CN104593278B - 固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

固定化脂肪酶的制备方法，涉及固定化脂肪酶。将菌种活化、培养后上罐发酵得游离酶液；将无水乙醇和去离子水混合，再加入氨水，混合后，加入TEOS，再离心收集白色沉淀，洗涤和干燥，然后超声分散在去离子水中，加入CTAB溶液和Na2CO3，离心收集沉淀后，洗涤和干燥，得到HMSS；将HMSS超声分散在甲苯中，磁力搅拌、冷凝回流后，加入(EtO)3SiPrCN，回流，离心收集产品，洗涤和干燥后，得改性产物HMSS‑CN；再将改性产物在硫酸中回流，离心收集产物，洗涤和干燥后，得产物HMSS‑COOH，再与游离酶液混合，在冰浴下搅拌，离心收集沉淀，并用磷酸钾缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即得到固定化脂肪酶。

Description

固定化脂肪酶的制备方法
技术领域
本发明涉及固定化脂肪酶，尤其是涉及一种固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称三酰甘油酯水解酶，是催化酯类化合物的分解、合成、酯交换等多种反应的一类酶的总称[1]。南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipaseB，CALB)是一种重要的脂肪酶，具有很多优良特征，对水相和非水相的反应都有很强的催化能力，尤其是在氨解反应上得到广泛的应用。然而，脂肪酶的应用往往也受到酶活力低、稳定性差、回收利用困难等因素的影响，但是如果酶被固定化后再使用，可以在很大程度上避免这些问题。目前已经商业化的固定化脂肪酶是诺维信的Novozym 435，但是由于其价格昂贵，无法在工业上大规模利用。
用于固定化酶的载体主要分有机材料和无机材料两大类，无机材料中的介孔二氧化硅就被广泛应用在酶的固定化研究中。介孔二氧化硅(mesoporous silica,MPS)是一种多孔材料，孔径介于2～50nm，具有极高的比表面积、规则有序的孔道结构、狭窄的孔径分布、孔径大小连续可调[2,3]等特点，是一种用于制备固定酶的不错的载体。
介孔材料固定蛋白质酶的方法有很多，例如吸附、交联都是比较常用的传统方法，但是这种通过物理方法固定得到的蛋白酶在催化的过程中容易浸出，酶分子很容易从载体上脱落下来，而载体与酶通过形成共价键得到的固定化酶就没有这些缺陷。目前，国内外已经有许多研究者做了介孔材料对酶的固定化方面的研究。B.Paul[4]等人用介孔硅胶MCM-42和功能化的SBA-15将微过氧化物酶进行固定化研究，提高了酶的稳定性和使用寿命；DirkJung[5]将葡萄糖氧化酶共价结合固定在化学改性的SBA-15上，该固定化酶与游离酶相比，贮藏稳定性明显得到提高，与通过物理吸附固定的酶相比，酶的浸出现象得到良好改善。Falahati M[6]等人将β-乳球蛋白-B成功固定在胺官能化的纳米二氧化硅KIT-6上，得到的固定蛋白比游离蛋白的耐热能力更高。Michela Vittorini[7]将厌氧乙醇脱氢酶固定在介孔二氧化硅SBA-15上，与游离酶相比，固定化酶在有机相中的稳定性显著增强。Bai[8]等人利用改性的介孔二氧化硅固定脂肪酶，固定化酶相比游离酶的催化活性有明显提高。Ganapati D[9]等人以六角介孔二氧化硅为载体通过物理方法将洋葱假单胞菌脂肪酶和CALB分别进行固定化，酶的回收活力仅仅26％。Emil Dumitriu[10]等人用物理吸附的方法将CALB固定在介孔二氧化硅MCM-36上，吸附量仅仅达到4mgCALB/g载体。Yu Han[11]利用压力驱动法将CALB固定在MPS上，固定化酶的可重用性和热稳定性都优于商业化的Novozyme435。Rosa M.[12]同样也是利用物理方法将CALB固定在MPS上，将固定化酶与Novozyme435进行对比研究，固定酶的稳定性和重复利用性都很高。
参考文献：
[1]GANDHI N N.Applications of lipase[J].JAm Oil Chem Soc,1997,74(6):621-634.
[2]Kresge C T,Leonowicz M E,RothW J,et al.Ordered mesoporousmolecular-sieves synthesize by a liquid-crystal template mechanism[J].Nature,1992,359:710-712.
[3]Beck J S,Vartuli J C,RothW J,et al.A new family of mesoporousmolecular sieves prepared with liquid-crystal templates[J].JAm Chem Soc,1992,114(27):10834-10843.
[4]Zhang B P,Janicke M T,Woodruff W H,et al.Fast photoreduction of aheme peptide encapsulated in nanostructured materials[J].The Journal ofPhysical Chemistry B,2005,109(42):19547-19549.
[5]Jung D,Streb C,Hartmann M.Covalent anchoring of chloroperoxidaseand glucose oxidase on the mesoporous molecular sieve SBA-15[J].Internationaljournal of molecular sciences,2010,11(2):762-778.
[6]Falahati M,Saboury A A,Shafiee A,et al.Highly efficientimmobilization of beta-lactoglobulin in functionalized mesoporousnanoparticles:A simple and useful approach for enhancement of proteinstability[J].Biophysical chemistry,2012,165:13-20.
[7]Vittorini M,Dumitriu E,Barletta G,et al.Immobilization ofThermoanaerobium brockii alcohol dehydrogenase on SBA-15[J].Bioprocess andbiosystems engineering,2011,34(2):247-251.
[8]Bai Y X,Li Y F,Yang Y,et al.Covalent immobilization oftriacylglycerol lipase onto functionalized novel mesoporous silica supports[J].Journal of biotechnology,2006,125(4):574-582.
[9]Yadav G D,Jadhav S R.Synthesis of reusable lipases byimmobilization on hexagonal mesoporous silica and encapsulation in calciumalginate:transesterification in non-aqueous medium[J].Microporous andMesoporous Materials,2005,86(1):215-222.
[10]Dumitriu E,Secundo F,Patarin J,et al.Preparation and propertiesof lipase immobilized on MCM-36support[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2003,22(3):119-133.
[11]Han Y,Lee S S,Ying J Y.Pressure-driven enzyme entrapment insiliceous mesocellular foam[J].Chemistry of materials,2006,18(3):643-649.
[12]Blanco R M,Terreros P,Fernández-Pérez M,et al.Functionalizationof mesoporous silica for lipase immobilization:Characterization of thesupport and the catalysts[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2004,30(2):83-93.
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化脂肪酶的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1)将菌种活化、培养后上罐发酵得游离酶液；
在步骤1)中，所述菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)CALB，该菌种已于2015年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.10277；
所述活化的方法可为：从甘油管中接500～1000μL菌液到装有25mL YPD培养基的250mL的锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养24～48h，转接一次；所述YPD培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；
所述培养的方法可为：将活化后菌体按5％～10％的接种量接种到装有50mL BMGY培养基的500mL锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养12～36h；所述BMGY培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，10g/L甘油，pH6.0的1mol/L磷酸钾缓冲液；
所述上罐发酵的方法可为：将种子液按5％～10％的接种量接种到BSM培养基中，发酵开始12h后，2～4h内流加50％甘油作为碳源，24h后，平均每24h补加80～160mL甲醇，诱导菌体产酶，120～144h后停止发酵，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液；所述BSM培养基的组成为：甘油40g/L，磷酸26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH 4.13g/L，PTM14mL/L，pH用氨水调为6.5。
2)制备中空介孔SiO2，具体方法如下：
将无水乙醇和去离子水混合，再加入氨水，混合后，加入TEOS，再离心收集白色沉淀，第1次洗涤和干燥，然后超声分散在去离子水中，加入CTAB溶液和Na2CO3，离心收集沉淀后，第2次洗涤和干燥，得到中空介孔SiO2(HMSS)。
在步骤2)中，所述无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液和Na2CO的配比可为(25～30)ml∶(2～4)ml∶(1～2)ml∶(2～3)ml∶(3.5～4.5)ml∶(0.6～1)g，其中，无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液以体积计算，Na2CO以质量计算；所述第1次洗涤和干燥的条件可为：采用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，再置于鼓风干燥箱内70～80℃干燥24h；所述超声分散的条件可为将第1次干燥后的产物2g超声分散在350～400ml去离子水中；所述CTAB溶液的质量浓度可为12.5mg/ml；所述第2次洗涤和干燥的条件可为：用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。
3)HMSS的改性
将HMSS超声分散在甲苯中，磁力搅拌、冷凝回流后，加入(EtO)3SiPrCN，继续回流，离心收集产品，第1次洗涤和干燥后，得改性产物(命名为HMSS-CN)；再将改性产物在硫酸中回流，离心收集产物，第2次洗涤和干燥后，得到产物，命名为HMSS-COOH；
在步骤3)中，所述HMSS、甲苯、(EtO)3SiPrCN的配比可为(1～2)g∶(20～50)ml∶(110～150)μL，其中，HMSS以质量计算，甲苯、(EtO)3SiPrCN以体积计算；所述磁力搅拌、冷凝回流的条件可为130℃下磁力搅拌、冷凝回流2～4h；所述继续回流的时间可为20～30h；所述第1次洗涤和干燥的条件可用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h；所述将改性产物在硫酸中回流的条件可将改性产物在30～50mL质量浓度为50％硫酸中、120℃下搅拌回流3～5h；所述第2次洗涤和干燥的条件可用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。
4)酶的固定化
将HMSS-COOH与游离酶液混合，在冰浴下搅拌，离心收集沉淀，并用磷酸钾缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即得到固定化脂肪酶。
在步骤4)中，所述HMSS-COOH与游离酶液的配比可为(200～500)mg∶(10～30)ml，其中，HMSS-COOH以质量计算，游离酶液以体积计算；所述冰浴下搅拌的时间可为3～9h；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度可为0.1mol/L，pH6.5；所述洗涤的次数可为3次；所述冷冻干燥的时间可为12～24h。
所制备的固定化脂肪酶的性质表征可采用以下方法：
酶活力的定量检测：将含有2％三丁酸甘油酯、2％阿拉伯胶的底物溶液经过超声波乳化形成的乳白色底物溶液，用碱调节pH为6.5。取10mL底物溶液与0.2mL发酵上清液或者10mg固定化酶混合，30℃反应10min，立即用20mmol/L NaOH滴定三丁酸甘油酯水解产生的游离酸。酶活力单位(U)定义为在一定温度、pH条件下，每分钟催化底物水解产生1μmol丁酸所需的酶量。
最适反应温度的测定：将游离酶和固定化酶的反应体系分别在20、25、30、35、40、45、50、60、70、80℃下各反应10min，定量测定酶活力，比较在不同反应温度下的酶活力，分别得到游离酶和固定化酶的最佳催化温度。
热稳定性的测定：将发酵上清液和固定化酶分别在20、30、40、50、60、70、80℃保温1h，然后再在30℃、pH6.5条件下检测酶活力，测定不同温度处理后游离酶和固定化酶的残留活力，比较热稳定性。
最适反应pH：配制pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的底物溶液，测定在不同pH条件下游离酶和固定化酶的酶活力，分别得出游离酶和固定化酶催化最适催化pH。
pH稳定性测定：将发酵上清液和固定化酶分别放置在不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的柠檬酸钠缓冲液中，冰浴下放置1h，然后将pH调到6.5，再在30℃下反应10min，定量测定残留酶活力，比较pH稳定性。
本发明中的载体是自制的中空介孔二氧化硅(Hollow mesoporous silicaspheres，HMSS)，它内部呈现中空状态，能负载上更多的蛋白，与普通介孔二氧化硅相比在对酶的固定化效果上更具优势。
本发明中，先发酵工程菌获得含有CALB的发酵上清液，再通过溶胶凝胶法制备SiO2球体，并使用阳离子表面活性剂来选择性的刻蚀，使SiO2形成中空结构，再通过修饰剂改性，使SiO2表面负载羧基官能团，最后利用改性的SiO2以其表面的羧基和CALB非活性中心的氨基发生脱水缩合反应而使CALB得到固定化，且通过单因素变量法研究固定化酶的热、酸碱稳定性。
本发明采用了一种改性中空介孔二氧化硅固定脂肪酶B的方法，采用该方法固定的脂肪酶在热稳定性、酸碱稳定性上与游离酶相比都有很大的优越性，与其他固定化酶相比，该固定化酶蛋白负载量和酶活力有很大的提高并且生产成本大大降低。
本发明中的载体是自制的中空介孔二氧化硅(Hollow mesoporous silicaspheres，HMSS)，它内部呈现中空状态，能负载上更多的蛋白，与普通介孔二氧化硅相比在对酶的固定化效果上更具优势。
附图说明
图1为HMSS的XRD分析图谱。
图2为HMSS的SEM表征图。
图3为HMSS的TEM表征图。
图4为HMSS的BET脱吸附曲线。
图5为HMSS的BJH吸附孔径分布曲线。
图6为HMSS、HMSS-CN、HMSS-COOH、HMSS-CALB红外检测。
图7为HMSS、HMSS-CN、HMSS-COOH、HMSS-CALB元素分析。
图8为固定化过程中发酵上清液中蛋白含量的变化。
图9为固定化过程中发酵上清液的相对酶活力的变化。
图10为游离酶和固定化酶的催化最适温度的测定。
图11为游离酶和固定化酶的热稳定性的比较。
图12为游离酶和固定化酶的催化最适pH的测定。
图13为游离酶和固定化酶的pH稳定性的比较。
具体实施方式
为阐述本发明的目的及其技术效果，以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例步骤如下：
(1)发酵重组菌
菌种的活化：从甘油管中接500～1000μL菌液到装有25mL YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)的250mL的锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养24～48h，转接一次；
种子的培养：将活化后菌体按5％～10％的接种量接种到装有50mL BMGY(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，10g/L甘油，pH6.0的1mol/L磷酸钾缓冲液)培养基的500mL锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养12～36h；
上罐发酵获取酶液：将种子液按5％～10％的接种量接种到BSM(甘油40g/L，磷酸26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，K2SO418.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，PTM14mL/L，pH用氨水调为6.5)中，发酵开始12h后，2～4h内流加50％甘油作为碳源，24h后，平均每24h补加80～160mL甲醇，诱导菌体产酶。120～144h后停止发酵，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液。
(2)中空介孔SiO2的制备
量取无水乙醇250～300ml，去离子水20～40ml，在磁力搅拌下混合均匀，加入10～20ml氨水，再次混合均匀后，快速加入20～30ml TEOS，室温下大力搅拌1～2h，离心收集白色沉淀，并用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，所得产物放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24h；将上述干燥产物2g超声分散在350～400ml去离子水中，加入溶有35～45ml(12.5mg/ml)CTAB溶液，室温下搅拌30～60min，加入6～10g Na2CO3，35℃下剧烈搅拌24～36h，离心收集沉淀，并用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h，得到HMSS。
(3)HMSS的改性
1～2g HMSS超声分散在20～50ml甲苯中，130℃下磁力搅拌、冷凝回流2～4h后，加入110～150μL(EtO)3SiPrCN，继续回流20～30h，离心收集产品，并用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h，得到产物命名为HMSS-CN；将上述改性产物在30～50mL 50％硫酸中、120℃下剧烈搅拌回流3～5h，离心收集产物，并用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h，得到产物命名为HMSS-COOH。
(4)酶的固定化
称取HMSS-COOH 200～500mg与10～30ml发酵上清液混合均匀，在冰浴下匀速搅拌3～9h，低温离心收集沉淀，并用磷酸钾缓冲液(0.1mol/L，pH 6.5)洗涤3次，冷冻干燥12～24h，得到固定化酶。
固定化酶性质的表征如下：
酶活力的定量检测：将含有2％三丁酸甘油酯、2％阿拉伯胶的底物溶液经过超声波乳化形成的乳白色底物溶液，用碱调节pH为6.5。取10mL底物溶液与0.2mL发酵上清液或者10mg固定化酶混合，30℃反应10min，立即用20mmol/L NaOH滴定三丁酸甘油酯水解产生的游离酸。酶活力单位(U)定义为在一定温度、pH条件下，每分钟催化底物水解产生1μmol丁酸所需的酶量。
最适反应温度的测定：将游离酶和固定化酶的反应体系分别在20、25、30、35、40、45、50、60、70、80℃下各反应10min，定量测定酶活力，比较在不同反应温度下的酶活力，分别得到游离酶和固定化酶的最佳催化温度。
热稳定性的测定：将发酵上清液和固定化酶分别在20、30、40、50、60、70、80℃保温1h，然后再在30℃、pH6.5条件下检测酶活力，测定不同温度处理后游离酶和固定化酶的残留活力，比较热稳定性。
最适反应pH：配制pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的底物溶液，测定在不同pH条件下游离酶和固定化酶的酶活力，分别得出游离酶和固定化酶催化最适催化pH。
pH稳定性测定：将发酵上清液和固定化酶分别放置在不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的柠檬酸钠缓冲液中，冰浴下放置1h，然后将pH调到6.5，再在30℃下反应10min，定量测定残留酶活力，比较pH稳定性。
实施例1：HMSS的表征
图1给出制备的HMSS的XRD衍射图。检测条件：起始角度是5°，结束角是60°，扫面步长是0.016711。从图1中可以看出，产物在2为15°～34°间出现一宽峰，而其他角度处几乎没有杂质峰生成，说明得到的产物正是高纯度的标准无定型结构的二氧化硅。
实施例2：SEM扫面电子显微镜表征
图2为HMSS的SEM图，从图2中可以看出，该介孔二氧化硅的大部分粒子的粒径在300～400nm左右，形状非常均一，为规则的圆球状。
实施例3：TEM透射电子显微镜表征
图3为HMSS的TEM图，从图3中可以看到，粒子粒径在300～400nm左右，呈规则球形。球体内部有大面积的亮白中空部分，这些亮白部分的形成，正是由于球体内部被蚀刻而形成的中空结构在透射电镜的检测下所表现出来的，这说明该粒子内部为明显的中空结构。实施例4：BET氮气脱吸附比表面积表征
图4为HMSS的BET脱吸附曲线，图5为BJH的吸附孔径分布曲线，HMSS的BET表面积为438.4m2/g，BJH吸附孔容是0.51cm3/g，平均孔径是3.9775nm。BET脱吸附曲线为典型的H1型迟滞回线，表明该HMSS孔径分布相对较窄，粒子的尺寸比较均一；从吸附孔径分布曲线看，第一个高峰出现在2～4nm之间，这个峰最高最大，几乎没有其他峰出现，这说明该粒子的孔径大部分都大于2nm，几乎都在50nm以内，这是典型的介孔材料的孔径特征。结果说明本研究中的HMSS为典型的介孔材料。
实施例5：HMSS、改性HMSS、固定化酶的红外检测
为了定性检测HMSS是否改性成功以及酶是否被成功被固定化，对实验过程中的产物做了红外光谱检测。如图6，与HMSS的图谱相比较，在HMSS-CN的图谱中，波数2248.82cm-1处出现了明显的伸缩峰，该峰正是氰基的特征伸缩振动吸收峰，这说明在HMSS上成功引入了氰基；而在HMSS-COOH的图谱中，波数2248.82cm-1处的伸缩峰消失了，在波数1716.23cm-1处出现了明显的伸缩峰，此新出现的伸缩峰正是羰基的特征伸缩振动吸收峰，这说明氰基完全水解成了羧基；而在HMSS-CALB中，波数1716.23cm-1处的伸缩峰消失了，而波数1551.09cm-1处出现了一个明显的伸缩峰，此伸缩峰正是酰胺键的伸缩振动吸收峰，这初步说明发酵上清液中CALB成功的被固定化在改性的HMSS上。
实施例6：HMSS、改性HMSS、固定化酶的元素分析
为了进一步确定HMSS是否被成功改性以及酶是否被成功固定化，对HMSS、HMSS-CN、HMSS-COOH、HMSS-CALB分别做了元素分析。在是实验过程中发生了如下三步反应：
如图7所示，结合上述反应和实验数据分析，HMSS改性成HMSS-CN，负载上-CN基团使得C、N百分含量都有所升高，N的增加更加显著；将HMSS-CN水解成HMSS-COOH后，由于氧原子的大量介入，使得C的百分含量大幅度降低，由于引入-COOH的同时虽然也引入了H，O元素分子量大于H的分子量，使得H百分含量反而表现出稍微降低；HMSS-CALB与HMSS-COOH相比较，固定上了蛋白质后，C的百分含量大幅度升高，N、H百分含量也有略微的升高，但幅度不大，这是由于蛋白质中C的百分含量最高，C元素的增加量掩盖了N、H的增加量。由此结果可得知HMSS已经成功得到改性并且CALB已经成功被固定在改性后的HMSS上。
实施例7：固定化过程中蛋白残留量、酶活力残留量的分析
为了更准确的确定酶的固定化方式是通过物理吸附的方式还是通过形成共价键的方式，分别用等质量的HMSS和HMSS-COOH对等量的发酵上清液做固定化过程，并定时取样对上清液进行蛋白含量和酶活力的测定。如图8为蛋白的相对含量曲线变化趋势，可以看到，固定化过程中HMSS-COOH对蛋白的吸附量远远高于HMSS，特别是在3h后，HMSS中上清液的蛋白含量有增有减，极不稳定，这是由于HMSS对酶的固定化方式仅仅是物理吸附，非常不稳定，使得酶会解吸重新回到溶液中，而HMSS-COOH中的上清液中的蛋白含量在3h后相对比较稳定，这说明HMSS-COOH固定CALB主要是靠化学键的作用，物理吸附的方式存在但作用非常微小；图9为上清液的相对酶活力的比较，同样，HMSS固定化体系中的上清液的酶活力在整个过程中都较高，而HMSS-COOH固定化体系中上清液酶活力在3h后较低且趋于稳定。说明本研究中改性材料对酶的固定化方式包括物理吸附和共价结合两种形式，但前者作用微乎其微，起主导作用的还是后者。
实施例8：固定化酶与游离酶最适催化温度的比较
如图10，游离酶、固定化酶的最适催化温度分别是30℃、45℃，分别设为100％，固定化酶的最优催化温度与游离酶相比提高了15℃，而且在50～80℃高温下的酶活力都高于游离酶，说明固定化酶与游离酶相比，具有较强的抗热能力。
实施例9：固定化酶和游离酶热稳定性的比较
将没有在特定温度下孵育的酶的活力设置成100％。如图11，可以看出，在60℃中保温1h，固定化酶仍然可以保存50％左右的酶活，而游离酶相对酶活力仅有3％左右，在70、80℃中保温1h，固定化酶的相对酶活力依然可以在25％以上，而游离酶几乎没有活性，由此可见，该固定化酶在耐热能力上较游离酶存在明显的优势。
实施例10：固定和酶与游离酶最适催化pH的比较
由图12可知，游离酶、固定化酶的最优催化pH都是6.5，在此条件下催化的酶活力分别都设为100％。固定化酶在pH为7、7.5、8、8.5的环境中的相对酶活力都高于游离酶，这说明此固定化酶较游离酶具有更强的酸碱耐受范围。
实施例11：固定化酶和游离酶pH稳定性的比较
将游离酶和固定化酶分别置于不同的pH的柠檬酸钠缓冲溶液中冰浴1h，配置pH为6.5的底物溶液，再将两种状态的酶在各自的最适温度下催化反应，测定酶活，将没有用酸碱处理过的酶的活性力定义成100％。如图13，从曲线中可以看出，固定化酶在pH为6.0的缓冲溶液中的相对酶活力相对最高，而游离酶则在pH为6.5的缓冲溶液中相对较高。从曲线的变化趋势可以分析出，无论是在过酸性环境还是在过碱性环境中，固定化酶的相对活力都高于游离酶的相对活力，这说明该固定化酶的有良好的抗酸抗碱的能力。
改性中空介孔二氧化硅来固定脂肪酶的优势，在于共价交联的固定化方式使固定化酶在催化过程中不易从载体上脱落，增强其重复利用的能力。同时，载体本身的中空结构能够更好地保护酶在催化过程中耐热、耐酸碱的能力而不易失活。固定化酶制备的过程中，材料的制备与改性尤为重要，固定化酶性质的探究对其日后在工业上的应用也相当重要。
本发明首先利用溶胶凝胶法制备出普通二氧化硅，再在阳离子表面活性剂的作用下制备出中空结构的二氧化硅，然后通过化学改性的作用使其附上羧基官能团并与目标酶上的非功能氨基发生脱水缩合反应达到固定化的效果。该方法得到了较高活力的固定化酶，且它的催化最适温度比游离酶的高15℃，其耐热、酸碱能力远远强于游离酶。

Claims (8)

1.固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将菌种活化、培养后上罐发酵得游离酶液；所述菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)CALB，已于2015年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.10277；
2)制备中空介孔SiO2，具体方法如下：
将无水乙醇和去离子水混合，再加入氨水，混合后，加入TEOS，再离心收集白色沉淀，第1次洗涤和干燥，然后超声分散在去离子水中，加入CTAB溶液和Na2CO3，离心收集沉淀后，第2次洗涤和干燥，得到HMSS；所述无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液和Na2CO3的配比为(25～30)ml∶(2～4)ml∶(1～2)ml∶(2～3)ml∶(3.5～4.5)ml∶(0.6～1)g，其中，无水乙醇、去离子水、氨水、TEOS、CTAB溶液以体积计算，Na2CO3以质量计算；
3)HMSS的改性
将HMSS超声分散在甲苯中，磁力搅拌、冷凝回流后，加入(EtO)3SiPrCN，继续回流，离心收集产品，第1次洗涤和干燥后，得改性产物HMSS-CN；再将改性产物在硫酸中回流，离心收集产物，第2次洗涤和干燥后，得到产物，命名为HMSS-COOH；所述HMSS、甲苯、(EtO)3SiPrCN的配比为(1～2)g∶(20～50)ml∶(110～150)μL，其中，HMSS以质量计算，甲苯、(EtO)3SiPrCN以体积计算；
4)酶的固定化
将HMSS-COOH与游离酶液混合，在冰浴下搅拌，离心收集沉淀，并用磷酸钾缓冲液洗涤，冷冻干燥后，即得到固定化脂肪酶；所述HMSS-COOH与游离酶液的配比为(200～500)mg∶(10～30)ml，其中，HMSS-COOH以质量计算，游离酶液以体积计算。
2.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述活化的方法为：从甘油管中接500～1000μL菌液到装有25mL YPD培养基的250mL的锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养24～48h，转接一次；所述YPD培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。
3.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的方法为：将活化后菌体按5％～10％的接种量接种到装有50mL BMGY培养基的500mL锥形瓶中，30℃、200rpm回转式摇床培养12～36h；所述BMGY培养基的组成为：10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，10g/L甘油，1mol/L磷酸钾，pH6.0。
4.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述上罐发酵的方法为：将种子液按5％～10％的接种量接种到BSM培养基中，发酵开始12h后，2～4h内流加50％甘油作为碳源，24h后，平均每24h补加80～160mL甲醇，诱导菌体产酶，120～144h后停止发酵，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液；所述BSM培养基的组成为：甘油40g/L，磷酸26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，PTM1 4mL/L，pH用氨水调为6.5。
5.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述第1次洗涤和干燥的条件为：采用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，再置于鼓风干燥箱内70～80℃干燥24h；所述超声分散的条件为将第1次干燥后的产物2g超声分散在350～400ml去离子水中；所述CTAB溶液的质量浓度为12.5mg/ml；所述第2次洗涤和干燥的条件为：用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。
6.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述磁力搅拌、冷凝回流的条件为130℃下磁力搅拌、冷凝回流2～4h；所述继续回流的时间为20～30h；所述第1次洗涤和干燥的条件是用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。
7.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述将改性产物在硫酸中回流的条件是将改性产物在30～50mL质量浓度为50％硫酸中、120℃下搅拌回流3～5h；所述第2次洗涤和干燥的条件是用无水乙醇和去离子水各洗涤2次，放置鼓风干燥箱内70～80℃干燥24～48h。
8.如权利要求1所述固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述冰浴下搅拌的时间为3～9h；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L，pH6.5；所述洗涤的次数为3次；所述冷冻干燥的时间为12～24h。
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