. El ADN codifica una secuencia señal procedente de una especie distinta de A. clavatus . Una secuencia señal y una secuencia promotora que comprenden un constructo o vector de ADN pueden introducirse en una célula hospedera fúngica y pueden derivar de la misma fuente. Por ejemplo, la secuencia señal es la secuencia señal cbhl que está unida operativamente a un promotor cbhl .
Un vector de expresión puede comprender, además, un terminador de transcripción adecuado y, en los eucariotas, secuencias de poliadenilación conectadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica una AcAmyl o variante de esta.
Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse adecuadamente de las mismas fuentes que el promotor El vector puede comprender, además, una secuencia de ADN que permite la multiplicación del vector en la célula hospedera. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBU O, pE194, pAMBl, y pIJ702.
El vector puede comprender, además, un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula hospedera aislada, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o un gen que confiere resistencia a los antibióticos tales como, por ejemplo, resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranlenicol o tetracíclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus, tales como amdS, argB, niaD y xxsC, un marcador que genera resistencia a la higromicina o la selección puede realizarse por cotransformación tal como se conoce en la materia. Ver, por ejemplo, la solicitud internacional del PCT núm. WO 91/17243.
La expresión intracelular puede ser favorable en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se usan ciertas bacterias u hongos como células hospederas para producir grandes cantidades de una AcAmyl o variante de esta para una purificación posterior. Además, la secreción extracelular de la AcAmyl o variante de esta al medio de cultivo puede usarse para producir un material celular cultivado que comprende la AcAmyl o variante de esta aisladas.
El vector de expresión incluye, típicamente, los componentes de un vector de clonación, tal como, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo huésped seleccionado y uno o más marcadores detectables fenotípicamente para propósitos de selección. El vector de expresión comprende, generalmente, secuencias de nucleótidos de control, tal como un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de traducción y, opcionalmente, un gen represor o uno o más genes activadores. Adicionalmente, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos capaz de dirigir a la AcAmyl o variante de esta a un organelo de la célula hospedera tal como un peroxisoma, o a un compartimento particular de la célula hospedera. La secuencia de acceso incluye, pero no se limita a, la secuencia, SKL. Para la expresión bajo la dirección de secuencias control, la secuencia de ácido nucleico de la AcAmyl o variante de esta está unida operativamente a las secuencias control de manera adecuada con respecto a la expresión.
Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN que codifica una AcAmyl o variante de esta, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para replicación, son muy conocidos para las personas con experiencia en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al . , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.° ed., Coid Spring Harbor, 1989, y 3.° ed., 2001). 3.2. Transformación y cultivo de celulas hospederas Una célula aislada, que comprende ya sea un constructo de ADN o un vector de expresión, se usa favorablemente como una célula hospedera en la producción recombinante de una AcAmyl o variante de esta. La célula puede transformarse con el constructo de ADN que codifica la enzima, convenientemente mediante la integración del constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera, generalmente, como una ventaja ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga establemente en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede realizarse de conformidad con métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homologa o heteróloga. Alternativamente, la célula puede transformarse con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en relación con los distintos tipos de células hospederas.
Los ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados son especies de bacterias Gram positiva tales como Bacillaceae que incluyen Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Bacillus lentus , Bacillus brevis , Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, y Bacillus thuringi ensis; especies Streptomyces tales como Streptomyces murinus; especies de bacterias de ácido láctico que incluyen Lactococcus sp. tales como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp. que incluye Lactobacillus reuteri ; Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; y Streptococcus sp. Alternativamente, como organismo huésped pueden seleccionarse especies bacterianas Gram negativas que pertenecen a Enterobacteriaceae y que incluyen E. coli o que pertenecen a Pseudomonadaceae.
Un organismo huésped de levadura adecuado puede seleccionarse de especies de levaduras bioteenológicamente relevantes, tales como, pero sin limitarse a, especies de levadura tales como las especies Pichia sp., Hansenula sp., o Kluyveromyces, Yarrowinia, Schizosaccharomyces o una especie de Saccharomyces, que incluye Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a Schizosaccharomyces tal como, por ejemplo, la especie S. pombe. Una cepa de la especie de levadura metilotrópica, Pichia pastoris puede usarse como el organismo huésped. Alternativamente, el organismo huésped puede ser una especie Hansenula . Los organismos huésped adecuados entre los hongos filamentosos incluyen las especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori, o Aspergillus nidulans . Alternativamente, las cepas de una especie Fusarium, por ejemplo, Fusariu oxysporum o de una especie Rhizomucor tal como Rhizomucor miehei pueden usarse como organismo huésped. Otras cepas adecuadas incluyen las especies Thermomyces y Mucor. Adicionalmente, la Trichoderma sp. puede usarse como un huésped. Un procedimiento adecuado para la transformación de células hospederas de Aspergillus incluye, por ejemplo, el descrito en EP 238023. La AcAmyl o variante de esta expresadas por una célula hospedera fúngica puede estar glicosilada, es decir, la AcAmyl o variante de esta comprenderán una porción glicosilo. El patrón de glicosilación puede ser el mismo que el presente en la AcAmyl silvestre. Alternativamente, el organismo huésped puede ser un huésped de expresión de algas, de bacterias, de levadura o de plantas.
Es favorable eliminar genes de los huéspedes de expresión, en donde la deficiencia del gen puede curarse por el vector de expresión transformado. Pueden usarse métodos conocidos para obtener una célula hospedera fúngica que tiene uno o más genes inactivados. La desactivación de genes podría lograrse mediante eliminación parcial o completa, mediante desactivación insercional o mediante cualquier otro medio que da un gen no funcional para su fin pretendido de manera que se evite que el gen exprese una proteína funcional. Cualquier gen de Trichoderma sp. u otro huésped fúngico filamentoso que se clonó puede eliminarse, por ejemplo, los genes cbhl , cbh2 , egll, y egl2. La supresión de genes puede llevarse a cabo al insertar una forma del gen que se desea inactivar dentro de un plásmido mediante métodos conocidos en la materia.
La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula hospedera incluye téenicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transíección, por ejemplo, transfección mediada por DEAE-dextrina y lipofección; incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN; y fusión de protoplasto. Las técnicas generales de transformación se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (2001), supra. La expresión de la proteína heteróloga en Trichoderma se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 6,022,725. Se hace referencia a Cao et al. (2000) Science 9:991-1001 para la transformación de cepas de Aspergillus . Pueden construirse transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores de manera que el ácido nucleico que codifica una AcA yl o variante de esta se integra establemente en un cromosoma de la cepa huésped. Los transformantes se seleccionan y purifican después por técnicas conocidas.
La preparación de Trichoderma sp. para la transformación, por ejemplo, puede implicar la preparación de protoplastos a partir de micelios fúngicos. Ver Campbell et al. (1989) Curr. Gene t . 16: 53-56. Los micelios pueden obtenerse a partir de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiere la pared celular, lo que resulta en protoplastos. Los protoplastos se protegen por la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro potásico, sulfato magnésico, y similares. Usualmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0.8 M y 1.2 M, por ejemplo, puede usarse una solución de sorbitol de 1.2 M en el medio de suspensión.
La captación de ADN en la cepa de Trichoderma sp. depende de la concentración de iones de calcio. Generalmente, se usa entre aproximadamente 10-50 mM CaCl2 en una solución de captación. Los compuestos adicionales adecuados incluyen un sistema amortiguador, tal como amortiguador TE (Tris 10 mM, pH 7.4; 1 mM EDTA) o 10 mM MOPS, pH 6.0 y polietilenglicol. Se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares y, así, permite que los contenidos del medio se envíen al citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. Esta fusión deja, frecuentemente, múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma huésped.
Usualmente, la transformación de Trichoderma sp. usa protoplastos o células que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad, típicamente, a una densidad de 105 a 107/ml, particularmente 2xl06/ml. Un volumen de 100 ml de estos protoplastos o células en una solución adecuada (por ejemplo, sorbitol 1.2 M y CaCl2 50 mM) puede mezclarse con el ADN deseado. Generalmente, se añade una concentración alta de PEG a la solución de captación. De 0.1 a 1 volumen de 25 % de PEG 4000 puede adicionarse a la suspensión de protoplastos; sin embargo, es útil adicionar aproximadamente 0.25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. Aditivos, tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, spermidina, cloruro de potasio y similares, podrían adicionarse a la solución de captación para facilitar la transformación. Hay disponibles procedimientos similares para otras células hospederas fúngicas. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,022,725. 3.3. Expresión Un método para producir una AcAmyl o variante de esta puede comprender cultivar una célula hospedera como se describió anteriormente bajo condiciones que conducen a la producción de la enzima y recuperar la enzima de las células y/o medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión la expresión de una AcAmyl o variante de esta. El medio y los componentes del medio adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de conformidad con recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos de la American Type Culture Collection).
Una enzima secretada por las células hospederas puede usarse en una preparación de caldo de cultivo completo. En los presentes métodos, la preparación de un caldo de fermentación completo gastado de un microorganismo recombinante puede lograrse mediante el uso de cualquier método de cultivo conocido en la materia que resulte en la expresión de una a-amilasa. Por lo tanto, la fermentación puede comprender el cultivo en un matraz de agitación, fermentación pequeña o gran escala (que incluye fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado, o en estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión o el aislamiento de la celulasa. El término "caldo de fermentación completo gastado" se define en la presente como los contenidos no fraccionados del material de fermentación que incluye medio de cultivo, proteínas extracelulares (por ejemplo, enzimas), y biomasa celular. Se entiende que el término "caldo de fermentación completo gastado" abarca, además, la biomasa celular que se ha lisado o permeabilizado mediante el uso de métodos muy conocidos en la materia.
Una enzima secretada de las células hospederas puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos muy conocidos que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración y, en algunos casos, concentrar el caldo de cultivo depurado. Otros procesos pueden incluir precipitar los componentes proteínicos del medio por medio de una sal, tal como sulfato amónico, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad o similares.
El polinucleótido que codifica AcAmyl o una variante de esta en un vector puede estar unido operativamente a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula hospedera, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias control pueden modificarse, por ejemplo mediante la adición de otros elementos reguladores de la transcripción para hacer que el nivel de transcripción dirigido por las secuencias control sea más sensible a los moduladores transcripcionales. Las secuencias control pueden comprender, particularmente, promotores.
Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas que permitan la expresión de la AcAmyl o variante de esta. La expresión de enzimas puede ser constitutiva de manera que las proteínas se producen continuamente o inducible, es decir, que se requiere un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de la expresión inducible, la producción de proteínas puede comenzar cuando se requiere, por ejemplo, por la adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo, dexametasona o IPTG o Sophorose. Además, los polipéptidos pueden producirse de manera recombinante en un sistema libre de células in vitro, tal como el sistema de reticulocitos de conejo TnT™ (Promega).
Un huésped de expresión puede cultivarse, además, en el medio adecuado para el huésped, bajo condiciones aerobias. Se puede proporcionar agitación o una combinación de agitación y aireación, y la producción ocurre a la temperatura adecuada para ese huésped, por ejemplo, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 75 °C (por ejemplo, 30 °C a 45 °C), dependiendo de las necesidades del hospedero y la producción de AcAmyl deseada o variante de esta. El cultivo puede producirse en aproximadamente 12 a aproximadamente 100 horas o más (y cualquier cantidad de horas entre esos límites, por ejemplo, de 24 a 72 horas). Típicamente, el caldo de cultivo está a un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.0, otra vez dependiendo de las condiciones de cultivo necesarias para huésped con relación a la producción de una AcAmyl o variante de esta. 3.4. Identificación de la actividad AcAmyl Para evaluar la expresión de una AcAmyl o variante de esta en un célula hospedera, los ensayos pueden medir la proteína expresada, el ARNm correspondiente, o la actividad a-amilasa. Por ejemplo, los ensayos adecuados incluyen transferencia de tipo Northern, reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa, e hibridación in situ, mediante el uso de una sonda de hibridación marcada apropiadamente. Los ensayos adecuados incluyen, además, medir la actividad de AcAmyl en una muestra, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente azúcares reductores tales como glucosa en los medios de cultivo. Por ejemplo, la concentración de glucosa puede determinarse mediante el uso del reactivo de glucosa del kit núm. 15-UV (Sigma Chemical Co.) o un instrumento, tal como un Autoanalizador Technicon. La actividad a-amilasa puede medirse, además, mediante cualquier método conocido, tal como los ensayos PAHBAH o ABTS descritos más abajo. 3.5. Métodos para purificar AcAmyl y variantes de esta.
Las téenicas de fermentación, separación, y concentración se conocen bien en la materia y los métodos convencionales pueden usarse con el objetivo de preparar una solución que contiene el polipéptido concentrado de a-amilasa de AcAmyl o una variante.
Después, de la fermentación se obtiene un caldo de fermentación, las células microbianas y varios sólidos suspendidos que incluyen materiales de fermentación crudos residuales se eliminan por téenicas de separación convencionales para obtener una solución de amilasa. Generalmente, se usa filtración, centrifugación, microfiltración, filtración al vacío con tambor rotatorio, ultrafiltración, centrifugación seguido de ultrafiltración, extracción o cromatografía, o similares.
Es deseable concentrar una solución que contiene el polipéptido de la a-amilasa AcAmyl o una variante con el objetivo de optimizar la recuperación. El uso de soluciones no concentradas requiere mayor tiempo de incubación con el objetivo de recoger el precipitado de la enzima purificada.
La solución que contiene la enzima se concentra mediante el uso de técnicas de concentración convencionales hasta que se obtiene el nivel deseado de la enzima. La concentración de la solución que contiene enzimas puede obtenerse por cualquiera de las técnicas consideradas en la presente descripción. Los métodos ilustrativos de purificación incluyen, pero no se limitan a, la filtración rotatoria al vacío y/o ultrafiltración.
La solución enzimática se concentra en una solución enzimática concentrada hasta que la actividad enzimática de la solución concentrada que contiene el polipéptido de la a-amilasa AcAmyl o una variante esté en un nivel deseado.
La concentración puede llevarse a cabo mediante el uso de, por ejemplo, un agente de precipitación, tal como un agente de precipitación de haluro de metal. Los agentes de precipitación de haluros de metal incluyen, pero no se limitan a, metales alcalinos, bromuros de metales alcalinos y mezclas de dos o más de estos haluros de metal. Los haluros de metal ilustrativos incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de potasio y mezclas de dos o más de estos haluros de metal . El agente de precipitación del haluro metálico, cloruro de sodio, puede usarse como un conservador.
El agente de precipitación del haluro metálico se usa en una cantidad eficaz para precipitar la AcAmyl o variante de esta. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima del haluro de metal eficaz en provocar la precipitación de la enzima, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima que incluyen tiempo de incubación, pH, temperatura y concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, después de pruebas de rutina.
Generalmente, una cantidad de al menos aproximadamente 5 % en p/v (peso/volumen) a aproximadamente 25 % en p/v de haluro de metal se añade a la solución concentrada de enzimas y, usualmente, al menos 8 % en p/v. Generalmente, no más de aproximadamente 25 % en p/v de haluro de metal se añade a la solución concentrada de enzimas y, usualmente, no más de aproximadamente 20 % en p/v. La concentración óptima del agente de precipitación de haluro de metal dependerá, entre otros, de la naturaleza del polipéptido específico de la a-amilasa AcA yl o una variante y de su concentración en la solución enzimática concentrada.
Otra forma alternativa para precipitar la enzima es el uso de compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos ilustrativos incluyen: ácido 4-hidroxibenzoico, sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, ásteres alquílicos del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos pueden agregarse antes, simultáneamente o después de agregar el agente de precipitación de haluro de metal y ambos agentes de precipitación, el compuesto orgánico y el haluro de metal, pueden agregarse secuencialmente o simultáneamente.
Generalmente, los agentes de precipitación orgánicos se seleccionan del grupo que consiste en sales de metales alcalinos del ácido 4-hidroxibenzoico, tales como sales de sodio o potasio y ásteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los agentes de precipitación de compuestos orgánicos pueden ser, por ejemplo, ásteres alquílicos lineales o ramificados del ácido 4-hidroxibenzoico en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 10 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos Los compuestos orgánicos ilustrativos son ásteres alquílicos lineales del ácido 4-hidroxibenzoico, en donde el grupo alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Además, puede usarse el áster metílico del ácido 4-hidroxibenzoico, ásteres propílico del ácido 4-hidroxibenzoico, áster butílico del ácido 4-hidroxibenzoico, áster etílico del ácido 4-hidroxibenzoico y mezclas de dos o más de estos compuestos orgánicos. Los compuestos orgánicos incluyen, además, pero no se limitan a, metil áster del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado metil PARABEN), propilo áster del ácido 4-hidroxibenzoico (denominado propil PARABEN) que son, además, agentes conservantes de amilasa. Para descripciones adicionales, ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.5,281,526.
La adición del agente de precipitación de compuestos orgánicos proporciona la ventaja una alta flexibilidad de las condiciones de precipitación con respecto al pH, temperatura, AcAmyl o concentración del polipéptido de a-amilasa variante, concentración del agente de precipitación y tiempo de incubación.
El agente de precipitación de compuestos orgánicos se usa en una cantidad eficaz para mejorar la precipitación de la enzima por medio del agente de precipitación de haluro de metal. La selección de al menos una cantidad eficaz y una cantidad óptima del agente de precipitación de un compuesto orgánico, así como las condiciones de la precipitación para una recuperación máxima que incluyen el tiempo de incubación, el pH, la temperatura y la concentración de la enzima, serán fácilmente evidentes para un experto en la materia, a la luz de la presente descripción, después de pruebas de rutina.
Generalmente, al menos aproximadamente 0.01 % en p/v del agente de precipitación del compuesto orgánico se añade a la solución concentrada de la solución de enzima y, usualmente, al menos aproximadamente 0.02 % en p/v. Generalmente, no más de aproximadamente 0.3 % en p/v del agente de precipitación del compuesto orgánico se añade a la solución de enzimas concentrada y usualmente no más de aproximadamente 0.2 % en p/v.
La solución concentrada del polipéptido, que contiene el agente de precipitación del haluro de metal, y el agente de precipitación del compuesto orgánico, puede ajustarse a un pH, que, por necesidad, dependerá de la enzima a purificar. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel cercano al punto isoeléctrico de la amilasa. El pH puede ajustarse a un pH en el intervalo de aproximadamente 2.5 unidades de pH por debajo del punto isoeléctrico (pl) hasta a aproximadamente 2.5 unidades de pH por encima del punto isoeléctrico.
El tiempo de incubación necesario para obtener un precipitado de enzima purificada depende de la naturaleza de la enzima específica, la concentración de la enzima y el o los agentes de precipitación específico(s) y su concentración Generalmente, el tiempo eficaz para precipitar la enzima es entre aproximadamente 1 a aproximadamente 30 horas; usualmente este no excede de aproximadamente 25 horas. En presencia del agente de precipitación del compuesto orgánico, el tiempo de incubación puede reducirse hasta menos de aproximadamente 10 horas y, en la mayoría de los casos incluso, hasta aproximadamente 6 horas.
Generalmente, la temperatura durante la incubación está entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 50 °C. Usualmente, el metodo se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 45 °C ( por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C). La temperatura óptima para inducir la precipitación varía de conformidad con las condiciones de la solución y el o los agentes de precipitación usados.
La recuperación total del precipitado de enzimas purificado y la eficacia con la cual se realiza el proceso mejoran si se agita la solución que comprende la enzima, el haluro de metal añadido y el compuesto orgánico añadido. La etapa de agitación se realiza durante la adición del haluro de metal y el compuesto orgánico y durante el periodo de incubación posterior. Los métodos de agitación adecuados incluyen agitación mecánica, aireación vigorosa o cualquier téenica similar.
Después, del período de incubación, la enzima purificada se separa después del pigmento disociado y otras impurezas y se recoge mediante técnicas de separación convencionales, tales como filtración, centrifugación, microfiltración, filtración rotatoria al vacío, ultrafiltración, filtración con presión, microf iltración con membrana cruzada, microfiltración con membrana de flujo transversal, o similares. La purificación adicional del precipitado de enzima purificada puede obtenerse al lavar el precipitado con agua. Por ejemplo, el precipitado de enzima purificado se lava con agua que contiene el agente de precipitación de haluro metálico, o con agua que contiene el haluro de metal y los agentes de precipitación del compuesto orgánicos.
Durante la fermentación, un polipéptido de la a-amilasa AcAmyl o una variante se acumula en el caldo de cultivo. Para el aislamiento y la purificación de la a-amilasa de AcAmyl o una variante deseadas, el caldo de cultivo se centrifuga o se filtra para eliminar las células, y el líquido libre de células resultante se usa para la purificación de la enzima. En una modalidad, el caldo libre de células se somete a un desalado mediante el uso de sulfato amónico a aproximadamente 70 % de saturación; la fracción de saturación-precipitación al 7Ó % se disuelve, después, en un amortiguador y se aplica a una columna tal como una columna Sephadex G-100, y se eluye para recuperar la fracción de enzima activa. Para la purificación adicional se puede usar un procedimiento convencional, tal como cromatografía de intercambio de iones.
Las enzimas purificadas son útiles para aplicaciones de lavandería y de limpieza. Por ejemplo, pueden usarse en detergentes y quitamanchas para lavandería. Pueden prepararse como un producto final líquido (solución, suspensión) o sólido (granular, polvo).
Un ejemplo más específico de purificación, se describe en Sumitani et al. (2000) "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal región of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484, y se resume brevemente aquí. La enzima obtenida de 4 litros de un sobrenadante del cultivo de Streptomyces lividans TK24 se trató con (NH4)2S04 a 80 % de saturación. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 10,000 x g (20 min. y 4 °C) y se volvió a disolver en amortiguador Tris/HCl 20 mM (pH 7.0) que contenía CaCl25 mM. Después, el precipitado solubilizado se dializó frente al mismo amortiguador. La muestra dializada se aplicó después a una columna Sephacryl S-200, que se había equilibrado previamente con amortiguador Tris/HCl 20 mM, (pH 7.0), CaCl25 mM, y se eluyó a una velocidad de flujo lineal de 7 ml/h con el mismo amortiguador. Las fracciones de la columna se recogieron y su actividad se evaluó mediante un ensayo enzimático y SDS-PAGE. La proteína se purificó, adicionalmente, como sigue. Una columna Toyopearl HW55 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA; cat. núm. 19812) se equilibró con 20 mM de amortiguador Tris/HCl (pH 7.0) que contenía 5 mM CaCl2 y 1.5 M (NH4)2SO4. La enzima se eluyó con un gradiente lineal del 1.5 a 0 M (NH4)2S04 en amortiguador Tris/HCl 20 mM, pH 7.0 que contenía CaCl2 5 mM. Las fracciones activas se recogieron, y la enzima se precipitó con (NH4)2S04 a 80 % de saturación. El precipitado se recuperó, se volvió a disolver, y se dializó como se describió anteriormente. Después, la muestra dializada se aplicó a una columna Mono Q HR5/5 (Amersham Pharmacia; cat. núm.17-5167-01) equilibrada previamente con amortiguador Tris/HCl 20 mM (pH 7.0) que contenía CaCl25 mM, a una velocidad de flujo de 60 ml/hora. Las fracciones activas se recogen y se añaden a una solución de (NH4)2S041.5 M. Las fracciones activas de la enzima se volvieron a analizar por cromatografía en una columna Toyopearl HW55, como antes, para producir una enzima homogénea como se determinó por SDS-PAGE. Ver Sumitani et al. (2000) Biochem. J. 350: 477-484, para una discusión general del método y las variaciones de este.
Para la recuperación en escala de producción, un polipéptido de la -amilasa AcAmyl o una variante puede purificarse parcialmente como se describió, generalmente, anteriormente al eliminar las células a través de floculación con polímeros. Alternativamente, la enzima puede purificarse mediante microfiltración seguida de concentración por ultrafiltración mediante el uso de membranas y equipos disponibles. Sin embargo, para algunas aplicaciones, la enzima no necesita purificarse, y el caldo de cultivo completo puede U sarse y usarse sin tratamiento adicional. La enzima puede procesarse, después, por ejemplo, en gránulos. 4. Composiciones y usos de AcAmyl y variantes de esta La AcAmyl y sus variantes son útiles para una variedad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la AcAmyl y sus variantes son útiles en un proceso de conversión del almidón, particularmente en un proceso de sacarificación de un almidón que se ha sometido a licuación. El producto final deseado puede ser cualquier producto que puede producirse mediante la conversión enzimática del sustrato de almidón. El producto final puede ser alcohol u, opcionalmente, etanol. El producto final puede ser, además, ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itacónico y otros ácidos carboxílíeos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propánodiol, y biodiesel. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en glucosa y maltosa, que puede usarse en otros procesos, tales como la preparación de HFCS, o que puede convertirse en un número de otros productos útiles, tales como intermedios de ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato; ácido 2-ceto-L-gulonico; 5-ceto-gluconato; y 2,15-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (por ejemplo, lactato, piruvato, succinato, isocitrato, y oxaloacetato); aminoácidos (por ejemplo, serina y glicina); antibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; y hormonas.
El proceso de conversión de almidón puede ser un precursor de, o simultáneo con, un proceso de fermentación diseñado para producir alcohol para combustible o para bebida (es decir, alcohol potable). Una persona con experiencia en la materia es consciente de las diversas condiciones de fermentación que pueden usarse en la producción de estos productos finales. La AcAmyl y variantes de esta son útiles, además, en composiciones y métodos de preparación de alimentos. Estos diversos usos de AcAmyl y sus variantes se describen con más detalle más abajo. 4.1. Preparación de sustratos de almidón Las personas con experiencia general en la materia conocen los métodos disponibles que podrían usarse para preparar sustratos de almidón para usar en los procesos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un sustrato de almidón útil podría obtenerse de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o granos enteros. Más específicamente, el almidón granular puede obtenerse de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mijo, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, chícharos, frijoles, plátanos o papas. El maíz contiene aproximadamente 60-68 % de almidón; la cebada contiene aproximadamente 55-65 % de almidón; el mijo contiene aproximadamente 75-80 % de almidón; el trigo contiene aproximadamente 60-65 % de almidón; y el arroz pulido contiene 70-72 % de almidón. Los sustratos de almidón contemplados específicamente son almidón de maíz y almidón de trigo. El almidón de un grano podría estar molido o entero e incluye sólidos de maíz, tales como granos, salvado y/o mazorcas. El almidón podría ser almidón sin procesar refinado o materia prima de procesos de refinería de almidón. Se encuentran disponibles comercialmente, además, varios almidones. Por ejemplo, el almidón de maíz podría encontrarse disponible de Cerestar, Sigma, y Katayama Chemical Industry Co. (Japón); el almidón de trigo está disponible de Sigma; el almidón de camote está disponible de Wako Puré Chemical Industry Co. (Japón); y el almidón de papa está disponible de Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japón).
El sustrato de almidón puede ser un almidón crudo de grano entero molido, el cual contiene fracciones sin almidón, por ejemplo, fibras y residuos de germen. La molienda puede comprender la molienda en húmedo o la molienda en seco o triturado. En la molienda en húmedo, el grano entero puede empaparse en agua o ácido diluido para separar el grano en sus partes componentes, por ejemplo, almidón, proteína, germen, aceite, fibras de granos. La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (por ejemplo, gránulos de almidón y proteína) y es especialmente adecuada para la producción de jarabes. En la molienda en seco o triturado, los granos enteros se trituran para formar un polvo fino y, frecuentemente, se procesan sin fraccionar el grano en sus partes componentes. En algunos casos, el aceite de los granos se recupera. El grano molido en seco comprenderá, entonces, cantidades significativas de compuestos de carbohidratos sin almidón además del almidón. El triturado en seco del sustrato de almidón puede usarse para la producción de etanol y otros productos bioquímicos. El almidón que se va a procesar podría ser una calidad de almidón altamente refinado, por ejemplo, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, o al menos 99.5 % puro. 4.2. Gelatinización y licuación del almidón Como se usan en la presente descripción, los términos "licuación" o "licuar" se refieren a un proceso por el cual el almidón se convierte a dextrinas menos viscosas y de cadena más corta. Generalmente, este proceso implica la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguida de la adición de una a-amilasa aunque, opcionalmente, pueden añadirse enzimas inductoras de licuación adicionales. En algunas modalidades, el sustrato de almidón preparado como se describió anteriormente se remoja con agua. La suspensión de almidón puede contener almidón como un por ciento en peso de sólidos secos de aproximadamente 10-55 %, aproximadamente 20-45 %, aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 %, o aproximadamente 30-35 %. La a-amilasa (EC 3.2.1.1) puede añadirse a la suspensión, con una bomba dosificadora, por ejemplo. La a-amilasa que se usa, típicamente, para esta aplicación es una a-amilasa bacteriana, térmicamente estable, tal como una oí-amilasa de Geobacillus stearothermophilus. La a-amilasa se suministra usualmente, por ejemplo, a aproximadamente 1500 unidades por kg de materia seca de almidón. Para optimizar la estabilidad y actividad de la a-amilasa, el pH de la suspensión se ajusta, típicamente, a aproximadamente pH 5.5-6.5 y, típicamente, se añade aproximadamente 1 mM de calcio (aproximadamente 40 ppm iones de calcio libres). Las variantes de Geobacillus stearothermophilus u otras a-amilasas pueden requerir condiciones diferentes. La a-amilasa bacteriana restante en la suspensión después de la licuación puede desactivarse a través de un número de métodos, que incluyen la reducción del pH en una etapa de reacción subsecuente o mediante la eliminación de calcio de la suspensión en los casos en que la enzima es dependiente de calcio.
La suspensión de almidón más la a-amilasa puede ser bombeada continuamente a través de una cocina a chorro, que es vapor de agua calentado a 105 °C. La gelatinización sucede rápidamente bajo estas condiciones, y la actividad enzimática, combinada con las fuerzas de cizallamiento significativas, comienza la hidrólisis del sustrato de almidón. El tiempo de permanencia en la cocina a chorro es breve. El almidón parcialmente gelatinizado podría pasarse a una serie de tubos de retención mantenidos a 105-110 °C y mantenerse durante 5-8 min para completar el proceso de gelatinización ("licuación primaria"). La hidrólisis al DE requerido se completa en tanques de almacenamiento a 85-95 °C o temperaturas más altas durante aproximadamente 1 a 2 horas ("licuación secundaria"). Estos tanques podrían contener deflectores para desalentar un mezclado posterior. Como se usa en la presente descripción, el término "minutos de licuación secundaria" se refiere al tiempo transcurrido desde el inicio de la licuación secundaria hasta el momento en que se mide el equivalente de dextrosa (DE, por sus siglas en inglés). La suspensión se deja enfriar después a temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede ser de 30 minutos a 180 minutos, por ejemplo 90 minutos a 120 minutos.
El almidón liquidificado resultante del proceso anterior contiene, típicamente, aproximadamente 98 % de oligosacáridos y aproximadamente 2 % de maltosa y 0.3 % de D-glucosa. El almidón liquidificado está, típicamente, en la forma de una suspensión que tiene un contenido de sólidos secos (p/p) de aproximadamente 10-50 %,- aproximadamente 10-45 %; aproximadamente 15-40 %; aproximadamente 20-40 %; aproximadamente 25-40 %; o aproximadamente 25-35 %.
La AcAmyl y variantes de esta pueden usarse en un proceso de licuación en lugar de a-amilasas bacterianas. La licuación con AcAmyl y variantes de esta puede llevarse a cabo favorablemente a un pH bajo, lo que elimina el requisito de ajustar el pH a un pH de aproximadamente 5.5-6.5. La AcAmyl y variantes de esta pueden usarse para la licuación en un intervalo de pH de 2 a 7, por ejemplo, pH 3.0-7.5, pH 4.0-6.0, o pH 4.5-5.8. La AcAmyl y variantes de esta pueden mantener la actividad de licuación en un intervalo de temperatura de aproximadamente 80 °C-95 °C, por ejemplo, 85 °C, 90 °C, o 95 °C. Por ejemplo, la licuación puede realizarse con 800 mg de AcAmyl o una variante de esta en una solución de almidón de maíz DS al 25 % por 10 min a pH 5.8 y 85 °C, o pH 4.5 y 95 °C, por ejemplo. La actividad de licuación puede ensayarse mediante el uso de un número de ensayos de viscosidad conocidos en la materia. 4.3. Sacarificación El almidón liquidificado puede sacarificarse en un jarabe rico en sacáridos de DP inferiores (por ejemplo, DPI + DP2) con el uso de la isoamilasa y la AcAmyl y variantes de estas, opcionalmente, en presencia de otra enzima o enzimas. La composición exacta de los productos de sacarificación depende de la combinación de las enzimas usadas, así como el tipo de almidón granular procesado. Favorablemente, el jarabe obtenible mediante el uso de la AcAmyl y variantes de esta proporcionadas pueden contener un porcentaje en peso de DP2 de los oligosacáridos totales en el almidón sacarificado superior a 30 %, por ejemplo, 45 % - 65 % o 55 % - 65 %. El porcentaje en peso de (DPI + DP2) en el almidón sacarificado puede exceder aproximadamente 70 %, por ejemplo, 75 % - 85 % o 80 % - 85 %. La AcAmyl o sus variantes en combinación con una isoamilasa producen, además, una producción relativamente alta de glucosa, por ejemplo, DPI > 20 %, en el producto jarabe.
Mientras que la licuación se ejecuta, generalmente, como un proceso continuo, la sacarificación se realiza, frecuentemente, como un proceso discontinuo. La sacarificación es, típicamente, más eficaz a temperaturas de aproximadamente 60-65 °C y un pH de aproximadamente 4.0-4.5, por ejemplo, pH 4.3, que necesita refrigeración y ajuste del pH del almidón liquidificado. La sacarificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura entre aproximadamente 30 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 50 °C o aproximadamente 55 °C y aproximadamente 60 °C o aproximadamente 65 °C. La sacarificación se lleva a cabo normalmente en tanques agitados, los que pueden tomar varias horas para llenarse o vaciarse. Las enzimas se añaden, típicamente, ya sea en una relación fija con respecto a los sólidos secos a medida que los tanques se llenan o se añaden como una dosis única al comienzo de la etapa de llenado. Una reacción de sacarificación para hacer un jarabe se ejecuta, típicamente, aproximadamente por 24-72 horas, por ejemplo, 24-48 horas. Cuando se ha alcanzado un DE máximo o deseado, la reacción se detiene mediante calentamiento a 85 °C durante 5 min, por ejemplo. Una incubación adicional resultará en un DE inferior, eventualmente, en aproximadamente 90 DE, ya que la glucosa acumulada se vuelve a polimerizar a isomaltosa y/u otros productos de reversión a través de una reacción enzimática de reversión y/o con el enfoque del equilibrio termodinámico. Cuando se usa un polipéptido AcAmyl o variantes de este, la sacarificación se lleva a cabo, óptimamente, a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C, por ejemplo, 45 °C-75 °C o 47 °C-74 °C. La sacarificación pude llevarse a cabo en un intervalo de pH de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, pH 3.0-pH 7.5, pH 3.5-pH 5.5, pH 3.5, pH 3.8, o pH 4.5.
La AcAmyl o una variante de esta y/o isoamilasa puede agregarse, además , a la suspensión en forma de una composición. AcAmyl o una variante de esta pueden añadirse a la suspensión de un sustrato de almidón granular en una cantidad de aproximadamente 0.6-10 ppm ds, por ejemplo, 2 ppm ds. La AcAmyl o variante de esta pueden añadirse como una enzima purificada, parcialmente purificada, clarificada, o en el caldo completo. La actividad específica de la AcAmyl o variante de esta purificadas puede ser de aproximadamente 300 U/mg de enzima, por ejemplo, medida con el ensayo PAHBAH. La AcAmyl o variante de esta pueden añadirse, además, como un producto de caldo completo.
La AcAmyl o una variante de esta y/o una isoamilasa puede agregarse a la suspensión como una solución enzimática aislada. Por ejemplo, la AcAmyl o una variante de esta y/o una isoamilasa puede agregarse en forma de un material de células cultivadas producido por células hospederas que expresan la AcAmyl o variante de esta y/o una isoamilasa. La AcAmyl o una variante de esta y/o una isoamilasa puede ser, además, secretada por una célula hospedera en el medio de reacción durante el proceso de fermentación o SSF, de manera que la enzima se proporciona de manera continua en la reacción. La célula hospedera que produce y secreta la AcAmyl o una variante puede, además, expresar una enzima adicional, tal como una glucoamilasa y/o una isoamilasa. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm.5,422,267 describe el uso de una glucoamilasa en levadura para la producción de bebidas alcohólicas. Por ejemplo, una célula hospedera, por ejemplo, Trichoderma reesei o Aspergillus niger, puede diseñarse para coexpresar AcAmyl o una variante de esta y una glucoamilasa, por ejemplo, HgGA, TrGA o una variante de TrGA, y/o una isoamilasa y/u otras enzimas durante la sacarificación. La célula hospedera puede modificarse genéticamente para no expresar su glucoamilasa endógena y/o isoamilasa y/u otras enzimas, proteínas u otros materiales. La célula hospedera puede modificarse por ingeniería genética para expresar un amplio espectro de diversas enzimas sacarolíticas. Por ejemplo, la célula hospedera de levadura recombinante puede comprender ácidos nucleicos que codifican una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una enzima que usa azúcar pentosa, una a-amilasa, una pululanasa, beta amilasa, una isoamilasa y/o una isopululanasa, y/u otras enzimas hidrolíticas, y/u otras enzimas de beneficio en el proceso. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2011/153516 A2. 4.4. Isomerización El hidrolisato de almidón soluble producido por el tratamiento con AcAmyl o variantes de esta y/o isoamilasa puede convertirse en jarabe a base de almidón con alto contenido de frutosa (HFSS, por sus siglas en inglés), tal como un jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (HFCS, por sus siglas en inglés). Para esta conversión se puede usar una glucosa isomerasa, particularmente, una glucosa isomerasa inmovilizada sobre un soporte sólido. El pH aumenta a aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, por ejemplo, pH 7.5, y el Ca2+ se elimina por intercambio de iones. Las isomerasas adecuadas incluyen Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, y G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 líquido, y GenSweet® IGI. Después de la isomerización, la mezcla contiene, típicamente, aproximadamente 40-45 % de fructosa, por ejemplo, 42 % de fructosa. 4.5. Fermentación El hidrolizado de almidón soluble, particularmente un jarabe rico en glucosa, puede fermentarse al poner en contacto el hidrolizado de almidón con un organismo fermentativo, típicamente, a una temperatura de aproximadamente 32 °C, tal como de 28 °C a 65 °C. Los productos de EOF incluyen metabolitos. El producto final puede ser alcohol u, opcionalmente, etanol. El producto final puede ser, además, ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itacónico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso de omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol y biodiesel.
Los microorganismos etanologénicos incluyen levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae y bacterias, por ejemplo, Zymomonas moblis, que expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa. Los microorganismos etanologénicos pueden expresar xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, que convierten la xilosa a xilulosa. Las cepas mejoradas de microorganismos etanologénicos, que pueden soportar temperaturas más altas, por ejemplo, se conocen en la materia y pueden usarse. Ver Liu et al. (2011) Sheng Nu Gong Cheng Xue Bao 27(7): 1049-56. Las fuentes comerciales de levadura incluyen ETHANOL RED® (LeSaffre); Thermosacc® (Lallemand); RED STAR® (Red Star) ; FERMIOL® (DSM Specialties); y SUPERSTART® (Alltech). Los microorganismos que producen otros metabolitos, tales como ácido cítrico y ácido láctico, por fermentación se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Papagianni (2007) "Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger : productos bioquímicos aspects, membrane transport and modeling", Biotechnol . Adv. 25(3): 244-63; John et al. (2009) "Direct lactic acid fermentation: focus on simultaneous saccharification and lactic acid production", Biotechnol . Adv. 27(2): 145-52.
Los procesos de sacarificación y fermentación pueden llevarse a cabo como un proceso de SSF. La fermentación puede comprender una subsecuente purificación y recuperación de etanol, por ejemplo. Durante la fermentación, el contenido de etanol del caldo o la "cerveza" puede alcanzar aproximadamente 8-18 % en v/v, por ejemplo, 14-15 % en v/v. El caldo puede destilarse para producir soluciones enriquecidas de etanol, por ejemplo, 96 % de pureza. Adicionalmente, el CO2 generado por la fermentación puede recogerse con un depurador de CO2, comprimirse, y comercializarse para otros usos, por ejemplo, bebidas carbonatadas o producción de hielo seco. Los residuos sólidos a partir del proceso de fermentación pueden usarse como productos ricos en proteínas, por ejemplo, para la alimentación del ganado.
Como se mencionó anteriormente, un proceso SSF puede llevarse a cabo con células fúngicas que expresan y secretan AcAmyl o sus variantes continuamente a lo largo de SSF. Además, las células fúngicas que expresan AcAmyl o sus variantes pueden ser el microorganismo fermentativo, por ejemplo, un microorganismo etanologénico. Así la producción de etanol puede llevarse a cabo mediante el uso de una célula fúngica que expresa suficiente AcAmyl o sus variantes de manera que menos o ninguna enzima tenga que añadirse exógenamente. La célula hospedera fúngica puede ser a partir de una cepa fúngica diseñada apropiadamente. Pueden usarse, además, las células hospederases fúngicas que expresan y secretan otras enzimas, además, de AcAmyl o sus variantes. Tales1células pueden expresar glucoamilasa y/o una pululanasa, hexocinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, proteasa, b-amilasa, a-amilasa, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, trehalasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa u otras hidrolasas, otra enzima, o una combinación de estas. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/099783.
Una variación de este proceso es un sistema de "fermentación semicontinua", en donde el sustrato se añade en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión por catabolito puede inhibir el metabolismo de las células, y en donde se prefiere tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La concentración real de sustrato en los sistemas semicontinuos se estima por los cambios de los factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto y presión parcial de los gases de desecho, tales como CO2. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y muy conocidas en la materia.
La fermentación continua es un sistema abierto en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente en un biorreactor, y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua, generalmente, mantiene los cultivos a una densidad alta constante, en donde las células se encuentran, principalmente, en crecimiento de fase logarítmica. La fermentación continua permite la modulación del crecimiento de la célula y/o la concentración del producto. Por ejemplo, un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno, se mantiene a una velocidad fija y esto permite moderar todos los otros parámetros. Debido a que el crecimiento se mantiene en un estado de equilibrio, la pérdida de células debido a la retirada de medio debe balancearse con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para optimizar los procesos de fermentación continua y maximizar la tasa de formación de producto se conocen en la materia de la microbiología industrial. 4.6. Composiciones que comprenden AcAmyl o variantes de esta La AcAmyl o variantes de esta y/o una isoamilasa pueden combinarse con una glucoamilasa (EC 3.2.1.3), por ejemplo, una glucoamilasa de Trichoderma o variante de esta. Una glucoamilasa ilustrativa es la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA) y variantes de esta que poseen actividad específica y estabilidad térmica superiores. Ver las solicitudes publicadas núms. 2006/0094080, 2007/0004018, y 2007/0015266 (Danisco US Inc.). Las variantes adecuadas de TrGA incluyen aquellas con actividad glucoamilasa y al menos 80 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la TrGA silvestre. La AcAmyl y sus variantes aumentan favorablemente el rendimiento de glucosa producida en un proceso de sacarificación catalizada por TrGA.
Alternativamente, la glucoamilasa puede ser otra glucoamilasa derivada de plantas, hongos o bacterias. Por ejemplo, las glucoamilasas pueden ser la glucoamilasa G1 o G2 de Aspergillus niger o sus variantes (por ejemplo, Boel et al (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; patente núm. WO 92/00381; patente núm. WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S)); y una glucoamilasa de A. awamori (por ejemplo, patente núm. WO 84/02921 (Cetus Corp.)). Otras glucoamilasas de Aspergillus contempladas incluyen las variantes con estabilidad térmica mejorada, por ejemplo, G137A y G139A (Chen et al. (1996) Prot Eng. 9: 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995) Prot .
Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994) Biochem. J. 301: 275-281); A246C (Fierobe et al. (1996) Biochemistry, 35: 8698-8704); y las variantes con residuos de Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204). Otras glucoamilasas contempladas incluyen las glucoamilasas de Talaromyces, particularmente, derivadas de T emersonii (por ejemplo, la patente núm. WO 99/28448 (Novo Nordisk A/S), de T. leycettanus (por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. RE 32,153 (CPC International, Inc.)), de T. duponti , o T. thermophilus (por ejemplo, la patente de los EE UU. núm. 4,587,215). Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, particularmente, C. thermoamylolyticum (por ejemplo, EP 135,138 (CPC International, Inc). y C. thermohydrosulfuricum (por ejemplo, patente núm. WO 86/01831 (Michigan Biotechnology Institute)). Las glucoamilasas adecuadas incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus oryzae, tal como una glucoamilasa que se muestra en la sec. con núm. de ident.:2 en la patente núm. WO 00/04136 (Novo Nordisk A/S) Además, son adecuadas las glucoamilasas comerciales, tales como AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER y AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 y OPTIDEX L-400 (Danisco US Inc.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); y G-ZYME® G990 ZR (glucoamilasa de A. niger con un bajo contenido de proteasa). Todavía otras glucoamilasas adecuadas incluyen glucoamilasa de Aspergillus fumigatus, glucoamilasa de Talaromyces, glucoamilasa de Thielavia, glucoamilasa de Trametes, glucoamilasa de Thermomyces, glucoamilasa de Athelia, o glucoamilasa de Humicola (por ejemplo, HgGA). Las glucoamilasas típicamente se añaden en una cantidad de aproximadamente 0.1-2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds, por ejemplo, aproximadamente 0.16 GAU/g ds, 0.23 GAU/g ds, o 0.33 GAU/g ds.
Particularmente, las glucoamilasas como se contemplan en la presente descripción pueden usarse para procesos de conversión de almidón y, particularmente, en la producción de dextrosa para jarabes de fructosa, azúcares de especialidad y en alcohol y otros productos finales (por ejemplo, producción de ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros productos bioquímicos) a partir de la fermentación de sustratos que contienen almidón (por ejemplo, G.M.A. van Bcynum et al., Eds. (1985) STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc. NY; ver, además, la patente de los Estados Unidos núm. 8,178,326). La variante de glucoamilasa contemplada puede funcionar, además, sinérgicamente con enzimas vegetales producidas de manera endógena o modificadas genéticamente. Adicionalmente, la variante de glucoamilasa contemplada puede funcionar sinérgicamente con enzimas endógenas, modificadas, secretadas o no secretadas a partir de un huésped que produce el producto final deseado (por ejemplo, ácidos orgánicos, aminoácidos, biocombustibles y otros productos bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a, etanol, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, ácido itacónico y otros ácidos carboxílicos, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, lisina, ácido graso omega 3, butanol, isopreno, 1,3-propanodiol, y biodiesel). Además, las células hospederas que expresan la variante de glucoamilasa contemplada pueden producir productos bioquímicos además de las enzimas usadas para digerir las diversas materias primas. Tales células hospederas pueden ser útiles para los procesos de fermentación o de sacarificación y fermentación simultáneos para reducir o eliminar la necesidad de adicionar enzimas.
Otras enzimas adecuadas que pueden usarse con AcAmyl o sus variantes incluyen otra glucoamilasa, hexocinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, proteasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, trehalasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa u otras hidrolasas, o una combinación de estas. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2009/099783. Por ejemplo, una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68), puede agregarse en cantidades eficaces bien conocidas para la persona con habilidad en la materia. Una pululanasa (E.C.3.2.1.41), por ejemplo, Promozyme®, también es adecuada. Típicamente, la pululanasa se añade a 100 U/kg ds. Otras enzimas adecuadas incluyen proteasas, tales como proteasas de hongos, de levadura y de bacterias, proteasas de plantas y proteasas de algas. Las proteasas fúngicas incluyen aquellas obtenidas a partir de Aspergillus, tales como A. niger, A. awamori, A. oryzae; Mucor (por ejemplo, M. miehei) ; Rhizopus; y Tri choderma .
Las b-amilasas (EC 3.2.1.2) son exoamilasas maltogénicas que catalizan la hidrólisis de enlaces 1,4-a-glucosídicos a amilopectina y polímeros de glucosa relacionados, que de esta manera libera la maltosa. Las b amilasas se han aislado a partir de varias plantas y microorganismos. Ver Fogarty et al (1979) en PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol.15, págs.112- 115. Estas b-amilasas tienen temperaturas óptimas en el intervalo de 40 °C a 65 °C y pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.0. Las b-amilasas contempladas incluyen, pero no se limitan a, b-amilasas de cebada Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc.); y Novozym™ WBA (Novozymes A/S). 5. Composiciones y métodos para hornear y preparar alimentos La presente invención se relaciona, además, con una "composición alimenticia" que incluye, pero no se limita a, un producto alimenticio, alimento para animales y/o aditivos para los alimentos/alimenticios que comprenden una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa, y métodos para preparar tal composición alimenticia que comprenden mezclar AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa con uno o más ingredientes alimenticios, o usos de estos.
Además, la presente invención se relaciona con el uso de una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa en la preparación de una composición alimenticia, en donde la composición alimenticia se hornea después de la adición del polipéptido de la presente invención. Como se usa en la presente descripción el término "composición para hornear" significa cualquier composición y/o aditivo preparado en el proceso de proporcionar un producto alimenticio horneado, que incluye, pero no se limita a, harina de panadería, una masa, un aditivo para hornear y/o un producto horneado. La composición alimenticia o aditivo pueden ser líquidos o sólidos.
Como se usa en la presente descripción, el término "harina" significa grano de cereal molido o triturado. El término "harina" puede significar, además, productos de Sago o de tubérculos que se han molido o hecho puré. Además, en algunas modalidades, la harina puede contener componentes, además, de la materia vegetal o de cereal molido o hecho puré Un ejemplo de un componente adicional, aunque no pretende ser limitante, es un agente termentador. Los granos de cereales incluyen trigo, avena, centeno y cebada. Los productos de tubérculo incluyen harina de tapioca, harina de mandioca, y polvo de cremas. El término "harina" incluye, además, harina de maíz molido, harina gruesa de maíz, harina de arroz, harina integral, harina con levadura, harina de tapioca, harina de mandioca, arroz molido, harina enriquecida, y polvo de cremas.
Para el uso comercial y doméstico de la harina para hornear y la producción de alimentos, es importante mantener un nivel adecuado de actividad a-amilasa en la harina. Un nivel de actividad que es demasiado alto puede resultar en un producto que es pegajoso y/o pastoso y, por lo tanto, no comercializable. La harina con insuficiente actividad a-amilasa puede no contener suficiente azúcar para una función adecuada de levadura, lo que resulta en pan desmenuzable, o productos horneados, secos. En consecuencia, una AcAmyl o variante de esta, por sí misma o en combinación con otra(s) a-amilasa(s), puede añadirse a la harina para aumentar el nivel de actividad endógena de a-amilasa en la harina.
Una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa pueden agregarse, además, solas o en una combinación con otras amilasas para prevenir o retardar el enranciamiento, es decir, la dureza de las migas de productos horneados. La cantidad de amilasa contra el enranciamiento estará, típicamente, en el intervalo de 0.01-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0.5 mg/kg ds. Las amilasas contra el enranciamiento adicionales que pueden usarse en combinación con una AcAmyl o variante de esta incluyen una endo-amilasa, por ejemplo, una endo-amilasa bacteriana de Bacillus . La amilasa adicional puede ser otra a-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133), por ejemplo, a partir de Bacillus. Novamyl® es una a-amilasa maltogénica ilustrativa de B. stearothermophilus cepa NCIB 11837 y se describe en Christophersen et al. (1997) Starch 50: 39-45. Otros ejemplos de endo-amilasas contra el enranciamiento incluyen a-amilasas bacterianas derivadas de Bacillus, tal como B . licheniformis o B. amyloliquefaciens. La amilasa contra el enranciamiento puede ser una exo-amilasa, tal como una b-amilasa, por ejemplo, a partir de fuentes vegetales, tales como la soja, o a partir de fuentes microbianas, tal como de Bacillus .
La composición para hornear que comprende una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa puede comprender, además, una fosfolipasa o enzima con actividad de fosfolipasa. Una enzima con actividad fosfolipasa tiene una actividad que puede medirse en unidades de lipasa (LU). La fosfolipasa puede tener una actividad Ai o A2 para eliminar los ácidos grasos de los fosfolípidos, lo que forma un lisofosfolípido. Puede o puede no tener actividad de lipasa, es decir, actividad sobre sustratos de triglicéridos. La fosfolipasa tiene, típicamente, una temperatura óptima en el intervalo de 30-90 °C, por ejemplo, 30-70 °C. Las fosfolipasas adicionadas pueden ser de origen animal, por ejemplo, a partir de páncreas, por ejemplo, páncreas bovino o porcino, de veneno de serpiente o de veneno de abeja. Alternativamente, la fosfolipasa puede ser de origen microbiano, por ejemplo, a partir de hongos filamentosos, levaduras o bacterias, por ejemplo.
La fosfolipasa se añade en una cantidad que mejora la suavidad del pan durante el período inicial después del horneado, particularmente las primeras 24 horas. La cantidad de fosfolipasa estará, típicamente, en el intervalo de 0.Olio mg de proteína enzimática por kg de harina, por ejemplo, 0.1-5 mg/kg. Es decir, la actividad fosfolipasa estará, generalmente, en el intervalo de 20-1000 LU/kg de harina, en donde una unidad de 1ipasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 mmo? de ácido butírico por minuto a 30 °C, H 7.0, con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.
Las composiciones de masa comprenden, generalmente, harina gruesa de trigo o harina de trigo y/u otros tipos de harina gruesa, harina o almidón tal como harina de maíz, almidón de maíz, harina gruesa de centeno, harina de centeno, harina de avena, harina gruesa de avena, harina de soja, harina gruesa de sorgo, harina de sorgo, harina gruesa de papa, harina de papa o almidón de papa. La masa puede estar fresca, congelada u parcialmente horneada. La masa puede ser una masa fermentada o una masa que se va a someter a fermentación. La masa puede fermentarse de varias maneras, tal como por adición de agentes químicos de fermentación, por ejemplo, bicarbonato sódico o por adición de un termentador, es decir, una masa termentadora. La masa puede fermentarse, además, por adición de un cultivo de levadura adecuado, tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero), por ejemplo, una cepa disponible comercialmente de S. cerevisiae.
La masa puede comprender, además, otros ingredientes de masa convencionales, por ejemplo, proteínas, tales como leche en polvo, gluten y soja; huevos (por ejemplo, huevos enteros, yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante, tal como ácido ascórbico, bromato potásico, yodato potásico, azodicarbonamida (ADA) o persulfato amónico; un aminoácido tal como L-cisteína; un azúcar; o una sal, tal como cloruro sódico, acetato cálcico, sulfato sódico o sulfato cálcico. La masa puede comprender, además, por ejemplo, triglicéridos, tales como grasa granulada o manteca. La masa adicionalmente puede comprender un emulsionante tal como mono o diglicéridos, ásteres de ácido diacetil tartárico y mono o diglicéridos, ásteres de azúcar y ácidos grasos, ásteres de poliglicerol y ácidos grasos, ásteres de ácido láctico y monoglicéridos, ásteres de ácido acético y monoglicéridos, estearatos de polioxietileno, o lisolecitina. Particularmente, la masa puede obtenerse sin adición de emulsionantes.
El producto de masa puede ser cualquier producto de masa procesada, que incluye masas fritas, refritas, asadas, horneadas, al vapor y cocidas, tales como tortas de pan y arroz al vapor. En una modalidad, el producto alimenticio es un producto de panadería. Los productos típicos de panadería (horneados) incluyen pan, tales como barras de pan, bollos, panecillos, roscos, bases de pizza, etc. pasteles, galletas saladas, tortillas, tortas, galletas dulces, bizcochos, galletitas, etc.
Opcionalmente, una enzima adicional puede usarse junto con la amilasa contra el enranciamiento y la fosfolipasa. La enzima adicional puede ser una segunda amilasa, tal como una amiloglucosidasa, una b-amilasa, una ciclodextrina glucanotransferasa, o la enzima adicional puede ser una peptidasa, particularmente, una exopeptidasa, una transglutaminasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una proteasa, una proteína disulfuro isomerasa, por ejemplo, una proteína disulfuro isomerasa, como se describe en la patente núm. WO 95/00636, por ejemplo, una glicosiltransferasa, una enzima ramificadora (enzima ramificadora 1,4-o¡-glucano), una 4-a-glucanotransferasa (dextrina glicosiltransferasa) o una oxidorreductasa, por ejemplo, una peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa, una lipoxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una carbohidrato oxidasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser de cualquier origen, que incluye mamífero y vegetal, y particularmente de origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico) y puede(n) obtenerse mediante téenicas usadas convencionalmente en la materia.
Típicamente, la xilanasa es de origen microbiano, por ejemplo, derivada de una bacteria o un hongo, tal como una cepa de Aspergillus. Las xilanasas incluyen Pentopan® y Novozym 384®, por ejemplo, que son preparaciones de xilanasa disponibles comercialmente producidas a partir de Trichoderma reesei . La amiloglucosidasa puede ser una amiloglucosidasa de ?. niger (tal como AMG®). Otros productos de amilasa útiles incluyen Grindamyl® A 1000 o A 5000 (Grindsted Products, Dinamarca) y Amylase® H o Amylase® P (DSM). La glucosa oxidasa puede ser una glucosa oxidasa fúngica, particularmente, una glucosa oxidasa de Aspergillus niger (tal como Gluzyme®). Una proteasa ilustrativa es Neutrase®.
El proceso puede usarse para cualquier tipo de producto horneado preparado a partir de una masa, ya sea de un carácter suave o crujiente, ya sea de tipo blanco, claro u oscuro. Los ejemplos son el pan, particularmente blanco, integral o pan de centeno, típicamente, en la forma de barras de pan o bollos, tales como, pero sin limitarse a, pan francés de tipo baguette, pan de pita, tortillas, tortas, panqueques, bizcochos, galletitas, costra del pastel, pan crujiente, pan al vapor, pizza y similares.
La AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa pueden usarse en una premezcla que comprende harina junto con una amilasa contra el enranciamiento, una fosfolipasa y/o un fosfolípido. La premezcla puede contener otros aditivos para mejorar la masa y/o para mejorar el pan, por ejemplo, cualquiera de los aditivos, que incluyen las enzimas, mencionados anteriormente. La AcAmyl o variante de esta pueden ser un componente de una preparación enzimática que comprende una amilasa contra el enranciamiento y una fosfolipasa, para usarse como un aditivo para hornear.
La preparación enzimática está, opcionalmente, en la forma de un polvo granulado o aglomerado. La preparación puede tener una distribución estrecha del tamaño de partículas con más de 95 % (en peso) de las partículas en el intervalo de 25 a 500 mha. Los polvos granulados y aglomerados pueden prepararse mediante métodos convencionales, por ejemplo, al rociar la AcAmyl o variante de esta sobre un vehículo en un granulador de lecho fluidizado. Los vehículos pueden consistir en núcleos particulados que tienen un tamaño de partícula adecuado. El vehículo puede ser soluble o insoluble, por ejemplo, una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (tal como sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (tal como sorbitol), almidón, arroz, sémola de maíz, o soja.
Las partículas envueltas, es decir, las partículas de a-amilasa, pueden comprender una AcAmyl o variantes de esta. Para preparar partículas de a-amilasa envueltas, la enzima se pone en contacto con un lípido de grado alimenticio en cantidad suficiente para suspender todas las partículas de a-amilasa. Los lípidos de grado alimenticio, como se usa en la presente descripción, pueden ser cualquier compuesto orgánico natural que es insoluble en agua, pero es soluble en solventes orgánicos no polares tales como hidrocarburos o éter dietílico. Los lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, triglicéridos ya sea en la forma de grasas o aceites que son saturados o insaturados. Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de estos que componen los triglicéridos saturados incluyen, pero no se limitan a, butírico (derivado de la grasa de la leche), palmítico (derivado de la grasa animal y vegetal), y/o esteárico (derivado de la grasa animal y vegetal). Los ejemplos de ácidos grasos y combinaciones de estos, que componen los triglicéridos insaturados incluyen, pero no se limitan a, palmitoleico (derivado de la grasa animal y vegetal), oleico (derivado de la grasa animal y vegetal), linoleico (derivado de aceites vegetales), y/o linolénico (derivado del aceite de linaza). Otros lípidos de grado alimenticio adecuados incluyen, pero no se limitan a, monoglicéridos y diglicéridos derivados de los triglicéridos discutidos anteriormente, fosfolípidos y glicolípidos.
El lípido de grado alimenticio, particularmente en forma líquida, se pone en contacto con una forma en polvo de las partículas de a-amilasa de una manera tal que el material lipídico cubre al menos una porción de la superficie de al menos una mayoría, por ejemplo, 100 % de las partículas de a-amilasa. Así, cada partícula de a-amilasa está envuelta individualmente en un lípido. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las partículas de a-amilasa se proporcionan con una película de lípidos, fina, continua, envolvente. Esto puede lograrse primero al verter una cantidad de lípido en un recipiente y, después, suspender las partículas de a-amilasa de manera que el lípido humedezca totalmente la superficie de cada partícula de a-amilasa. Después, de un corto periodo de agitación, se recuperan las partículas de a-amilasa envueltas, que portan una cantidad sustancial de los lípidos en sus superficies. El espesor del revestimiento así aplicado a las partículas de a-amilasa puede controlarse mediante la selección del tipo de lípido usado y al repetir la operación con el objetivo de crear una película más gruesa, cuando se desee.
El almacenamiento, la manipulación y la incorporación del vehículo de suministro cargado pueden lograrse por medio de una mezcla de envasado. La mezcla de envasado puede comprender la a-amilasa envuelta. Sin embargo, la mezcla de envasado puede contener, además, ingredientes adicionales según se requiera por el fabricante o el panadero. Después de que la a-amilasa envuelta se ha incorporado en la masa, el panadero continúa a través del proceso normal de producción de el producto.
Las ventajas de envolver las partículas de a-amilasa son de dos tipos. Primero, el lípido de grado alimenticio protege a la enzima de la desnaturalización térmica durante el procéso de horneado para aquellas enzimas que son lábiles al calor. Consecuentemente, mientras la a-amilasa se estabiliza y se protege durante las etapas de prueba y horneado, se libera del revestimiento protector en el producto horneado final, en donde hidroliza los enlaces glucosídicos en los poliglucanos. El vehículo de suministro cargado proporciona, además, una liberación sostenida de la enzima activa en el producto horneado. Es decir, tras el proceso de horneado, la a-amilasa activa se libera de manera continua del revestimiento protector a una velocidad que contrarresta y, por lo tanto, reduce la velocidad de los mecanismos de enranciamiento.
Generalmente, la cantidad de lípido aplicado a las partículas de a-amilasa puede variar de un pequeño por ciento del peso total de la a-amilasa a muchas veces ese peso, en dependencia de la naturaleza del lípido, la manera en que se aplica a las partículas de a-amilasa, la composición de la mezcla de masa a tratar, y la severidad de la operación de mezcla de la masa en cuestión.
El vehículo de suministro cargado, es decir, la enzima con envoltura lipídica, se añade a los ingredientes usados para preparar un producto horneado en una cantidad eficaz para prolongar la vida en estante del producto horneado. El panadero calcula la cantidad de a-amilasa envuelta, preparada como se describió anteriormente, que se requerirá para lograr el eíecto contra el ranciamiento deseado. La cantidad de la a-amilasa envuelta requerida se calcula en base a la concentración de la enzima envuelta y a la proporción de a-amilasa con respecto a la harina especificada. Se ha encontrado que es eficaz en un amplio intervalo de concentraciones, aunque, como se ha discutido, las mejoras observables en contra del enranciamiento no se corresponden linealmente con la concentración de a-amilasa, pero por encima de ciertos niveles mínimos, grandes aumentos en la concentración de la a-amilasa produce poca mejora adicional. La concentración de a-amilasa usada realmente en una producción de panadería podría ser mucho más alta que el mínimo necesario para proporcionar al panadero con un seguro contra errores de baja medida inadvertidos por el panadero. El límite inferior de concentración de la enzima se determina por el mínimo efecto contra el enranciamiento que el panadero desea alcanzar.
Un método para preparar un producto horneado puede comprender: a) preparar partículas de a-amilasa revestidas con lípido, en donde sustancialmente todas las partículas de oí-amilasa están revestidas; b) mezclar una masa que contiene harina; c) añadir la a-amilasa revestida con lípido a la masa antes que se complete la mezcla y terminar el mezclado antes de que se elimine el revestimiento lipídico de la a-amilasa; d) probar la masa; y e) hornear la masa para proporcionar el produ!cto horneado, en donde la a-amilasa está inactiva durante las etapas de mezcla, de prueba y de horneado y está activa en el producto horneado).
La a-amilasa envuelta puede añadirse a la masa durante el ciclo de mezclado, por ejemplo, cerca del final del ciclo de mezclado. La a-amilasa envuelta se añade en un punto en la etapa de mezclado que permite la distribución suficiente de la a-amilasa envuelta en toda la masa; sin embargo, la etapa de mezclado se termina antes que el revestimiento protector se despoje de la(s) partícula(s) de a-amilasa. En dependencia del tipo y el volumen de la masa, y de la acción mezcladora y la velocidad, podrían requerirse de uno a seis minutos o más para mezclar la a-amilasa envuelta en la masa, pero el promedio es de dos a cuatro minutos. Así, algunas variables pueden determinar el procedimiento preciso. En primer lugar, la cantidad de a-amilasa envuelta debe tener un volumen total suficiente para permitir que la a-amilasa envuelta se disperse en toda la mezcla de la masa. Si la preparación de a-amilasa envuelta está muy concentrada, puede necesitarse añadir aceite adicional a la premezcla antes de añadir la a-amilasa envuelta a la masa. Las recetas y los procesos de producción pueden requerir modificaciones específicas; sin embargo, generalmente pueden lograrse buenos resultados cuando el 25 % del aceite especificado en una fórmula de masa de pan se lleva a cabo fuera de la masa y se usa como un vehículo para un a-amilasa envuelta concentrada cuando se añade cerca del final del ciclo de mezclado. En el pan u otros productos horneados, particularmente aquellos que tienen un bajo contenido en grasa, por ejemplo, panes de estilo francés, una mezcla de a-amilasa envuelta de aproximadamente 1 % del peso de harina seca es suficiente para mezclar apropiadamente la a-amilasa envuelta con la masa El intervalo de porcentajes adecuados es amplio y depende de la fórmula, del producto terminado, y de los requisitos de la metodología de producción del panadero individual. En segundo lugar, la suspensión de a-amilasa envuelta debe añadirse a la mezcla con tiempo suficiente para el mezclado completo en la masa, pero no por un tiempo tal que la acción mecánica excesiva despoje del revestimiento protector lipídico a las partículas envueltas de -amilasa.
En un aspecto adicional de la presente invención, la composición alimenticia es una composición de aceite, carne, manteca que comprende una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa. En este contexto el término "composición de [aceite/carne/grasa]" significa cualquier composición, basada en, obtenida de y/o que contiene aceite, carne o grasa, respectivamente. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para preparar una composición de aceite o carne o manteca y/o aditivo que comprende una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa; el método comprende mezclar el polipéptido de la presente invención con una composición de aceite/carne/manteca y/o ingredientes aditivos.
En un aspecto adicional de la presente invención, la composición alimenticia es una composición de alimento para animales, aditivo de alimento para animales y/o alimento para mascotas que comprende una AcAmyl y variantes de esta con una isoamilasa. La presente invención se relaciona, además, con un método para preparar tal composición de alimento para animales, composición aditiva de alimento para animales y/o alimento para mascotas que comprende mezclar una AcAmyl y variantes de esta con una isoamilasa con uno o más ingredientes de alimento para animales y/o ingredientes aditivos de alimento para animales y/o ingredientes de alimentos para mascotas. Además, la presente invención se relaciona con el uso de una AcAmyl y variantes de esta con una isoamilasa en la preparación de una composición de alimento para animales y/o composición aditiva de alimento para animales y/o alimento para mascotas.
El término "animal" incluye todos los animales no rumiantes y rumiantes. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante, tal como un caballo y un animal monogástrico. Los ejemplos de animales monogástricos incluyen, pero no se limitan a, cerdos y puercos, tales como lechones, cerdos en crecimiento, cerdas; aves tales como pavos, patos, pollos, pollos de engorde, ponedoras, peces tales como salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas; y crustáceos tales como camarones y langostinos. En una modalidad adicional, el animal es un animal rumiante, que incluye, pero no se limita a, vacas, terneros, cabras, ovejas, jirafas, bisontes, alces, alces, yaks, búfalos de agua, ciervos, camellos, alpacas, llamas, antílopes, berrendo y nilgai.
En el presente contexto, se pretende que el término "alimento de mascotas" se entienda que signifique un alimento para un animal doméstico tal como, pero sin limitarse a perros, gatos, gerbos, hámsteres, chinchillas, ratas de lujo, cobayas; aves de compañía, tales como canarios, periquitos, y loros; mascotas reptiles, tales como tortugas, lagartos y serpientes; y animales acuáticos, tales como peces tropicales y ranas.
Los términos "composición de pienso animal", "alimento" y "pienso" se usan indistintamente y pueden comprender una o varias materias primas seleccionadas del grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de estos) y/o granos grandes tales como el maíz o el sorgo, b) subproductos a partir de cereales, tales como harina de gluten de maíz, granos de destilería secos con solubles (DDGS) (particularmente, granos de destilería secos con solubles basados en maíz (cDDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, subproducto de la molienda de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, almendra de palma, y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida a partir de fuentes tales como soja, girasol, cacahuate, altramuz, chícharos, habas, algodón, cañóla, harina de pescado, proteína de plasma seca, harina de carne y hueso, proteína de papa, suero, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos a partir de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas. 6. Composiciones de desaprestado de telas y uso Además, se contempla composiciones y métodos para tratar telas (por ejemplo, para desaprestar un textil) con el uso de una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa. Los métodos de tratamiento de telas se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm.6,077,316). Por ejemplo, la sensación y apariencia de una tela puede mejorarse mediante un método que comprende poner en contacto la tela con una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa en una solución. Opcionalmente la tela puede tratarse con la solución bajo presión.
Una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden aplicarse durante o después del proceso de tejido de un textil, o durante la etapa de desaprestado, o una o más etapas adicionales del procesamiento de telas. Durante el tejido de las telas, los hilos se exponen a una deformación mecánica considerable. Antes de tejer en telares mecánicos, los hilos de urdimbre se recubren, frecuentemente, con almidón del apresto o derivados de almidón para aumentar su resistencia a la tracción y para evitar la rotura. Una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden aplicarse durante o después del proceso de tejido para eliminar el aprestado del almidón o derivados de almidón. Después, del proceso de tejido, una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden usarse para eliminar el revestimiento del apresto antes del procesamiento posterior de la tela para garantizar un resultado homogéneo y a prueba de lavado.
Una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden usarse solas o con otros reactivos químicos de desaprestado y/o enzimas de desaprestado para desaprestar telas, que incluyen telas que contienen algodón, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. Una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden usarse, además, en composiciones y métodos para producir una apariencia de lavado con abrasivos en telas y prendes de mezclilla índigo. Para la fabricación de prendas de vestir, la tela se puede cortar y coser en prendas de vestir que, después, se terminan. Particularmente, para la fabricación de pantalones vaqueros de mezclilla se han desarrollado diferentes métodos de acabado enzimático. El acabado de la prenda de mezclilla se inicia, normalmente, con una etapa de desaprestado enzimático durante la cual las prendas se exponen a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad a la tela y hacer que el algodón sea más accesible a las etapas de acabado enzimático posteriores. Una AcAmyl o una variante de esta con una isoamilasa pueden usarse en métodos para el acabado de prendas de mezclilla (por ejemplo, un "proceso de destinción"), desaprestado enzimático y para dar suavidad a las telas y/o proceso de acabado. 7. Composiciones de limpieza Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es una composición de limpieza que incluye una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa como un componente. Un polipéptido de amilasa con una isoamilasa pueden usarse como un componente en composiciones detergentes para el lavado de manos, lavado de ropa sucia, lavado de vajillas y para la limpieza de otras superficies duras. 7.1. Descripción general Preferentemente, la AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa se incorporan en detergentes en o cerca de una concentración usada convencionalmente para la amilasa en detergentes. Por ejemplo, un polipéptido de amilasa puede añadirse en una cantidad correspondiente a 0.00001 - 1 mg (calculada como proteína enzimática pura) de amilasa por litro de solución de lavado/lavavajillas. Las formulaciones ilustrativas se proporcionan en la presente, como se ejemplifican por lo siguiente: Un polipéptido de amilasa puede ser un componente de una composición detergente, como la única enzima o con otras enzimas que incluyen otras enzimas amilolíticas. Como tal, pueden incluirse en la composición detergente en la forma de un granulado que no forma polvo, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Los granulados que no forman polvo pueden producirse, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los EE. UU. núms. 4,106,991 y 4,661,452 y, opcionalmente, pueden recubrirse por métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados, en donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono, y en donde hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de revestimiento adecuados que forman una película para la aplicación por medio de téenicas de lecho fluidizado se proporcionan, por ejemplo, en la patente de Gran Bretaña núm. GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol sacaroso, ácido láctico o ácido bórico de conformidad con métodos establecidos. En la materia se conocen otros estabilizantes de enzimas. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito por ejemplo en la patente europea núm. EP 238216. Los polioles se conocen desde hace tiempo como estabilizantes de proteínas, así como mejoradores de la solubilidad de las proteínas.
La composición detergente puede estar en cualquier forma útil, por ejemplo, como polvos, gránulos, pastas, o líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente, con un contenido de hasta aproximadamente 70 % de agua y 0 % a aproximadamente 30 % de solvente orgánico. Además, puede estar en la forma de un tipo de gel compacto que contiene solo aproximadamente 30 % de agua.
La composición detergente comprende uno o más tensioactivos, cada uno de los cuales puede ser aniónico, no iónico, catiónico o zwiteriónico. El detergente usualmente contendrá de 0 % a aproximadamente 50 % de tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal (LAS); a-olefinsulfonato (AOS), sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso) (AS); etoxisulfato de alcohol (AEOS o AES); alcanosulfonatos secundarios (SAS); a-sulfo metil esteres de ácidos grasos; ácido alquil o alquenilsuccínico; o jabón. Además, la composición puede contener de 0 % a aproximadamente 40 % de tensioactivo no iónico tal como etoxiíato de alcohol (AEO o AE), etoxilatos de alcohol carboxilado, etoxiíato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácidos grasos etoxilados, monoetanolamida de ácidos grasos, o amida de ácidos grasos polihidroxialquilados (como se describe, por ejemplo, en la patente núm. WO 92/06154).
La composición detergente puede comprender, adicionalmente, una o más de otras enzimas, tales como proteasas, otra enzima amilolítica, cutinasa, lipasa, celulasa, pectato liasa, perhidrolasa, xilanasa, peroxidasa, y/o lacasa en cualquier combinación.
El detergente puede contener de aproximadamente 1 % a aproximadamente 65 ¾ de un aditivo detergente o agente formador de complejos, tales como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTMPA), ácido alquil o alquenil succínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst). Además, el detergente puede no contener aditivos, es decir, puede estar esencialmente libre de aditivo de detergente. Las enzimas pueden usarse en cualquier composición compatible con la estabilidad de la enzima. Las enzimas pueden protegerse, generalmente, contra componentes perjudiciales por medio de formas de encapsulación conocidas, por ejemplo mediante granulación o secuestro en hidrogeles. Las enzimas y, específicamente, las amilasas, ya sea con o sin dominios de unión al almidón, pueden usarse en una variedad de composiciones que incluyen aplicaciones para lavandería y lavavajillas, limpiadores de superficies, así como en composiciones para la producción de etanol a partir de almidón o biomasa.
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los ejemplos incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilatos, tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/ácido acrílico y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.
El detergente puede contener un sistema blanqueador que puede comprender una fuente de H2O2, tal como perborato o percarbonato, que se puede combinar con un activador de blanqueo formador de perácido, tal como tetraacetiletilendiamina (TAED) o nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). Alternativamente, el sistema blanqueador puede comprender peroxiácidos (por ejemplo, los peroxiácidos del tipo amida, imida o sulfona). El sistema blanqueador puede ser, además, un sistema blanqueador enzimático, por ejemplo, perhidrolasa, tal como el descrito en la solicitud internacional del PCT núm. WO 2005/056783.
Las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse mediante el uso de agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol; un azúcar o alcohol de azúcar; ácido láctico; ácido bórico o un derivado de ácido bórico tal como, por ejemplo, un áster de borato aromático; y la composición puede formularse tal como se describe, por ejemplo, en las patentes núms. WO 92/19709 y WO 92/19708.
El detergente puede contener, además, otros ingredientes detergentes convencionales tales como, por ejemplo, acondicionadores de telas que incluyen arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes contra el redepósito de suciedad, tintes, bactericidas, inhibidores de deslustre, abrillantadores ópticos, o perfumes.
El pH (medido en solución acuosa en la concentración de uso) es usualmente neutro o alcalino, por ejemplo, un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 11.0.
Más abajo se describen formas particulares de las composiciones detergentes para la inclusión de la presente a-amilasa. 7.2. Composición detergente de lavandería líquida de gran rendimiento (HDL, por sus siglas en ingles) Las composiciones detergentes de lavandería HDL ilustrativas incluyen un tensioactivo detersivo (10 % -40 % p/p), que incluye un tensioactivo detersivo aniónico (seleccionado de un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, sulfatos de alquilo sustituidos o no sustituidos, sulfonatos de alquilo, sulfato alquil alcoxilado, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, carboxilatos de alquilo, y/o mezclas de estos) y, opcionalmente, un tensioactivo no iónico (seleccionado de un grupo de cadena lineal o ramificada o aleatoria, alcohol alquil alcoxilado sustituido o no sustituido, por ejemplo, un alcohol alquil etoxilado Ce-Cie y/o alquil fenol alcoxilatos C6-C12), en donde la relación en peso del tensioactivo detersivo aniónico (con un índice hidrófilo (HIc) de 6.0 a 9) con respecto al tensioactivo detersivo no iónico es mayor que 1: 1. Los tensioactivos detersivos adecuados incluyen, además, tensioactivos detersivos catiónicos (seleccionados de un grupo de compuestos de alquil piridinio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de fosfonio cuaternario de alquilo, compuestos de sulfonio ternarios de alquilo, y/o mezclas de estos); tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfoteros (seleccionados de un grupo de alcanolamina sulfo-betaínas); tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos y mezclas de estos.
La composición puede incluir, opcionalmente, un polímero impulsor de tensioactividad que consiste en polímeros de limpieza de grasa alcoxilados anfifílicos (seleccionados de un grupo de polímeros alcoxilados que tiene propiedades hidrófilas e hidrófobas ramificadas, tales como polialquileniminas alcoxiladas en el intervalo de 0.05 % en peso-Í0 % en peso) y/o polímeros de injerto aleatorios (comprenden, típicamente, un esqueleto hidrófilo que comprende monómeros seleccionados del grupo que consiste en: ácidos carboxílíeos insaturados de C1-C6, éteres, alcoholes, aldehidos, cetonas, ásteres, unidades de azúcar, unidades alcoxi, anhídrido maleico, polialcoholes saturados tales como glicerol, y mezclas de estos; y cadena(s) lateral (es) hidrófoba(s) seleccionadas del grupo que consiste en: grupo alquilo C4-C25, polipropileno, polibutileno, éster de vinilo de un ácido monocarboxílico saturado de C1-C6, alquil éster de C1-C6 de ácido acrílico o metacrílico, y mezclas de estos.
La composición puede incluir polímeros adicionales tales como polímeros de liberación de suciedad (incluyen poliésteres con remate aniónico, por ejemplo SRP1, polímeros que comprenden al menos una unidad monomérica seleccionada de un sacárido, ácido dicarboxílico, poliol y combinaciones de estos, en una configuración aleatoria o en bloque, polímeros basados en tereftalato de etileno y copolímeros de estos en una configuración aleatoria o en bloque, por ejemplo, Repel-o-tex SF, SF-2 y SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 y SRN325, Marloquest SL), polímeros contra el redepósito (0.1 % en peso a 10 % en peso, incluyen polímeros de carboxilato, tales como polímeros que comprenden al menos un monómero seleccionado de ácido acrílico, ácido maleico (o anhídrido maleico), ácido fumárico, ácido itacónico, ácido aconítico, ácido mesacónico, ácido citracónico, ácido metilenmalónico, y cualquier mezcla de estos, homopolímero de vinilpirrolidona, y/o polietilenglicol, con peso molecular en el intervalo a partir de 500 a 100,000 Da); polímero celulósico (que incluye los seleccionados de alquilcelulosa, alquilalcoxialquilcelulosa, carboxialquilcelulosa, alquilcarboxialquilcelulosa, cuyos ejemplos incluyen carboximetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y mezclas de estas) y carboxilato polimérico (tal como copolímero aleatorio de maleato/acrilato u homopolímero de poliacrilato).
La composición puede incluir, además, ácido graso saturado o insaturado, preferentemente, ácidos grasos C12-C24 saturados o insaturados (0 % en peso a 10 % en peso); agentes de depósito (ejemplos de los cuales incluyen polisacáridos, preferentemente, polímeros celulósicos, haluros de poli dialil dimetil amonio (DADMAC), y copolímeros de DAD MAC con vinil pirrolidona, acrilamidas, imidazoles, haluros de imidazolinio, y mezclas de estos, en una configuración aleatoria o de bloque, goma de guar catiónica, celulosa catiónica tal como hidroxietil celulosa catiónica, almidón catiónico, policilamidas catiónicas, y mezclas de estos.
La composición puede incluir, adicionalmente, agentes inhibidores de la transferencia de colorantes, ejemplos de los cuales incluyen ftalocianina de manganeso, peroxidasas, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles y/o mezclas de estos; agentes quelantes, ejemplos de los cuales incluyen ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), ácido dietilen triamino penta metilenofosfónico (DTPMP), ácido hidroxi-etano difosfónico (HEDP), ácido etilendiamina N,N'-disuccínico (EDDS), ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) , ácido propilendiamino tetraacético (PDT A), N-óxido de la 2-hidroxipiridina (HPNO), o ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido glutámico ácido N,N diacético (sal tetrasódica del ácido N,N-dicarboximetil glutámico (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-dihidroxi-m-bencenodisulfónico, ácido cítrico y cualquier sal de estos, ácido N-hidroxietiletilendiaminetri -acético (HEDTA), ácido trietilentetraaminohexaacét ico (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA) , dihidroxietilglicina (DHEG) , ácido etilendiaminotetrapropiónico (EDTP) , y derivados de estos.
La composición incluye, preferentemente, enzimas (generalmente, .aproximadamente 0.01 % en peso de enzima activa a 0.03 % en peso de enzima activa) seleccionadas de proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas , pectato liasas, mananasas cutinasas, lacasas, fosfolipasas , lisofosfolipasas , aciltransf erasas, perhidrolasas , arilesterasas , y cualquier mezcla de estas. La composición puede incluir un estabilizador de enzima (ejemplos de los cuales incluyen polioles tales como propilenglicol o glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, inhibidor de proteasa reversible, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un áster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico tal como ácido 4-formilfenil borónico) .
La composición incluye, opcionalmente, silicona o supresores de jabonaduras basados en ácidos grasos; colorantes de matizado, cationes calcio y magnesio, ingredientes de señalización visual, antiespuma (0.001 % en peso a aproximadamente 4.0 % en peso), y/o un agente de estructuración/espesante (0.01 % en peso a 5 % en peso, seleccionado del grupo que consiste en diglicéridos y triglicér idos, diestearato de etilenglicol , celulosa microcristalina , materiales a base de celulosa, celulosa de microfibra, biopolímeros, goma de xantano, goma gelana, y mezclas de estos).
La composición puede ser de cualquier forma líquida, por ejemplo, una forma líquida o gel, o cualquier combinación de estas. La composición puede estar en cualquier forma de dosis unitaria, por ejemplo, una bolsa. 7.3. ^ sición detergente de lavandería seca/sólida de gran rendimiento (HDD, por sus siglas en inglés) Las composiciones detergentes de lavandería HDD ilustrativas incluyen un tensioactivo detersivo, que incluye tensioactivos detersivos aniónicos (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada o aleatorio, sulfatos de alquilo sustituidos o no sustituidos, sulfonatos de alquilo, sulfato de alquilo alcoxilado, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, carboxilatos de alquilo y/o mezclas de estos), tensioactivo detersivo no iónico (por ejemplo, de cadena lineal o ramificada o aleatoria, etoxilatos de alquilo de Cs-Cis sustituidos o no sustituidos, y/o alquil alcoxilatos de fenol de C6-C12), tensioactivos detersivos catiónicos (por ejemplo, compuestos de alquil piridinio, compuestos de amonio cuaternario, compuestos de alquil fosfonio cuaternario, compuestos de alquil sulfonio ternario, y mezclas de estos), tensioactivos detersivos zwitteriónicos y/o anfoteros (por ejemplo, alcanolamina sulfo-betaínas), tensioactivos anfolíticos, tensioactivos semipolares no iónicos, y mezclas de estos; aditivos que incluyen aditivos libres de fosfato (por ejemplo, aditivos de zeolita ejemplos de lo cuales incluyen zeolita A, zeolita X, zeolita P y zeolita M?R en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso), aditivos de fosfato (por ejemplo tri-polifosfato de sodio en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso), ácido cítrico, sales de citrato y ácido nitrilotriacético, sal de silicato (por ejemplo, silicato sódico o potásico o meta-silicato sódico en el intervalo de 0 % en peso a menos de 10 % en peso, o silicato estratificado (SKS-6)); sal de carbonato (por ejemplo, carbonato sódico y/o bicarbonato sódico en el intervalo de 0 % en peso a menos de 80 % en peso); y agentes blanqueadores que incluyen fotoblanqueadores (por ejemplo, ftalocianinas de zinc sulfonadas, ftalocianinas de aluminio sulfonadas, colorantes de xantenos, y mezclas de estos) activadores de blanqueo hidrófobos o hidrófilos (por ejemplo, sulfonato de dodecanoil oxibenceno, sulfonato de decanoil oxibenceno, ácido decanoil oxibenzoico o sales de estos, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoil oxibenceno, tetraacetil etilendiamina TAED, sulfonato de nonanoiloxibenceno -NOBS, nitrilo quats, y mezclas de estos), fuentes de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, sales de perhidrato inorgánicas ejemplos de los cuales incluyen la sal de mono o tetrahidrato de sodio de perborato, percarbonato, persulfato, perfosfato, o persilicato), perácidos hidrófilos y/o hidrófobos preformados (por ejemplo, ácidos y sales percarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, y mezclas de estos), y/o catalizadores de blanqueo (por ejemplo, reforzadores de blanqueo de imina (ejemplos de los cuales incluyen cationes iminio y poliiones), zwitteriones de iminio, aminas modificadas, óxidos de aminas modificadas, N-sulfoniloiminas, N-fosfoniloiminas, N-aciloiminas, dióxidos de tiadiazol, perfluoroiminas, cetonas de azúcar cíclicas, y mezclas de estos, y catalizadores de blanqueo que contienen metales (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno, o manganeso junto con cationes de un metal auxiliar tal como zinc o aluminio y un secuestrador tal como ácido etilendiaminotetraacético, etilendiaminotetra(ácido metilenfosfónico), y sales solubles en agua de estos).
La composición incluye, preferentemente, enzimas, por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, colina oxidasas, peroxidasas/oxidasas, pectato liasas, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa, y cualquier mezcla de estas.
La composición puede incluir, opcionalmente, ingredientes detergentes adicionales que incluyen microcápsulas de perfume, acorde de perfume encapsulado con almidón, agentes de matizado, polímeros adicionales, que incluyen polímeros catiónicos y para la integridad de la tela, ingredientes de bloqueo de tintes, agentes suavizantes de telas, abrillantadores (por ejemplo abrillantadores fluorescentes C.I.), agentes floculantes, agentes quelantes, poliaminas alcoxiladas, agentes de depósito de las telas, y/o ciclodextrina. 7.4. Composiciones detergentes para el lavado automático de vajillas (ADW, por sus siglas en ingles) Un detergente ADW ilustrativo incluye tensioactivos no iónicos, que incluyen tensioactivos etoxilados no iónicos, tensioactivos de alcohol alcoxilado, polialcoholes (oxialquilados) con remate epoxi, o tensioactivos de óxido de amina presentes en cantidades de 0 a 10 % en peso; aditivos en el intervalo de 5-60 % que incluyen aditivos de fosfato (por ejemplo, mono-fosfatos, di-fosfatos, tripolifosfatos, otros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato sódico-STPP) y aditivos libres de fosfatos (por ejemplo, compuestos a base de aminoácidos que incluyen ácido metil-glicina-diacético (MGDA) y sales y derivados de estos, ácido glutámico N,N-diacético (GLDA) y sales y derivados de este, ácido iminodisuccínico (IDS) y sales y derivados de este, carboximetil inulina y sales y derivados de esta, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietilen-triamino pentaacético (DTPA), ácido B-alaninadiacético (B-ADA) y sus sales, homopolímeros y copolímeros de ácidos policarboxílíeos y sus sales parcialmente o totalmente neutralizadas, ácidos policarboxílicos monoméricos y ácidos hidroxicarboxílíeos, y sus sales en el intervalo de 0.5 % a 50 % en peso; polímeros sulfonados/carboxilados en el intervalo de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50 % en peso para proporcionar estabilidad dimensional; agentes de secado en el intervalo de 0.1 % a aproximadamente 10 % en peso (por ejemplo, poliésteres, especialmente poliésteres aniónicos, opcionalmente, junto con otros monómeros con 3 a 6 funcionalidades, típicamente, funcionalidades de ácido, alcohol o áster propicias para la policondensación, compuestos de poliorganosiloxano de policarbonato, poliuretano y/o poliurea, o compuestos precursores, de estos, particularmente del carbonato cíclico reactivo y de tipo urea); silicatos en el intervalo de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % en peso (que incluyen silicatos de sodio o potasio, por ejemplo, disilicato de sodio, meta-silicato de sodio y filosilicatos cristalinos); blanqueador inorgánico (por ejemplo, sales de perhidrato tales como sales de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato y persilicato) y blanqueador orgánico (por ejemplo, peroxiácidos orgánicos, que incluyen diacil y tetraacilperóxidos, especialmente ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico, y ácido diperoxihexadecanodioico); activadores de blanqueo (es decir, precursores de perácidos orgánicos en el intervalo de 0.1 % a aproximadamente un 10 % en peso); catalizadores de blanqueo (por ejemplo, triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados, bispiridilamina de Co, Cu, Mn y Fe y complejos relacionados, y acetato de cobalto de pentamina (III) y complejos relacionados); agentes para el cuidado del metal en el intervalo de aproximadamente 0.1 % a 5 % en peso (por ejemplo, benzatriazoles, sales metálicas y complejos, y/o silicatos); enzimas en el intervalo de aproximadamente 0.01 a 5.0 mg de enzima activa por gramo de la composición detergente para lavavajillas automáticos (por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, celulasas, oxidasas de colina, peroxidasas/oxidasas, liasas de pectato, mananasas, cutinasas, lacasas, fosfolipasas, lisofosfolipasas, aciltransferasa, perhidrolasa, arilesterasa, y mezclas de estas); y componentes del estabilizador de enzima (por ejemplo, oligosacáridos, polisacáridos, y sales de metales divalentes inorgánicos). 7.5. Composiciones detergentes adicionales Formulaciones detergentes ilustrativas a las que se puede añadir la presente amilasa se describen, más abajo, en los párrafos numerados. 1) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1, que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 7 % a aproximadamente 12 %; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-18, 1-2 óxido de etileno (EO)) o sulfato de alquilo (por ejemplo, Cie-18): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C14-15, 7 EO): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CO3): aproximadamente 14 % a aproximadamente 20 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 2 a aproximadamente 6 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 15 % a aproximadamente 22 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2S04): 0 % a aproximadamente 6 %; citrato sódico/ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na307/C6H807): aproximadamente 0 % a aproximadamente 15 %; perborato sódico (por ejemplo, NaBC>3H2O): aproximadamente 11 % a aproximadamente 18 %; TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %,- carboximetilcelulosa (CMC) y 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3 %; enzimas (calculadas como enzima pura) 0.0001-0.1 % de proteína; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfumes, abrillantador óptico, fotoblanqueador) 0-5 %. 2) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 6 % a aproximadamente 11 %; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de Ci2-i8, 1-2 EO) o sulfato de alquilo (por ejemplo, Ci6-ie): aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C14-15, 7 EO): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2C03): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 24 % a aproximadamente 34 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4) de aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 %; citrato sódico/ácido cítrico (por ejemplo, C6H5Na307/ C6H807): 0 % a aproximadamente 15 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-6 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 3) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 5 % a aproximadamente 9 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de Ci2-is, 7 EO): aproximadamente 7 % a aproximadamente 14 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido graso de C16-22): aproximadamente 1 a aproximadamente 3 %; carbonato sódico (como Na2CO3): aproximadamente 10 % a aproximadamente 17 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; zeolita (como NaAlSi04): aproximadamente 23 % a aproximadamente 33 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2S04): 0 % a aproximadamente 4 %; perborato sódico (por ejemplo, NaB03H2O): aproximadamente 8 % a aproximadamente 16 % TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; fosfonato (por ejemplo, EDTMPA): 0 % a aproximadamente 1 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 0-3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5 %. 4) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 8 % a aproximadamente 12 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO): aproximadamente 10 % a aproximadamente 25 %; carbonato sódico (como Na2CC>3): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2S1O2): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSiC): aproximadamente 25 % a aproximadamente 35 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 10 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PVP, PEG) 1-3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 5) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO o alcohol de C12-15, 5 EO): aproximadamente 12 % a aproximadamente 18 %; jabón como ácido graso ( por ejemplo, ácido oléico): aproximadamente 3 % a aproximadamente 13 %; ácido alquenilsuccínico (C12-14): 0 % a aproximadamente 13 %; aminoetanol: aproximadamente 8 % a aproximadamente 18 %; ácido cítrico: aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; fosfonato: 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros ( por ejemplo, PVP, PEG): 0 % a aproximadamente 3 %; borato (por ejemplo, B407): 0 % a aproximadamente 2 %; etanol: 0 % a aproximadamente 3 %; propilenglicol: aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantador óptico) 0-5 %. 6) Una composición detergente líquida acuosa estructurada que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 15 % a aproximadamente 21 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): 3-9 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido oléico): aproximadamente 3 % a aproximadamente 10 %; zeolita (como NaAlSi04): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; citrato potásico: aproximadamente 9 % a aproximadamente 18 %; borato (por ejemplo, B407): 0 % a aproximadamente 2 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, PVP, PEG): 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros de anclaje tales como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico; relación molar 25:1, peso molecular 3800) 0 % a aproximadamente 3 %; glicerina: 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, dispersantes, supresores de las jabonaduras, perfume, abrillantadores ópticos) 0-5 %. 7) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alcohol graso aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; monoetanolamida de ácido graso etoxilado: aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; jabón como ácido graso 0-3 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 5 ¾ a aproximadamente 10 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO): aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; perborato sódico (por ejemplo, NaBC>3H2O): aproximadamente 12 % a aproximadamente 18 %; TAED: aproximadamente 2 % a aproximadamente 7 %; polímeros (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 8) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal(calculado como ácido): aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; monoetañolamída de ácido graso etoxilado: aproximadamente 5 % a aproximadamente 11 %; jabón como ácido graso 0 % a aproximadamente 3 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 4 % a aproximadamente 10 %; silicato soluble (Na2Ü, 2S1O2): aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSi04): aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): aproximadamente 3 % a aproximadamente 11 %; citrato sódico (por ejemplo, C6H5Na307): aproximadamente 5 % a aproximadamente 12 %; polímeros (por ejemplo, PVP, copolímero de ácido maleico/acrílico, PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, supresores de las jabonaduras, perfume) 0-5 %. 9) Una composición detergente formulada como un granulado que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 6 % a aproximadamente 12 %; tensioactivo no iónico: aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; jabón como ácido graso: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2CC>3): aproximadamente 14 % a aproximadamente 22 %; zeolita ( por ejemplo, NaAlSiO.): aproximadamente 18 % a aproximadamente 32 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SC>4): aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %; citrato sódico (por ejemplo, C6HsNa307): aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; perborato sódico (por ejemplo, NaB03H2O): aproximadamente 4 % a aproximadamente 9 %; activador de blanqueo (por ejemplo, NOBS o TAED): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 2 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilato o PEG): aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, perfume) 0-5 %. 10) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido) : aproximadamente 15 % a aproximadamente 23 %; etoxisulfato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 2-3 EO) : aproximadamente 8 % a aproximadamente 15 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): aproximadamente 3 % a aproximadamente 9 %; jabón como ácido graso (por ejemplo, ácido láurico): 0 % a aproximadamente 3 %; aminoetanol: aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; citrato sódico: aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; hidrótropo (por ejemplo, toluensulfonato de sodio) : aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; borato (por ejemplo, B4O7): 0 % a aproximadamente 2 %; carboximetilcelulosa 0 % a aproximadamente 1 %; etanol : aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %; propilenglicol: aproximadamente 2 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0 .0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, polímeros, dispersantes, perfume, abrillantadores 11) Una composición detergente líquida acuosa que comprende alquilbencenosulfonato lineal (calculado como ácido): aproximadamente 20 % a aproximadamente 32 %; etoxilato de alcohol (por ejemplo, alcohol de C12-15, 7 EO, o alcohol de C12-15, 5 EO): 6-12 %; aminoetanol: aproximadamente 2 % a aproximadamente 6 %; ácido cítrico: aproximadamente 8 % a aproximadamente 14 %; borato (por ejemplo, B4O7): aproximadamente 1 % a aproximadamente 3 %; polímero (por ejemplo, copolímero de ácido maleico/acrílico, polímero de anclaje tales como, por ejemplo, copolímero de metacrilato de laurilo/ácido acrílico): 0 % a aproximadamente 3 %; glicerol: aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores ( por ejemplo, hidrótropos, dispersantes, perfume, abrillantadores ópticos): 0-5 %. 12) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende tensioactivo aniónico (alquilbencenosulfonato lineal, sulfato de alquilo, a-olefinsulfonato, metil esteres de ácidos grasos a-sulfo, alcanosulfonatos, jabón): aproximadamente 25 % a aproximadamente 40 %; tensioactivo no iónico: (por ejemplo, etoxilato de alcohol): aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %; carbonato sódico (por ejemplo, Na2C03): aproximadamente 8 % a aproximadamente 25 %; silicatos solubles: (por ejemplo, Na20, 2Si02): aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %; sulfato sódico (por ejemplo, Na2SO4): 0 % a aproximadamente 5 %; zeolita (NaAlSi04): aproximadamente 15 % a aproximadamente 28 %; perborato sódico (por ejemplo, NaBC>3.4H2O): 0 % a aproximadamente 20 %; activador de blanqueo (TAED o NOBS): aproximadamente 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; ingredientes menores (por ejemplo, perfume, abrillantadores ópticos): 0-3 %. 13) Composiciones detergentes tal como se describieron en las composiciones 1)-12) supra, en donde todo o parte del alquilbencenosulfonato lineal se reemplaza por sulfato de alquilo de (Ci2-Cis). 14) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alquilo de (Ci2-Ci8): aproximadamente 9 % a aproximadamente 15 %; etoxilato de alcohol: aproximadamente 3 % a aproximadamente 6 %; amida de ácido graso de polihidroxilo alquilo: aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %; zeolita (por ejemplo, NaAlSiCU): aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %; disilicato en capas (por ejemplo, SK56 de Hoechst): aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %; carbonato sódico (por ejemplo, a2C03): aproximadamente 3 % a aproximadamente 12 %; silicato soluble (por ejemplo, Na20, 2Si02): 0 % a aproximadamente 6 %; citrato sódico: aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 %; percarbonato sódico: aproximadamente 13 % a aproximadamente 22 %; TAED: aproximadamente 3 % a aproximadamente 8 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): 0 % a aproximadamente 5 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fotoblanqueador, perfume, supresores de las jabonaduras) 0-5 %. 15) Una composición detergente formulada como un granulado que tiene una densidad global de al menos 600 g/1 que comprende sulfato de alquilo de (Ci2-Cis): aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 %; etoxilato de alcohol: aproximadamente 11 % a aproximadamente 15 %; jabón: aproximadamente 1 % a aproximadamente 4 %; zeolita MAP o zeolita A: aproximadamente 35 % a aproximadamente 45 %; carbonato sódico (como Na2CO3): aproximadamente 2 % a aproximadamente 8 %; silicato soluble ( por ejemplo, Na20, 2Si02): 0 % a aproximadamente 4 %; percarbonato sódico: aproximadamente 13 % a aproximadamente 22 %; TAED 1-8 %; carboximetilcelulosa (CMC): 0 % a aproximadamente 3 %; polímeros (por ejemplo, policarboxilatos y PVP): 0 % a aproximadamente 3 %; enzimas (calculadas como proteína de enzima pura) 0.0001-0.1 %; e ingredientes menores (por ejemplo, abrillantador óptico, fosfonato, perfume): 0-3 %. 16) Formulaciones detergentes tal como se describieron en 1)-15), supra, que contienen perácido estabilizado o encapsulado ya sea como un componente adicional o como un sustituto para sistemas blanqueadores ya especificados. 17) Composiciones detergentes tal como se describieron supra en 1), 3), 7), 9), y 12), en donde el perborato se reemplaza por percarbonato. 18) Composiciones detergentes tal como se describieron supra en 1), 3), 7), 9), 12), 14) y 15), además, contienen un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso, por ejemplo, es uno de los compuestos descritos en "catalizadores eficientes para el blanqueo de manganeso de baja temperatura," Naturaleza 369: 637-639 (1994). 19) Composición detergente formulada como un detergente líquido no acuoso que comprende un tensioactivo no iónico líquido, tal como, por ejemplo, alcohol primario alcoxilado lineal, un sistema aditivo (por ejemplo, fosfato), una o varias enzimas y álcali. El detergente puede comprender, además, tensioactivo aniónico y/o un sistema blanqueador.
Como se mencionó anteriormente, el presente polipéptido de amilasa puede incorporarse a una concentración convencionalmente empleada en los detergentes. Actualmente, se contempla que en la composición detergente, la enzima puede añadirse en una cantidad correspondiente a 0.00001-1.0 mg (calculada como proteína enzimática pura) de polipéptido de amilasa por litro de licor de lavado.
La composición detergente puede contener, además, otros ingredientes detergentes convencionales, por ejemplo, material desfloculante, material rellenador, depresores de espuma, agentes anticorrosión, agentes de suspensión de suciedad, agentes secuestrantes, agentes antirredepósito de suciedad, agentes deshidratantes, tintes, bactericidas, agentes fluorescentes, espesantes y perfumes.
La composición detergente puede formularse como una composición detergente para lavandería a mano (manual) o en máquina (automática), que incluye una composición aditiva para lavandería adecuada para el tratamiento previo de telas manchadas y una composición suavizante de telas añadida en el enjuague o puede formularse como una composición detergente para usar en operaciones generales de limpieza de superficies duras en el hogar, o formularse para operaciones de lavado de vajillas manual o automático.
Cualquiera de las composiciones de limpieza descritas en la presente descripción pueden incluir cualquier número de enzimas adicionales. Generalmente, la o las enzimas deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (por ejemplo, con respecto al pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos o no enzimáticos, y similares), y la o las enzima deberían estar presentes en cantidades eficaces. Las siguientes enzimas se proporcionan como ejemplos.
Proteasas. Las proteasas adecuadas incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se incluyen mutantes modificados químicamente o de proteínas diseñados por ingeniería genética, así como proteínas procesadas naturalmente. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, una proteasa microbiana alcalina, una proteasa de tipo tripsina, o una proteasa de tipo quimotripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147, y subtilisina 168 (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 89/06279). Los ejemplos de proteasas de tipo tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y las proteasas de Fusarium {ver, por ejemplo, la patente núm. WO 89/06270 y la patente núm. WO 94/25583).
Además, los ejemplos de proteasas útiles incluyen, pero no se limitan a, las variantes descritas en las patentes núm. WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946. Las enzimas proteasas comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a: ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE®, KANNASE™, y BLAZE™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP™, FN2™, y FN3™ (Danisco US Inc.). Otros ejemplos de proteasas incluyen NprE de Bacillus amyloliquifaciens y ASP de Cellulomonas sp., cepa 69B4.
Lipasas. Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen las modificadas químicamente, modificadas proteolíticamente, o mutantes manipulados de proteína. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen, pero no se limitan a, lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) {ver, por ejemplo, EP 258068 y EP 305216), de H. insolens {ver, por ejemplo, patente núm. WO 96/13580); una lipasa de Pseudomonas (por ejemplo, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes; ver, por ej mplo, EP 218272), P. cepacia {ver, por ejemplo, EP 331376), P. stutzerí {ver, por ejemplo, GB 1,372,034), P. fluor scens, cepa SD 705 de Pseudomonas {ver por ejemplo, patentes núm. WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis {ver por ejemplo, patente núm. WO 96/12012); una lipasa de Bacillus {por ejemplo, de B. subtilis; ver, por ejemplo, Dartois et al . Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993)), B. stearothermophilus (ver, por ejemplo, patente núm. JP 64/744992), o B. pumilus (ver, por ejemplo, patente núm. WO 91/16422). Variantes de lipasa adicionales contempladas para usarse en las formulaciones incluyen las descritas por ejemplo en: las patentes núm. WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, y EP 260105. Algunas enzimas lipasa comercialmente disponibles incluyen LIPOLASE® y LIPOLASE ULTRA™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
Poliesterasas. Las poliesterasas adecuadas pueden incluirse en la composición, tales como las descritas en, por ejemplo, las patentes núm. WO 01/34899, WO 01/14629, y US6933140.
Amílasas. las composiciones pueden combinarse con otras amilasas, tales como amilasa mejorada de no producción. Estas pueden incluir las amilasas disponibles comercialmente, tal como, pero sin limitarse a, STAINZYME®, NATALASE®, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL® y BAN™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); RAPIDASE®, POWERASE®, y PURASTAR® (de Danisco US Inc.).
Celulasas . Las celulasas pueden añadirse a las composiciones. Las celulasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes diseñados por ingeniería de proteínas o modificados químicamente. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas , Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremoníum, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum que se describen, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. núms.4,435,307; 5,648,263; 5,691,178; 5,776,757; y la patente núm. WO 89/09259. Las celulasas ilustrativas adecuadas para el uso son las que proporcionan a la tela un beneficio de cuidado del color. Los ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas por ejemplo en las patentes núm. EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasas, tales como las descritas en la patente núm. WO 94/07998; la patente núm. WO 98/12307; la patente núm. WO 95/24471; PCT/DK98/00299 ; patente núm. EP 531315; las patentes de los EE. UU. núm. 5,457,046; 5,686,593; y 5,763,254. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CELLUZYME® y CAREZYME® (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S); CLAZINASE® y PURADAX HA® (Danisco US Inc.); y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
Peroxidasas/oxidasas . Las peroxidasas/oxidasas adecuadas contempladas para usar en las composiciones incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes diseñados por ingeniería de proteínas o modificados químicamente. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. clnereus, y variantes de estas tales como las descritas en las patentes núm. WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARDZYME™ (Novo Nordisk A/S y Novozymes A/S).
La composición detergente puede comprender, además, 2,6-b-D-fructano hidrolasa, que es eficaz para la eliminación/limpieza de la biopelícula presente en hogares y/o industrial textil/ropa.
La o las enzimas detergentes pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas o mediante la adición de un aditivo combinado que comprende todas estas enzimas. Un aditivo detergente, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse por ejemplo, como un granulado, un líquido, una suspensión, y similares formulaciones de aditivos de detergentes a manera de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, granulados, particularmente granulados no pulverulentos, líquidos, particularmente líquidos estabilizados o suspensiones.
Los granulados que no forman polvo pueden producirse, por ejemplo, tal como se describe en las patentes de los EE. UU. núms. 4,106,991 y 4,661,452 y, opcionalmente, pueden recubrirse por métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de materiales de revestimiento ceroso son productos de poli(óxido de etileno) (por ejemplo, polietilenglicol, PEG) con pesos molares promedio de 1,000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en donde hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Los ejemplos de materiales de revestimiento adecuados que forman una película para la aplicación por medio de téenicas de lecho fluidizado se proporcionan, por ejemplo, en la patente de Gran Bretaña núm. GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o alcohol sacaroso, ácido láctico o ácido bórico de conformidad con métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de conformidad con el método descrito en la patente europea núm. EP 238,216.
La composición detergente puede estar en cualquier forma convencional, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta, o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, típicamente, con un contenido de hasta aproximadamente 70 % de agua y de 0 % a aproximadamente 30 % de solvente orgánico. Además, se contemplan los geles detergentes compactos que contienen aproximadamente 30 % o un porcentaje menor de agua. La composición detergente puede, opcionalmente, comprender uno o más tensioactivos adicionales, que pueden ser no iónicos, que incluyen semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o anfotéricos. Los tensioactivos pueden estar presentes en una amplia variedad, de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 60 % en peso.
Cuando se incluye en ella, el detergente contendrá, típicamente, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % de un tensioactivo aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal, a-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico del ácido a-sulfo graso, ácido alquil o alquenilsuccínico o jabón.
Cuando se incluye en ella, el detergente contendrá, usualmente, de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 40 % de un tensioactivo no iónico, tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetañolamída de ácido graso etoxilado, monoetañolamída de ácido graso, amida de ácidos grasos polihidroxialquilados o derivados de N-acil-N-alquilo de glucosamina ( "glucamidas").
El detergente puede contener de 0 % a aproximadamente 65 % de un aditivo detergente o agente formador de complejos tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético, ácido alquil o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más polímeros. Los polímeros ilustrativos incluyen carboximetilcelulosa (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli() (PEG), poli (alcohol vinílico) (PVA), poli (vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, por ejemplo, poliacrilatos, copolímeros de maleico/ácido acrílico) y copolímeros de metacrilato de laurilo/ácido acrílico.
La o las enzimas de la composición detergente pueden estabilizarse con agentes estabilizadores convencionales, por ejemplo, como poliol (por ejemplo, propilenglicol o glicerina), un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico (por ejemplo, un éster de borato aromático), o un derivado de ácido fenil borónico (por ejemplo, ácido 4-formilfenil borónico). La composición puede formularse tal como se describe en las patentes núm. WO 92/19709 y WO 92/19708.
Se contempla que en las composiciones detergentes, particularmente, las variantes de enzimas, pueden añadirse en una cantidad correspondiente a aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado (por ejemplo, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 5.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado o 0.1 a aproximadamente 1.0 mg de proteína enzimática por litro de licor de lavado).
Aunque las presentes composiciones y métodos se han descrito con referencia a los datos más abajo, debería entenderse que pueden hacerse varias modificaciones. 7.6. Métodos de evaluación de la actividad amilasa en composiciones detergentes Numerosos ensayos de limpieza con a-amilasa se conocen en la materia, incluidos los ensayos de muestras y micromuestras. Los ejemplos agregados describen solamente unos pocos de tales ensayos.
A fin de ilustrar, además, las composiciones y métodos y ventajas de ellos, los siguientes ejemplos específicos se dan con el entendimiento de que son ilustrativos más bien que limitantes. 8. Composiciones de fermentación de cerveza Una AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa pueden ser un componente de una composición de elaboración de cerveza que se usa en un proceso para elaborar, por ejemplo, preparar una bebida de malta fermentada. Hidratos de carbono no fermentables constituyen la mayoría de los sólidos disueltos en la cerveza final. Este residuo permanece como la causa de la incapacidad de amilasas de malta para hidrolizar las uniones alfa-l,6-del almidón. Los hidratos de carbono no fermentables aportan aproximadamente 50 calorías por 354.9 mi (12 onzas) de cerveza. La AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa, en combinación con una glucoamilasa y, opcionalmente, una pululanasa y/o isoamilasa, ayudan a convertir el almidón en dextrinas y azúcares fermentables, lo que reduce los carbohidratos no fermentables residuales en la cerveza final.
Las principales materias primas usadas en la fabricación de estas bebidas son agua, lúpulo y malta. Además, adjuntos tales como granos comunes de maíz, sémola de maíz refinado, levadura molida de cerveza, arroz, sorgo, almidón de maíz refinado, cebada, almidón de cebada, cebada descascarillada, trigo, almidón de trigo, cereales torrificados, copos de cereales, centeno, avena, papa, tapioca, y jarabes, tales como almíbar de maíz, almíbar de caña de azúcar, almíbar de azúcar invertido, cebada y/o almíbar de trigo, y similares pueden usarse como una fuente de almidón.
Por un número de razones, la malta, que se produce principalmente a partir de variedades seleccionadas de cebada, tiene el mayor efecto sobre el carácter general y la calidad de la cerveza. En primer lugar, la malta es el agente aromatizante primario en la cerveza. En segundo lugar, la malta proporciona la mayor parte de la azúcar fermentable. En tercer lugar, la malta proporciona las proteínas, lo que contribuirá a la calidad del cuerpo y la espuma de la cerveza. En ciiarto lugar, la malta proporciona la actividad enzimática necesaria durante la maceración. El lúpulo contribuye, además, significativamente, a la calidad de la cerveza, incluida la condimentación. Particularmente, el lúpulo (o sus constituyentes) añade sustancias deseables de amargor a la cerveza. Además, el lúpulo actúa como precipitante de proteínas, establece agentes conservantes y ayuda en la formación de la espuma y la estabilización.
Los cereales, tales como la cebada, la avena, el trigo, así como componentes de plantas, como el maíz, el lúpulo, y el arroz se usan, además, para la elaboración de la cerveza, tanto en la industria como en la elaboración de cerveza casera. Los componentes usados en la elaboración de la cerveza pueden estar sin maltear o pueden ser malteados, es decir, parcialmente germinados, resultando en un aumento en los niveles de enzimas, incluyendo a-amilasa. Para la elaboración de la cerveza con éxito, niveles adecuados de actividad de la enzima a-amilasa son necesarios para garantizar niveles adecuados de azúcares para la fermentación. Una AcAmyl o variante de esta, por sí misma o en combinación con otra a-amilasa(s), en consecuencia, podría añadirse a los componentes usados para la elaboración de la cerveza.
En la presente descripción, el término "reserva", significa los granos y los componentes de la planta que son triturados o rotos. Por ejemplo, la cebada usada en la producción de cerveza es un grano que ha sido ordinariamente molido o triturado para dar una consistencia apropiada para producir un puré para la fermentación. Como se usa en la presente descripción, el término "materia prima" incluye cualquiera de los tipos de plantas y granos triturados u ordinariamente molidos. Los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para determinar los niveles de actividad a-amilasa en ambos harinas y reserva.
Los procesos para la fabricación de cerveza, son muy conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Wolfgang Kunze (2004) "Teenology Brewing and Malting, " Instituto de Investigación y Enseñanza de la Elaboración de Cerveza, Berlín (VLB), 3.° edición. Brevemente, el proceso implica: (a) preparar un puré, (b) filtrar el puré para preparar un mosto, y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, tal como la cerveza. Típicamente, la malta molida o triturada se mezcla con agua y se mantiene durante un período de tiempo bajo temperaturas controladas para permitir que las enzimas presentes en la malta conviertan el almidón presente en la malta en azúcares fermentables. El puré se transfiere entonces a un filtro de mosto, en donde el líquido se separa del residuo del grano. Este líquido dulce se llama "mosto", y el residuo de grano dejado se llama "grano agotado." La masa se somete, típicamente, a una extracción, que implica la adición de agua al puré con el objetivo de recuperar el extracto soluble residual del grano agotado. El mosto se hierve entonces vigorosamente para esterilizar el mosto y ayudar a desarrollar el color, sabor y olor. Los lúpulos se añaden en algún momento durante la ebullición. El mosto se enfría y se transfiere a un termentador.
El mosto se pone en contacto con la levadura en un termentador. El fermentador puede enfriarse para detener la fermentación. La levadura flocula y se retira. Finalmente, la cerveza se enfría y se almacena durante un período de tiempo, durante el cual se aclara la cerveza y su sabor se desarrolla, y se elimina cualquier material que pueda perjudicar la apariencia, el sabor y la conservación de la cerveza. La cerveza contiene, usualmente, de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 % en v/v de alcohol, aunque puede obtenerse cerveza con un mayor contenido de alcohol, por ejemplo, 18 % en v/v. Antes del envasado, la cerveza es carbonatada y, opcionalmente, se filtra y se pasteuriza.
La composición de elaboración de cerveza que comprende la AcAmyl o variante de esta con una isoamilasa, en combinación con una glucoamilasa y, opcionalmente, una pululanasa y/o isoamilasa, pueden agregarse al puré de la etapa (a) mencionado anteriormente, por ejemplo, durante la preparación del puré. Alternativamente, o adicionalmente, la composición de fermentación puede añadirse al puré de la etapa (b) anterior, es decir, durante la filtración del puré. Alternativamente, oo aaddiicciioonnaallmmeennttee,, la composición de fermentación puede añadirse al mosto de la etapa (c) anterior, es decir, durante la fermentación del mosto.
Una bebida fermentada, tal como una cerveza, puede producirse por uno de los métodos anteriores. La bebida fermentada puede ser una cerveza, tal como cerveza malteada completa, cerveza elaborada bajo el marco de la "Reinheitsgebot", ale, IPA, lager, bitter (amarga), Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, cerveza negra (stout), licor de malta, cerveza sin alcohol, licor de malta sin alcohol y similares pero, además, bebidas alternativas de cereales y malta tales como bebidas de malta con sabor a frutas, por ejemplo, con sabor a cítricos, tales como bebidas de malta con sabor a limón, naranja, lima, o bayas, bebidas de malta con sabor a licor, por ejemplo, licor de malta con sabor a vodka, ron, o tequila, o bebidas de malta con sabor a café, tal como licor de malta con sabor a cafeína, y similares. 9. Reducción de almidón positivo a yodo La AcAmyl y variantes de esta con una isoamilasa pueden reducir el almidón positivo a yodo (IPS, por sus siglas en inglés), cuando se usan en un método de licuación y/o sacarificación. Una fuente de IPS es de la amilosa que escapa a la hidrólisis y/o de polímero de almidón retrogradado. La retrogradación del almidón ocurre espontáneamente en una pasta de almidón, o gel en envejecimiento, debido a la tendencia de las moléculas de almidón de unirse unas a otras seguido por un aumento de la cristalinidad. Las soluciones de baja concentración se vuelven cada vez más turbias debido a la asociación progresiva de las moléculas de almidón en artículos más grandes. Se produce la precipitación espontánea y el almidón precipitado aparentemente vuelve a su condición original de insolubilidad en agua fría. Las pastas de concentración más alta en el enfriamiento se gelifican y, durante el añejamiento, se vuelven más firmes debido a la asociación creciente de las moléculas de almidón. Esto se debe a una marcada tendencia para formar enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxi en moléculas de almidón adyacentes. Ver J.A. Radlcy, ed., STARCH AND ITS DERIVATIVES 194-201 (Chapman y Hall, Londres (1968)).
La presencia de IPS en el licor de sacáridos afecta negativamente la calidad del producto final y representa una cuestión importante con respecto al procesamiento corriente abajo. El IPS tapona o reduce la velocidad del sistema de filtración y obstruye las columnas de carbono usadas para la purificación. Cuando el IPS alcanza niveles suficientemente altos, puede filtrarse a través de las columnas de carbono y reducir la eficacia de la producción. Además, el producto final obtenido se puede volver turbio en el almacenamiento, de manera que la calidad final del producto sea inaceptable. La cantidad de IPS puede reducirse al aislar el tanque de sacarificación y mezclar los contenidos de vuelta. Sin embargo, el IPS se acumulará en columnas de carbono y sistemas de filtro, entre otras cosas. Así, se espera que el uso de AcAmyl o variantes de esta mejoren el rendimiento global del proceso al reducir la cantidad de IPS.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Clonación de AcAmyl Se secuencia el genoma de Aspergillus clavatus. Ver Base de datos comparativas de 10 direcciones de Aspergillus asp2_v3, en Internet en el protocolo de transferencia de hipertexto:http://aspgd.broadinstitute.org/cgi-bin/asp2_v3/shared/show_organism.cgi?site=asp2_v3&id=2 (descargado el 24 de mayo de 2010). A. clavatus codifica una glicosil hidrolasa con homología con otra alfa-amilasa fúngica como se determinó a partir de una búsqueda BLAST. Ver la Fig. 1. La secuencia de nucleótidos del gen AcAmyl, que comprende ocho intrones, se expone en la sec. con núm. de ident:. 2. Una secuencia similar está presente en el núm. de referencia del NCBI XM_001272244.1, Aspergillus clavatus amilasa NRRL 1 alfa amilasa, putativo (ACLA_052920; sec. con núm. de ident.: 7). El polinucleótido descrito en el núm de referencia del NCBI XM_001272244.1 representa una secuencia de ADNc obtenida a partir del ARNm que codifica AcAmyl que carece de las ocho secuencias de intrones.
El gen AcAmyl se amplificó a partir de ADN genómico de Aspergillus clavatus mediante el uso de los siguientes cebadores: cebador 1 (Not I) 5'-ggggcggccgccaccATGAAGCTTCTAGCTTTGACAAC-3' (sec. con núm. de ident.: 8), e cebador 2 (Ase I) 5'-cccggcgcgccttaTCACCTCCAAGAGCTGTCCAC-3' (sec. con núm. de ident.: 9). Después, de la digestión con Not I y Ase I, el producto de PCR se clonó en el vector de expresión pTrex3gM (descrito en la solicitud publicada de los EE. UU. núm. 2011/0136197 Al) se digirió con las mismas enzimas de restricción, y el plásmido resultante se etiquetó pJG153. Un mapa del plásmido de pJG153 se proporciona en la Fig.2. La secuencia del gen AcAmyl se confirmó por secuenciación de ADN La secuencia difiere de la sec. con núm. de ident:.2 en dos posiciones, en las bases 1165 (G -> A) y 1168 (T C). Los cambios en la secuencia de nucleótidos no cambian la secuencia de aminoácidos de AcAmyl.
Ejemplo 2. Expresión y purificación de AcAmyl.
El plásmido pJG153 se transformó en una cepa de Trichoderma reesei quad-eliminado (que se describe en la patente núm. WO 05/001036) mediante el uso del método biolístico (Te1o et al., J. Microbiol . Methods 51: 393-99, 2002). La proteína se secretó al medio extracelular, y el medio de cultivo filtrado se usó para realizar un SDS-PAGE y un ensayo de actividad de alfa-amilasa para confirmar la expresión de la enzima.
La proteína AcAmyl se purificó mediante precipitación con sulfato amónico, más cromatografía en 2 etapas. El sulfato amónico se agregó a aproximadamente 900 mi de caldo de cultivo de un matraz de agitación para obtener una concentración final de sulfato amónico de 3 M. La muestra se centrifugó a IO,OOOC g durante 30 min y el sedimento se suspendió nuevamente en amortiguador de fosfato sódico 20 mM pH 7.0, sulfato amónico 1 M (amortiguador A). Después de filtrar, esta muestra se cargó en una columna Phenyl-Sepharose™ de 70 mi equilibrada con amortiguador A. Después, del cargado, la columna se lavó con tres volúmenes de columna del amortiguador A. La proteína objetivo se eluyó en sulfato amónico 0.6 M. Las fracciones de la columna Phenyl-Sepharose™ se agruparon y se dializaron frente a Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 (amortiguador C) durante la noche y, después, se cargaron en una columna de Q-HP Sepharose de 50 mi equilibrada con el amortiguador C. La proteína objetivo se eluyó con un gradiente de 20 volúmenes de columna de 0-100 % del amortiguador C con NaCl 1 M (amortiguador D). Las fracciones que contenían AcAmyl se agruparon y se concentraron mediante el uso de dispositivos Amicon Ultra-15 de 10 KDa. La muestra estaba por encima de 90 % de pureza y se almacenó en glicerol al 40 % a -80 °C. o 3. Determinación de la actividad a-amilasa de La actividad de a-amilasa se analizó en base a su liberación de azúcar reductor a partir del sustrato de amilopectina de papa. La formación de azúcares reductores se controló colorimétricamente mediante un ensayo PAHBAH. El número de actividad se informa como equivalentes de glucosa liberada por minuto.
El sustrato de amilopectina de papa al 2.5 % (AP, Fluka, cat. núm.10118) se preparó con 1.25 g ds en total de 50 g de agua/Tween al 0.005 % seguido de calentamiento durante 1 min con un horno de microondas a intervalos de 15 s y agitación. Un cóctel de amortiguadores se preparó al mezclar 5 mi de 0.5 M de acetato de Na, pH 5.8; 2.5 mi de 1 M NaCl; 0.2 mi de 0.5 M CaCl2; y 7.3 mi de agua/Tween (167 mM acetato de Na, 167 mM NaCl, 6.67 mM CaCl2).
La enzima purificada se diluyó a 0.4 mg/ml (400 ppm) en agua/Tween como solución estándar. En la primera fila de una placa de microtitulación sin unión (Corning 3641), se agregó 195 ml de agua y se colocó 100 ml de agua/Tween en todos los pocilios restantes se agregó 5 m? de 400 ppm de enzima a la primera fila de manera que la concentración de enzima es 10 ppm en el pocilio y la concentración de enzima final en la reacción es de 2 ppm. Un doble dilución en serie se llevó a cabo (40 m? + 40 m?), a través del séptimo pocilio, y se dejó el octavo pocilio como un blanco libre de enzima. Se dispensó 15 ml de cóctel de amortiguadores, seguido por 25 ml de amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática. Las reacciones se iniciaron al dispensar 10 m? de la dilución enzimática en serie a la placa de PCR, se mezclaron rápidamente con un agitador de vórtice, e incubaron durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR a 50 °C con una tapa calentada (80 °C). Después de exactamente 10 minutos, se agregó 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa seguido por agitación con vórtice para terminar la reacción.
Los azúcares reductores totales presentes en los tubos se analizaron a través de un método PAHBAH: 80 m? de NaOH 0.5 N se dividieron en alícuotas en una placa de microtubo de PCR seguido por 20 m? del reactivo de PAHBAH (hidrazida de ácido 4-hidroxibenzoico 5 % en p/v en HCl 0.5 N). se agregó 10 m? de las reacciones terminadas a cada fila mediante el uso de una pipeta multicanal y se mezcló brevemente con pipeteo hacia arriba y hacia bajo. La placa cargada se incubó a 95 °C durante 2 min sellada con papel de estaño. Se transfirieron 80 m? de las reacciones desarrolladas a una placa de icrotitulación de poliestireno (Costar 9017), y se determinó la OD a 410 nm. Los valores de OD resultantes se representaron contra la concentración de enzima mediante el uso de Microsoft Excel. La regresión lineal se usó para determinar la pendiente de la parte lineal del gráfico. La actividad amilasa se cuantificó mediante el uso de la Ecuación 1:.
Actividad específica (unidad/mg) = pendiente (enzima)/pendiente (est.) x 100 (1), en donde 1 unidad = 1 mmo? de eq. glucosa /min.
Una actividad específica representativa de AcAmyl y la AkAA amilasa de referencia se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Actividad específica de alfa-amilasas purificadas en amilopectina.
Ejemplo 4. Efecto del pH sobre la actividad a-amilasa de AcAmyl.
El efecto del pH sobre la actividad amilasa de AcAmyl se controló mediante el uso del protocolo de ensayo de alfa-amilasa como se describió en el Ejemplo 3 en un intervalo de pH de 3.0 a 10.0. Las soluciones estándar de amortiguadores se prepararon como soluciones estándar de amortiguador de acetato sódico 1 M con pH 3.0 a 6.0, solución estándar de amortiguador de HEPES 1 M con pH 6.0 a pH 9.0, y solución estándar de amortiguador de CAPS 1 M, pH 10.0. El amortiguador de trabajo contiene 2.5 mi de acetato Na 1 M (pH 3.5-6.5) o HEPES 1 M (pH 7 - 9), cada mitad de unidades de pH, con 2.5 mi de NaCl 1 M y 50 ml de CaCl2 2 M, 10 mi de agua/Tween (167 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl2 6.67 mM), de manera que la mezcla de reacción enzimática final contiene 50 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl22 mM.
Las soluciones estándar de enzimas se prepararon en agua/Tween 0.005 % a concentraciones en el intervalo lineal del ensayo PAHBAH. Se dispensaron 15 ml de amortiguador de trabajo (pH 3.5-7.0 mediante el uso de acetato sódico, pH 6.0-9.0 mediante el uso de HEPES), seguido por 25 ml de amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática Los amortiguadores de acetato sódico y HEPES se usaron por separado a valores de pH de 6.0, 6.5, y 7.0 para confirmar que no hay efectos de los amortiguadores sobre la actividad enzimática. Las reacciones se iniciaron al dispensar 10 m? de solución estándar enzimática a la placa de PCR, mezclar rápidamente en un agitador con vórtice, e incubar durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR a 50 °C con una tapa calentada (80 °C). Las reacciones se realizaron en repeticiones de tres. Se incluyeron muestras blanco con el uso de los diferentes amortiguadores de pH solos. Después, de exactamente 10 min, se agregó 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa, seguido por agitación con vórtice para terminar la reacción. Los azúcares reductores totales presentes en los pocilios se analizaron con el método PAHBAH descrito anteriormente. Los valores resultantes de OD se convirtieron a un porcentaje de la actividad relativa al definir el pH óptimo como 100 % de actividad. El porcentaje de actividad relativa, representado gráficamente como una función del pH, se muestra en la Fig.3A (AkAA de referencia) y la Fig. 3B (AcAmyl). El pH óptimo y el intervalo de pH a> 70 % de la actividad máxima cuando la hidrólisis se mide a 50 °C se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 2 pH óptimo e intervalo de H (> 70 % de actividad) a 50 °C para las alfa-amilasas purificadas.
Ejemplo 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad o¡-amilasa de AcAmyl.
La actividad de la alfa-amilasa fúngica se controló mediante el uso del protocolo de ensayo de alfa-amilasa como se describió en el Ejemplo 4 en un intervalo de temperatura de 30 °C a 95 °C. Un solución estándar de amortiguador óptimo de cada enzima se prepara como 2.5 mi del amortiguador 1 M (acetato sódico o HEPES, en dependencia del pH óptimo de la enzima), 2.5 mi de NaCl 1 M y 50 ml de CaCl22 M, 10 mi de agua/Tween (167 mM ea. amortiguador y NaCl, CaCl26.67 mM), i de manera que la mezcla de reacción final contenía 50 mM de cada amortiguador y NaCl, CaCl22 mM.
Las soluciones estándar de enzimas se prepararon como se describió anteriormente. Se dispensaron 15 ml del solución estándar de amortiguador (pH óptimo, predeterminado), seguido de 25 ml de la amilopectina, en una placa de PCR mediante el uso de una pipeta automática. Las reacciones se iniciaron al dispensar 10 m? de enzima a la placa de PCR, mezclar rápidamente en un agitador de vórtice, e incubar durante 10 minutos en un bloque de calor de PCR, a 30 - 95 °C (cada 5-10 °C) con la tapa calentada a la misma temperatura o mayor que la de incubación. Las reacciones se realizaron en repeticiones de tres. Se incluyeron muestras blanco mediante el uso de los diferentes amortiguadores solos. Después de exactamente 10 min, se agregó 20 m? de NaOH 0.5 N a la placa, seguido por agitación con vórtice para terminar las reacciones. Los azúcares reductores totales presentes en los tubos se analizaron con un método PAHBAH como se describió anteriormente. Los valores de OD resultantes se convirtieron a un porcentaje de actividad relativa al definir la temperatura óptima como 100 % de actividad. Los perfiles de temperatura de las alfa-amilasas fúngicas se muestran en la Fig. 4A (AkAA de referencia) y la Fig. 4B (AcAmyl). La temperatura óptima y el intervalo de temperatura a> 70 % de la actividad máxima se enumeran en la Tabla 3, cuando se miderí en el pH óptimo indicado de la enzima.
Tabla 3. Temperatura óptima e intervalo de temperatura (>70 % de actividad) para las alfa-amilasas en sus respectivos pH óptimos. i io sostenido sobre la actividad g-amilasa de AcAmyl.
SSF se realiza, usualmente, a pH 3.5-5.5, a 32 °C durante 55 horas, y las enzimas usadas en el proceso deben ser capaces de mantener su actividad durante todo el proceso. Así, es útil saber la estabilidad a pH bajo de las a-amilasas. El siguiente protocolo se usa para probar la estabilidad por pH.
Las enzimas se diluyeron en acetato sódico 50 mM a pH 3.5 y 4.8 a una concentración en el intervalo lineal del ensayo de a-amilasa descrito anteriormente. Las enzimas diluidas se incubaron a temperatura ambiente, y se muestrearon 10 ml para los ensayos en t = 0, 2, 4, 19, 24, 28, y 43 h. Los ensayos se llevaron a cabo bajo condiciones estándar mediante el uso de amilopectina como un sustrato y PAHBAH para el azúcar reductor a pH 5, 50 °C, como se describió anteriormente. Los datos se procesaron al normalizar la señal con el estándar de glucosa y se representaron gráficamente como el porcentaje de actividad residual con relación a t = 0 como una función del tiempo. En la Fig.5A y la Fig.5B se muestra la actividad residual de la AkAA de referencia y AcAmyl, respectivamente, después de una incubación a pH 3.5 o 4.8 para diferentes períodos de tiempo. Tanto AkAA como AcAmyl mantienen >60 % de actividad después de la incubación extendida a pH 3.5. La AcAmyl retuvo menos actividad que AkAA a pH 4.8. Por el contrario, las amilasas de origen bacteriano usualmente perdieron la mayor parte de su actividad en varias horas bajo estas condiciones (datos no mostrados).
Ejemplo 7. Análisis del perfil de productos de AcAmyl.
Para ensayar los productos de la catálisis de a-amilasa fúngica de polisacáridos, las amilasas se incubaron con tres sustratos diferentes, DP7, amilopectina, y licuefacto de DE10 de maltodextriña, a 50 °C, pH 5.3 durante 2 horas. Los oligosacáridos liberados por las enzimas se analizaron mediante HPLC.
Una concentración final de 10 ppm de amilasa se incubó con 0.5 % (p/v) de sustrato en amortiguador de citrato sódico 50 mM pH 5.3 que contenía NaCl 50 mM y CaCl22 mM durante 120 min a 50 °C. Después, la reacción se detuvo al añadir el mismo volumen de etanol y centrifugar 10 min a 14,000 rpm. El sobrenadante se diluyó por un factor de 10 mediante el uso de agua MilliQ, y se cargaron 10 ml en una columna de HPLC Aminex HPX-42A, 300 mm x7.8 mm, equipada con un detector de índice de refracción. La fase móvil fue agua MilliQ, y la velocidad de flujo fue de 0.6 ml/min a 85 °C.
La Tabla 4 muestra el perfil de oligosacáridos sacarificados por AcAmyl y AkAA de referencia para varios sustratos. Solo se muestran los oligosacáridos con DPI- DP7. Los números en la tabla reflejan el porcentaje en peso de cada DPn como una fracción del total de DPI - DP7. La AcAmyl produjo principalmente DPI y DP2, con DP2 como el producto principal para todos los substratos ensayados. La AcAmyl produjo una composición de azúcares que contenían al menos 50 % p/p de DP2 con relación a las cantidades combinadas de DP1-DP7. La AkAA, por otro lado, produjo un perfil de productos más uniformemente distribuido de DPI a DP4.
Tabla 4. Perfil de productos de alfa-amilasas fúngicas sobre tres sustratos. o 8. Licuación La AcAmyl se usó para licuar un solución de almidón de maíz DS al 25 %. Se agregó 800 mg de AcAmyl a la solución de almidón de maíz durante 10 minutos a pH 5.8 y 85 °C, y pH 4.5 y 95 °C. La actividad de licuefacción se analizó mediante una prueba con viscosímetro RVA. La Tabla 5 muestra la reducción de la viscosidad por AcAmyl.
Tabla 5. Viscosidad pico y final de la harina de maíz durante la licuación en la i d Ejemplo 9. Fermentación de etanol con SSF La capacidad de AcAmyl para producir etanol y reducir el almidón residual insoluble (IRS, por sus siglas en inglés) se analizó en SSF. Los resultados muestran que AcAmyl puede lograr efectos comparables con AkAA pero a una dosis reducida El licuefacto se preparó especialmente para contener una cantidad relativamente alta de almidón residual al final de la fermentación (EOF) de la suspensión de maíz para ayudar a diferenciar el rendimiento en el abatimiento del almidón residual insoluble (IRS) y la suciedad por IRS. La SSF se llevó a cabo con AkAA o AcAmyl en la presencia de una variante de glucoamilasa de Trichoderma que tiene un índice de desempeño de DP7 de al menos 1.15 medido con el uso de FPLC (ver patente de los EE. UU. núm. 8,058,033 B2, Danisco US Inc.), de acuerdo con el procedimiento más abajo. Después, de SSF, las muestras se analizaron para: (i) el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+ mediante el uso de HPLC; y (ii) IRS mediante el uso de un ensayo de yodo. Los niveles de DP3+ se miden a través del volumen de vacíos, la reducción de los cuales se interpreta comúnmente que refleja la eficacia de la sacarificación de los licuefactos.
Preparación de licuefacto. El licuefacto congelado (30 % DS) se incubó durante la noche a 4 °C, después se colocó en baño de agua a 70 °C hasta la descongelación completa (1-3 horas). La temperatura del licuefacto se ajustó a 32 °C. El licuefacto se pesó, y se agregó urea sólida a 600 ppm. El pH del licuefacto se ajustó con ácido sulfúrico 6 N o hidróxido amónico al 28 %.
Fermentación. Se usó levadura ETHANOL RED® (Lesaffre) para convertir la glucosa en etanol. La levadura seca se agregó a 0.1 % p/p al lote de licuefacto, y la composición se mezcló bien y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se pesó 100 g +/- 0.2 g de licuefacto (32 % DS) en matraces Erlenmcyer de 150 mi etiquetados individualmente, se agregó glucoamilasa a cada matraz a dosificaciones variables de 0.325 GAU/g sólidos, 0.2275 GAU/g sólidos, y 0.1625 GAU/g sólidos. Las alfa-amilasas AkAA o AcAmyl se agregó a cada matraz en dosificaciones variables, con la dosificación más alta en 20 mg de proteína/g sólidos (dosis 100 %). La mezcla se incubó en una incubadora de aire forzado con mezclado a 200 rpm durante 54 o 70 horas a un pH de 3.5 a 4.8, 32 °C. Aproximadamente 1 mi de muestras de la suspensión de EOF de maíz se tomaron en aproximadamente t = 0, 3, 19, 23, 27, 43, 52, y/o 70 horas y se almacenaron en congelación. Las muestras de EOF se analizaron para el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+, e IRS. (i) Rendimiento de etanol y reducción de DP3+ Para determinar el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+, las muestras de cada punto de tiempo se descongelaron a 4 °C y se centrifugaron durante 2 min a 15,000 rpm. 100 ml de los sobrenadantes de las muestras se mezclaron en tubos de microcentrífuga individuales con 10 ml de ácido sulfúrico 1.1 N y se incubaron 5 min a temperatura ambiente, se agregó 1 mi de agua a cada tubo, y los tubos se centrifugaron durante 1 min a 15,000 rpm. 200 m? de la muestra se filtraron en una placa de HPLC. La placa se analizó en un equipo de HPLC Agilent con el uso de una columna Rezex Fast Fruit RFQ con un tiempo de elución de 8 min. Las curvas de calibración para los componentes mencionados anteriormente se prepararon con el uso de un etanol Supelco Fuel (Sigma, cat. núm. 48468-U). Las concentraciones de DPI, DP2, DP3+, glicerol, ácido acético, ácido láctico, y etanol (g/1) se determinaron mediante el uso del software ChemStation. La producción de etanol se convirtió al por ciento v/v de la mezcla de reacción.
Las velocidades de producción de etanol obtenido con AcAmyl y una glucoamilasa a pH 4.8 fueron comparables a las obtenidas con AkAA y una glucoamilasa (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares a pH 3.5 y pH 3.8 para la velocidad y el rendimiento de la producción de etanol y la hidrólisis de DP3+ (datos no mostrados) . A las 21 horas, el rendimiento de etanol era de aproximadamente 8 % en v/v para el control y AcAmyl como la a-amilasa. Para ambos se observaron, además, rendimientos de etanol similares alrededor de las 48 horas. La velocidad de hidrólisis de DP3+; sin embargo, mejoró notablemente mediante el uso de AcAmyl y glucoamilasa. A las 6 horas, DP3+ (p/v) se redujo de 23 % a aproximadamente 8-9 % con AcAmyl y glucoamilasa, en comparación con aproximadamente 14 % para el control. La cantidad final de DP3+ a las 48 horas fue de aproximadamente 2 % en ambos casos. Los mismos resultados a pH 4.8 para el rendimiento de etanol y la velocidad y extensión de la hidrólisis de DP3+ se obtuvieron mediante el uso de menos AcAmyl que AkAA (datos no mostrados), lo que indica que AcAmyl puede usarse en una dosificación reducida en comparación con AkAA . (ii) Almidón positivo al yodo El siguiente procedimiento describe un método para predecir cualitativamente los niveles de almidón residual después de una fermentación convencional de licuefacto de maíz mediante tinción de amilosa con yodo. Se agregó un gramo de la suspensión de maíz EOF a tubos de microcentrí fuga etiquetados individualmente. Se agregó 200 ml de agua desionizada a cada tubo, después se agregó 20 ml de solución de yodo a cada tubo y se mezcló a fondo La solución de yodo (reactivo de Lugol) se preparó al disolver 5 g de yodo y 10 g de yoduro de potasio en 100 mi de agua. Los tubos teñidos con yodo se clasificaron en el orden de incremento del color azul. Las muestras teñidas con azul/negro contienen los niveles más altos de almidón residual.
El protocolo Megazyme Total Starch (Megazyme International, Irlanda) disponible comercialmente se adaptó para determinar cuantitativamente los niveles de almidón residual de una fermentación convencional de licuación de maíz. 800 mg (+/- 20 mg) de la suspensión de maíz de EOF se agregó a un tubo de ensayo de polipropileno seguido por la adición de 2 mi de amortiguador MOPS 50 mM con un pH de 7.0. Después, se agregó 3 mi de a-amilasa termoestable (300 U) en amortiguador MOPS 50 mM, pH de 7.0 y el tubo se agitó vigorosamente. El tubo se incubó en un baño de agua hirviente durante 12 min con agitación vigorosa después de 4 min y 8 min. Posteriormente, se agregó 4 mi de amortiguador de acetato sódico 200 mM, pH de 4.5, y 0.1 mi de amiloglucosidasa (50 U). El tubo se agitó en un mezclador de vórtice y se incubó en un baño de agua a 60 °C durante 60 min. La mezcla se centrifugó a 3,500 rpm durante 5 min.8 ul del sobrenadante se trasladaron a una placa de microtitulación que contiene 240 ul de reactivo GOPOD. 8 ul de controles de glucosa y blancos de reactivos se agregaron, además, a 240 ul de reactivo GOPOD y las muestras se incubaron a 50 °C durante 20 min. Después, de la incubación, se determinó directamente la absorbancia a 510 nm. La cantidad de glucosa medida para la suspensión de maíz EOF se convirtió en la cantidad de almidón residual.
La Tabla 6 muestra el nivel de almidón residual en la suspensión de maíz EOF después de una SSF con AcAmyl y AkAA. Se descubrió que el almidón residual era aproximadamente el mismo con el uso de 10 ug de proteína / g de sólido de AkAA (dosis al 50 %) y 3.3 mg de proteína / g de sólido para AcAmyl (dosis al 17 %). Dados los datos, AcAmyl aparece al menos tres veces más eficiente que AkAA en eliminar el almidón residual.
Tabla 6. Análisis de almidón residual por SSF con AcAmyl y AkAA.
Ejemplo 10. Fermentación de etanol por SSF con isoamilasa y glucoamilasa La capacidad de AcAmyl con isoamilasa y glucoamilasa para producir etanol y reducir el almidón residual insoluble (IRS) se analizaron en SSF. Los resultados muestran que la AcAmyl con isoamilasa y glucoamilasa pueden lograr efectos comparables como AkAA con isoamilasa y glucoamilasa, pero a una dosificación reducida de la alfa amilasa.
El licuefacto se obtuvo de Lincolnway Energy LLC (Nevada, IA, Estados Unidos). La SSF se llevó a cabo con AkAA o AcAmyl, con o sin isoamilasa y en presencia de una variante de glucoamilasa de Trichoderma que tiene un índice de rendimiento de DP7 de por lo menos 1.15 determinado con el uso de la FPLC (ver la patente de los Estados Unidos núm. 8,058,033 B2, Danisco US Inc .), de conformidad con el proceídimiento a continuación. Después, de SSF, las muestras se analizaron para: (i) el rendimiento de etanol y la reducción de DP3+ mediante el uso de HPLC; y (ii) almidón residual con el uso de un ensayo de almidón residual. Los niveles de DP3+ se miden a través del volumen de vacíos, la reducción de los cuales se interpreta comúnmente que refleja la eficacia de la sacarificación de los licuefactos.
Preparación de licuefacto. El licuefacto congelado (DS al 31 %) se descongeló durante la noche a temperatura ambiente antes de usar. El licuefacto se pesó y el pH se ajustó hasta 4.8 con el uso de ácido sulfúrico 4 N y se usó urea hasta una concentración final de 600 ppm.
Fermentación. Se usó levadura ETHANOL RED® (Lesaffre) para convertir la glucosa en etanol. La levadura seca se agregó a 0.1 % p/p al lote de licuefacto, y la composición se mezcló bien y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se pesó 50 g +/1 g- 0. de licuefacto (31 % DS) en matraces Erlenmcyer de 150 mi etiquetados individualmente. Se agregó glucoamilasa en cada matraz a 49.5 mg de proteína/g de sólido. Se agregó alfa-amilasas AkAA o AcA yl en cada matraz a diversas dosificaciones. Se agregó isoamilasa en cada matraz a diversas dosificaciones. La mezcla se incubó en una incubadora de aire forzado con mezclado a 100 rpm durante 53 horas a un pH de 4.8, 32 °C. Se tomó aproximadamente 1 mi de las muestras de suspensión de maíz a aproximadamente t = 5, 22, 29, 46 y 53 horas y se centrifugaron durante 5 min a 15,000 rpm. Se mezcló 100 ml de los sobrenadantes de las muestras en tubos de microcentrífuga individuales con 10 ml de ácido sulfúrico 1.1 N y se incubaron 5 min a temperatura ambiente. Se agregó 1 mi de agua en cada tubo y los tubos se incubaron a 95 °C durante 5 minutos. Los tubos se almacenaron a 4 °C para su análisis posterior. Las muestras se analizaron para evaluar la producción de etanol, la reducción de DP3+ y el almidón residual. (i) Producción de etanol y reducción de DP3+ Para determinar la producción de etanol y la reducción de DP3+, las muestras de un momento específico se filtraron y se recolectaron en una placa de HPLC. Las muestras se analizaron en un equipo de HPLC Agilent con el uso de una columna Rezex Fast Fruit RFQ con un tiempo de elución de 6 min. Las curvas de calibración para los componentes mencionados anteriormente se generaron con el uso de protocolos convencionales.
Las velocidades de producción de etanol obtenidas con 3.3 mg de proteína/g de sólido AcAmyl con isoamilasa y una glucoamilasa a un pH de 4.8 fueron comparables a las obtenidas con el uso de 10 pg de proteína/g de sólido AkAA con isoamilasa y una glucoamilasa. A las 22 horas, la producción de etanol era de aproximadamente 8.8 % en v/v para 3.3 pg de proteína/g de sólido AcAmyl en combinación con 0.63 pg de proteína/g de sólido isoamilasa y 49.5 pg de proteína/g de sólido glucoamilasa, en comparación con 8.6 % en v/v para 10 mg de proteína/g de sólido AkAA en combinación con 0.63 pg de proteína/g de sólido isoamilasa y 49.5 pg de proteína/g de sólido glucoamilasa. Para ambos se observó, además, producciones de etanol similares a aproximadamente 46 horas: La producción de etanol fue 12.7 % en v/v para 3.3 pg de proteína/g de sólido AcAmyl en combinación con 0.63 pg de proteína/g de sólido isoamilasa y 49.5 pg de proteína/g de sólido glucoamilasa, en comparación con 12.8 % en v/v para 10 pg de proteína/g de sólido AkAA en combinación con 0.63 pg de proteína/g de sólido isoamilasa y 49.5 pg de proteína/g de sólido glucoamilasa. Se obtuvo los mismos resultados para la producción de etanol después de 53 horas con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl como se obtuvo con el uso de 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA, lo que indica que la AcAmyl puede usarse a una dosificación reducida en comparación con AkAA cuando cualquier enzima se combina con una combinación invariable de 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa. Ver la Tabla 7. Se observa el mismo efecto en la producción de etanol incluso cuando la dosis de isoamilasa se incrementa hasta 1.3 pg de proteína/g de sólido. Cuando 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl o 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA se combinaron con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa, se obtuvo casi los mismos resultados a un pH de 4.8 para el nivel de producción de etanol después de 53 horas, a pesar de la diferencia en la dosificación. Ver la Tabla 7.
Tabla 7. Análisis de producción de etanol después de 53 horas para SSF con AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa.
Sin embargo, la velocidad de hidrólisis de DP3+ se mejoró notablemente con el uso de AcAmyl con isoamilasa y glucoamilasa, tal como se muestra en la Tabla 8. Se obtuvo los mismos resultados para el nivel de hidrólisis de DP3+ después de 53 horas (es decir, 0.7 % (w/v)) con el uso de 3.3 ug de proteína/g de sólido de AcAmyl como se obtuvo con el uso de 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA, lo que indica que la AcAmyl puede usarse a una dosificación reducida en comparación con la AkAA cuando cualquier enzima se combina con una combinación invariable de 49.5 mg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa. Se observó el mismo efecto en la hidrólisis de DP3+ incluso cuando la dosis de isoamilasa se incrementó hasta 1.3 pg de proteína/g de sólido. Por ejemplo, cuando 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl o 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA se combinaron con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa, se obtuvo casi los mismos resultados para el nivel de hidrólisis de DP3+ después de 53 horas, por ejemplo, 0.6-0.7 % (w/v). De hecho, la AcAmyl a la dosificación inferior fue ligeramente más efectiva que la AkAA a la dosificación superior, dado que quedó menos DP3+ después de 53 horas.
Tabla 8. Análisis de DP3+ después de 53 horas para SSF con AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa.
Tabla 9. Análisis de DP3+ despues de 53 horas para SSF con AcAmyl en combinación con glucoamilasa con y sin isoamilasa.
La Tabla 9 ilustra que se obtuvo los mismos resultados a un pH de 4.8 para el nivel de hidrólisis de DP3+ después de 53 horas (por ejemplo, 0.6 % (w/v)) con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl en combinación con 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa como se obtuvo con el uso de 6.6 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl sin isoamilasa cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa. En otras palabras, la dosis de alfa amilasa puede reducirse en una mitad cuando se agrega 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa.
Tabla 10. Análisis de etanol después de 29 horas para SSF con AcAmyl en combinación con glucoamilasa con y sin isoamilasa.
La Tabla 10 ilustra que se obtuvo los mismos resultados a un pH de 4.8 para el nivel de hidrólisis de etanol después de 29 horas (por ejemplo, 10.5-10.8 % (w/v)) con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl en combinación con 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa como se obtuvo con el uso de 6.6 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl sin isoamilasa cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa. En otras palabras, la dosis de alfa amilasa puede reducirse en una mitad cuando se agrega 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa. La dosis de isoamilasa que se agrega (1.3 pg de proteína/g de sólido) corresponde al 20 % de la dosis de alfa amilasa (6.6 pg de proteína / g de sólido) que se requiere en ausencia de isoamilasa para obtener casi los mismos resultados.
Tabla 11. Perfil del producto después de 29 horas para SSF con AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa. Los productos se expresaron como (¾ en w/v).
La Tabla 11 muestra el perfil del producto después de 29 horas para SSF con AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa, con el uso de la misma dosificación de alfa amilasa (3.3 pg de proteína / g de sólido) para propósitos de comparación.
Los resultados muestran que a las 29 horas el DPI se enriqueció con el uso de AcAmyl en comparación con el uso de AkAA, cuando cualquier enzima se usó para SSF en combinación con isoamilasa y glucoamilasa. Además, se enriqueció DP2 y DP1+DP2 bajo las mismas condiciones. (ii) Almidón residual El protocolo Megazyme Total Starch (Megazyme International, Ireland) disponible comercialmente se adaptó para determinar cuantitativamente los niveles de almidón residual de una fermentación convencional de licuefacto de maíz. Se agregó 800 mg (+/- 20 mg) de la suspensión de maíz de EOF en un tubo de ensayo de polipropileno seguido por la adición de 2 mi de amortiguador de MOPS 50 mM a un pH de 7.0. Después, se agregó 3 mi de a-amilasa termoestable (300 U) en amortiguador MOPS 50 mM, pH de 7.0 y el tubo se agitó vigorosamente. El tubo se incubó en un baño de agua hirviente durante 12 min con agitación vigorosa después de 4 min y 8 min. Posteriormente, se agregó 4 mi de amortiguador de acetato sódico 200 mM, pH de 4.5, y 0.1 mi de amiloglucosidasa (50 U). El tubo se agitó en un mezclador de vórtice y se incubó en un baño de agua a 60 °C durante 60 min La mezcla se centrifugó a 3,500 rpm durante 5 min.8 ul del sobrenadante se trasladaron a una placa de microtitulación que contiene 240 ul de reactivo GOPOD. 8 ul de controles de glucosa y blancos de reactivos se agregaron, además, a 240 ul de reactivo GOPOD y las muestras se incubaron a 50 °C durante 20 min. Después, de la incubación, se determinó directamente la absorbancia a 510 nm. La cantidad de glucosa medida para la suspensión de maíz EOF se convirtió en la cantidad de almidón residual.
La Tabla 12 muestra el nivel de almidón residual en la suspensión de maíz de EOF seguida por SSF con AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa. Se descubrió que el almidón residual fue aproximadamente el mismo con el uso de 10 mg de proteína/g de sólido de AkAA y 3.3 pg de proteína/g de sólido para AcAmyl, cuando la dosis de isoamilasa y glucoamilasa se mantiene constante. Se obtuvo resultados ligeramente mejores a un pH de 4.8 para el nivel de almidón residual después de 53 horas con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl tal como se obtuvo con el uso de 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA cuando se combinaron con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa, por ejemplo, 0.749 ± al 0.088 % (w/v) para AkAA en comparación con 0.698 ± al 0.080 % (w/v) para AcAmyl. Esto indica que la AcAmyl puede usarse a una dosificación reducida en comparación con AkAA cuando cualquier enzima se combina con una combinación invariable de 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa. El mismo efecto se observó sobre el nivel de almidón residual cuando la dosis de isoamilasa se incrementó hasta 1.3 pg de proteína/g de sólido. Por ejemplo, cuando 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl o 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA se combinaron con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa y 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa, se obtuvo resultados ligeramente mejotes para el nivel de almidón residual después de 53 horas con 3.3 mg de proteína/g de sólido de AcAmy que con 10 pg de proteína/g de sólido de AkAA, por ejemplo, 0.861 ± al 0.102 % (w/v) para AkAA en comparación con 0.763 ± al 0.051 % (w/v) para AcAmyl.
En base a los datos, la AcAmyl en combinación con isoa ilasa y glucoa ilasa parece por lo menos tres veces más eficiente que la AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa para eliminar el almidón residual.
Tabla 12. Análisis de almidón residual para SSF con dosis diferentes de AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa.
La Tabla 13 muestra el nivel de almidón residual en la suspensión de maíz de EOF seguida por SSF con dosis iguales de AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa Se descubrió que el almidón residual se redujo por 12 % con el uso de 3.3 mg de proteína/g de sólido de AcAmyl en comparación con 3.3 pg de proteína/g de sólido de AkAA cuando la dosis de isoamilasa fue de 0.63 pg de proteína/g de sólido y la dosis de isoamilasa fue de 49.5 pg de proteína/g de sólido. Se descubrió que el almidón residual se redujo por 5 % con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl en comparación con 3.3 mg de proteína/g de sólido de AkAA cuando la dosis de isoamilasa fue 1.3 pg de proteína/g de sólido y la dosis de glucoamilasa fue 49.5 pg de proteína/g de sólido. Tabla 13. Análisis de almidón residual para SSF con dosis iguales de AcAmyl y AkAA en combinación con isoamilasa y glucoamilasa.
Tabla 14. Análisis de almidón residual con AcAmyl en combinación con glucoamilasa con y sin isoamilasa.
La Tabla 14 muestra el nivel de almidón residual en la suspensión de maíz de EOF seguida por SSF con AcAmyl en combinación con glucoamilasa con y sin isoamilasa. Esta ilustra que se obtuvo casi los mismos resultados (es decir, 0.701-0.763 % (w/v)) con el uso de 3.3 pg de proteína/g de sólido de AcAmyl en combinación con 1.3 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa como se obtuvo con el uso de 6.6 pg de proteina/g de AcAmyl sin isoamilasa, cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa. En otras palabras, la dosis de alfa amilasa puede reducirse por la mitad o 50 % cuando se agrega 0.63 pg de proteína/g de sólido de isoamilasa cuando la alfa amilasa se combina, además, con 49.5 pg de proteína/g de sólido de glucoamilasa. La dosis de isoamilasa que se agrega (1.3 pg de proteína/g de sólido) corresponde al 20 % de la dosis de alfa amilasa (6.6 pg de proteína / g de sólido) que se requiere en ausencia de isoamilasa para obtener casi los mismos resultados.
Listado abreviado de las secuencias de aminoácidos y nucleotidos Sec. con núm. de ident.: 1 Secuencia de proteína de AcAmyl silvestre: MKLLAL TTAFALLGKGVFGLTPAEWRGQSIYFLITDRFARTDGSTTAPCDLSQRAYCGGSW QGIIKQLDY IQGMGFTAIWITPITEQIPQDTAEGSAFHGYWQKDIYNVNSHFGTADDIRALSKALHDRGM YLMIDW AN HMGYNGPGASTDFSTFTPFNSASYFHSYCPINNYNDQSQVENCWLGDNTVALADLYTQHSD VRNIWYSWI KEIVGNYSADGLRIDTVKHVEKDFWTGYTQAAGVYTVGEVLDGDPAYTCPYQGYVDGVLNY PIYYPLLRA FESSSGSMGDLYNMINSVASDCKDPTVLGSFIENHDNPRFASYTKDMSQAKAVISYVILSD GIPIIYSGQ EQHYSGGNDPYNREAIWLSGYSTTSELYKFIATTNKIRQLAISKDSSYLTSRNNPFYTDSN TIAMRKGSG GSQVITVLSNSGSNGGSYTLNLGNSGYSSGANLVEVYTCSSVTVGSDGKIPVPMASGLPRV LVPAS MSG SGLCGSSSTTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGSCKTATTVPW LEESVRTSYGENI FISGSIPQL GSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYKFLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVP EACAGTSQK VDSSWR Sec. con núm. de ident.: 2 Secuencia de nucleotidos del gen AcAmyl : ATGAAGCTTCTAGCTTTGACAACTGCCTTCGCCCTGTTGGGCAAAGGGGTATTTGGTCTA ACTCCGGCCGAATGGCGGGGCCAGTCTATCTACTTCCTGATAACGGACCGGTTTGCTCGT ACAGATGGCTCAACAACCGCTCCATGTGATCTCAGCCAGAGGGTTAGTGATTTCATCGTA TTCTTTGTCATGTGTCATGACGCTGACGATTTCAGGCGTACTGTGGTGGAAGCTGGCAGG GTATTATCAAGCAAGTAAGCCTACTGGTTTCCAATTTTGTTGAATTCCTTTCTGACTCGG CCAGCTCGATTATATCCAAGGAATGGGCTTCACTGCTATTTGGATCACACCCATTACGGA GCAAATCCCACAGGATACCGCTGAAGGATCAGCATTCCACGGCTATTGGCAGAAGGATAT GTGAGTTTCCTTATAACATTCACTACGTTTTGCTAATATAGAACAGTTACAATGTCAACT CCCATTTCGGAACCGCCGATGACATTCGGGCATTGTCCAAGGCCCTTCACGACAGGGGAA TGTACCTGATGATTGACGTTGTTGCCAACCACATGGTAGGTGATATCTCACTGATTGAGT TATACCATTCCTACTGACAGCCCGACCTCAACAAAAGGGTTACAATGGACCTGGTGCCTC GACTGATTTTAGCACCTTTACCCCGTTCAACTCTGCCTCCTACTTCCACTCGTACTGCCC GATCAACAACTATAACGACCAGTCTCAGGTAGAGAACTGTTGGTTGGGAGACAACACTGT GGCTCTGGCAGACCTATACACCCAGCATTCGGATGTGCGGAACATCTGGTACAGCTGGAT CAAAGAAATTGTTGGCAATTACTCTGGTTAGTAATCCAATCCAAGTCCCGTCCCCTGGCG TCTTTCAGAACTAACAGAAACAGCTGATGGTCTGCGTATCGACACCGTCAAGCACGTTGA AAAGGATTTCTGGACTGGCTACACCCAAGCTGCTGGTGTTTATACCGTTGGCGAGGTATT AGATGGGGACCCGGCTTATACCTGCCCCTATCAGGGATATGTGGACGGTGTCCTGAATTA TCCCATGTGAGTTCACCCTTTCATATACAGATTGATGTACTAACCAATCAGCTATTATCC CCTCCTGAGAGCGTTCGAATCGTCGAGTGGTAGCATGGGTGATCTTTACAATATGATCAA CTCTGTGGCCTCGGATTGTAAAGACCCCACCGTGCTAGGAAGTTTCATTGAGAACCATGA CAATCCTCGCTTCGCTAGGTAGGCCAATACTGACATAGGAAAGGAGAAGAGGCTAACTGT TGCAGCTATACCAAGGATATGTCCCAGGCCAAGGCTGTTATTAGCTATGTCATACTATCG GACGGAATCCCCATCATCTATTCTGGACAGGAGCAGCACTACTCTGGTGGAAATGACCCG TACAACCGCGAAGCTATCTGGTTGTCGGGTTACTCTACCACCTCAGAGCTGTATAAATTC ATTGCCACCACGAACAAGATCCGTCAGCTCGCCATTTCAAAGGATTCAAGCTATCTTACT TCACGAGTATGTGTTCTGGCCAGACTCACACTGCAATACTAACCGGTATAGAACAATCCC TTCTACACTGATAGCAACACCATTGCAATGCGAAAGGGCTCCGGGGGCTCGCAGGTCATC ACTGTACTTTCCAACTCTGGTTCCAACGGTGGATCGTACACGCTCAACTTGGGTAACAGC GGATACTCGTCTGGAGCCAATCTAGTGGAGGTGTACACCTGCTCGTCTGTCACGGTCGGT TCCGACGGCAAGATCCCCGTCCCCATGGCATCTGGTCTTCCCCGTGTCCTTGTTCCGGCA TCTTGGATGTCCGGAAGTGGATTGTGCGGCAGCTCTTCCACCACTACCCTCGTCACCGCC ACCACGACTCCAACTGGCAGCTCTTCCAGCACTACCCTCGCCACCGCCGTCACGACTCCA ACTGGTAGCTGCAAAACTGCGACGACCGTTCCAGTGGTCCTTGAAGAGAGCGTGAGAACA TCCTACGGCGAGAACATCTTCATCTCCGGCTCCATCCCTCAGCTCGGTAGCTGGAACCCG GATAAAGCAGTCGCTCTTTCTTCCAGCCAGTACACTTCGTCGAATCCTTTGTGGGCCGTC ACTCTCGACCTCCCCGTGGGAACTTCGTTTGAATACAAATTCCTCAAGAAGGAGCAGAAT GGTGGCGTCGCTTGGGAGAATGACCCTAACCGGTCTTACACTGTTCCCGAAGCGTGTGCC GGTACCTCCCAAAAGGTGGACAGCTCTTGGAGGTGA Sec. con núm. de ident.: 3 Secuencia de aminoácidos del peptido señal AcAmyl: MKLLALTTAFALLGKGVFG Sec. con núm. de ident.: 4 g-amilasa putativa a partir de Talaromyces stipitatus ATCC 10500 (XP 00248703.1) >gi |242775754|ref|XP_002478703.1| alfa-amilasa, putativa [Talaromyces stipitatus ATCC 10500] MKLSLLATTLPLFGKIVDALSAAEWRSQSIYFLLTDRFARTDGSTSAPCDLSQRAYCGGSW QGIIDHLDY IQGMGFTAVWITPITKQIPQATSEGSGYHGYWQQDIYSVNSNFGTADDIRALSKALHDKGM YLMIDW AN HMGYNGPGASTDFSVFTPFNSASYFHSYCPISNYDDQNQVENCWLGDDTVSLTDLYTQSNQ VR IWYSWV KDLVANYTVDGLRIDTVKHVEKDFWTGYREAAGVYTVGEVLHGDPAYTCPYQGYVDGVFNY PIYYPLLNA FKSSSGSISDLVNMINTVSSDCKDPSLLGSFIENHDNPRFPSYTSDMSQAKSVIAYVFFAD GIPTIYSGQ EQHYTGGNDPYNREAIWLSGYATDSELYKFITTANKIRNLAISKDSSYLTTRNNAFYTDSN TIAMRKGSS GSQVITVLSNSGSNGASYTLELANQGYNSGAQLIEVYTCSSVKVDSNGNIPVPMTSGLPRV LVPASWVTG SGLCGTSSGTPSSTTLTTTMSLASSTTSSCVSATSLPITFNELVTTSYGENIFIAGSIPQL GNWNSANAV PLASTQYTSTNPVWSVSLDLPVGSTFQYKFMKKEKDGSW WESDPNRSYTVGNGCTGAKYT VNDSWR Sec. con núm. de ident.: 5 Proteína AN3402.2 de Aspergillus nidulans FGSC A4 (XP 661006.1) >gi|67525889|ref|XP_661006.1| proteína hipotética AN3402.2 [Aspergillus nidulans FGSC A4] MRLLALTSALALLGKAVHGLDADGWRSQSIYFLLTDRFARTDGSTTAACDLAQRRYCGGSW QGIINQLDY IQDMGFTAIWITPITEQIPDVTAVGTGFHGYWQK IYGVDTNLGTADDIRALSEALHDRGM YLMLDW AN HMSYGGPGGSTDFSIFTPFDSASYFHSYCAINNYDNQWQVENCFLGDDTVSLTDLNTQSSE VRDIYDWI EDIVANYSVDGLRIDTVKHVEKDFWPGYIDAAGVYSVGEIFHGDPAYTCPYQDYMDGVMNY PIYYPLLNA FKSSSGSMSDLYNMINTVASNCRDPTLLGNFIENHDNPRFPNYTPDMSRAKNVLAFLFLTD GIPIVYAGQ EQHYSGSNDPYNREPVWWSSYSTSSELYKFIATTNKIRKLAISKDSSYLTSRNTPFYSDSN YIAMRKGSG GSQVLTLLNNIGTSIGSYTFDLYDHGYNSGANLVELYTCSSVQVGSNGAISIPMTSGLPRV LVPAAWVSG SGLCGLTNPTSKTTTATTTSTTTCASATATAITW FQERVQTAYGENVFLAGSISQLGNWD TTEAVALSA AQYTATDPLWTVAIELPVGTSFEFKFLKKRQDGSIVWESNPNRSAKVNEGCARTTQTISTS R Sec. con núm. de ident.: 6 g-amilasa de Aspergillus niger (entrada de la base de datos de proteínas 2GUY|A) ATPADWRSQS IYFLLTDRFA RTDGSTTATC NTADQKYCGG TWQGIIDKLD YIQGMGFTAI WITPVTAQLP QTTAYGDAYH GYWQQDIYSL NENYGTADDL KALSSALHER GMYLMVDW A NHMGYDGAGS SVDYSVFKPF SSQDYFHPFC FIQNYEDQTQ VEDCWLGDNT VSLPDLDTTK DWKNEWYDW VGSLVSNYSI DGLRIDTVKH VQKDFWPGYN KAAGVYCIGE VLDGDPAYTC PYQNVMDGVL NYPIYYPLLN AFKSTSGSMD DLYNMINTVK SDCPDSTLLG TFVENHDNPR FASYTNDIAL AKNVAAFIIL NDGIPIIYAG QEQHYAGGND PANREAT LS GYPTDSELYK LIASANAIRN YAISKDTGFV TYKNWPIYKD DTTIAMRKGT DGSQIVTILS NKGASGDSYT LSLSGAGYTA GQQLTEVIGC TTVTVGSDGN VPVPMAGGLP RVLYPTEKLA GSKICSSS Sec. con núm. de ident.: 7 ADNc codificante, alfa-amilasa NRRL 1 de Aspergillus cla.va.tus putativa (ACLA 052920) >gi|121708777|ref|XM_001272244.1| Aspergillus clavatus NRRL 1 alfa amilasa, putativa (ACLA_052920), ARNm parcial. ATGAAGCTTCTAGCTTTGACAACTGCCTTCGCCCTGTTGGGCAAAGGGGTATTTGGTCTAA CTCCGGCCG AATGGCGGGGCCAGTCTATCTACTTCCTGATAACGGACCGGTTTGCTCGTACAGATGGCTC AACAACCGC TCCATGTGATCTCAGCCAGAGGGCGTACTGTGGTGGAAGCTGGCAGGGTATTATCAAGCAA CTCGATTAT ATCCAAGGAATGGGCTTCACTGCTATTTGGATCACACCCATTACGGAGCAAATCCCACAGG ATACCGCTG AAGGATCAGCATTCCACGGCTATTGGCAGAAGGATATTTACAATGTCAACTCCCATTTCGG AACCGCCGA TGACATTCGGGCATTGTCCAAGGCCCTTCACGACAGGGGAATGTACCTGATGATTGACGTT GTTGCCAAC CACATGGGTTACAATGGACCTGGTGCCTCGACTGATTTTAGCACCTTTACCCCGTTCAACT CTGCCTCCT ACTTCCACTCGTACTGCCCGATCAACAACTATAACGACCAGTCTCAGGTAGAGAACTGTTG GTTGGGAGA CAACACTGTGGCTCTGGCAGACCTATACACCCAGCATTCGGATGTGCGGAACATCTGGTAC AGCTGGATC AAAGAAATTGTTGGCAATTACTCTGCTGATGGTCTGCGTATCGACACCGTCAAGCACGTTG AAAAGGATT TCTGGACTGGCTACACCCAAGCTGCTGGTGTTTATACCGTTGGCGAGGTATTAGATGGGGA CCCGGCTTA TACCTGCCCCTATCAGGGATATGTGGACGGTGTCCTGAATTATCCCATCTATTATCCCCTC CTGAGAGCG TTCGAATCGTCGAGTGGTAGCATGGGTGATCTTTACAATATGATCAACTCTGTGGCCTCGG ATTGTAAAG ACCCCACCGTGCTAGGAAGTTTCATTGAGAACCATGACAATCCTCGCTTCGCTAGCTATAC CAAGGATAT GTCCCAGGCCAAGGCTGTTATTAGCTATGTCATACTATCGGACGGAATCCCCATCATCTAT TCTGGACAG GAGCAGCACTACTCTGGTGGAAATGACCCGTACAACCGCGAAGCTATCTGGTTGTCGGGTT ACTCTACCA CCTCAGAGCTGTATAAATTCATTGCCACCACGAACAAGATCCGTCAGCTCGCCATTTCAAA GGATTCAAG CTATCTTACTTCACGAAACAATCCCTTCTACACTGATAGCAACACCATTGCAATGCGAAAG GGCTCCGGG GGCTCGCAGGTCATCACTGTACTTTCCAACTCTGGTTCCAACGGTGGATCGTACACGCTCA ACTTGGGTA ACAGGGGATACTCGTCTGGAGCCAATCTAGTGGAGGTGTACACCTGCTCGTCTGTCACGGT CGGTTCCGA CGGCAAGATCCCCGTCCCCATGGCATCTGGTCTTCCCCGTGTCCTTGTTCCGGCATCTTGG ATGTCCGGA AGTGGATTGTGCGGCAGCTCTTCCACCACTACCCTCGTCACCGCCACCACGACTCCAACTG GCAGCTCTT CCAGCACTACCCTCGCCACCGCCGTCACGACTCCAACTGGTAGCTGCAAAACTGCGACGAC CGTTCCAGT GGTCCTTGAAGAGAGCGTGAGAACATCCTACGGCGAGAACATCTTCATCTCCGGCTCCATC CCTCAGCTC GGTAGCTGGAACCCGGATAAAGCAGTCGCTCTTTCTTCCAGCCAGTACACTTCGTCGAATC CTTTGTGGG CCGTCACTCTCGACCTCCCCGTGGGAACTTCGTTTGAATACAAATTCCTCAAGAAGGAGCA GAATGGTGG CGTCGCTTGGGAGAATGACCCTAACCGGTCTTACACTGTTCCCGAAGCGTGTGCCGGTACC TCCCAAAAG GTGGACAGCTCTTGGAGGTGA Sec. con núm. de ident.: 8 Cebador sintetico: 5'-ggggcggccgccaccATGAAGCTTCTAGCTTTGACAAC-3' Sec. con núm. de ident.: 9 Cebador sintético: 5'-cccggcgcgccttaTCACCTCCAAGAGCTGTCCAC-3' Sec. con núm. de ident.: 10 Dominio de unión a carbohidratos de AcAmyl CKTATTVPW LEESVRTSYGENIFISGSIPQLGSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDL PVGTSFEYK FLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVPEACAGTSQKVDSSWR Sec. con núm. de ident.: 11 Enlazador AcAmyl (región enlazadora) STTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGS Sec. con núm. de ident.: 12 a-amilasa de Aspergillus fumigatus Af293 (XP 749208.1) MKWIAQLFPLSLCSSLLGQAAHALTPAEWRSQSIYFLLTDRFGREDNSTTAACDVTQRLYC GGSWQGIIN HLDYIQGMGFTAIWITPVTEQFYENTGDGTSYHGYWQQN1HEVNANYGTAQDLRDLANALH ARGMYLMVD WANHMGYNGAGNSV YGVFTPFDSATYFHPYCL I TDYNNQTAVEDCWLGDTTVSLPDLDT TSTAVRSIW YDWVKGLVANYSIDGLRIDTVKHVEKDFWPGYNDAAGVYCVGEVFSGDPQYTCPYQNYLDG VLNYPIYYQ LLYAFQSTSGSISNLYNMISSVASDCADPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVISFM FFSDGIPIV YAGQEQHYSGGADPANREAVWLSGYSTSATLYSWIASTNKIRKLAISKDSAYITSKNNPFY YDSNTLAMR KGSVAGSQVITVLSNKGSSGSSYTLSLSGTGYSAGATLVEMYTCTTLTVDSSGNLAVPMVS GLPRVFVPS SWVSGSGLCGDSISTTATAPSATTSATATRTACAAATAIPILFEELVTTTYGESIYLTGSI SQLGNWDTS SAIALSASKYTSSNPEWYVTVTLPVGTSFEYKFVKKGSDGSIAWESDPNRSYTVPTGCAGT TVTVSDTWR Sec. con núm. de ident.: 13 Precursor de alfa-amilasa de Aspergillus terreus N1H2624 (XP 001209405.1) MKWTSSLLLLLSVIGQATHALTPAEWRSQSIYFLLTDRFGRTDNSTTAACDTSDRVYCGGS WQGIINQLD YIQGMGFTAIWITPVTGQFYENTGDGTSYHGYWQQDIYDLNYNYGTAQDLKNLANALHERG MYLMVDW A NHMGYDGAGNTVDYSVFNPFSSSSYFHPYCLISNYDNQTNVEDC LGDTTVSLPDLDTTST AVRNIWYDW VADLVANYSIDGLRVDTVKHVEKDFWPGYNSAAGVYCVGEVYSGDPAYTCPYQNYMDGVLN YPIYYQLLY AFESSSGSISDLYNMISSVASSCKDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVITFIFLS DGIPIVYAG QEQHYSGGSDPANREATWLSGYSTSATLYTWIATTNQIRSLAISKDAGYVQAKN PFYSDS NTIAMRKGT TAGAQVITVLSNKGASGSSYTLSLSGTGYSAGATLVETYTCTTVTVDSSGNLPVPMTSGLP RVFVPSSWV NGSALCNTECTAATSISVLFEELVTTTYGENIYLSGSISQLGSWNTASAVALSASQYTSSN PEWYVSVTL PVGTSFQYKFIKKGSDGSW WESDPNRSYTVPAGCEGATVTVADTWR Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (114)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para la sacarificación de una composición que comprende almidón para producir una composición que comprende glucosa, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la composición que comprende almidón con una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1; y (ii) sacarificar la composición que comprende almidón para producir la composición que comprende glucosa; caracterizado porque la isoamilasa y la AcAmyl aislada o variante de esta catalizan la sacarificación de la composición de almidón a glucosa.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sacarificación produce aproximadamente 5 %-12 % menos almidón residual en comparación con una sacarificación llevada a cabo por una isoamilasa y AkAA bajo las mismas condiciones.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % o, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición que comprende glucosa está enriquecida en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con una segunda composición que comprende glucosa producida por AkAA con la isoamilasa bajo las mismas condiciones.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde además la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde además la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde además la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
12. El método de conformidad con las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec con núm. de ident.:1.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident. :1.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la composición que comprende almidón comprende almidón liquidificado, almidón gelatinizado, o almidón granular.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque la sacarificación se lleva a cabo a un intervalo de temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 75 °C.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el intervalo de temperatura es 47 °C-74 °C.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque la sacarificación se lleva a cabo a un intervalo de pH de pH 2.0-pH 7.5.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el intervalo de pH es pH 3.5-pH 5.5.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el intervalo de pH es pH 4.0-pH 5.0.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque comprende además, fermentar la composición de glucosa para producir un producto final de fermentación (EOF).
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la fermentación es una reacción de sacarificación y fermentación (SSF) simultánea.
22. El método de conformidad con las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo por 24 - 70 horas a pH 2-8 y en un intervalo de temperatura de 25 °C-70 °C.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-22, caracterizado porque el producto EOF comprende etanol.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, caracterizado porque el producto EOF comprende 8 %-18 % (v/v) etanol.
25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 - 24, caracterizado porque el método comprende, además, poner en contacto un puré y/o un mosto con la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el método comprende, adicionalmente: (a) preparar un puré; (b) filtrar el puré para obtener un mosto; y (c) fermentar el mosto para obtener una bebida fermentada, en donde además una isoamilasa y AcAmyl o variante de esta se agregan a: (i) el puré de la etapa (a) y/o (ii) el mosto de la etapa (b) y/o (iii) el mosto de la etapa (c).
27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-26, caracterizado porque el producto EOF comprende un metabolito.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el metabolito es ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato sódico, gluconato cálcico, gluconato potásico, glucono delta-lactona, eritorbato sódico, ácido graso omega 3, butanol, un aminoácido, lisina, ácido itacónico, 1,3-propanodiol, o isopreno.
29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 28, caracterizado porque comprende además, agregar glucoamilasa, hexocinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, proteasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, trehalasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa, hidrolasa, o una combinación de estas, a la composición de almidón.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la glucoamilasa se agrega a una dosificación de 0.1 - 2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la glucoamilasa se agrega a una dosificación de aproximadamente 49.4 mg de proteína/g de sólido.
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizado porque la isoamilasa se agrega a una dosificación de aproximadamente 0.63 mg de proteína/g de sólido a aproximadamente 1.3 pg de proteína/g de sólido.
33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizado porque la AcAmyl aislada o una variante de esta se expresa y secreta por una célula hospedera.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la célula hospedera expresa y secreta, además, la isoamilasa.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33 o 34, caracterizado porque la composición que comprende almidón se pone en contacto con la célula hospedera.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, caracterizado porque la célula hospedera expresa y secreta, además, una glucoa ilasa.
37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-36, caracterizado porque la célula hospedera es capaz de fermentar la composición de glucosa.
38. Una composición caracterizada porque comprende glucosa producida por el método de conformidad con la reivindicación 1.
39. Un almidón liquidificado caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 1.
40. Una bebida fermentada caracterizada porque es producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-37.
41. Una composición para usarse para sacarificar una composición que comprende almidón, caracterizado porque comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
43. La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
45. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:l.
46. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-45, caracterizada porque la composición es un material celular cultivado.
47. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-46, caracterizada porque la composición comprende, adicionalmente, una glucoamilasa.
48. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 - 45 y 47, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta se purifica.
49. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-48, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta se expresa y secreta por una célula hospedera.
50. La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula hospedera es una célula fúngica filamentosa.
51. La composición de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de Aspergillus sp. o Trichoderma reesei .
52. Uso de la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-51 en la producción de una composición que comprende glucosa.
53. Uso de la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-51, en la producción de un almidón liquidificado.
54. Uso de la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-51, en la producción de una bebida fermentada.
55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-34, la bebida fermentada de conformidad con la reivindicación 45, o el uso de conformidad con la reivindicación 49, en donde además la bebida fermentada o producto final de la fermentación se selecciona del grupo que consiste en: i) una cerveza seleccionada del grupo que consiste en cerveza malteada completa, cerveza elaborada bajo la "Reinheitsgebot", ale, IPA, lager, bitter (amarga), Happoshu (segunda cerveza), tercera cerveza, cerveza seca, casi cerveza, cerveza ligera, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza baja en calorías, porter, cerveza bock, cerveza negra (stout), licor de malta, cerveza sin alcohol, y licor de malta sin alcohol; y ii) bebidas de cereales o malta seleccionados del grupo que consiste en bebidas de malta con sabor a frutas, bebidas de malta con sabor a licor, y bebidas de malta con sabor a café.
56. Un método para producir una composición alimenticia, caracterizado porque comprende combinar: (i) uno o más ingredientes alimenticios, y (ii) una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.rl o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1, en donde la AcAmyl aislada o variante de esta cataliza la hidrólisis de componentes de almidón presentes en los ingredientes alimenticios para producir glucosa.
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones.
58. El método de conformidad con la reivindicación 56 o 57, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones.
59. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la composición alimenticia está enriquecida en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con una segunda composición alimenticia producida por AkAA con la isoamilasa bajo las mismas condiciones.
60. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de componentes de almidón bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de componentes de almidón bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
61. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
62. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-62, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident 1.
65. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-62, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
67. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 59-66, caracterizado porque la composición alimenticia se selecciona del grupo que consiste en un producto alimenticio, una composición para hornear, un aditivo para alimentos, un producto alimenticio animal, un aditivo alimenticio, un aceite, una carne y una manteca.
68. El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 59-67, caracterizado porque el o los ingredientes alimenticios comprenden un ingrediente de horneado o un aditivo.
69. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-68, caracterizado porque el uno o más ingredientes alimenticios se seleccionan del grupo que consiste en harina; una amilasa contra el enranciamiento; una fosfolipasa; un fosfolípido; una alfa-amilasa maltogénica o una variante, homólogo, o mutantes de ella que tiene actividad alfa-amilasa maltogénica; una xilanasa de panadería (EC 3.2.1.8); y una lipasa.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el o los ingredientes alimenticios se seleccionan del grupo que consiste en: (i) una alfa-amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus , (ii) una xilanasa de panadería es de Bacillus , Aspergillus , Thermomyces o Trichoderma, (iii) una glicolipasa de Fusarium heterosporum.
71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-70, caracterizado porque la composición alimenticia comprende una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesado.
72. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-71, caracterizado porque comprende hornear la composición alimenticia para producir un producto horneado.
73. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-72, caracterizado porque comprende, adicionalmente: (i) proporcionar un medio de almidón; (ii) agregar al medio de almidón la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta; y (iii) aplicar calor al medio de almidón durante o después de la etapa (b) para producir un producto de panadería.
74. Una composición para usarse para producir una composición alimenticia caracterizada porque comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm de ident.:l o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:l y uno o más ingredientes alimenticios.
75. La composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
76. La composición de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
77. La composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con nú . de ident. :1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident. :1.
78. La composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
79. Uso de la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-78, para preparar una composición alimenticia.
80. El uso de conformidad con reivindicación 79, en donde la composición alimenticia comprende una masa o un producto de masa, preferentemente, un producto de masa procesado.
81. El uso de conformidad con reivindicación 79 o 80, en donde la composición alimenticia es una composición de panadería.
82. Uso de la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-78, en un producto de masa para retardar o reducir el enranciamiento, preferentemente, la retrodegradación perjudicial, del producto de masa.
83. Un método para eliminar manchas de almidón de la ropa sucia, platos o textiles, caracterizado porque comprende incubar una superficie de la ropa sucia, platos o textiles en presencia de una composición .acuosa que comprende una cantidad efectiva de una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1, y que permite que la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta hidrolicen los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas derivadas de almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie para eliminar la mancha de almidón de la superficie.
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones.
85. El método de conformidad con la reivindicación 83 o 84, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones.
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque las moléculas derivadas de almidón enriquecidas en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con las moléculas derivadas de almidón producidas por AkAA con la isoamilasa bajo las mismas condiciones.
87. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de componentes de almidón bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de componentes de almidón bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
88. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
89. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
90. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 83-85, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.rl o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident 1.
92. El método de conformidad con la reivindicación 83-85, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.rl o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.rl.
93. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
94. Una composición para usarse para eliminar manchas de almidón de ropa sucia, platos o textiles, caracterizado porque comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) los residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1 y un tensioactivo.
95. La composición de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
96. La composición de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
97. La composición de conformidad con la reivindicación 94, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:l o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
98. La composición de conformidad con la reivindicación 97, caracterizada porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
99. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94-98, caracterizada porque la composición es un detergente para lavandería, un aditivo de detergente para lavandería, o un detergente para lavavajillas manual o automático.
100. Un método para el desaprestado de un textil; caracterizado porque comprende poner en contacto una composición de desaprestado con un textil durante el tiempo suficiente para desaprestar el del textil, en donde la composición de desaprestado comprende una isoamilasa y una AcAmyl aislada o variante de esta que tiene actividad de a-amilasa y que comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 80 % de identidad de secuencias de aminoácidos con (a) lós residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) los residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1 y que permite que la isoamilasa y la AcAmyl o variante de esta quiten el apresto de los componentes de almidón presentes en la mancha de almidón para producir moléculas derivadas de almidón más pequeñas que se disuelven en la composición acuosa, y enjuagar la superficie para eliminar la mancha de almidón de la superficie.
101. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones.
102. El método de conformidad con la reivindicación 100 o 101, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 17 %-50 % u, opcionalmente, aproximadamente 17 %-34 % la dosis de AkAA, para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones.
103. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque las moléculas derivadas de almidón están enriquecidas en DPI, DP2 o (DPI + DP2), en comparación con las moléculas derivadas de almidón producidas por AkAA con la isoamilasa bajo las mismas condiciones.
104. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, caracterizado porque la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de almidón residual bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
105. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en dondeen donde234 la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para reducir la misma cantidad de DP3+ bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
106. El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta se dosifica a aproximadamente 50 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa y, opcionalmente, en donde la isoamilasa se dosifica a aproximadamente 20 % de la dosis de AcAmyl que se requeriría para obtener la misma producción de etanol bajo las mismas condiciones en ausencia de isoamilasa.
107. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-106, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
108. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta comprende (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
109. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-106, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en una secuencia de aminoácidos con al menos 80 %, 90 %, 95 %, o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la AcAmyl o variante de esta consiste en (a) residuos 20-636 de la sec. con núm. de ident.:1 o (b) residuos 20-497 de la sec. con núm. de ident.:1.
111. Uso de una composición de desaprestado que comprende AcAmyl o variante de esta para el desaprestado de textiles.
112. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-73, 79-93 y 100-111, caracterizado porque comprende, además, agregar glucoamilasa, hexocinasa, xilanasa, glucosa isomerasa, xilosa isomerasa, fosfatasa, fitasa, proteasa, pululanasa, b-amilasa, a-amilasa, proteasa, celulasa, hemicelulasa, lipasa, cutinasa, trehalasa, isoamilasa, enzima de redox, esterasa, transferasa, pectinasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, liasa, hidrolasa o una combinación de estas a la AcAmyl aislada o variante de esta.
113. El método de conformidad con la reivindicación 112, caracterizado porque la glucoamilasa se agrega a una dosificación de 0.1 - 2 unidades de glucoamilasa (GAU)/g ds.
114. El método de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado porque la glucoamilasa se agrega a una dosificación de aproximadamente 49.4 mg de proteína/g de sólido.
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