CN113355317B - 一种酶固定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酶固定方法，将待固定酶分散于缓冲溶液中，加入载体对所述待固定酶进行吸附固定，其中，所述载体的制备方法包括如下步骤：将非离子表面活性剂分散于溶剂中得到第一溶液；加入金属盐和非金属前驱体，并根据溶剂挥发诱导自组装‑热聚或水热反应得到所述载体。本发明提供的酶固定方法普适性较高，酶负载量高、并且酶活性和循环稳定性提高，此外，本发明提供的方法简便易行、成本较低，具有很好的应用前景。

Description

一种酶固定方法

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，尤其涉及一种酶固定方法。

背景技术

酶是一种高效、绿色的生物催化剂，广泛应用于精细化学品合成、制药工业、生物传感、食品加工等领域。然而，不相容的条件，如高温、不利的酸碱度和有机溶剂，很容易破坏酶的构象，导致酶活性部位的变形而丧失酶活性。同时，在实际应用中，从反应混合物中提取酶的过程通常会引起酶变性和活性丧失，循环稳定性差。

酶固定化是解决如上问题最为有效的途径之一，酶固定化技术是用载体材料将酶束缚或限制在一定的空间内，保留其催化活性，并可回收及重复使用的一类技术，载体常选用聚合物、氧化硅、金属有机框架化合物(MOFs)、介孔材料、DNA纳米胶囊等。但是，目前还没有普适的酶固定的方法，并且不同酶的负载量差异也较大；共价结合是酶固定化研究最多，也是最常用的提供负载量的方法之一，但是，共价结合法降低了酶的移动程度并促进了其构象变化，可能导致酶活性的丧失。因此，亟需一种具有普适性的酶固定方法，并且提高酶的负载量、活性和循环稳定性。

发明内容

本发明提供一种酶固定方法，用于解决目前酶固定方法普适性较差，以及酶负载量、活性和循环稳定性较差的问题。

本发明第一方面提供一种酶固定方法，将待固定酶分散于缓冲溶液中，加入载体对所述待固定酶进行吸附固定，其中，所述载体的制备方法包括如下步骤：

将非离子表面活性剂分散于溶剂中得到第一溶液；

加入金属盐和非金属前驱体，并根据溶剂挥发诱导自组装-热聚法或水热法反应得到所述载体；

所述金属盐选自ⅣB、ⅤB族金属的盐；

所述非金属前驱体包含羟基、氨基、羰基、巯基、酯基中的一种或多种官能团。

本发明提供了一种酶固定方法，通过调控载体电荷以提高酶的固定效果。众所周知，酶与其他蛋白质一样，能发生两性电离，具有确定的等电点(pI)。当pH小于酶等电点时，酶表面带负电荷；反之，其表面带正电荷，而研究结果表明载体表面的带点性质显著影响酶的负载量以及催化反应活性，基于此，本发明通过酶与载体表面的静电引力实现酶的高效固定，载体带电性可以用Zeta电位衡量。本发明提供的酶固定方法，通过酶和载体之间的静电引力实现酶的高效固定。载体表面带有电荷，具有长程的介观结构聚合物，骨架相对致密，孔内相对疏松。在具体使用过程中，通过调节载体的金属中心和非金属前驱体中官能团的种类和用量，调控载体表面电荷，适用于多种酶的固定，普适性较好，并且可实现酶的负载量可调；并且本发明提供的酶固定方法固定效果较好，储存和反应过程中，无酶泄漏，并且重复利用多次后，其相对活性仍然显著高于游离酶活性。

在一种实施方式中，本发明提供的酶固定方法适用于血红蛋白酶、细胞色素C、辣根过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、肌红蛋白、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶中的一种或多种，即本发明提供的方法可以实现上述单个酶的固定，也可以实现上述两种及两种以上酶的固定。

本发明提供的载体的制备方法具体包括如下步骤：

步骤1、将非离子表面活性剂分散于溶剂中得到第一溶液：

非离子表面活性剂作为基体用于载体的制备，其中，所述非离子表面活性剂为聚环氧乙烷－聚环氧丙烷、聚环氧乙烷－聚环氧丁烷、烷烃－聚环氧乙烷中的一种或多种；进一步地，所述非离子表面活性剂选自EO₂₀PO₇₀EO₂₀、EO₁₀₆PO₇₀EO₁₀₆、EO₁₃₂PO₅₀EO₁₃₂中的一种或多种；溶剂可以为去离子水和/或有机溶剂。

步骤2、加入金属盐和非金属前驱体：

在制备得到第一溶液的基础上加入金属盐和非金属前驱体，制备得到第二溶液，其中，所述金属盐为钛盐、锆盐、铌盐中的一种或多种，具体地，所述金属盐为四氯化钛、三氯化钛、钛酸丁酯、四氯化锆、醋酸锆、正丙醇锆、五氯化铌、水合草酸铌的一种或多种；

进一步地，所述非金属前驱体为低阶酚醛树脂、尿素、二氰二胺、磷酸三甲酯、三甲氧基巯丙基硅烷、苯磺酸、硫酸胺中的一种或多种。

上述步骤中，所述非离子表面活性剂的质量百分数为1.6％-13.6％，所述金属盐的质量百分数为1.5％-11.5％；所述非金属前驱体的质量百分数为1.2％-7.8％，需要注意的是，上述组分质量百分数的计算方式为各组分的质量/反应体系总质量*100％，例如，非离子表面活性剂的质量百分数＝非离子表面活性的质量/(非离子表面活性剂的质量+溶剂的质量+金属盐的质量+非金属前驱体的质量)*100％，金属盐和非金属前驱体的质量百分数的计算方式同上。

步骤3、反应得到所述载体：

在制备得到第二溶液的基础上，可采用溶剂挥发诱导自组装-热聚法或水热法反应得到该载体，其中，溶剂挥发诱导自组装-热聚法具体包括如下步骤：将第二溶液转移到35-40℃的烘箱中放置8-24h，随后在80-120℃下反应12-36h得到所述载体；

或者，水热法具体包括如下步骤：将第二溶液转移到水热釜中，在100-130℃下水热12-36h得到所述载体。

在制备得到载体的基础上，即可对酶进行固定，固定过程包括使用上述方法制备得到载体对酶进行吸附固定，直至吸附饱和，具体地包括如下步骤：

在含有所述待固定酶的缓冲溶液中加入所述载体，并在0-37℃、50-250次/分摇床转速下摇动吸附0-36h。

其中，含有所述待固定酶的缓冲溶液中酶的浓度为0.5-2.5mg/ml，进一步地，酶的浓度为1.0-1.5mg/ml；

所述缓冲溶液为磷酸缓冲盐溶液、氨水-氯化铵缓冲溶液中的一种，不同的待固定酶所使用的缓冲溶液可以不一致，例如，血红蛋白酶、细胞色素C可使用pH为7.2-7.4的磷酸缓冲盐溶液。

在上述缓冲溶液中加入载体，在一定温度下摇动吸附，直至吸附饱和，进一步地，在25-37℃、100-150次/分摇床转速下摇动吸附12-24h。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明提供的酶固定方法普适性较高，并且提高了酶负载量、活性和循环稳定性，此外，本发明提供的方法简便易行、成本较低，具有很好的应用前景。

2、本发明提供的酶固定方法，酶的负载量为100-305mg/g，并且通过调节载体中金属离子和官能团的种类的数量调节酶的负载量；本发明提供的固定酶在重复利用10次后，其相对活性仍然高达85％以上，与游离酶相比，固定化酶活性提高了2-50倍。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的酶固定产物的SEM图像和mapping图像；

图2为本发明实施例1提供的酶固定产物的激光共聚焦显微镜图像；

图3为本发明实施例1提供的酶固定产物的脱附实验紫外吸收光谱图；

图4为本发明实施例2提供的酶固定产物的贮藏稳定性测试结果；

图5为本发明实施例1、4提供的酶固定产物的4-氨基安替比林氧化反应活性测试结果；

图6为本发明实施例4的提供的酶固定产物的循环稳定性测试结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供的载体制备方法包括如下步骤：

步骤1、将1.0g非离子表面活性剂F127分散在30g乙醇中得到第一溶液；

步骤2、在第一溶液中加入0.58g ZrCl₄、0.48gTiCl₄以及0.85g磷酸三甲酯(OP(OCH₃)₃)，搅拌60分钟得到第二溶液；

步骤3、将步骤2制备得到的第二溶液迅速转移到培养皿中，40℃的温度下挥发24小时，随后在100℃下热聚24小时，得到载体。

称取100mg载体放于50mL烧杯中，用pH＝7.2-7.3的PBS缓冲溶液配置浓度为1mg/mL的血红蛋白酶溶液，并将其和烧杯中的载体混合，30℃下震荡24h至吸附平衡；收集离心得到的下层固体并用缓冲溶液清洗2-3次后，冻干干燥，得到酶固定产物。

图1为本发明实施例1提供的酶固定产物的SEM图像和mapping图像，如图1所示，相应的P、Zr和Ti元素在横截面视野范围中的均匀分布，且与载体的形貌相符合；酶中N和S元素的分布与材料的形貌相符合，说明血红蛋白已经固载在载体上，且分布较为均匀。

图2为本发明实施例1提供的酶固定产物的激光共聚焦显微镜图像，如图2所示，荧光颜色均匀分布于载体上，荧光存在的位置能够与载体的形状基本符合，相同的焦距下，各处的荧光强度并不完全相同，说明血红蛋白固载在载体内部孔道中而不是吸附在载体外表面上。

利用紫外-可见分光光度计对酶的浓度进行定量测试，测试显示，载体中血红蛋白酶的负载量为227mg/g。

将实施例1制备得到的酶固定化产物放在缓冲溶液中，30℃下震荡24h，过滤清液，用紫外分光光度计检测上清液中酶的浓度，即为脱附掉的酶。图3为本发明实施例1提供的酶固定产物的脱附实验紫外吸收光谱图，位于下方的曲线为After，位于上方的曲线为Before，如图3所示，血红蛋白酶的脱附量在5％以下。

实施例2

本实施例提供的载体制备方法包括如下步骤

步骤1、将1.0g非离子表面活性剂F127分散在20g乙醇中得到第一溶液；

步骤2、在第一溶液中加入0.48gTiCl₄和0.38g磷酸三甲酯，在室温下搅拌60分钟，以获得第二溶液；

步骤3、将步骤2制备得到的第二溶液在40℃下挥发24小时，并在100℃下热聚24小时，得到载体。

用缓冲溶液配置浓度为1.5mg/mL的细胞色素C溶液，称取200mg载体并与细胞色素C溶液混合，在35℃下震荡24h至吸附平衡，收集离心得到的下层固体并用缓冲溶液清洗2-3次后，冻干干燥，得到酶固定产物。

采用与实施例1相同的测试方法得知，载体中酶的负载量为204mg/g。

测试本实施例提供的酶固定产物的贮藏稳定性，图4为本发明实施例2提供的酶固定产物的贮藏稳定性测试结果，如图4所示，随着贮藏时间的延长，酶的相对活性逐渐降低，当贮藏时间为15月时，酶的相对活性仍然保持在60％以上，说明本发明提供的酶固定方法有助于提高酶稳定性，延长酶的贮藏时间。

实施例3

本实施例提供的载体制备方法包括如下步骤：

步骤1、将1.5g非离子表面活性剂F127分散在8g无水乙醇和1g去离子水中得到第一溶液；

步骤2、在第一溶液中加入1.96gTiCl₄，5g低阶酚醛树脂的乙醇溶液(20wt％)以及0.34g尿素，在40℃下搅拌30min得到第二溶液；

步骤3、将步骤2制备得到的第二溶液转移至鼓风干燥箱中，在40℃下挥发24h，随后在100℃下热聚24h，得到载体。

用缓冲溶液配置浓度为1.0mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，并加入上述制备方法制备得到的载体，在30℃下震荡36h至吸附平衡；收集离心得到的下层固体用缓冲溶液清洗2-3次后，冻干干燥，得到酶固定产物；

采用与实施例1相同的测试方法得知，载体中酶的负载量为126mg/g。

实施例4

本实施例提供的载体制备方法包括如下步骤：

步骤1、将2.5g非离子表面活性剂P123分散在115g H₂O和24.4g盐酸中得到第一溶液；

步骤2、在第一溶液中加入4.16g正丙醇锆、2.3g(NH₄)₂SO₄，在40℃下搅拌60分钟得到第二溶液；

步骤3、将第二溶液转移至100ml水热釜中，在100℃下进行水热烘干24小时，随后进行过滤并用去离子水至少洗涤三次，将过滤好的物质放于100℃的烘箱烘干加热24小时，即可得到载体。

称取100mg载体放于50mL烧杯中，用PBS缓冲溶液配置浓度为1mg/mL的血红蛋白酶溶液，并将其和烧杯中的载体混合，30℃下震荡24h至吸附平衡；收集离心所得到的下层固体并用缓冲溶液清洗2-3次后，冻干干燥，得到酶固定产物。

采用与实施例1相同的测试方法得知，载体中酶的负载量为143mg/g。

将实施例1与实施例4制备得到的酶固定产物置于NH₃·H₂O-NH₄Cl缓冲溶液中，依次加入1.12Mm 4-氨基安替比林、1.12mM苯酚、0.2mgHb以及过氧化氢溶液，测试产物中醌类物质生成量，计算米氏常数和催化转化数，图5为本发明实施例1、4提供的酶固定产物的4-氨基安替比林氧化反应活性测试结果，如图5所示，相比于游离的血红蛋白酶，固定后的酶的相对活性显著提高。

对本实施例提供的酶固定产物的循环稳定性进行测试，图6为本发明实施例4的提供的酶固定产物的循环稳定性测试结果，如图6所示，随着循环次数的不断增加，酶的相对活性保持在85％以上，具有较好的循环稳定性。

实施例5

本实施例提供的载体制备方法包括如下步骤：

步骤1、将1.0g表面活性剂F127分散在30g乙醇中得到第一溶液；

步骤2、在第一溶液中加入0.58g ZrCl₄以及0.6g磷酸三甲酯，搅拌60分钟，以获得第二溶液；

步骤3、将第二溶液在40℃下挥发24小时，并在100℃下热聚24小时，得到载体。

称取100mg载体放于50mL烧杯中，用缓冲溶液配置浓度为1mg/mL的辣根过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶(GOx)溶液，并将其和烧杯中的载体混合，30℃下震荡24h至吸附平衡；收集离心得到的下层固体并用缓冲溶液清洗2-3次后，冻干干燥，得到酶固定产物。

采用与实施例1相同的测试方法得知，载体中HRP、GOx的负载量分别为103mg/g、98mg/g。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种酶固定方法，其特征在于，将待固定酶分散于缓冲溶液中，加入载体对所述待固定酶进行吸附固定，其中，所述载体的制备方法包括如下步骤：

将非离子表面活性剂分散于溶剂中得到第一溶液；

加入金属盐和非金属前驱体，并根据溶剂挥发诱导自组装-热聚法或水热法反应得到所述载体；

所述金属盐为钛盐、锆盐、铌盐中的一种或多种；

所述非金属前驱体为磷酸三甲酯、硫酸胺中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶为血红蛋白酶、细胞色素C、辣根过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、肌红蛋白、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂为聚环氧乙烷－聚环氧丙烷、聚环氧乙烷－聚环氧丁烷、烷烃－聚环氧乙烷中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂的质量百分数为1.6％-13.6％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属盐的质量百分数为1.5％-11.5％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非金属前驱体的质量百分数为1.2％-7.8％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂挥发诱导自组装-热聚法具体包括：在35-40℃的烘箱中放置8-24h，随后在80-120℃下反应12-36h得到所述载体；

所述水热法具体包括：在100-130℃下水热12-36h得到所述载体。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述载体和所述待固定酶进行吸附固定，具体包括：

在含有所述待固定酶的缓冲溶液中加入所述载体，并在0-37℃、50-250次/分摇床转速下摇动吸附0-36h。

Images