CN101671664A - 一种固定化氨基酰化酶的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了种固定化氨基酰化酶的制备方法，其包含下列步骤：在水中，60－90℃下将固定化材料(卡拉胶和明胶)溶解，降温至40－60℃，再加入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20－35℃的有机溶剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCl水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl水溶液中还含有戊二醛。本发明还公开了由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。本发明的制备方法可有效降低固定化材料的凝固点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，流动性好，可以高效方便的拆分光学活性氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酶的制备方法及其产品和应用，具体的涉及一种固定化氨基酰化酶的制备方法、由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。
背景技术
氨基酰化酶主要用于拆分酰化-DL-氨基酸为L-型和D-型光学活性氨基酸。在生产光学活性氨基酸中可以使用自由酶，但是稳定性差，而且自由酶只能采用批式反应器，反应后酶不能回收，使产品的分离纯化困难，容易造成蛋白质污染，所以对生产非天然氨基酸来说自由酶还不是一种理想的催化剂。为了克服自由酶的各种缺点，人们大量研究固定化氨基酰化酶的工艺以及应用技术，1969年，Chibata等以DEAE-Sephadex为载体将米曲霉氨基酰化酶固定化，但是该固定化材料昂贵，只能够用于固定化床反应，工业操作并不方便。
卡拉胶是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物，作为固定化材料具有稳定性好、成本低的优点，是用量最为广泛的固定化材料。但是它有两个比较大的缺点：一是它的凝固点太高，众所周知工业生产上固定化操作均在凝固点附近进行，这不仅给固定化成形带来困难，而且严重影响被包埋细胞及酶的活性；二是固定化后的胶一般是大的块状，需要手工或者机械切片，而片状催化剂装卸入反应器不方面，片状流动性差，在反应器内容易流体短路等，而切片也增加了工序以及造成催化剂的流失。
为了降低卡拉胶的凝固点，国内外进行了大量的卡拉胶复配固定化研究，如欧阳平凯等用卡拉胶混合凝胶固定化延胡索酸酶生产L-苹果酸，无锡轻工大学陈坚等PVA-卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌-酵母菌混合体系生产谷胱甘肽等。
球状(颗粒状)催化剂具有广泛的优点，能否把卡拉胶固定化酶由一般的片状改为球状？如果能够成为球状，就具有了良好的流动性，可以方便用于流化床与反应釜中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的固定氨基酰化酶的材料中价格昂贵，只能够用于固定化床反应，工业操作并不方便，以及凝固点太高不易固定化成形且影响酶活性，固定化后的胶多是大的块状或片状，流动性差等缺陷，而提供了一种固定化氨基酰化酶的制备方法、由其制得的固定化氨基酰化酶及其应用。本发明的制备方法可有效降低固定化材料的凝固点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，流动性好，可以高效方便的拆分光学活性氨基酸。
发明人发现，明胶凝固点较低，同时也是固定化材料，在卡拉胶中混合一定比例的明胶，可以有效降低固定化材料的凝固点；发明人还发现，基于反相悬浮技术，以有机溶剂为固定化溶剂，将熔融的固定化材料滴入有机溶剂中，可以制备出颗粒状的固定化酶。
发明人将以上两点结合使用，制备出凝固点低而且是颗粒状的固定化酶，并将这样的酶成功地应用于流化床与反应釜中，高效方便地拆分生产了光学活性氨基酸。
本发明涉及一种固定化氨基酰化酶的制备方法，其包含下列步骤：在水中，60-90℃下将固定化材料(卡拉胶和明胶)溶解，降温至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20-35℃的有机溶剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCl水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl水溶液中还含有戊二醛。
其中，所述的卡拉胶和明胶的重量比较佳的为80-95∶20-5，优选88-92∶12-8；所述的固定化材料(即卡拉胶和明胶)与水的重量比较佳的为1-8∶99-92；所述的氨基酰化酶与固定化材料的重量比较佳的为1-15∶99-85；所述的有机溶剂较佳的为煤油、汽油、植物油、石油醚、苯和甲苯中的一种或多种，更佳的为煤油、汽油和植物油中的一种或多种；所述的固化时间较佳的为2小时；所述的KCl水溶液中KCl的浓度较佳的为0.1N，其中戊二醛的浓度较佳的为0.5％(重量百分比)。
本发明中，上述制备方法制得的固定化氨基酰化酶的外观呈现为颗粒状。
本发明进一步涉及由上述制备方法制得的固定化氨基酰化酶。
本发明还涉及上述固定化氨基酰化酶在催化合成光学活性的氨基酸中的应用，其包含下列步骤：在固定化氨基酰化酶的催化下，乙酰化氨基酸被拆分为光学活性的氨基酸。
其中，所述的应用较佳的包含下列步骤：
(1)水中，温度25-50℃，pH保持为7.5-7.8，DL-乙酰化氨基酸在碱的作用下以及固定化氨基酰化酶的催化下反应；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，过滤出固定化氨基酰化酶颗粒，将滤液浓缩结晶即可制得光学活性的L-氨基酸，母液中的D-乙酰化氨基酸通过水解反应即可制得D-氨基酸。
上述应用包含的最佳步骤如下：
在反应器中加入DL-乙酰化氨基酸水溶液，调节pH至7.5-7.8，加入上述颗粒状固定化氨基酰化酶，用碱液维持pH，保持温度25-50℃，反应至pH不再变化后DL-乙酰化氨基酸被催化为L-氨基酸，然后过滤出固定化酶颗粒，将滤液浓缩结晶，即得到光学活性的L-氨基酸；母液中未转化的D-乙酰化氨基酸通过水解反应即可制得D-氨基酸，其中，反应器指流化床与反应釜。
其中，过滤出的固定化酶颗粒还可以循环套用于下一批反应。
除特殊说明外，本发明涉及的原料和试剂均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的制备方法可有效降低固定化材料的凝固点，并且制得的固定化氨基酰化酶是颗粒状，机械强度高、回收率很高、流动性好，可以高效方便的拆分光学活性氨基酸，并且可以循环使用，便于生产操作。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1
以卡拉胶∶明胶2克，配比为9∶1比例，加入100ml水，加热溶解，降到50℃，与氨基酰化酶0.1克混合均匀，流加到室温状态(25℃)的煤油烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例2
以卡拉胶∶明胶2克，配比为4∶1比例，加入100ml水，60℃溶解，降到40℃，与氨基酰化酶0.02克混合均匀，流加到室温状态(25℃)的汽油烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例3
以卡拉胶∶明胶2克，配比为19∶1比例，加入198ml(198g)水，75℃溶解，降到50℃，与氨基酰化酶0.3克混合均匀，流加到室温状态(25℃)的煤油烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例4
以卡拉胶∶明胶2克，配比为11∶1比例，加入100ml水，90℃溶解，降到50℃，与氨基酰化酶0.02克混合均匀，流加到室温状态(35℃)的植物油烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例5
以卡拉胶∶明胶2克，配比为8∶1比例，加入100ml水，70℃溶解，降到50℃，与氨基酰化酶0.02克混合均匀，流加到室温状态(20℃)的石油醚烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例6
以卡拉胶∶明胶2克，配比为9∶1比例，加入100ml水，80℃溶解，降到60℃，与氨基酰化酶0.1克混合均匀，流加到室温状态(20℃)的苯烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
实施例7
以卡拉胶∶明胶2克，配比为9∶1比例，加入100ml水，80℃溶解，降到50℃，与氨基酰化酶0.1克混合均匀，流加到室温状态(25℃)的甲苯烧瓶中，150rpm转速下速，搅拌30分钟，然后过滤，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为固定化酶颗粒。
效果实施例
对照试验：为以卡拉胶2克，加入100ml水，加热溶解，降到60℃，与氨基酰化酶0.1克混合均匀，倒入培养皿中，固化1小时，然后切片成为2*3*2mm块状，蒸馏水洗涤一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛浓度0.5％，固化2小时，制备为片状固定化酶。测定初始酶活力。
取实施例1制得的固定化酶颗粒及上述制备的固定化颗粒各20克，加入100ml 0.1M的N-乙酰-DL-苯丙氨酸底物，转化反应。反应1小时后，滤出固定化颗粒，重新加入100ml 0.1M的N-乙酰-DL-苯丙氨酸底物，重复转化反应。共计转化30批次。测定30批后酶活力，计算酶活力保留率。结果见表1。
表1
| 载体名称 | 载体浓度g.L-1 | 载体包埋酶量g.L-1 | 起始酶活力u/g.h-1 | 30批次后酶活力u/g.h-1 | 酶活力保留率％ |
| 卡拉胶固定化酶(片状) | 20 | 10 | 350 | 191 | 50.3 |
| 卡拉胶-明胶固定化酶(颗粒) | 20 | 10 | 382 | 236 | 61.8 |
从表1可以看出，在同样固定化材料比例的情况下颗粒状酶的起始酶活力大于片状固定化酶，这是因为低温片状固定化酶使用了明胶与卡拉胶作为混合材料有效降低了凝固点和制备温度，因而酶损失较少的原因。颗粒固定化酶连续转化30批后颗粒状酶酶活力保留率优于片状酶，这可能是片状因为切片以及搅拌缘故，有较多酶流失到了反应液中。
应用实施例1
在250L反应釜中加入100L反应底物(0.2M N-乙酰-DL-苯丙氨酸，PH7.8)，控制37℃，pH7.8，加入活力为400U/gh-1的固定化颗粒酶20KG，反应6小时，离心机过滤回收催化剂，称重。每隔1小时测定L-PHE-OH含量。测定反应液中L-PHE-OH转化率。反应罐规格为标准250L搪瓷反应釜，搅拌为桨式搅拌，转速为83rpm.结果表明反应2小时，转化率达到88。1％，反应6小时后转化率达到100％。
应用实施例2
实验条件：在100L固定化酶反应器中加入100L反应底物(0.2M N-乙酰-DL-苯丙氨酸，pH7.8)，控制37℃，PH7.8，加入活力为400U/gh-1的固定化颗粒酶20KG，当反应达到99％时候停止反应，过滤出催化剂，继续加同样物料反应，同时测定固定化酶活力。重复反应。结果见表2。
表2
| 批次 | 反应时间 | 转化率 | 酶活力 |
| 1 | 4 | 99.7 | 385 |
| 2 | 4 | 99.7 | 378 |
| 3 | 4 | 99.6 | 370 |
| 4 | 4 | 99.5 | 365 |
| 5 | 4 | 99.4 | 360 |
| 6 | 4 | 99.3 | 356 |
| 7 | 4 | 99.3 | 350 |
| 8 | 4 | 99.2 | 346 |
| 9 | 4 | 99.0 | 340 |
| 10 | 5 | 99.3 | 332 |
| 11 | 5 | 99.2 | 326 |
| 12 | 5 | 99.1 | 320 |
| 13 | 5 | 99.0 | 312 |
| 14 | 6 | 99.5 | 313 |
| 15 | 6 | 99.4 | 305 |
| 16 | 6 | 99.3 | 295 |
| 17 | 6 | 99.2 | 287 |
| 18 | 6 | 99.1 | 280 |
| 19 | 7 | 99.3 | 275 |
| 20 | 7 | 99.2 | 269 |
| 21 | 7 | 99.2 | 262 |
| 22 | 7 | 99.1 | 256 |
| 23 | 8 | 99.3 | 249 |
| 24 | 8 | 99.3 | 242 |
| 25 | 8 | 99.2 | 237 |
| 26 | 8 | 99.2 | 231 |
| 27 | 8 | 99.1 | 224 |
| 28 | 8 | 99.0 | 215 |
| 29 | 9 | 99.2 | 209 |
| 30 | 9 | 99.2 | 202 |
| 31 | 9 | 99.1 | 195 |
| 32 | 9 | 99.1 | 188 |
| 33 | 9 | 99.0 | 180 |
| 34 | 10 | 99.2 | 172 |
从以上反应可以看出，固定化酶具有良好的稳定性，同时本专用反应器内体现了良好的转化率。在酶套用30批次后酶依然保存了50％的酶活力。
Claims (10)
1、一种固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于包含下列步骤：在水中，60-90℃下将固定化材料溶解，降温至40-60℃，再加入氨基酰化酶，混合均匀，然后将此混合液流加到温度为20-35℃的有机溶剂中，搅拌，过滤得颗粒，将所得颗粒加入到KCl溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl溶液中还含有戊二醛，所述的固定化材料为卡拉胶和明胶。
2、如权利要求1所述的固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的卡拉胶和明胶的重量比为80-95∶20-5；所述的固定化材料与水的重量比为1-8∶99-92；所述的氨基酰化酶与固定化材料的重量比为1-15∶99-85。
3、如权利要求2所述的固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的卡拉胶和明胶的比例为88-92∶12-8。
4、如权利要求1所述的固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的固化的时间为2小时；所述的有机溶剂为煤油、汽油、植物油、石油醚、苯和甲苯中的一种或多种。
5、如权利要求4所述的固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为煤油、汽油和植物油中的一种或多种。
6、如权利要求1所述的固定化氨基酰化酶的制备方法，其特征在于：所述的KCl溶液中KCl的浓度为0.1N，其中戊二醛的浓度为0.5％。
7、一种由权利要求1所述的制备方法制得的固定化氨基酰化酶。
8、如权利要求7所述的固定化氨基酰化酶在催化合成光学活性的氨基酸中的应用，其包含下列步骤：在固定化氨基酰化酶的催化下，乙酰化氨基酸被拆分为光学活性的氨基酸。
9、如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的应用包含下列步骤：
(1)水中，温度25-50℃，pH保持为7.5-7.8，DL-乙酰化氨基酸在碱的作用下以及固定化氨基酰化酶的催化下反应；
(2)将步骤(1)得到的反应液过滤，将滤液浓缩结晶即可制得光学活性的L-氨基酸，母液中的D-乙酰化氨基酸通过水解反应即可制得D-氨基酸。
10、如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的应用包含下列步骤：在反应器中加入DL-乙酰化氨基酸水溶液，调节pH至7.5-7.8，加入颗粒状固定化氨基酰化酶，用碱液维持pH，保持温度25-50℃，反应至pH不再变化后DL-乙酰化氨基酸即被催化为L-氨基酸，然后过滤出固定化酶颗粒，将滤液浓缩结晶，即得到光学活性的L-氨基酸；母液中未转化的D-乙酰化氨基酸通过水解反应即可制得D-氨基酸，其中，反应器指流化床与反应釜。
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