CN101914519A - 一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，特别涉及无机纳米氧化物-有机高分子聚丙烯酰胺杂化凝胶的吸附-絮凝固定化酶技术，其工艺过程为：采用吸附-絮凝耦合固定化技术，以无机纳米氧化物为吸附载体，利用纳米材料如二氧化硅、钛、锆、磁性材料等比表面积大等特点，有效吸附溶液中的酶分子，再将纳米酶絮凝固定于有机高分子聚丙烯酰胺凝胶体系中，制备无机-有机杂化凝胶固定化酶。本发明制备的杂化凝胶固定化酶酶分子负载量大、不易脱落、稳定性好。

Description

一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法

技术领域

本发明涉及一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，特别涉及无机纳米氧化物-有机高分子聚丙烯酰胺杂化凝胶的吸附-絮凝固定化酶技术，本发明制备的无机-有机杂化凝胶固定化酶负载量大、不易脱落且酶稳定性好，属吸附-絮凝耦合固定化酶的制备技术。

背景技术

固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料，随着对固定化酶研究的不断深入，综合性能优良的载体材料的设计与耦合固定化技术已成为固定化酶技术领域的一个非常重要的研究内容。

传统的无机载体材料稳定性好、无毒、成本低、机械强度高，一般是借助吸附方法负载酶分子。吸附固定条件温和，酶的构象变化较小，对酶的催化活性影响小。特别是无机纳米颗粒具有高表面能等特性，吸附力强，能够负载更多的酶，同时增加了与底物的接触面积，催化反应扩散影响小，是目前非常活跃的研究方向。其缺点是酶与载体结合不牢，易脱落，酶活力损失。

高分子凝胶絮凝是固定化酶比较简便的方法(张志华2005；刘勇2006；)固定化条件温和，较少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，酶分子也不容易脱落，但也存在机械强度差、酶分子容易发生泄露和传质阻力较大等不足。解决问题的方法之一是利用无机纳米粒子预吸附酶分子，然后进行有机高分子凝胶絮凝耦合固定化，制备无机-有机杂化固定化酶催化体系。吸附-絮凝耦合固定化技术能够很好地解决固定化酶分子易脱落、机械强度差、扩散限制等问题(Youichi 1998)。利用高分子凝胶絮凝体多孔疏松结构能有效改善固定化酶传质阻力大、酶分子易脱落、机械强度低的缺点，采用吸附-絮凝耦合固定化法得到的固定化酶兼有吸附和絮凝固定化方法的优点，在固定化酶领域具有广泛的应用前景。

有机高分子聚丙烯酰胺凝胶是一种具有实用潜力的凝胶絮凝材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究。聚丙烯酰胺凝胶可以通过氢键、范德华力、弱静电引力与载体及酶作用，将纳米酶牵连在一起；聚丙烯酰胺的长分子链可以提供空间位阻屏蔽和静电斥力稳定作用，有效阻碍纳米颗粒的团聚。

这种纳米颗粒增强型聚丙烯酰胺杂化凝胶具有以下特点：(1)纳米载体增加固定化酶催化剂的比表面，提高催化活性。纳米吸附载体材料，比表面积大，负载量大，能有效减少酶的泄漏；(2)无机纳米颗粒可有效抑制高分子凝胶溶胀，并提高固定化酶载体的稳定性和机械强度；(3)高分子凝胶絮凝体具有较大的凝胶孔径，纳米酶与高分子凝胶絮凝剂连结成一种具有大孔的疏松网络状结构，可以保证酶促反应底物和产物具有较高的扩散速率，酶促反应扩散限制小；(4)凝胶絮凝固定酶分子，温和的相互作用为酶分子创造出适宜的微环境，可使酶分子的三维结构得以很好地维持，提高了聚丙烯酰胺凝胶固定化酶的活性和稳定性等；吸附絮凝固定化条件温和，较好保持固定化酶的酶活性，催化活性高；(5)无机-有机杂化凝胶酶固定化技术，方便实现酶与底物和产物的快速分离，从而提高酶的使用效率；所制备的固定化杂化凝胶载体可用于酶及生物大分子的固定化，既保持了较高的酶活，又可在反应后回收再利用，是一种简便、温和、稳定性好、酶分子不易脱落的耦合固定化酶制备技术。

[1]张志华，江昌明，酶催化剂耦合固定化技术的研究进展，工业催化，2005，13(1)：5-8

[2]刘勇，吾满江·艾力，夏木西卡玛尔，张永学，甘争艳，孙燕，黑曲霉脂肪酶的耦合固定化及特性，分子催化，2006，20(3)：260-265

[3]Youichi K，Keiichiro S，Yuko T.Adsorption and enzyme(β-galactosidase and α-chymotrypsin)：Immobilization properties of gel fiber prepared by the gel formation of cellulose acetate and titaniumiso-propoxide.Biotechnol Bioeng 1998，59：651～656

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，本发明采用吸附-絮凝耦合固定化酶技术，以无机纳米材料为吸附载体，利用纳米氧化物如二氧化硅、钛、锆、磁性材料等具有比表面积大等特点，有效吸附溶液中的酶分子；再将纳米酶絮凝固定于有机高分子聚丙烯酰胺凝胶体系中，制备无机-有机杂化凝胶固定化酶。本发明制备的杂化凝胶固定化酶是一种高活性、高稳定性和高传质性的固定化酶催化体系。是一种简便、温和、活力稳定、酶分子不易脱落的耦合固定化酶制备技术。

技术方案：本发明涉及一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，特别涉及无机纳米氧化物-有机高分子聚丙烯酰胺杂化凝胶吸附-絮凝耦合固定化酶的制备方法。

具体实施过程为：

载体溶液配制：将聚丙烯酰胺缓慢加入温水中，迅速搅拌，配成0.1～20g/L聚丙烯酰胺凝胶溶液，将吸附载体无机纳米氧化物粉体超声分散，制备含量为20.0～2400g/L纳米凝胶悬浮液，均质后备用；

酶蛋白液配制：酶蛋白用缓冲溶液溶解，含量为1～50g/L；

构建无机-有机杂化凝胶固定化酶体系，其组成及含量为：无机纳米氧化物载体10.0～2000g/L，酶蛋白0.1～30g/L，聚丙烯酰胺0.01～10g/L，其余为缓冲溶液。

吸附-絮凝耦合固定化工艺过程：采用吸附-絮凝耦合固定化工艺过程，先混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 6～10，30～45℃摇床预吸附酶蛋白20～60min后，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液，30～45℃振荡，絮凝固定20～60min，得无机-有机杂化凝胶絮凝体，离心洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止，获得杂化凝胶耦合固定化酶，2～4℃冰箱保存于缓冲溶液中备用。

所述的酶蛋白来自细胞，经增殖培养、离心分离菌体、超声波破碎、冷冻离心后，经饱和硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，溶于缓冲溶液留存；酶蛋白也可以来自酶制剂。

所述的无机纳米氧化物为二氧化硅、二氧化钛、二氧化锆或磁性材料。

所添加的有机高分子凝胶包括：聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

所述的聚丙烯酰胺包括：阳离子聚丙烯酰胺，阴离子聚丙烯酰胺，非离子聚丙烯酰胺。

本发明可以推广到对甘油脱氢酶、甘油脱水酶、1，3-丙二醇氧化还原酶等其它酶和生物大分子的吸附-絮凝固定，无机-有机杂化凝胶耦合固定的生物催化剂可用于歧化甘油合成1，3-丙二醇。

有益效果：本发明的目的在于提供一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，本发明采用吸附-絮凝耦合固定化酶技术，以无机纳米材料为吸附载体，利用纳米材料具有比表面积大等特点，有效吸附溶液中的酶分子，再将纳米酶絮凝固定于有机高分子聚丙烯酰胺凝胶体系中，制备无机-有机杂化凝胶耦合固定化酶。具有负载量大，不易溶脱，活性稳定的优点。

附图说明

图1.耦合固定化温度条件对固定化酶负载量和活力回收的影响。

图2.固定化酶溶脱时间曲线，1为单一吸附法固定化酶；2为吸附-絮凝耦合固定化酶。

图3.吸附-絮凝耦合固定化酶和游离酶储存稳定性的比较。

具体实施方式

载体溶液配制：将聚丙烯酰胺缓慢加入温水中，迅速搅拌，配成0.1～20g/L聚丙烯酰胺凝胶溶液，将吸附载体无机纳米氧化物粉体超声分散，制备含量为20.0～2400g/L纳米凝胶悬浮液，均质后备用；

酶蛋白液配制：酶蛋白用缓冲溶液溶解，含量为1～50g/L；

构建无机-有机杂化凝胶固定化酶体系，其组成及含量为：无机纳米氧化物载体10.0～2000g/L，酶蛋白0.1～30g/L，聚丙烯酰胺0.01～10g/L，其余为缓冲溶液。

吸附-絮凝耦合固定化工艺过程：采用吸附-絮凝耦合固定化工艺过程，先混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 6～10，30～45℃摇床预吸附酶蛋白20～60min后，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液，30～45℃振荡，絮凝固定20～60min，得无机-有机杂化凝胶絮凝体，离心洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止，获得杂化凝胶耦合固定化酶，2～4℃冰箱保存于缓冲溶液中备用。

实施例一不同TiO₂加量对杂化凝胶固定化酶负载量及负载率的影响

菌种：克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae)

评价指标：

①根据固定化前后溶液中的酶蛋白含量C₀，C及溶液体积V，计算杂化凝胶载体对酶蛋白的负载量Q：

$Q=\frac{(C_0-C)\×V}{m}$

式中C₀为初始酶蛋白含量(mg/mL)；C为吸附-絮凝耦合固定化后，上清液残余酶蛋白含量(mg/mL)；V是混合液体积(mL)，m以无机纳米氧化物质量(g)计，Q为负载量(mg/g)。

其中酶蛋白质含量测定采用Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准蛋白。

②根据吸附前后溶液中的蛋白含量C₀C_t，计算纳米TiO₂粒子对酶蛋白的负载率ε：

$\mathrm{\ϵ}=\frac{C_0-C_t}{C_0}\×100\%$

式中C₀为初始酶含量(g/L)，C_t为吸附t时刻残余酶蛋白含量(g/L)，ε为负载率。

取500mL发酵液离心收集菌体，洗涤并称重，加入10倍质量0.9％生理盐水，混匀后，冰浴环境下超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶，粗酶用磷酸缓冲液溶解后，经饱和度50％的硫酸铵沉淀及透析脱盐后，用磷酸缓冲液溶解，得酶蛋白液。

取五份不同浓度的TiO₂(P25)悬浮液(pH7.0)各5mL，向其中分别加入5mL酶蛋白液，在一定温度下振荡预吸附30min后，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液1mL，相应温度下振荡絮凝固定30min，取出在4000rpm下离心10min，下层沉淀(杂化凝胶耦合固定化酶)用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白后，合并洗涤液及上清液，用于负载量和负载率的分析，实验结果表1。

表1不同TiO₂含量对杂化凝胶固定化酶负载量及负载率影响

实施例一比较了在吸附-絮凝耦合固定化过程中，不同TiO₂含量对固定化酶负载量及负载率的影响。结果表明，杂化凝胶固定化酶的负载量随着TiO₂含量的增加而减小，其负载率一直增加并逐渐变平缓，当TiO₂含量在200g/L时，TiO₂对酶吸附达饱和，再增加TiO₂量不会对吸附率有很大的改进，同时会导致负载量的减小。综合两个因素考虑，可选择100～200g/L的TiO₂作为固定化酶的最佳加量。实施例二耦合固定化温度条件对杂化凝胶固定化酶负载量及活力回收的影响

实验用酶蛋白液同实施例一。

甘油脱氢酶(GDH)酶活测定：5mL GDH反应液(含30mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.2mol/L甘油，2mmol/L NAD⁺，1μmol/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂，用pH＝11的碳酸钾缓冲液配制)在37℃条件下加入酶启动反应，在摇床中恒温反应40min，转移到离心管中于8000r/min离心10分钟，上清液于紫外340nm下测定吸光度A。一个酶活力单位(U)是在该条件下一分钟内消耗1mol底物所需要的酶量。

固定化酶负载量和酶活力回收实验：

①负载量Q定义同例一；

②酶的活力回收率是指固定化酶活力与用于固定化的溶液酶活力之比(％)。耦合固定化温度条件对杂化凝胶固定化酶负载量及活力回收的影响实验：

取六份已超声分散的TiO₂(P25)悬浮液(pH7.0)5mL，向其中分别加入5mL酶蛋白液，不同温度下(4～60℃)振荡预吸附30min后，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液1mL，相应温度下振荡絮凝固定30min，取出在4000rpm下离心10min，下层沉淀(杂化凝胶耦合固定化酶)用pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤至上清液无蛋白后，合并洗涤液及上清液，用于负载量的分析；固定化酶用于酶活测定，实验结果如图1。

实施例二研究了耦合固定温度条件对固定化酶负载量和活力回收的影响情况，结果表明随着温度的升高，固定酶负载量有所增加，最高可达到85.16mg/g，但是增加的比较缓慢，这说明温度不是影响TiO₂酶负载量的主要因素。但温度对酶活力影响很大，随着耦合固定温度增加，酶活力回收明显下降，所以固定温度在35～45℃比较适宜。

实施例三单吸附固定化酶和吸附-絮凝杂化凝胶固定化酶溶脱情况的比较

实验用酶蛋白液同实施例一。

混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 7，37℃摇床预吸附酶蛋白60min，离心得单吸附固定化酶；

混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 7，37℃摇床预吸附酶蛋白60min，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液，37℃摇床振荡絮凝固定30min，离心得吸附-絮凝杂化凝胶固定化酶；

分别取用单吸附和吸附-絮凝法制备好的固定化酶各0.3g，加入到100mL三角瓶中。向每个三角瓶内加入20mL缓冲溶液(pH＝8.0)，将固定化酶放于摇床中振荡(37℃，180rpm)，间隔时间测量上清液吸光度，计算溶脱下来的酶蛋白量。两个平行样取平均值，实验结果如图2。

实施例三比较了pH＝8时单吸附固定化酶和吸附-絮凝杂化凝胶固定化酶的溶脱情况。结果表明，耦合固定酶的酶蛋白脱落得到改善，溶脱率显著小于单一吸附时情况，杂化凝胶固定化酶具有更好的稳定性。

实施例四固定酶和游离酶催化稳定性和储存稳定性考察

实验用酶蛋白液同实施例一。

酶活测定同实施例二。

混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 7，37℃摇床预吸附酶蛋白60min，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液，相应温度下振荡絮凝固定30min，离心得吸附-絮凝杂化凝胶固定化酶；

催化稳定性：将吸附-絮凝杂化凝胶固定化酶，进行多批次催化反应，测定每批次反应后剩余酶活，考察催化稳定性。以第一次固定化酶活力作为100％，如表2结果表明经过4批次反应，相对酶活力能保持在46.7％。

表2固定化酶催化稳定性

循环次数	1	2	3	4
					相对酶活力/％	100.0	63.4	54.5	46.7

储存稳定性：将固定化酶和游离酶4℃保存，间隔时间测其酶活力，如图3，以第一次活力作为100％。结果表明将固定化酶和游离酶4℃保存30天后，游离酶活力下降近34％，而固定化酶活力下降17％。杂化凝胶耦合固定化酶储存30天后酶活仍保持80％以上，储存稳定性好。

Claims (5)

1.一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，其特征在于该方法采用吸附-絮凝耦合固定化酶方法，以无机纳米氧化物粉体为吸附载体，利用纳米材料具有比表面积大的特点，有效吸附溶液中的酶分子；再将纳米酶絮凝固定于有机高分子聚丙烯酰胺凝胶体系中，制备无机-有机杂化凝胶固定化酶体系，其工艺过程为：

载体溶液配制：将聚丙烯酰胺缓慢加入温水中，迅速搅拌，配成0.1～20g/L聚丙烯酰胺凝胶溶液，将吸附载体无机纳米氧化物粉体超声分散，制备含量为20.0～2400g/L纳米凝胶悬浮液，均质后备用；

酶蛋白液配制：酶蛋白用缓冲溶液溶解，含量为1～50g/L；

构建无机-有机杂化凝胶固定化酶体系，其组成及含量为：无机纳米氧化物载体10.0～2000g/L，酶蛋白0.1～30g/L，聚丙烯酰胺0.01～10g/L，其余为缓冲溶液；

吸附-絮凝耦合固定化工艺过程：采用吸附-絮凝耦合固定化工艺过程，先混合酶蛋白液与纳米凝胶悬浮液，pH 6～10，30～45℃摇床预吸附酶蛋白20～60min后，添加聚丙烯酰胺凝胶溶液，30～45℃振荡，絮凝固定20～60min，得无机-有机杂化凝胶絮凝体，离心洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止，获得杂化凝胶耦合固定化酶，2～4℃冰箱保存于缓冲溶液中备用。

2.根据权利要求1所述的一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，其特征在于所述的酶蛋白来自细胞，经增殖培养、离心分离菌体、超声波破碎、冷冻离心后，经饱和硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，溶于缓冲溶液留存；酶蛋白也可以来自酶制剂。

3.根据权利要求1所述的一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，其特征在于所述的无机纳米氧化物为二氧化硅、二氧化钛、二氧化锆或磁性材料。

4.根据权利要求1所述的一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，其特征在于所添加的有机高分子凝胶包括：聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

5.根据权利要求4所述的一种杂化凝胶载体的固定化酶制备方法，其特征在于所述的聚丙烯酰胺包括：阳离子聚丙烯酰胺，阴离子聚丙烯酰胺，非离子聚丙烯酰胺。

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