CN103157430B - 一种海胆状核-壳型Fe3O4@TiO2磁性微球及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种海胆状核-壳型的磁性微球及其制备方法和在磷酸化多肽选择性富集方面的应用。该磁性微球是在Fe₃O₄磁性微球表面以溶胶凝胶法包覆一层SiO₂材料，然后再沉积一层锐钛矿晶核，最后通过水热生长使得纳米晶种在表面长成金红石纳米棒，形成具有海胆状外形的磁性微球颗粒。该种磁性材料比表面积大，具有快速的外部磁场响应，对生物样品中痕量磷酸化多肽选择性富集时处理简单、特异性强。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种海胆状核-壳型Fe3O4TiO2磁性微球及其制备和应用

技术领域

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种海胆状核-壳型的 磁性微球及其制备方法和应用。

本发明提出的磁性微球，可作为一种亲和探针对含复杂肽段生物样品中痕量磷酸化肽实现高选择性富集，并结合MALDI-TOF/MS对富集到的磷酸化多肽进行分析和鉴定。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。 

背景技术

蛋白质的磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要方式之一，在细胞中蛋白质的磷酸化是一种普遍的现象，这些磷酸化的蛋白在细胞信号传导，细胞分化和细胞生长等生命过程起着重要调节作用。因此对于磷酸化蛋白的结构鉴定和磷酸化水平的分析对于解释蛋白磷酸化如何调节生命过程具有十分重要的意义。近年来，生物质谱已经成为磷酸化蛋白结构解析的有力工具。然而，由于磷酸化肽段丰度低且在质谱分析中的离子化效率相对较差，样品中非磷酸化肽段信号严重干扰了磷酸化肽段的检测。因此，在质谱分析之前对磷酸化肽段进行选择性富集是非常必要的。 

目前，在磷酸化多肽富集领域最为典型的两种技术是固定金属亲和色谱和金属氧化物柱色谱。人们将不同的金属离子，比如钛，锆，铁，镍等固定于不同的柱基质上，尤其于近年来和整体柱填料结合解决了大部分磷酸化多肽富集问题。但是该法除了树脂固有“孔洞效应”造成富集到的磷酸化多肽无法被检测外，一般由于金属离子通过螯合技术键合在树脂表层，作用力薄弱，在反复使用过程中容易造成金属离子流失，富集能力下降。此外，整体柱型固定离子亲和色谱多借助液相色谱泵来促使样品溶液，淋洗液和洗脱液通过亲和基质，使得整个预处理过程十分繁琐。金属氧化物表现出的高亲和性能和稳定性越来越赢得人们的青睐。一度人们热衷于制备各种氧化物的微球，像氧化锆，氧化钛，氧化铁以及一些氧化物的复合粒子。不过这些氧化物微球多采用装填成柱子或者直接离心分离的方法用于磷酸化肽段的分离富集。但是，装柱多涉及平衡，上样，淋洗，洗脱及脱盐等处理过程，使用相对复杂繁琐；使用高速离心可能高质量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段共沉淀下来而造成部分低含量磷酸化多肽漏检。 

近年来，磁性纳米粒子以高比表面积，易表面修饰和快速的外 磁场响应，易回收等优越性能已经被广泛的应用于核磁成像，催化，传感，疾病治疗，富集等领域。逐步的人们将磁性粒子与磷酸化多肽的亲和基团，诸如金属离子和金属氧化物相结合，形成独特的核-壳型复合材料，应用于磷酸化多肽选择性富集领域，尤为突出的是，磁性材料经过富集后可以直接点靶进行MALDI分析，无需洗脱，因此大大简化了整个样品预处理过程。但是，现有的金属氧化物磁性材料比表面积偏小，表层亲和位点不足，造成磷酸化肽段富集效果不是太理想。因此，合成高比表面积的包覆金属氧化物型的磁性材料，对于实现高效、快速磷酸化肽段的选择性富集中有重要意义。一维纳米棒具有较高的表面积/体积比，相对为球体而言能提供更对的活性位点。从一定意义上讲，提高了相互作用的比表面积。本发明提供的海胆状核一壳型的磁性微球集合了磁性材料快速外磁场响应和金属氧化物稳定性的优点，具有很高的比表面积，不但简化了磷酸化多肽富集过程，提高了富集通量，而且这种合成方法更为新型磁性材料的合成提供了新思路。 

发明内容

本发明的目的是提供一种海胆状核-壳型 磁性微球及其制备方法和应用。

一种海胆状核-壳型的 磁性微球，于四氧化三铁磁性微球表面包裹一层SiO₂材料层，形成核壳结构的 磁性微球材料，然后在核壳结构的 磁性微球材料表面制备一层TiO₂纳米棒，形成海胆状结构；其中，四氧化三铁磁性微球的粒径为150-350nm，中间层氧化硅层的厚度为30-60nm，外层海胆状TiO₂纳米棒的直径50-100nm，长度200-500nm。 

该发明所述的海胆状核-壳型 磁性微球的具体合成方法是：通过溶剂热还原法合成四氧化三铁超顺磁微球，之后用正硅酸四乙酯通过溶胶凝胶法包覆一层二氧化硅，以酞酸丁酯为钛源于表层沉积一层锐钛矿纳米晶，最后通过水热生长法在磁球表层形成金红石纳米棒。具体合成方法如下： 

第一步用溶剂热还原法合成Fe₃O₄磁性微球：以1-1.5gFeCl₃·6H₂O为原料，用40-60mL乙二醇作分散剂，加入3-5g乙酸钠和1-2g聚乙二醇，反应温度为200℃，反应时间为6-12小时，得到Fe₃O₄磁性微球。 

第二步首先将Fe₃O₄磁性微球分别用水和乙醇反复超声清洗以除去表层吸附杂质，干燥后取20-50mg Fe₃O₄磁性微球重新分散在体积比1∶4的20-50 mL水/乙醇溶液中，再加入质量浓度10％氨水3-6mL，在30-60℃搅拌条件下逐滴加入正硅酸乙酯200-500μL，反应2-8小时；经过水和乙醇分别清洗之后得到 磁性微球。 

第三步在 微球表面沉积锐钛矿晶种：将2)得到的 磁性微球浸泡于10-20mL质量浓度5-20％聚乙烯亚胺水溶液中，超声处理表面10分钟以上，然后静置10-15小时。取出处理过的材料15-25 mg，经过水清洗后重新悬浮在体积比1∶9的15-30mL水/乙醇溶液中，加入15μL质量浓度0.02-0.05％稀盐酸水溶液搅拌，以改变磁球表面的Z-电位为正，3-8 mL酞酸丁酯乙醇稀释溶液在搅拌条件下逐滴加入，酞酸丁酯与乙醇的体积比1∶25-1∶40；之后在70-100℃之间回流1-3小时；经过乙醇和水清洗若干次后，表层氧化钛低聚物通过4 5 0-5 5 0℃高温煅烧而形成锐钛矿晶种； 

第四步生成具有海胆状核-壳的 磁性微球颗粒：步骤3)得到的材料2-10mg经过超声均一分散在30 mL质量浓度10-20％盐酸水溶液中，之后含磁球的悬浮液转移至反应釜中，在80-120℃之间高温反应6-12小时；反应过后反应釜自然冷却到室温，取出固体产物，固体产物用水和乙醇分别洗若干次后干燥。 

与现有技术相比，本发明具有如下优点：该材料是以氧化钛为主体的材料，中间的磁核能提供足够的磁场响应，同时避免了以往以磁核为主材料氧化层薄、比表面积小的缺点。由于纳米棒的各向异性生长，对于混合体系中磷酸化多肽的捕获十分有利。该材料在磷酸化多肽富集过程中展现了很高的选择性和富集能力，在蛋白组学领域具有良好的实用前景和应用价值。 

本发明的产品能高效、处理过程简单地对痕量磷酸化肽段进行特异性捕获。 

附图说明

图1是实施例1制备过程中不同阶段的透射电镜图。(a)溶剂热法合成的四氧化三铁微球。(b) 核壳结构微球。(c)在 表面沉积一层锐钛矿晶种。(d)海胆状核-壳型 微球。两个插图分别是纳米棒的局部放大图和选区电子能量衍射图。从图中可以观测到材料具有较好的分散性和均一的包覆性，锐钛矿晶种在 表面良好的分散，水热生长之后，由高度晶化的纳米粒子组成金红石型的纳米棒。 

图2是实施例1纳米棒生长前后磁性材料的扫描电镜图。(a)沉积锐钛矿晶种的 微球。(b)海胆状核-壳型 微球。由图可知，材料经过水热生长之后，锐钛矿晶种长成纳米棒，在材料表面具有较好的生长取向。 

图3是实施例1纳米棒生长前后磁性材料的X射线衍射图。(a)沉积锐钛矿晶种的 微球。(b)海胆状核-壳型 微球。前后对比图可以得知，在水热生长过程中，锐钛矿型纳米粒子转变成金红石型的纳米棒。 

图4是实施例2用该海胆状核-壳型的材料处理α-casein胰蛋白酶解混合多肽溶液前后的MALDI-TOF/MS图。处理前溶液的浓度是4×10^-7mol/L。比较处理前的(a)图和处理后的(b)图可知该材料具有很强的选择性。 

图5是实施例3用海胆状核-壳型的材料处理更低浓度的α-casein胰蛋白酶解混合多肽溶液的MALDI-TOF/MS图。处理前溶液的浓度是2×10^-9mol/L.处理前后的对比可以得知该材料具有优良的富集能力。 

具体实施方式

通过具体实例对本发明海胆状核-壳型的磁性材料用于多肽混合溶液中磷酸化多肽的选择性富集过程进行细致阐述. 

实施例1.海胆状核-壳型的 磁性材料合成。 

整个合成反应分成四步： 

第一步，用溶剂热还原法合成Fe₃O₄超顺磁性微球：1.35gFeCl₃·6H₂O加入到40mL乙二醇中，搅拌至溶液澄清。加3.6g乙酸钠和1g聚乙二醇(4000-6000)，充分搅拌至溶液均匀。将溶液转移至50mL反应釜，升高温度至200℃，反应8小时。待自然冷却之后用水和乙醇超声清洗若干次。最后产物在60℃条件下干燥备用。 

第二步，采用溶胶凝胶法合成具有核壳结构的 磁性微球：首先对由步骤一制得的Fe₃O₄磁性微球30mg在超声条件下重新分散在40mL 1∶4水/乙醇溶液中，再加入5mL10％氨水。在40℃条件下搅拌10分钟，逐滴加入正硅酸乙酯300μL，经过反应3小时，磁性材料用磁场收集，经过水和乙醇清洗之后得到 磁性微球。 

第三步，在 微球表面沉积锐钛矿晶种。步骤二得到的 磁性微球用10mL 10％聚乙烯亚胺超声处理表面30min，静置过夜。处理过的材料经过水清洗重新悬浮在20mL水/乙醇(1∶9v/v)溶液中，加入10μL稀盐酸水溶液(1∶1000v/v)搅拌20min至体系均一。之后5mL体积比为1∶25酞酸丁酯乙醇稀释溶液在常温持续搅拌条件下逐滴加入。至滴加结束十分钟后体系温度升高至85℃回流1.5小时。重复酞酸丁酯乙醇加入反应和回流步骤一次以使得表层氧化钛低聚物达适宜量.反应过后的磁性材料经过乙醇和水超声清洗，60℃干燥6小时。在氮气保护条件下500℃高温煅烧一小时而形成锐钛矿晶种。 

最后，生成具有海胆状核-壳的 磁性微球颗粒：步骤三得到的材料约5mg经过超声均一分散在30mL 9.3％浓盐酸的水溶液中，之后含磁球的悬浮液转移至50mL反应釜中，在110℃条件下高温反应11小时。反应过后反应釜自然冷却到室温，材料经过外 磁场控制，用水和乙醇洗若干次，60℃干燥。 

该种磁性材料比表面积大，具有快速的外部磁场响应，对生物样品中痕量磷酸化多肽选择性富集时处理简单、特异性强。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。 

实施例2.选择性富集复杂多肽混合液中的磷酸化多肽和基质辅助激光解析电离质谱分析。 

(1)α-casein蛋白酶解液制备。α-casein溶解在pH＝8的碳酸氢铵缓冲溶液中形成1mg/ml的溶液，按重量分数为2.5％比例加入胰蛋白酶，于37℃条件下进行酶解18小时后终止，得到的多肽混合溶液用含50％乙腈的0.1％三氟乙酸水溶液稀释至浓度为4×10^-7mol/L。 

(2)磷酸化多肽的选择性富集和MALDI-TOF/MS分析。5μL 10mg/mL的实施例1制备的海胆状核-壳型 微球水溶液加入到200μL浓度为4×10^-7mol/L的α-casein胰蛋白酶解混合多肽溶液中，涡旋震荡3分钟进行磷酸化多肽的捕获。之后用磁场控制分离上清，所得的磁性材料用100μL含50％乙腈的0.1％三氟乙酸水溶液进行非特异性吸收物质的清洗，每次涡旋30秒之后去上清。最后磁性材料用10μL 2％的氨水在涡旋振动条件下洗脱3分钟。取洗脱液0.5μL点在MALDI-TOF/MS靶板上，待自然干燥之后在滴加0.5μL基质溶液。基质溶液组成是20mg/mL的2，5-DHB(溶于70％乙腈水溶液)和1％的磷酸溶液水溶液，体积比是1∶1。然后用MALDI-TOF/MS进行分析。分析的条件为，337nm的氮脉冲激光，加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF/MS检测。结果如图4所示，说明该海胆状核-壳型磁性材料对磷酸化多肽具有很强的选择性，鉴定结果见表1。 

表1.MALDI-TOF/MS中检测到的磷酸化多肽列表 

实施例3调整α-casein胰蛋白酶解混合多肽溶液浓度为2×10^-9mol/L，其他条件同实例2，结果如图5(a)和(b)，有图可知，即使磷酸化多肽的浓度降到pmol/L级，仍然有磷酸化多肽峰可以被检测到，说明海胆状核-壳型的材料具有很高的富集能力。 

Claims (3)

1.一种海胆状核-壳型的Fe₃O₄TiO₂磁性微球的制备方法，在于：

1)用溶剂热还原法合成Fe₃O₄磁性微球：以1-1.5g FeCl₃·6H₂O为原料，用40-60mL乙二醇作分散剂，加入3-5g乙酸钠和1-2g聚乙二醇，反应温度为200℃，反应时间为6-12小时，得到Fe₃O₄磁性微球；

2)采用溶胶凝胶法合成具有核壳结构的Fe₃O₄SiO₂微球：首先将Fe₃O₄磁性微球分别用水和乙醇反复超声清洗以除去表层吸附杂质，干燥后取20-50mg Fe₃O₄磁性微球重新分散在体积比1:4的20-50mL水/乙醇溶液中，再加入质量浓度10％氨水3-6mL，在30-60℃搅拌条件下逐滴加入正硅酸乙酯200-500μL，反应2-8小时；经过水和乙醇分别清洗之后得到Fe₃O₄SiO₂磁性微球；

3)在Fe₃O₄SiO₂微球表面沉积锐钛矿晶种：将2)得到的Fe₃O₄SiO₂磁性微球浸泡于10-20mL质量浓度5-20％聚乙烯亚胺水溶液中，超声处理表面10分钟以上，然后静置10-15小时；取出处理过的材料15-25mg，经过水清洗后重新悬浮在体积比1:9的15-30mL水/乙醇溶液中，加入15μL质量浓度0.02-0.05％稀盐酸水溶液搅拌，以改变磁球表面的Z-电位为正，3-8mL酞酸丁酯乙醇稀释溶液在搅拌条件下逐滴加入，酞酸丁酯与乙醇的体积比1:25-1:40；之后在70-100℃之间回流1-3小时；经过乙醇和水清洗若干次后，表层氧化钛低聚物通过450-550℃高温煅烧而形成锐钛矿晶种；

4)生成具有海胆状核-壳的Fe₃O₄TiO₂磁性微球颗粒：步骤3)得到的材料2-10mg经过超声均一分散在30mL质量浓度10-20％盐酸水溶液中，之后含磁球的悬浮液转移至反应釜中，在80-120℃之间高温反应6-12小时；反应过后反应釜自然冷却到室温，取出固体产物，固体产物用水和乙醇分别洗若干次后干燥，得产品；

所得材料特征在于：四氧化三铁磁性微球表面包裹一层SiO₂，形成核壳结构的Fe₃O₄SiO₂磁性微球，之后再在Fe₃O₄SiO₂磁性微球材料表面制备一层金红石型TiO₂纳米棒，形成海胆状结构；其中，四氧化三铁磁性微球的粒径为150-350nm，中间层氧化硅层的厚度为30-60nm，外层海胆状TiO₂纳米棒的直径50-100nm，长度200-500nm。

2.一种权利要求1所述的海胆状核-壳型的Fe₃O₄TiO₂磁性微球的制备方法，其特征在于：应用于磷酸化多肽的微吸附剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：直接将权利要求1所述磁性微球加入含有磷酸化肽的复合肽段混合物中震荡，进行痕量磷酸化多肽的分离富集。