CN112011532B - 一种固定化酶载体材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种固定化酶载体材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种固定化酶载体材料，该载体材料由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成，具有较大比表面积，其无毒无害、对酶结合量大、结合稳定、对酶活力影响小、能够较好地维护酶分子空间构象，且适用范围广。本发明还涉及上述固定化酶载体材料的制备方法，采用该方法能够成功制备具有上述优良性能的酶载体材料。将上述固定化酶载体材料用于制备固定化碳酸酐酶，所制得的固定化碳酸酐酶酶活力较高，稳定性好，能够应用于工业生产，降低生物酶使用成本。

Description

一种固定化酶载体材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于固相化酶技术领域，涉及一种固定化酶载体材料及其制备方法与应用。
背景技术
酶的固定化是指利用载体，通过物理、化学或生物方法将酶限制在一定空间内，再进行催化反应的一种酶工程技术。固定化酶不仅保留了游离酶专一、温和的催化特点，还明显提高了催化效率和稳定性，且可多次重复使用。固定化酶催化过程易调控，非常有利于与多种装置耦合和功能化集成，即可开展大规模工业生产，又能进行微型生化催化反应与在线分析检测。
碳酸酐酶是一种能快速、高效催化CO2水合反应的低能耗金属含锌酶，广泛分布在除真菌外的各种动植物体内。碳酸酐酶是目前已知催化CO2水合反应最快的生物催化剂，其催化CO2水合反应速率最高可以是非催化反应速率的109倍，是一种稳定、安全、无害的催化剂。目前碳酸酐酶的固定化主要有物理吸附法、离子吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等，其中物理吸附法中吸附剂与游离酶之间作用力弱，吸附不牢固，易脱落；离子吸附法对载体的选择性高，结合量不高；交联法使用交联剂本身有毒性，且固定化酶活性较低；共价结合法由于共价键的存在，易造成酶分子空间构象的变化；包埋法适用范围小，且酶活损失较大。
因此，目前存在的问题是亟需研究开发一种对酶结合稳定、结合量大、无毒无害、不会造成酶分子空间构象的变化、酶活力损失小且适用范围广的碳酸酐酶固定化载体材料及其制备方法。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术存在的不足，提供一种固定化酶载体材料，该载体材料由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成，具有较大比表面积，其无毒性、对酶结合量大、结合力强、对酶活力影响小、能够较好地维护酶分子空间构象，且适用范围广。本发明的目的之二在于提供一种上述固定化酶载体材料的制备方法，采用该方法能够成功制备具有上述优良性能的酶载体材料。将上述固定化酶载体材料用于制备固定化碳酸酐酶，所制得的固定化碳酸酐酶酶活力较高，稳定性好，能够应用于工业生产，降低生物酶使用成本。
为此，本发明第一方面提供了一种固定化酶载体材料，其由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成。
根据本发明，所述纳米花状磁性纳米球包括Fe3O4磁性纳米粒子核、包覆于Fe3O4磁性纳米粒子核外的TiO2层；优选地，所述TiO2层外表面为花瓣状片层结构或近花瓣片层结构。
在本发明的一些实施例中，所述TiO2层厚度在60-160nm。
根据本发明，所述片层石墨烯以包裹或半包裹纳米花状磁性纳米球的方式负载纳米花状磁性纳米球；优选地所述纳米花状磁性纳米球呈聚集状，形成聚集状球体。
在本发明的一些实施例中，纳米花状磁性纳米球的直径为300-800nm。
在本发明的另一些实施例中，所述聚集状球体的直径在1000-6000nm。
在本发明的又一些实施例中，片层石墨烯的片层数在1-5层。
在本发明的一些实施例中，所述固定化酶载体材料的比表面积为200-400m2·g-1。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的固定化酶载体材料的制备方法，其包括：
步骤I，将Fe3O4磁性纳米粒子与A溶液均匀混合后，注加B溶液进行反应，所获得的产物经磁性分离、洗涤制备得到核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球；
步骤J，将核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球均匀分散在C溶液中，加入片层氧化石墨烯分散液进行反应，产物经磁性分离，洗涤制得固定化酶载体材料，所述固定化酶载体材料由TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层或近花瓣片层结构的磁性纳米球以被包裹或半包裹的方式负载于片层石墨烯上构成；
其中，所述A溶液为的第I有机溶剂与第I碱性溶液形成的混合液；优选地，所述第I有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；所述碱性溶液为氨水的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钠的水溶液和氢氧化钙的一种或多种的水溶液；
所述B溶液为钛酸四丁酯与第II有机溶剂的混合液；优选地，所述第II有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；
所述C溶液为去离子水、第III有机溶液与第III碱性溶液形成的混合液；优选地，所述第1II有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；所述第III碱性溶液为氨水、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钠的水溶液和氢氧化钙的水溶液中的一种或多种的水溶液。
根据本发明方法：在步骤I中，所述反应的温度在30-60℃，反应的时间在12-48h。
在本发明的一些实施例中，所述A溶液中第I碱性溶液与第I有机溶剂的体积比为(0-0.12)∶1。
在本发明的一些实施例中，B溶液中钛酸四丁酯与有机溶剂的体积比为(0.01-0.5)∶1。
在本发明的一些实施例中，以A溶液体积计的Fe3O4磁性纳米粒子的用量为0.5-2.0g/L。
在本发明的一些实施例中，A溶液与B溶液的体积比为1∶(0.1-1)。
根据本发明方法，在步骤J中，所述反应的温度在100-200℃，所述反应的时间为2-6h。
在本发明的一些实施例中，以C溶液的体积计核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的用量为(0.2-2)mg/mL。
在本发明的一些实施例中，优选C溶液中有机溶剂与碱性溶液的体积比为1∶(0.01-0.5)。
在本发明的一些实施例中，所述C溶液中去离子水与第III碱性溶液的体积比为1∶(0.01-0.5)。
在本发明的一些实施例中，所述氧化石墨烯分散液的浓度为0.1-1mg/mL。
在本发明的一些实施例中，C溶液与氧化石墨烯分散液的体积比为1∶(0.1-1)。
本发明第三方面提供了一种固定化碳酸酐酶，其由碳酸酐酶负载于本发明第一方面所述的固定化酶载体材料或如本发明第二方面所述的方法制备的固定化酶载体材料构成。
本发明中，所述碳酸酐酶为I型、II型和III型碳酸酐酶。
在本发明的一些实施例中，所述固定化碳酸酐酶中含有碳酸酐酶40-200mg/g。
本发明第四方面提供了一种如本发明第三方面所述的固定化碳酸酐酶的制备方法，其包括将本发明第一方面所述的固定化酶载体材料或如本发明第二方面所述的方法制备的固定化酶载体材料与D溶液均匀混合后，加入待固定化的碳酸酐酶溶液进行固载结合，所获得的产物经磁性分离、洗涤制得固定化碳酸酐酶；其中，所述D溶液为去离子水、含锌溶液与磷酸缓冲液形成的缓冲液。
本发明中，所述含锌溶液包括硫酸锌溶液、盐酸锌溶液以及硝酸锌溶液中的一种或多种。
在本发明的一些实施例中，含锌溶液与磷酸缓冲液的体积比为(0.01-2)∶1，优选为(0.1-1)∶1。
在本发明的一些实施例中，D溶液中去离子水与磷酸缓冲液的体积比为1∶(0.1-2)。
在本发明的一些实施例中，含锌溶液的浓度为(1-100)mmol/L。
本发明中，所述磷酸缓冲液的pH区间为6-9。
根据本发明方法：在步骤K中，所述固载结合的温度在15-35℃，所述固载结合的时间为1-4h，所述固载结合的摇床转速为120-200r/min；
在本发明的一些实施例中，D溶液中含锌溶液与磷酸缓冲液的体积比为(0.01-2)∶1，优选为(0.1-1)∶1。
在本发明的一些实施例中，以D溶液体积计载体材料的用量为(0.5-5.0)g/L。
在本发明的一些实施例中，碳酸酐酶溶液的浓度为(0.1-2)g/L。
在本发明的一些实施例中，D溶液与碳酸酐酶的体积比为1∶(0.01-0.2)。
与现有碳酸酐酶固定技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明采取纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料固定化碳酸酐酶，制备得到的固定化酶，结构稳定，具有300-4000nm的纳米级尺寸，分散性优越。
2)本发明制备得到的固定化酶具有超顺磁性，易于回收，在重复使用6次后，酶活保留仍在80％-95％范围。
3)本发明制备得到的固定化酶较游离酶稳定性得到提高，在室温25℃温度下贮存，第15天酶活保留率为80％-90％，游离酶酶活仅为45％-55％；当温度范围在10-50℃和pH范围在5.5-9.0时，相对酶活相对游离酶提高了10％-40％。固定化酶能够应用于工业生产，降低生物酶使用成本。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明的固定化酶载体材料的透射电镜图。
图2为本发明的固定化酶载体材料的扫描电镜图。
图3为本发明的固定化碳酸酐酶的贮藏稳定性结果图。
图4为本发明的固定化碳酸酐酶的重复利用结果图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图和实施例详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以互相组合。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围(包括括号中所述范围)的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
I.术语
本发明所述用语“Fe3O4@TiO2磁性纳米球”是指核壳结构的磁性纳米球，也就是说在“Fe3O4磁性纳米粒子核”外层包覆一层“TiO2壳”的核壳结构的磁性纳米球，其中符号“@”是指核壳结构。
本发明中所述“水”一词，在没有特别指定或说明的情况下是指超纯水、去离子水或蒸馏水。
II.实施方案
如前所述，目前碳酸酐酶的固定化方法不尽如人意，存在这样或那样一些问题，例如，物理吸附法中吸附剂与游离酶之间作用力弱，吸附不牢固，易脱落；离子吸附法对载体的选择性高，结合量不高；交联法使用交联剂本身有毒性，且固定化酶活性较低；共价结合法由于共价键的存在，易造成酶分子空间构象的变化；包埋法适用范围小，且酶活损失较大。鉴于此，本发明人对于碳酸酐酶的固定载体材料及其对于碳酸酐酶的固定化效果进行了大量的研究。
本发明人研究发现，磁性二氧化钛-石墨烯材料作为固定化酶的载体材料，具有较好热稳定性和化学稳定性、易分离回收、生物相容性好、比表面积大和容易进行表面化学修饰等优点。进一步地，磁性二氧化钛-石墨烯材料用于固定化酶，不仅具有较大的固载量，保留较高的酶活且能够通过不同化学修饰，应用于不同种类的酶，应用范围广泛。同时，其易于回收，重复使用在工业生产应用广泛。
本发明人通过研究将纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上制成一种酶固定化材料，一方面这种酶固定化材料具有较大比表面积，为酶与载体提供了大量相互作用微环境，另一方面这种酶固定化材料的石墨烯层和TiO2层表面均能提供羟基和羧基，使得这种酶固定化材料的表面分布有一定量的羟基和羧基，其能够与碳酸酐酶通过氢键结合，羧基还可以与酶蛋白的氨基官能团形成酰胺键，增强了酶与酶固定化材料的结合力；同时，在固载过程加入微量含锌溶液，很好地维护了固载后碳酸酐酶的构型，保持了酶的活力和稳定性。本发明正是基于上述发现做出的。
因此，本发明第一方面所涉及的一种固定化酶载体材料其由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成。
本发明中，所述纳米花状磁性纳米球包括Fe3O4磁性纳米粒子核、包覆于Fe3O4磁性纳米粒子核外的TiO2层，所述TiO2层外表面为花瓣状片层结构或近花瓣片层结构。在本发明的一些实施例中，所述TiO2层厚度在60-160nm。
本领域技术人员应该了解的是，构成固定化酶载体材料的所述片层石墨烯是以包裹或半包裹纳米花状磁性纳米球的方式负载纳米花状磁性纳米球，且所述纳米花状磁性纳米球呈聚集状，形成较大的聚集状球体。在本发明的一些实施例中，例如，纳米花状磁性纳米球的直径为300-800nm；在本发明的另一些实施例中，例如，所述聚集状球体的直径在1000-6000nm，优选为2000-6000nm。在本发明的又一些实施例中，例如，片层石墨烯的片层数在1-5层。
本发明人研究发现，本发明所提供的具有上述结构的固定化酶载体材料具有较大的比表面积，例如，所述固定化酶载体材料的比表面积为200-400m2·g-1，优选为260-310m2·g-1，酶固定化材料的石墨烯层和TiO2层表面均能提供羟基和羧基，使得这种酶固定化材料的表面分布有一定量的羟基和羧基，其能够与碳酸酐酶通过氢键结合，增强了酶与酶固定化材料的结合力。
图1为本发明的固定化酶载体材料的透射电镜图，图2为本发明的固定化酶载体材料的扫描电镜图。从图1和图2可以看出，包括纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料和碳酸酐酶。其中，载体材料包括Fe3O4磁性纳米粒子核、包覆于Fe3O4磁性纳米粒子核外的TiO2层，及负载以Fe3O4磁性纳米粒子为核的TiO2层的片层石墨烯，且所述TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层。其TiO2层厚度在100-160nm，TiO2层外表面呈花瓣片层结构，或近花瓣片层结构；纳米花状磁性纳米球的直径为400-800nm，纳米花状磁性纳米球呈聚集状，形成较大球体结构，聚集球体直径在2000-3600nm；石墨烯的片层数为1-2层，石墨烯片层半包裹着纳米花状磁性纳米球。
本发明第二方面所涉及的一种如本发明第一方面所述的固定化酶载体材料的制备方法，其包括：
步骤I，将Fe3O4磁性纳米粒子与A溶液均匀混合后，注加B溶液，在30-60℃条件下，反应12-48h，所获得的产物经磁性分离、洗涤制备得到核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球；
步骤J，将核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球均匀分散在C溶液中，加入片层氧化石墨烯分散液，在100-200℃条件下，反应2-6h，产物经磁性分离，洗涤制得固定化酶载体材料，所述固定化酶载体材料由TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层或近花瓣片层结构的磁性纳米球以被包裹或半包裹的方式负载于片层石墨烯上构成。
本领域技术人员应该了解的是，在步骤I中制备得到的核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球，是以Fe3O4磁性纳米粒子为核并以TiO2为壳构成的核壳结构的Fe3O4@TiO2球状磁性纳米球。而在步骤J中所制备得到的固定化酶载体材料是由TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层或近花瓣片层结构的磁性纳米球以被包裹或半包裹的方式负载于片层石墨烯上构成；依即，在步骤J中所制备得到的固定化酶载体材料是由片状石墨烯以包裹或半包裹的方式负载TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层或近花瓣片层结构的磁性纳米球构成，且TiO2层外表面为花瓣状TiO2片层或近花瓣片层结构的磁性纳米球在片层状石墨烯的包裹或半包裹的负载下呈聚集状，形成较大的聚集状球体。
步骤I中采用溶胶-凝胶法制备具备核壳结构的Fe3O4-TiO2磁性纳米球，在上述步骤I中：
(1)所述A溶液为的第I有机溶剂与第I碱性溶液形成的混合液；优选地，A溶液中第I碱性溶液与第I有机溶剂的体积比为(0-0.12)∶1。
所述第I有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；所述醛类包括但不限于甲醛、乙醛，所述醇类包括但不限于甲醇、乙醇，所述酮类包括但不限于丙酮。
所述第I碱性溶液为氨水的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钠的水溶液和氢氧化钙的一种或多种的水溶液。
所述第I碱性溶液的浓度优选为1mol/L。
(2)所述B溶液为钛酸四丁酯与第II有机溶剂的混合液；优选B溶液中钛酸四丁酯与第II有机溶剂的体积比为(0.01-0.5)∶1。
所述第II有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；所述醛类包括但不限于甲醛、乙醛，所述醇类包括但不限于甲醇、乙醇，所述酮类包括但不限于丙酮。
(3)以A溶液体积计的Fe3O4磁性纳米粒子的用量为0.5-2.0g/L。
(4)A溶液与B溶液的体积比为1∶(0.1-1)。
在上述步骤J中：
(1)所述C溶液为去离子水、第III有机溶液与第III碱性溶液形成的混合液；优选地，C溶液中第III有机溶剂与第III碱性溶液的体积比为1∶(0.01-0.5)，C溶液中去离子水与第III碱性溶液的体积比为1∶(0.01-0.5)。
所述第III碱性溶液的浓度优选为1mol/L。
所述第III有机溶剂包括醛类、醇类以及酮类的一种或多种；所述醛类包括但不限于甲醛、乙醛，所述醇类包括但不限于甲醇、乙醇，所述酮类包括但不限于丙酮。
所述第III碱性溶液为氨水、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钠的水溶液和氢氧化钙的水溶液中的一种或多种的水溶液。
(2)以C溶液的体积计核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的用量为(0.2-2)mg/mL，其中核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的用量以干重计。
(3)所述氧化石墨烯分散液为氧化石墨烯分散于去离子水中形成的分散液，所述氧化石墨烯分散液的浓度为0.1-1mg/mL。
(4)C溶液与氧化石墨烯分散液的体积比为1∶(0.1-1)。
本发明第三方面所涉及的一种固定化碳酸酐酶，其由碳酸酐酶负载于本发明第一方面所述的固定化酶载体材料或如本发明第二方面所述的方法制备的固定化酶载体材料构成，所述固定化碳酸酐酶中碳酸酐酶的含量为40-200mg/g。
本发明中，所述碳酸酐酶为I型、II型和III型碳酸酐酶。
本发明第四方面所涉及的一种如本发明第三方面所述的固定化碳酸酐酶的制备方法，其包括将固定化酶载体材料与D溶液均匀混合后，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，置于摇床上，在摇床转速为120-200r/min和15-35℃条件下进行固载结合1-4h，所获得的产物经磁性分离、洗涤制得固定化碳酸酐酶；其中，所述固定化酶载体材料为本发明第一方面所述的固定化酶载体材料或如本发明第二方面所述的方法制备的固定化酶载体材料。
上述碳酸酐酶固定化方法中：
(1)所述D溶液为去离子水、含锌溶液与磷酸缓冲液混合形成的含锌缓冲液；优选地，所述含锌溶液是锌盐的水溶液，所述锌盐包括硫酸锌、盐酸锌和硝酸锌中的一种或多种；进一步优选地，所述D溶液中含锌溶液与磷酸缓冲液的体积比为(0.01-2)∶1，优选为(0.1-1)∶1；D溶液中去离子水与磷酸缓冲液的体积比为1∶(0.1-2)；。
(2)所述含锌溶液的浓度为(1-100)mmol/L，优选为(5-20)mmol/L。
(3)所述磷酸缓冲液的pH区间为6-9。
(4)以D溶液体积计载体材料的用量为(0.5-5.0)g/L。
(5)碳酸酐酶溶液的浓度为(0.1-2)g/L。
(6)D溶液与碳酸酐酶的体积比为1∶(0.01-0.2)。
本发明人研究发现，在碳酸酐酶固载过程加入微量含锌溶液，能够很好地维护了固载后碳酸酐酶的构型，保持了酶的活力和稳定性。
本发明中，采用透射电子显微镜(JEM-1400，日本电子)观察核壳结构的Fe3O4-TiO2磁性纳米球、纳米花状磁性纳米球以及固定化酶载体材料的微观结构。
本发明中，采用扫描电子显微镜(JEM-6510，日本电子)观察核壳结构的Fe3O4-TiO2磁性纳米球、纳米花状磁性纳米球以及固定化酶载体材料的表面形态。
本发明中，酶活力的测定采用以橄榄油为底物的滴定法，酶活力的定义为：每分钟释放出1μmol的脂肪酸的酶量，为一个脂肪酶活力单位。参照中华人民共和国国家标准GB/T23535-2009。
本发明中，比表面积采用BET比表面积测试法，通过全自动比表面积和孔径分析仪(Autosorb-IQ-MP，美国Lakeshore公司)进行测量。
III.实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
实施例1：制备固定化酶载体材料
1)制备磁性纳米球颗粒：取39.6mL无水乙醇，加入0.4mL，1mol/L的NaOH，制成A液。取钛酸四丁酯0.8mL溶入到19.2mL无水乙醇中，制成B液。取40mgFe3O4，与A液均匀混合，注加B液(A液与B液体积比为40∶20，即1∶0.5)后，以500r/min的搅拌速度恒温45℃反应24h，制得核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球。
2)制备固定化酶载体材料：取27.4mL去离子水，加入20mL无水乙醇溶液和0.6mL，浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，制成C液。将60mg磁性纳米球颗粒超声溶于C液后，加入12mL，浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯分散液。混合液机械搅拌30分钟，转速为300r/min。然后将混合液转移到水热反应釜中，水热条件为140℃，时间为5小时。制备得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上形成的固定化酶载体材料。
将制备的固定化酶载体材料(纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料)采用透射电镜和扫描电镜检测，透射电镜照片如图1所示，扫描电镜照片如图2所示。
利用扫描电镜和透射电镜结果可以得出，制得的核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的平均粒径为500nm，核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的TiO2层厚度在120nm，TiO2层外表面呈花瓣片层结构，聚集球体直径在3000nm，单-双层石墨烯半包裹着整个聚集球体。
采用BET比表面积测试法，通过全自动比表面积和孔径分析仪(Autosorb-IQ-MP，美国Lakeshore公司)测得固定化酶载体材料的比表面积为283.78m2·g-1。
实施例2：制备固定化酶载体材料
1)制备磁性纳米球颗粒：取36mL无水乙醇中，加入4mL，1mol/L的NaOH，制成A液。取钛酸四丁酯0.8mL溶入到39.2mL无水乙醇中，制成B液。取30mgFe3O4，与A液均匀混合，注加B液(A液与B液体积比为40∶40，即1∶1)后，以500r/min的搅拌速度恒温60℃反应36h，制得核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球。
2)制备固定化酶载体材料：取22mL去离子水中，加入20mL无水乙醇溶液和8mL，浓度为1mol/L的氨水溶液，制成C液。将20mg磁性纳米球颗粒超声溶于C液，加入40mL，浓度为0.1mg/mL的氧化石墨烯分散液。混合液机械搅拌30分钟，转速为300r/min。然后将混合液转移到水热反应釜中，水热条件为180℃，时间为2小时。制备得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上形成的固定化酶载体材料。
采用与实施例1相同的方法对固定化酶载体材料进行检测，测得固定化酶载体材料的比表面积为309.72m2·g-1；利用扫描电镜和透射电镜结果可以得出，制得的核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的平均粒径为700nm，核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的TiO2层厚度在160nm，TiO2层外表面呈花瓣片层结构，聚集球体直径在6000nm，单-双层石墨烯半包裹着整个聚集球体。
实施例3：制备固定化酶载体材料
1)制备磁性纳米球颗粒：取39.6mL无水乙醇中，再加入0.4mL，1mol/L的NaOH，制成A液。取钛酸四丁酯2mL溶入到8mL无水乙醇中，制成B液。取60mgFe3O4，与A液均匀混合，注加B液(A液与B液体积比为40∶10，即1∶0.25)后，以500r/min的搅拌速度恒温37℃反应48h，制得核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球。
2)制备固定化酶载体材料：取8mL去离子水中，加入10mL无水乙醇溶液和2mL，浓度为1mol/L的氨水溶液制成C液。将40mg磁性纳米球颗粒超声溶于C液，加入20mL，浓度为0.2mg/mL的氧化石墨烯分散液。混合液机械搅拌30分钟，转速为300r/min。然后将混合液转移到水热反应釜中，水热条件为120℃，时间为6小时。制备得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上形成的固定化酶载体材料。
采用与实施例1相同的方法对固定化酶载体材料进行检测，测得固定化酶载体材料的比表面积为267.84m2·g-1；利用扫描电镜和透射电镜结果可以得出，制得的核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的平均粒径为500nm，核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的TiO2层厚度在120nm，TiO2层外表面呈花瓣片层结构，聚集球体直径在3000nm，单-双层石墨烯半包裹着整个聚集球体。
实施例4：制备固定化碳酸酐酶
取实施例1中制备得到的纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料2mg置于离心管中，加入由1.7mL去离子水、0.1mL，10mmol/L的硫酸锌溶液和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝8)制成的D液，再加入0.2mL，0.5g/L的碳酸酐酶。将离心管转移到全温震荡培养箱，转速为130r/min，温度为25℃，震荡一个小时后，磁铁分离并清洗磁性材料，得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过脂酶法测定催化活力，结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为94.4％，每克固定化碳酸酐酶的载酶量为48.6mg。
实施例5：制备固定化碳酸酐酶
取实施例2中制备得到的纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料2mg置于离心管中，加入由0.9mL去离子水、1mL，50mmol/L的硫酸锌溶液和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝8)制成的D液，再加入0.1mL，2g/L的碳酸酐酶。将离心管转移到全温震荡培养箱，转速为130r/min，温度为25℃，震荡一个小时后，磁铁分离并清洗磁性材料，得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过脂酶法测定催化活力，结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为80.4％，每克固定化碳酸酐酶的载酶量为91.2mg。
实施例6：制备固定化碳酸酐酶
取实施例3中制备得到的纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料4mg置于离心管中，加入由2.7mL去离子水、1mL，100mmol/L的硫酸锌溶液和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝8)制成的D液，再加入0.4mL，2g/L的碳酸酐酶。将离心管转移到全温震荡培养箱，转速为130r/min，温度为25℃，震荡一个小时后，磁铁分离并清洗磁性材料，得到纳米花状磁性纳米球负载于片层石墨烯上材料固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过脂酶法测定催化活力，结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为69.7％，每克固定化碳酸酐酶的载酶量为185.4mg。
实施例7：
将实施例4中制备的固定化碳酸酐酶同同量的游离酶分别25℃和4℃下保存，在第2天、第5天、第7天、第10天、第12天、第15天测定相应温度下固定化酶和游离酶的酶活。
结果如图3，当贮藏温度为4℃时，实施例1所制备的固定化碳酸酐酶的固定化酶和游离酶在15天里酶活基本一致；当贮藏温度在25℃时，实施例1所制备的固定化碳酸酐酶在第15天酶活为81.1％，而游离酶在第15天酶活为54.1％。可以得到，固定化酶显著提高了碳酸酐酶的贮藏稳定性。
实施例8：
将实施例4中制备的固定化碳酸酐酶进行批次使用重复性测试。固定化碳酸酐酶通过脂酶法对酶活测定后，磁性分离并清洗磁性材料，再次进行酶活测定。
固定化碳酸酐酶重复利用结果如图4，可见固定化酶在重复6次仍有82％的酶活保留。在工业化使用中可以显著降低生物酶使用成本。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (7)

1.一种固定化酶载体材料的制备方法，其包括：
步骤I，将Fe3O4磁性纳米粒子与A溶液均匀混合后，注加B溶液进行反应，所获得的产物经磁性分离、洗涤制备得到核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球；
步骤J，将核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球均匀分散在C溶液中，加入片层氧化石墨烯分散液进行反应，产物经磁性分离，洗涤制得固定化酶载体材料；
其中，所述A溶液为第Ⅰ有机溶剂与第Ⅰ碱性溶液形成的混合液；
所述B溶液为钛酸四丁酯与第Ⅱ有机溶剂的混合液；
所述C溶液为去离子水、第Ⅲ有机溶液与第Ⅲ碱性溶液形成的混合液；
所述第Ⅰ有机溶剂为无水乙醇；所述第Ⅰ碱性溶液为氢氧化钠的水溶液；
所述第Ⅱ有机溶剂为无水乙醇；
所述第Ⅲ有机溶剂为无水乙醇；所述第Ⅲ碱性溶液为氨水或氢氧化钠的水溶液；
在步骤I中，所述反应的温度为30-60 ℃，反应的时间为12-48h；
所述A溶液中第Ⅰ碱性溶液与第Ⅰ有机溶剂的体积比为（0.01-0.11）:1；所述B溶液中钛酸四丁酯与第Ⅱ有机溶剂的体积比为（0.01-0.5）:1；以A溶液体积计的Fe3O4磁性纳米粒子的用量为0.5-2.0 g/L；A溶液与B溶液的体积比为1:（0.1-1）；
在步骤J中，所述反应的温度为100-200℃，所述反应的时间为2-6h；
所述C溶液中第Ⅲ有机溶剂与第Ⅲ碱性溶液的体积比为1:（0.01-0.5）；所述C溶液中去离子水与第Ⅲ碱性溶液的体积比为1:（0.01-0.5）；以C溶液的体积计核壳结构的Fe3O4@TiO2磁性纳米球的用量为（0.2-2）mg/mL；氧化石墨烯分散液浓度为0.1-1mg/mL；C溶液与氧化石墨烯分散液的体积比为1:（0.1-1）。
2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的固定化酶载体材料，其由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成；所述纳米花状磁性纳米球包括Fe3O4磁性纳米粒子核、包覆于Fe3O4磁性纳米粒子核外的TiO2层；所述TiO2层外表面为花瓣状片层结构或近花瓣片层结构；所述TiO2层厚度在60-160nm；所述片层石墨烯以包裹或半包裹纳米花状磁性纳米球的方式负载纳米花状磁性纳米球，且所述纳米花状磁性纳米球呈聚集状，形成聚集状球体；
纳米花状磁性纳米球的直径为300-800nm；所述聚集状球体的直径在1000-6000nm；所述片层石墨烯的片层数在1-5层；
所述固定化酶载体材料的比表面积为200-400m2·g-1。
3.一种固定化碳酸酐酶，其由碳酸酐酶负载于权利要求1所述的制备方法制得的固定化酶载体材料或如权利要求2所述的固定化酶载体材料构成。
4.根据权利要求3所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于，所述固定化碳酸酐酶中碳酸酐酶的含量为40-200mg/g。
5.根据权利要求4所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于，所述碳酸酐酶为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型碳酸酐酶。
6.一种如权利要求3-5中任意一项所述的固定化碳酸酐酶的制备方法，其包括将权利要求1所述的制备方法制得的固定化酶载体材料或如权利要求2所述的固定化酶载体材料与D溶液均匀混合后，加入待固定化的碳酸酐酶溶液进行固载结合，所获得的产物经磁性分离、洗涤制得固定化碳酸酐酶；其中，所述D溶液为去离子水、含锌溶液与磷酸缓冲液形成的含锌缓冲液；
所述含锌溶液是锌盐的水溶液，所述锌盐包括硫酸锌、盐酸锌和硝酸锌中的一种或多种；
所述D溶液中含锌溶液与磷酸缓冲液的体积比为（0.01-2）:1；D溶液中去离子水与磷酸缓冲液的体积比为1:（0.1-2）；含锌溶液的浓度为（1-100）mmol/L；所述磷酸缓冲液的pH区间为6-9；
所述固载结合的温度为15-35℃，所述固载结合的时间为1-4h，所述固载结合的摇床转速为120-200r/min；
以D溶液体积计的载体材料用量为（0.5-5.0）g/L；碳酸酐酶溶液的浓度为（0.1-2）g/L；D溶液与碳酸酐酶的体积比为1:（0.01-0.2）。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述D溶液中含锌溶液与磷酸缓冲液的体积比为（0.1-1）:1。
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