CN108642037A - 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108642037A
CN108642037A CN201810479368.9A CN201810479368A CN108642037A CN 108642037 A CN108642037 A CN 108642037A CN 201810479368 A CN201810479368 A CN 201810479368A CN 108642037 A CN108642037 A CN 108642037A
Authority
CN
China
Prior art keywords
neuraminidase
microreactor
solution
preparation
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810479368.9A
Other languages
English (en)
Inventor
江正瑾
赵瑜梅
王启钦
张婷婷
王侣欢
黄洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
University of Jinan
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN201810479368.9A priority Critical patent/CN108642037A/zh
Publication of CN108642037A publication Critical patent/CN108642037A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于药物筛选技术领域，公开了一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用。将氨基磁珠分散液经固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球，然后与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米微球，再与溶解有神经氨酸酶的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃去上清液，得到神经氨酸酶微反应器。本发明的神经氨酸酶微反应器可应用于天然产物中抗流感活性成分的一步筛选。具有操作简便、自动化程度高的优点，而且能够有效克服传统方法“漏捡”的弊病。

Description

一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用。
背景技术
流感是由流感病毒引起的急性呼吸系统疾病。流感不仅发病率高，传播速度快，波及面广，同时也是致死率较高的传染性疾病[G.Neumann,T.Noda,Y.Kawaoka,Emergenceand pandemic potential of swine-origin H1N1influenza virus,Nature 459(2009)931-939.；R.J.Russell,L.F.Haire,D.J.Stevens,P.J.Collins,Y.P.Lin,G.M.Blackburn,A.J.Hay,S.J.Gamblin,J.J.Skehel,The structure of H5N1 avian influenzaneuraminidase suggests new opportunities for drug design,Nature 443(2006)45-49]。据世界卫生组织统计，平均二十到三十年就会爆发全球性的流感大流行。此外每年频发的季节性流感也时刻侵袭着人类，对人类的生命健康构成巨大威胁的同时，也造成了巨大的经济损失，严重危害公共卫生安全。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)又称唾液酸酶，编号E.C 3.2.1.18，位于流感病毒的包膜表面。作为影响病毒生命周期的重要糖蛋白，神经氨酸酶在流感作用过程中发挥着至关重要的作用，包括：(1)水解子代病毒的血凝素与宿主细胞膜表面的糖蛋白受体之间的α-糖苷键，帮助子代病毒从宿主细胞释放，同时可以有效防止新生后代病毒自身的聚集。(2)当流感病毒进入呼吸道后，神经氨酸酶帮助水解呼吸道中的唾液酸，使得呼吸道黏膜表面的粘液下降，从而有助于病毒的转染和穿透[A.Moscona,Neuraminidase inhibitors for influenza,N.Engl.J.Med.353(2005)1363-1373.；L.V.Gubareva,L.Kaiser,F.G.Hayden,Influenza virus neuraminidase inhibitors,Lancet 355(2000)827-835]。面对当前潜在的流感大爆发威胁，抗流感药物的研发已然成为了药物研发中重要的一环。神经氨酸酶作为已经被证实的抗流感作用靶点，寻找更多的新型神经氨酸酶抑制活性成分，在解决当前药物局限性的同时可有效对抗新型耐药菌株不断出现的威胁，其意义不言而喻[U.Grienke,M.Schmidtke,S.von Grafenstein,J.Kirchmair,K.R.Liedl,J.M.Rollinger,Influenza neuraminidase:A druggabletarget for natural products,Nat.Prod.Rep.29(2012)11-36]。
当前应用于筛选抗神经氨酸酶抑制活性成分的方法主要集中于传统的荧光法、化学发光法以及计算机模拟筛选[U.Grienke,M.Schmidtke,S.von Grafenstein,J.Kirchmair,K.R.Liedl,J.M.Rollinger,Influenza neuraminidase:A druggabletarget for natural products,Nat.Prod.Rep.29(2012)11-36]。这些基于分子水平的筛选方法通常以游离酶为测试对象，由于无法回收再利用，“一次性”实验造成了极大的浪费。而传统筛选方法最大的局限性在于只能针对单一化合物进行筛选，对于如中药，天然产物等复杂体系中活性化合物的筛选束手无策。众所周知，天然产物作为药物及其先导化合物开发的最重要的资源宝库贡献了近80％的抗病毒化学实体。然而目前的筛选方法，必须先从天然产物中拿到一定数量的化合物分子，才能够进一步测试其神经氨酸酶抑制活性。
从天然产物到单一化合物的提取分离过程往往十分漫长；不同化学试剂长时间的交叉作用也会对多肽类及一些敏感化合物造成影响；大批量试剂的使用和处理不仅违背了绿色环保的理念亦增加了实验成本。此外这种从复杂体系拿到化合物再进行活性筛选的方法本身也具有盲目性，耗费大量的时间和金钱在提取分离阶段，最后可能50％甚至更高比例的化合物毫无抑制活性。而对于具有良好活性但微量的成分，也很难通过传统的提取分离手段获得，容易造成活性成分的“漏捡”[R.Moaddel,Comparison ofanalytical techniques for the identification of bioactive compounds fromnatural products,Nat.Prod.Rep.33(2016)1131-1145.；A.Harvey,Strategies fordiscovering drugs from previously unexplored natural products,DrugDiscov.Today 5(2000)294-300]。因此，迫切需要开发一种新的筛选方法，使之从天然产物等复杂体系中快速筛选神经氨酸酶活性抑制成分的同时，让筛选更具针对性，且尽可能避免“漏捡”。
亲和垂钓法是运用固定化酶技术，在亲和色谱理论的指导下，建立起来的复杂体系筛选策略[R.J.Zhuo,H.Liu,N.N.Liu,Y.Wang,Molecules,2016,21(11):1516]。简言之就是基于药物靶点与活性配体之间的相互作用，将活性配体从复杂的样品体系中“挑选”出来，一般由靶标固定化，亲和垂钓，配体洗脱，HPLC-MS分析四个部分组成。固定化酶技术作为亲和垂钓法实施的核心，是实现复杂体系中目标活性配体的快速挑选的关键。可以预见结合有效的技术手段，采用恰当的筛选策略，开发新型的抗流感病毒筛选方法对药物研究者来说不仅是重要的，而且是必要的。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种神经氨酸酶微反应器的制备方法。本发明方法通过复合磁性纳米微球经“零交联剂”戊二醛活化后，其材料表面的活化醛基与神经氨酸酶氨基端经共价交联反应，实现神经氨酸酶的固定化，制备获得神经氨酸酶微反应器。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的神经氨酸酶微反应器。
本发明的再一目的在于提供上述神经氨酸酶微反应器在抗流感药物筛选中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将氨基磁珠分散液经固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球；
(2)将步骤(1)所得磁性纳米微球与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米微球；
(3)将步骤(2)所得活化磁性纳米微球与溶解有神经氨酸酶的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃去上清液，得到神经氨酸酶微反应器。
优选地，所述氨基磁珠分散液的水化平均粒径为5μm，浓度为50mg/mL。氨基磁珠分散液为可商业购买的原料，氨基磁珠由Fe3O4磁核和聚合物壳层构成。
优选地，步骤(2)中所述磁性纳米微球在进行活化反应前先使用吡啶溶液清洗。
优选地，步骤(2)中所述戊二醛溶液是指用1mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的浓度为5％(v/v)。
优选地，步骤(2)中所述活化反应的温度为4℃，反应时间为1～4h。
优选地，步骤(3)中所述活化磁性纳米微球与神经氨酸酶的质量比为1:(5～15)。
优选地，步骤(3)中进一步在溶解有神经氨酸酶的吡啶溶液中加入还原剂，进行还原态固定化反应；所述还原剂优选为氰基硼氢化钠。
优选地，步骤(3)中所述固定化反应的温度为4℃，反应时间5～18h。
优选地，步骤(3)中所述神经氨酸酶微反应器进一步使用Tris-HCl缓冲液清洗，对固定化反应后的剩余活性醛基进行封端处理。
一种神经氨酸酶微反应器，通过上述方法制备得到。
上述神经氨酸酶微反应器在抗流感药物筛选中的应用。
优选地，所述应用步骤如下：将神经氨酸酶微反应器与待筛选的溶液体系混合反应，固液分离，先用乙酸铵缓冲溶液洗脱与神经氨酸酶微反应器结合的非特异性吸附组分，然后用乙酸铵缓冲液与甲醇的混合溶液或纯甲醇溶液洗脱与神经氨酸酶微反应器结合的特异性吸附组分，得到抗流感药物成分。
优选地，所述待筛选的溶液体系是指以含DMSO(二甲基亚砜)的乙酸铵缓冲溶液溶解的天然产物溶液体系。
优选地，所述混合反应的温度为37℃，反应时间为0.5～4h。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)新型筛选工具。传统以神经氨酸酶为靶标的抗流感药物筛选常采用游离酶与单一化合物一一受试的方式。而本发明基于复合磁性纳米微球构建的神经氨酸酶微反应器，不仅能够克服游离酶“一次”使用率造成的浪费，同时也把筛选范围从单一化合物扩大到了天然产物等复杂体系中。
(2)新型的筛选方法。传统的天然产物的筛选，多以活性追踪分离为主，需不断提取分离获得目标化合物。而本发明在亲和筛选策略的指导下，基于神经氨酸酶微反应器，构建了复杂体系抗流感成分筛选方法，实现了天然产物中抗流感活性成分的一步筛选。该方法不仅操作简便、自动化程度高，而且能够有效克服传统方法“漏捡”的弊病。
(3)扩展能力强、推广价值大。本发明的创新性尝试不仅为筛选以神经氨酸酶为靶标的新型的抗流感药物提供了更多的选择，同时也为构建新型的抗流感药物筛选策略提供了新的思路。
附图说明
图1为实施例2中FITC标记的神经氨酸酶微反应器的荧光表征图。
图2为实施例2中获得的神经氨酸酶微反应器经酶动力学系统评估结果；(A)米氏常数测试拟合双倒数曲线图，(B)奥司他韦量效关系曲线图。
图3为由实施例2中获得的神经氨酸酶微反应器筛选奥司他韦、石蒜碱及苦参碱构成的标准混合物验证结果图。
图4为由实施例2中获得的神经氨酸酶微反应器对金银花乙酸乙酯提取物中抗流感活性成分的筛选结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例神经氨酸酶微反应器的制备：
(1)取氨基磁珠分散液(Mag NH2,5μm,50mg/mL,BcMagTM)10mg置于2mL离心管中，经磁分离器固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球，然后经吡啶溶液(1mM,pH＝6.0)清洗三次后静置待用。
(2)用1mM吡啶溶液配制浓度为5％(v/v)的戊二醛溶液，与步骤(1)清洗后的磁性纳米微球混合后置于混悬器，于4℃的层析柜中活化反应3小时，反应完成后用吡啶溶液清洗固体产物三次，得到活化磁性纳米微球，静置待用。
(3)用天平精密称取2.0mg的神经氨酸酶固体粉末，置于4mL离心管中，加入2mL的吡啶溶液(1mM,pH＝6.0)溶解待用；向步骤(2)所得活化磁性纳米微球中加入500μL含有125μg神经氨酸酶及0.5mg氰基硼氢化钠的吡啶溶液，均匀混合后，置于混悬器，于4℃层析柜中经还原态固定化反应16小时，反应产物经磁分离器固液分离，取固体产物保存于1mL离心管中，使用Tris-HCl(100mM,pH＝7.0)清洗三次，分别经磁分离弃去上清液，得到神经氨酸酶微反应器，经1mL乙酸铵溶液(15mM,pH＝5.0)清洗三次，将清洗后的神经氨酸酶微反应器加入到1mL乙酸铵溶液中并于4℃冰箱中保存待用。
实施例2
本实施例神经氨酸酶微反应器的制备：
(1)取氨基磁珠分散液(Mag NH2,5μm,50mg/mL,BcMagTM)10mg置于2mL离心管中，经磁分离器固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球，然后经吡啶溶液(1mM,pH＝6.0)清洗三次后，静置待用。
(2)用1mM吡啶溶液配制浓度为5％(v/v)的戊二醛溶液，与步骤(1)清洗后的磁性纳米微球混合后置于混悬器，于4℃的层析柜中活化反应3小时，反应完成后用吡啶溶液清洗固体产物三次，得到活化磁性纳米微球，静置待用。
(3)用天平精密称取2.0mg的神经氨酸酶固体粉末，置于4mL离心管中，加入2mL的吡啶溶液(1mM,pH＝6.0)溶解待用；向步骤(2)所得活化磁性纳米微球中加入500μL含有125μg神经氨酸酶的吡啶溶液，均匀混合后，置于混悬器，于4℃层析柜中经非还原态固定化反应16小时，反应产物经磁分离器固液分离，取固体产物保存于1mL离心管中，使用Tris-HCl(100mM,pH＝7.0)清洗三次，分别经磁分离弃去上清液，得到神经氨酸酶微反应器，经1mL乙酸铵溶液(15mM,pH＝5.0)清洗三次，将清洗后的神经氨酸酶微反应器加入到1mL乙酸铵溶液中并于4℃冰箱中保存待用。
一、实施例2所得神经氨酸酶微反应器的酶固定化效果测试：
异硫氰酸荧光素常常以荧光探针的形式标记于蛋白质表面，用于蛋白质的定位及荧光成像表征。本测试在神经氨酸酶固定化之前，首先对神经氨酸酶进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记处理，在1:7磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)中神经氨酸酶与FITC按摩尔比为1:10混合，在4℃下孵育1h。然后将步骤(3)中500μL含有125μg神经氨酸酶的吡啶溶液替换为500μL含有125μg经FITC标记的神经氨酸酶的溶液，得到FITC标记的神经氨酸酶微反应器。然后经Leica TCS SP8荧光共聚焦显微镜表征。
所得FITC标记的神经氨酸酶微反应器经荧光共聚焦显微镜成像结果如图1所示。由图1结果可知，在FITC的激发光照射下，被FITC标记的神经氨酸酶微反应器发出绿色荧光，表明FITC标记的神经氨酸酶成功键合到磁性纳米微球表面。同时除了少数微球表面有较强烈荧光外，大部分微球表面的荧光响应都较为均一，表明神经氨酸酶在微球表面基本实现均匀键合。
二、实施例2所得神经氨酸酶微反应器经酶反应动力学基本参数，考察酶固定化后的活性保持情况：
米氏常数(Km)是酶的特征性物理常数，是酶促反应动力学的一个重要考察指标，常用以评价酶的活力及亲和力表现。乙酸铵缓冲溶液(15mM,pH＝5.0)稀释特异性底物MUNANA(4-甲基伞形酮-alpha-N-乙酰基神经氨酸苷钠盐水合物)至下述浓度:1μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM,300μM,500μM；上述样品分别与经优化制备获得的神经氨酸酶反应器在37℃下反应30s，经磁分离后收集上清液，经LC-MS/MS测定并由标准曲线计算酶解产物4-MU含量，根据双倒数曲线法，数据经由Origin 8.0进行线性拟合，经拟合曲线方程计算神经氨酸酶微反应器的Km。拟合的双倒数曲线方程如图2(A)所示，根据双倒数法，经拟合方程，计算得神经氨酸酶微反应器的米氏常数为46.49±3.68μM。
奥司他韦(上市的神经氨酸酶抑制剂)的半数抑制浓度(IC50)被用于评测该酶反应器的抑制动力学水平。使用乙酸铵缓冲溶液分别配制一系列不同浓度的奥司他韦(0.01μM,0.1μM,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM)及含有40μM底物MUNANA的反应溶液；取神经氨酸酶微反应器与上述溶液在37℃下反应3min，所有样品经磁分离器固液分离，收集上清过滤，取500μL经LC-MS/MS检测，经标准曲线计算酶解产物4-MU含量，由GraphPad Prism 7.0拟合量效曲线，由曲线拟合数据可知奥司他韦的IC50。如图2(B)结果所示，经软件拟合结果可知奥司他韦的半数抑制浓度(IC50)为11.82±2.28μM。
通过酶反应动力学基本参数的考察，本发明所得神经氨酸酶微反应器表现出了良好的酶解能力，同时对抑制成分也保持相对较好的敏感性，以上结果为本发明神经氨酸酶微反应器应用于抗流感药物的筛选打下了坚实基础。
三、以实施例2所得神经氨酸酶微反应器为抗流感药物筛选工具，考察其用于复杂体系中抗流感药物筛选的有效性：
以奥司他韦(阳性对照)、石蒜碱及苦参碱(阴性对照)组成的混合体系考察天然产物中抗流感活性成分筛选模型。含3vt.％DMSO的乙酸铵缓冲溶液(15mM,pH＝5.0)配制奥司他韦，石蒜碱及苦参碱的混合溶液，体系化合物浓度均为0.1mM,混合溶液作为上样溶液(loading)命名为S0，待用。取1mL混合溶液与10mg的神经氨酸酶微反应器在37℃下反应1小时，经磁分离器固液分离，收集上清液命名为S1，待用。酶反应器经1mL的乙酸铵缓冲液分别清洗两次，分别经磁分离收集上清液，依据先后顺序分别命名为S2，S3，待用。随后，酶反应器与乙酸铵缓冲液/甲醇(1/1,v/v)组成的平衡溶液1mL经孵育后磁分离收集上清液，命名为S4，待用。最后，神经氨酸酶微反应器分别经100％的甲醇溶液(1mL)清洗两次，磁分离器分别固液分离后，收集上清液，依据先后顺序命名为S5，S6，待用。所有溶液经过滤后，准确取500μL，置于质谱小瓶，分别加入30μM的胞嘧啶(内标)，待测。
以上测试样品具体测试方法如下：
运行系统：Dionex UltimateTM 3000 RSLC串联AB SCIEX Triple QuadTM 3500MS/MS；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；
运行溶液及梯度：流动相A(H2O+0.1％FA)，流动相B(ACN)。0min，90％A；25min,10％A；27min,10％A；
流速：0.6mL/min；
如图3所示，标准化合物组成的混合体系与神经氨酸酶微反应器共孵育后，反应后上清液(supernatant)中的各成分含量较上样溶液(loading)有所减少，说明各成分与神经氨酸酶均有一定的相互作用；为有效排除酶反应器的非特异性吸附，微反应器经乙酸铵缓冲溶液分别清洗两次(S2-S3)，由结果可知，混合体系中的阴性对照：石蒜碱(lycorine)及苦参碱(matrine)仅在S2-S3中出现，证明了缓冲溶液能够有效去除酶反应器的非特异性吸附；而随着甲醇的加入，奥司他韦(oseltamivir)作为混合体系中的神经氨酸酶特异性结合配体被不断洗脱下来(S4-S6)，说明甲醇能够对神经氨酸酶起到变性洗脱的作用；同时奥司他韦与神经氨酸酶作用后，经不同强度的溶液洗脱，仍有一定比例与靶点特异性结合，也证明了固定化后的神经氨酸酶器仍具备识别特异性配体的能力。以上结果均证明基于神经氨酸酶微反应器开发的复杂体系筛选模型的有效性，有望用于天然产物中神经氨酸酶特异性结合配体的筛选。
四、以实施例2所得神经氨酸酶微反应器为抗流感药物筛选工具，用于金银花中抗流感药物的筛选：
含3vt.％DMSO的乙酸铵缓冲溶液(15mM,pH＝5.0)溶解金银花乙酸乙酯提取物(5mg/mL)，取1mL溶液作为上样溶液(loading)命名为S0，待用。取1mL上述溶液与10mg的神经氨酸酶微反应器(12.5μg NA/mg MB)在37℃下反应1小时，经磁分离器固液分离，收集上清液命名为S1，待用。酶反应器经1mL的乙酸铵缓冲液分别清洗两次，分别经磁分离收集上清液，依据先后顺序分别命名为S2，S3，待用。随后，酶反应器与乙酸铵缓冲液/甲醇(1/1,v/v)组成的平衡溶液1mL经孵育后磁分离收集上清，命名为S4，待用。最后，神经氨酸酶微反应器分别经100％的甲醇溶液(1mL)清洗两次，磁分离器分别固液分离后，收集上清液，依据先后顺序命名为S5，S6，待用。所有溶液经过滤后，准确取500μL,置于质谱小瓶，待测。
以上测试样品具体测试方法如下：
运行系统：Dionex UltimateTM 3000 RSLC串联AB SCIEX Triple QuadTM 3500MS/MS；
固定相：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；
运行溶液及梯度：流动相A(H2O+0.1％FA)，流动相B(ACN)。0min,90％A；20min,83％A；32min,79％A；40min,74％A；49min,64％A；54min,64％A；59min,63％A；65min,42％A；70min,39％A；75min,35％A；
流速：1mL/min；
测试结果如图4所示，金银花乙酸乙酯层在与神经氨酸酶特异性结合的洗脱溶液(S4-S6)中出现了四个亲和配体，被分别标记为化合物1，化合物2，化合物3及化合物4。相较于化合物3及化合物4，化合物1和化合物2在S4及S5中均能被识别，根据亲和色谱的理论，认为化合物1和化合物2具备更好的配体结合能力。与此同时，化合物2作为金银花乙酸乙酯层中较为微量的成分，在诸多化合物分子存在的复杂体系中仍能够被特异性识别，不仅证明了亲和配体的垂钓筛选的高选择性，也说明该方法能够克服传统方法中无法避免的“漏捡”现象。以上均证明了本发明制备的神经氨酸酶器能成功应用于抗流感药物的筛选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)将氨基磁珠分散液经固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球；
(2)将步骤(1)所得磁性纳米微球与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米微球；
(3)将步骤(2)所得活化磁性纳米微球与溶解有神经氨酸酶的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃去上清液，得到神经氨酸酶微反应器。
2.根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述戊二醛溶液是指用1mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的浓度为5vt.％；所述活化反应的温度为4℃，反应时间为1～4h。
3.根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述活化磁性纳米微球与神经氨酸酶的质量比为1:(5～15)。
4.根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中进一步在溶解有神经氨酸酶的吡啶溶液中加入还原剂，进行还原态固定化反应。
5.根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述固定化反应的温度为4℃，反应时间为5～18h。
6.根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所得神经氨酸酶微反应器进一步使用Tris-HCl缓冲液清洗，对固定化反应后的剩余活性醛基进行封端处理。
7.一种神经氨酸酶微反应器，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的神经氨酸酶微反应器在抗流感药物筛选中的应用。
9.根据权利要求8所述的神经氨酸酶微反应器在抗流感药物筛选中的应用，其特征在于所述应用步骤如下：将神经氨酸酶微反应器与待筛选的溶液体系混合反应，固液分离，先用乙酸铵缓冲溶液洗脱与神经氨酸酶微反应器结合的非特异性吸附组分，然后用乙酸铵缓冲液与甲醇的混合溶液或纯甲醇溶液洗脱与神经氨酸酶微反应器结合的特异性吸附组分，得到抗流感药物成分。
10.根据权利要求9所述的神经氨酸酶微反应器在抗流感药物筛选中的应用，其特征在于：所述待筛选的溶液体系是指以含DMSO的乙酸铵缓冲溶液溶解的天然产物溶液体系。
CN201810479368.9A 2018-05-18 2018-05-18 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用 Pending CN108642037A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810479368.9A CN108642037A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810479368.9A CN108642037A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108642037A true CN108642037A (zh) 2018-10-12

Family

ID=63756853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810479368.9A Pending CN108642037A (zh) 2018-05-18 2018-05-18 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108642037A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006025983A2 (en) * 2004-07-26 2006-03-09 The Regents Of The University Of California Labeled substrate conjugates for identifying enzyme inhibitors
WO2010139047A1 (en) * 2009-06-01 2010-12-09 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Reagents and methods for detecting influenza virus proteins
CN103627634A (zh) * 2013-12-02 2014-03-12 武汉大学 一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法
CN104480101A (zh) * 2014-12-04 2015-04-01 同济大学 磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备及其产品和应用
CN106434619A (zh) * 2015-08-11 2017-02-22 财团法人工业技术研究院 生化反应材料与装置以及体外处理血液或血浆的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006025983A2 (en) * 2004-07-26 2006-03-09 The Regents Of The University Of California Labeled substrate conjugates for identifying enzyme inhibitors
WO2010139047A1 (en) * 2009-06-01 2010-12-09 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Reagents and methods for detecting influenza virus proteins
CN103627634A (zh) * 2013-12-02 2014-03-12 武汉大学 一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法
CN104480101A (zh) * 2014-12-04 2015-04-01 同济大学 磁性纳米颗粒固定化氨基酰化酶的制备及其产品和应用
CN106434619A (zh) * 2015-08-11 2017-02-22 财团法人工业技术研究院 生化反应材料与装置以及体外处理血液或血浆的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIYAN ZHAO ET AL.: "Screening of neuraminidase inhibitors from traditional Chinese medicines by integrating capillary electrophoresis with immobilized enzyme microreactor", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
Z BÍLKOVÁ ET AL.: "Enzymes immobilized on magnetic carriers: efficient and selective system for protein modification", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Choi et al. Lateral flow assay based on paper–hydrogel hybrid material for sensitive point‐of‐care detection of dengue virus
CN102791734B (zh) 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
Porotto et al. The second receptor binding site of the globular head of the Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase activates the stalk of multiple paramyxovirus receptor binding proteins to trigger fusion
Zhou et al. Programmable low-cost DNA-based platform for viral RNA detection
Ahmadi et al. Green chemistry and coronavirus
Garcia et al. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update
CN113264998A (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
US20230228751A1 (en) Aptamers against sars-cov-2
Fu et al. The utility of specific antibodies against SARS-CoV-2 in laboratory diagnosis
CA2802193A1 (en) A kit for detecting non-pathogenic or pathogenic influenza a subtype h5 virus
Porotto et al. Inhibition of parainfluenza virus type 3 and Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase receptor binding: effect of receptor avidity and steric hindrance at the inhibitor binding sites
Shafagati et al. Enhanced detection of respiratory pathogens with nanotrap particles
CN102449476B (zh) 筛选抑制目标蛋白质-蛋白质相互作用的候选新药以开发一类药物的方法
DE202020105116U1 (de) Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
CN109239334A (zh) 建立时间分辨荧光免疫层析法检测MxA试剂盒
Kwak et al. Probing the neuraminidase activity of influenza virus using a Cytolysin A protein nanopore
CN101375163B (zh) 用噬菌体检测微观活生物体的装置与方法
DE202020105117U1 (de) Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion
Yeh et al. Point-of-care microdevices for blood plasma analysis in viral infectious diseases
Ye et al. An oleanolic acid derivative inhibits hemagglutinin-mediated entry of influenza A virus
Tarim et al. Microfluidic-based technologies for diagnosis, prevention, and treatment of COVID-19: recent advances and future directions
Diakou et al. Ebola virus disease and current therapeutic strategies: a review
CN112462061A (zh) 检测h1n1、rsv-a和adv3的试剂盒及其应用
Le et al. Spin-Enhanced Lateral Flow Immunoassay for High-Sensitivity Detection of Nonstructural Protein NS1 Serotypes of the Dengue Virus
CN108642037A (zh) 一种神经氨酸酶微反应器及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181012