CN108048446B - 一种含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二次固定化合成的含脂肪酶‑无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料及其制备方法和应用。利用脂肪酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成脂肪酶‑无机杂化纳米花，然后将其包埋到生物相容性较好的含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系中，并通过反复冷冻‑解冻的方法制备得到含有脂肪酶‑无机杂化纳米花的水凝胶，其独特的三维网状结构使酶稳定存在于催化体系中，从而达到二次固定化的目的。本发明通过二次固定化，使脂肪酶免受外界环境的影响，从而使酶的稳定性得到了改善，进一步提高了酶的重复利用性。该催化材料无需与反应物进行分离，省去了酶与底物分离的步骤，在酶的固定化领域将有很广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶固定化领域，涉及一种二次固定化合成的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶是一类可以在微水或非水相体系中催化甘油酯水解反应、酯化反应、转酯化反应的酶类，由于其具有较好的水溶性、反应专一性、高催化效率、生物相容性、低毒性等优点，使得其在能源、食品、洗涤、皮革、制药、纺织及造纸等行业中有着一定的应用，因此得到国内外学者广泛关注和研究。然而，脂肪酶作为工业催化剂在实际应用过程中仍存在很多缺陷，在反应剧烈的环境下容易出现稳定性降低、酶活损失甚至失活的现象，从而极大的限制了其进一步的工业化应用。为了解决这一难题，固定化技术得以提出并发展。
近几年来，国内外各方学者利用超分子组装的方法在合成具有三维花形结构的有机-无机杂化纳米花上取得了突破性的进展，这种方法将酶作为有机组分，金属离子作为无机组分，不但实现了酶的固定化，还极大地提高了酶的活性及稳定性，从而扩大了其在生物催化、生物传感、能源储存、气体检测、蛋白质组学分析等领域的应用潜力。然而，这种纳米花型催化材料的力学强度很低，容易受到外界环境或外力因素的影响从而导致稳定性降低，且需要离心才能将纳米花与底物分离，从而不利于工业化生产快速进行。
同时，有很多国内外学者通过包埋的方法将酶固定化到生物相容性较好、热稳定较好、多孔的聚合物水凝胶中，如：海藻酸钠凝胶微球、石墨烯聚合物复合水凝胶、壳聚糖-黏土纳米复合膜、硅聚合物凝胶微球等等，从而改善了酶催化材料的力学性能，提高了酶的稳定性，然而遗憾的是固定化后酶的扩散受到极大地限制，同时还伴有少量的酶从聚合物凝胶中溶出的现象，从而使其酶活性损失较为严重。因此，找寻一种既能提高酶活又能保证酶稳定性的固定方法是极为重要的。
发明内容
目前脂肪酶作为工业催化剂的在实际应用过程中仍存在很多缺陷，且在纳米级固定化后酶活虽有提高，但易受外界环境影响出现稳定性降低的现象，从而极大地限制了其进一步的工业化应用，因此为了解决这一难题，本发明提供了一种二次固定化方法，将脂肪酶-无机杂化纳米花和壳聚糖-PVA等亲水性聚合物构成的水凝胶二者优异的性能充分地结合在一起，从而得到具有一定强度且兼具较高催化活性及稳定性的含酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料。
本发明的技术方案如下：
一种含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶，其包括：
(a)脂肪酶和无机金属离子通过自组装而成的脂肪酶-无机杂化纳米花；
(b)含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系。
在上述技术方案中，所述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶由将所述的脂肪酶-无机杂化纳米花包埋到所述的凝胶载体体系中制备得到。
在上述技术方案中，所述的亲水性聚合物为壳聚糖、聚乙烯醇、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖。
在上述技术方案中，所述的无机金属离子来源于氯化铜、硫酸铜、硝酸铜中的一种或多种。
本发明还提供上述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)用水性溶液配制得到浓度为0.1～0.5mg/mL的脂肪酶溶液，加入无机金属离子溶液，在20～40℃下静置24～96小时，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)将至少两种亲水性聚合物溶于水性溶液中制备得到凝胶载体体系，加入步骤(1)得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，室温搅拌混合；
(3)步骤(2)的混合溶液，经循环冷冻和解冻的过程，得含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
在上述的技术方案中，在步骤(2)中，所述的脂肪酶-无机杂化纳米花在所述的凝胶载体体系中的质量百分含量为1～3％。脂肪酶-无机杂化纳米花在凝胶载体体系中的质量百分含量影响纳米花在载体体系中的分散度，浓度过高，纳米花在凝胶中的分散性就会变差，从而影响酶与底物的充分结合，进而影响酶催化材料的活性。
在上述的技术方案中，在步骤(2)中，可以采用至少两种亲水性聚合物溶于水性溶液中，制备得到稳定的凝胶载体体系。所述亲水性聚合物选自壳聚糖、聚乙烯醇、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖。优选的，至少两种亲水性聚合物选自壳聚糖和聚乙烯醇、或海藻酸钠和聚乙烯醇、或海藻酸钙和聚乙烯醇、或琼脂糖和聚乙烯醇、或聚乙烯醇和其他两种以上聚合物组合的复合聚合物。在所述两种聚合物组成的聚合物组合中，聚乙烯醇在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为10～20％，剩余聚合物如壳聚糖、海藻酸钠、海藻酸钙、或琼脂糖在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为4～6％。在所述两种以上聚合物组合的复合聚合物中，所述的聚乙烯醇在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为10～20％，剩余其他聚合物在所述的凝胶载体体系中所加入的质量百分含量为4～6％，其中不限定所述剩余其他聚合物所占的比例，总和在所述4～6％范围内时能够实现本发明。优选的，所述的壳聚糖的粘均分子量为620000±75000，所述的聚乙烯醇的聚合度为1750±50，所述的海藻酸钠粘均分子量为150000±35000，海藻酸钙的分子量为584.45，所述的琼脂糖分子量为630.55。
在上述技术方案中，所述的水性溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)、水、或含有酸性物质或碱性物质的水性溶液，所述酸性物质为醋酸、盐酸等，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾等。
在上述的技术方案中，在步骤(3)中，所述冷冻的条件为在-20～-30℃下冷冻12～24h，所述解冻的条件为在4～25℃下解冻6～12h，所述循环冷冻和解冻的过程为2～5次。含有脂肪酶-无机杂化纳米花的聚合物溶液，在冷冻解冻过程中由于聚合物的氢键作用形成紧密的三维交联网络，使脂肪酶纳米花被成功包埋进具有较高强度的水凝胶中，保护纳米花的结构稳定性，从而保持其催化活性。
在上述的技术方案中，在步骤(1)中，所述的无机金属离子溶液中无机金属离子的浓度为100～140mM。
本发明所述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的溶胀比为20～60。
本发明还提供上述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶在奶油生产奶味香精中的应用。
本发明利用脂肪酶作为有机组分与无机金属离子通过自组装的方式合成脂肪酶-无机杂化纳米花，该材料具有纳米材料比表面积较大的性质，避免了酶与底物间的传质阻碍，从而使固定化后的脂肪酶较游离酶的酶活有一定提高。同时本发明将上述具有较高酶催化活性的纳米花包埋到生物相容性较好的含有至少两种亲水性聚合物的凝胶载体体系中，并通过反复冷冻-解冻的方法制备得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶材料，其独特的三维网状结构使酶稳定存在于催化体系中，从而达到二次固定化的目的并将其应用于实际的催化反应中。
本发明的有益效果：
本发明提供通过二次固定化的方法所合成的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶型酶催化材料。与游离脂肪酶相比，脂肪酶纳米花因其较大的比表面积使酶的催化活性得以提高，通过二次固定化，使脂肪酶纳米花免受外界环境的影响，从而使酶的稳定性得到了改善，进一步提高了酶的重复利用性。该材料将脂肪酶-无机杂化纳米花和亲水性聚合物得到的水凝胶(如壳聚糖-PVA水凝胶)二者优异的性能充分的结合在一起，从而在生物催化、生物医药、食品工业等各个领域都将有广泛的应用价值。与传统的固定化方法相比，该催化材料无需与反应物进行分离，省去了酶与底物分离的步骤，且本发明的水凝胶可根据需要加工成各种形状。
附图说明
图1为三水合磷酸铜、脂肪酶、脂肪酶-无机杂化纳米花、壳聚糖-PVA水凝胶以及含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的红外图。
图2为三水磷酸铜、脂肪酶-无机杂化纳米花、含脂肪酶-无机杂化纳米花的壳聚糖-PVA水凝胶的X-射线衍射图。
图3为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的能谱图。
图4为脂肪酶-无机杂化纳米花、壳聚糖-PVA水凝胶以及含脂肪酶纳米花水凝胶的扫描电镜图。
图5为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的力学性能曲线图。
图6为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的循环利用性图。
具体实施方式
下述实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
下述实施例采用的材料以及脂肪酶酶活测定方法：
1、材料
脂肪酶：TypeⅡ猪胰腺脂肪酶，购自Sigma公司；
壳聚糖：粘度为50～800mPa·s，粘均分子量约62万；
聚乙烯醇(PVA)：聚合度为1750±50；
海藻酸钠：粘均分子量约15万；
海藻酸钙：分子量为584.45；
琼脂糖：分子量为630.55；
磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01M，pH 7.4，按照常规方法制备得到。
2、脂肪酶酶活测定方法：采用比色法，以棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)为底物，在脂肪酶的水解作用下生成对硝基苯酚(p-NP)，其中p-NP在碱性条件下显出明亮的黄色，在402nm的波长下有最大吸光值。在一定范围内，体系的吸光度值与p-NP的浓度呈线性关系。具体操作步骤如下：
(1)对硝基苯酚标准曲线的绘制：利用PBS将p-NP(2mM)分别稀释成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2μmol/mL，依次加入4mL底物乳化液以及5mL反应终止液(Na2CO3水溶液)，以p-NP的浓度为横坐标，OD402nm值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)酶活力的测定：分别取四支试管，一支作为空白对照，另外三支作为样品(三个平行试验)，首先，将含固定化酶的PBS溶液、底物溶液、终止液分开预热5-10min(37℃)，然后向1mL含有固定化酶的PBS溶液中加入4mL的底物溶液，持续振荡反应5min，最后向体系中加入终止液持续振荡5min，而后将固定化脂肪酶与反应体系分离，在402nm波长下测OD值。空白对照以1mL PBS溶液作为对照。
脂肪酶活力单位(U)定义为：在上述实验条件下，1min内催化底物释放出1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量定义为一个酶活单位。
实施例1
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的1wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，具体为：在-20℃下冷冻12h，在4℃下解冻6h，该冷冻-解冻过程重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。含有脂肪酶-无机杂化纳米花的聚合物溶液，在冷冻解冻过程中由于聚合物的氢键作用形成紧密的三维交联网络，使脂肪酶纳米花被成功包埋进具有较高强度的水凝胶中，保护纳米花的结构稳定性，从而保持其催化活性。
壳聚糖-PVA水凝胶的制备：按照上述步骤(2)的方法，得到含有相应浓度聚乙烯醇和壳聚糖的混合溶液，该混合溶液进行循环冷冻-解冻，具体为：在-20℃下冷冻12h，在4℃下解冻6h，该冷冻-解冻过程重复3次，获得壳聚糖-PVA水凝胶。
上述制备得到的含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的性能检测结果：
图1为三水合磷酸铜、脂肪酶、脂肪酶-无机杂化纳米花、壳聚糖-PVA水凝胶以及含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的红外图。由图可知，在波数1042cm-1(非对称伸缩振动)、988cm-1(伸缩振动)、623cm-1(弯曲振动)处的吸收峰来自于P-O键的振动，由此证明了磷酸基团的存在。图中脂肪酶(b)中的特征峰1655cm-1、1538cm-1为游离脂肪酶中-CONH(酰胺键)的伸缩振动，2800-3000cm-1的峰为-CH2和-CH3的伸缩振动，在3300cm-1为-OH的伸缩振动。从红外谱图中可以看出脂肪酶-无机杂化纳米花(c)以及含纳米花的壳聚糖-PVA水凝胶(e)同时具有脂肪酶(b)和三水合磷酸铜(a)的特征吸收峰。此外，通过与壳聚糖-PVA水凝胶(d)的红外图进行对比，更加进一步说明了，含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶是由上述几种物质组成的。
图2为三水磷酸铜(图2B)、脂肪酶-无机杂化纳米花(图2A)、含脂肪酶-无机杂化纳米花的壳聚糖-PVA水凝胶(图2C)的X-射线衍射图。由图可知，脂肪酶-无机杂化纳米花中和Cu3(PO4)2·3H2O中的所有的衍射峰都能够与标准三水合磷酸铜(JCPDS card no.22-0548)的PDF卡片图相对应，由此进一步证实纳米花是以三水合磷酸铜结晶体作为载体，并且三水合磷酸铜与游离脂肪酶结合具有很高的结晶度，说明二者组装结构较为稳定。此外，通过对比壳聚糖-PVA水凝胶和含脂肪酶纳米花的水凝胶的X-射线衍射图，皆具有较好的结晶度，可以更加证明脂肪酶纳米花被成功地引入壳聚糖-PVA凝胶体系中。
图3为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的能量色散X-射线衍射图。由图可知，纳米花中的Cu和P信号非常强烈。由此，进一步证明，含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的无机成分是三水合磷酸铜晶体。
图4为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的扫描电镜图，其中，图4a、4b、4c分别为脂肪酶-无机杂化纳米花、壳聚糖-PVA水凝胶、含脂肪酶-无机杂化纳米花的壳聚糖-PVA水凝胶的扫描电镜图。从图4a、4b中可看出脂肪酶-无机杂化纳米花由多层片状花瓣结构组成，尺寸均一，具有良好的分散性和较大的表面积，壳聚糖-PVA水凝胶具有明显的三维交联网络状结构，图4c中观察得到脂肪酶-无机杂化纳米花完好的存在于壳聚糖-PVA水凝胶的三维网状结构中，且有较好的分散性。
图5为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的力学性能曲线图。通过对所制备的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶进行拉伸以及压缩等力学性能的测试，由图可知，含脂肪酶纳米花的水凝胶表现出较强的力学性能，拉伸应力为0.6MPa(图5A)，压缩应力达到6MPa(图5B)。
在下述实施例1～14制备得到的含有脂肪酶酶-无机杂化纳米花水凝胶的力学性能均良好，其拉伸应力约在0.4-0.6MPa范围内，其压缩应力约在5-6MPa范围内。
实施例2
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻15h，在4℃下解冻8h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例3
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的3wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻16h，在4℃下解冻8h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例4
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的1wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻20h，在4℃下解冻10h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例5
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻20h，在4℃下解冻8h，重复4次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例6
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的3wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻14h，在4℃下解冻6h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例7
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的1wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻12h，在4℃下解冻6h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例8
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻12h，在4℃下解冻8h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例9
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.5mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用2％的醋酸水溶液配置的5％壳聚糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的3wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻15h，在4℃下解冻7h，重复3次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
实施例10
按照所述的酶活检测方法，检测上述实施例1～9的方法制备得到的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的催化活性，结果如表1。由表1可知，通过改变脂肪酶纳米花的初始酶浓度(0.1～0.5mg/mL)以及凝胶体系中纳米花的所占比例(1％～3％)，所制备的水凝胶的酶催化活性为11.37～52.53U/g，与游离酶(5.31U/g)对比，提高了2～10倍。
表1.含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的催化活性
实施例11
将实施例5所得到的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶作为酶催化材料，水解奶油(或稀奶油)制备天然奶味香精，具体为：将10g酶催化材料加入到40g经预处理的奶油中，在37℃下对奶油进行酶法水解，水浴振荡酶解4h，收集酶解产物，得具有奶香味特征的化合物(游离脂肪酸)，使酶解底物增香。通过对酶解后得到的产物的酸价进行测定，从而评价其酶解的程度，酸价为48.2mg/g时，认为酶解完成。从酶解产物中分离水凝胶，再加入奶油，在上述条件下进行酶解，实现脂肪酶的循环利用。
奶油预处理的具体方法为：将奶油与水以质量比1:3的比例混合，70℃水浴保温30min后，利用匀质搅拌机至乳化均质，降温至37℃左右，作为酶解底物。
从酶解产物中分离水凝胶的具体方法为：将酶解产物用两层灭过菌的洁净纱布过滤，使酶解产物与水凝胶分离，从而收集水凝胶。
水凝胶经过40次循环利用，酸价值仍保持一个较好的水平，为最初的80％左右，具有良好的循环利用性能。图6为含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的循环利用性图。由图可知，含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶可以很好的酶解奶油(或稀奶油)制备天然奶味香精，且循环利用40次以后，催化性能还能保持最初的80％以上。
实施例12
将实施实例5所得到的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶放入含水的烧杯中浸泡48h后，烧杯中并没有析出的物质出现，水凝胶完好的浸泡在水中，正如图4所呈现的一样，脂肪酶-无机杂化纳米花稳定地存在于水凝胶的三维网络状结构中，此外，通过将这种酶催化材料进行循环利用40次后，凝胶仍完好，没有任何物质从水凝胶中溶出，因此这种固定化酶的方法展现出较好的结构稳定性。
实施例13
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用PBS配置的5％海藻酸钠溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻20h，在4℃下解冻10h，重复4次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
制备得到的含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的酶催化活性为42.75±3.01U/g，是游离酶酶活(5.31U/g)的8.05倍。
实施例14
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用用PBS配置的5％的海藻酸钙溶液(利用5％氯化钙的PBS溶液和2％海藻酸钠的PBS溶液以2:1的比例搅拌混合配置的)，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻15h，在4℃下解冻7h，重复4次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
制备得到的含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的酶催化活性为41.21±2.34U/g，是游离酶酶活(5.31U/g)的7.76倍。
实施例15
(1)用PBS配制初始酶浓度为0.25mg/mL的脂肪酶溶液，取3mL该脂肪酶溶液，加入浓度为120mM的氯化铜溶液20μL，摇匀后在室温(25℃)下静置培养48小时后，收集沉淀，沉淀用用去离子水洗涤三次，并用低温高速离心机在4℃、3500rpm条件下离心5min，将沉淀部分冷冻干燥24h，得到蓝色粉末即为脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)取3g 15％的聚乙烯醇(PVA)PBS溶液，然后加入1g利用90℃热水配置的5％的琼脂糖溶液，混合均匀；混合溶液中加入(1)中制备得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，加入量为混合溶液质量的2wt％，25℃搅拌均匀；
(3)混合均匀的溶液进行循环冷冻-解冻，在-20℃下冷冻18h，在4℃下解冻8h，重复4次，得到含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶。
制备得到的含有脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的酶催化活性为36.59±1.92U/g，是游离酶酶活(5.31U/g)的6.89倍。
Claims (4)
1.一种含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)用水性溶液配制得到浓度为0.1～0.5mg/mL的脂肪酶溶液，加入无机金属离子溶液，在20～40℃下静置24～96小时，收集沉淀，经过洗涤、离心、冷冻干燥得到脂肪酶-无机杂化纳米花；
(2)将至少两种亲水性聚合物溶于水性溶液中制备得到凝胶载体体系，加入步骤(1)得到的脂肪酶-无机杂化纳米花，室温搅拌混合；
(3)步骤(2)的混合溶液，经循环冷冻和解冻的过程，得含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶；
在步骤(2)中，所述的脂肪酶-无机杂化纳米花在所述的凝胶载体体系中的质量百分含量为1～3％；
在步骤(3)中，所述冷冻的条件为在-20～-30℃下冷冻12～24h，所述解冻的条件为在4～25℃下解冻6～12h，所述循环冷冻和解冻的过程为2～5次；
所述的亲水性聚合物为壳聚糖、聚乙烯醇；
所述的无机金属离子来源于氯化铜。
2.根据权利要求1所述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将壳聚糖和聚乙烯醇溶于水性溶液中制备得到凝胶载体体系，在所述的凝胶载体体系中所加入的壳聚糖和聚乙烯醇的质量百分含量分别为4～6％和10～20％，所述的壳聚糖的粘均分子量为620000±75000，所述的聚乙烯醇的聚合度为1750±50。
3.根据权利要求1所述的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的无机金属离子溶液中无机金属离子的浓度为100～140mM。
4.如权利要求1～3的任一项所述的制备方法制备得到的含脂肪酶-无机杂化纳米花的水凝胶在奶油生产奶味香精中的应用。
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