CN114457064A - 一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法与应用，涉及油脂化工技术领域。本发明的制备方法，包括以下步骤，先将硅源、模板剂溶于醇溶液，30‑60℃反应3‑5h后，静置18‑24h，得到六方介孔硅；后加入氨基硅烷和交联剂反应得到活化的氨基改性的六方介孔硅；最后采用共价固定化的方式将皱褶假丝酵母脂肪酶固定化于活化后的六方介孔硅上，得到所述固定化脂肪酶催化剂。本发明所述的固定化脂肪酶催化剂采用化学共价固定化方法对脂肪酶进行固定化，即利用双功能交联剂连接氨基功能化的介孔硅与脂肪酶通过化学键进行连接，增强了固定化作用。
Description
技术领域
本发明涉及油脂化工技术领域，尤其涉及一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法与应用。
背景技术
脂肪酸可用作表面活性剂、润滑剂、合成中间体、肥皂原料和食品添加剂等，在有机合成、油脂化工、制药、日用品和食品生产等领域具有广泛应用。
通过油脂水解产生脂肪酸的工艺有皂化法、高温逆流水解法和酶催化油脂水解法等。其中皂化法通常造成设备腐蚀和排放污染等问题，而高压逆流水解法由于工艺简单、可连续化生产和不需要使用催化剂等优点，成为工业化水解油脂生产脂肪酸的主要工艺，然而其高温高压的条件导致其耗能高，且不适合用于水解高碘值或含羟基的油脂。
脂肪酶酶催化水解法具有能耗低和催化效率高等优点，但脂肪酶的成本高，环境耐受性差，尤其由于脂肪酶酶溶于水而导致其重复利用率低，因此工业化应用受到一定限制。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中脂肪酶催化剂的合成成本高、环境耐受性差、重复利用率低的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法与应用。该催化剂具有制备简易温和，催化效率高、可重复利用的特点。
本发明的第一个目的是提供一种固定化脂肪酶催化剂的制备方法，包括以下步骤，
(1)将硅源、模板剂溶于醇溶液，30-60℃反应3-5h后，静置18-24h，得到六方介孔硅；
(2)将氨基硅烷和步骤(1)所述的六方介孔硅80-110℃下回流反应10-14h，得到氨基改性的六方介孔硅；
(3)将交联剂和步骤(2)所述的氨基改性的六方介孔硅反应3-6h，得到活化的六方介孔硅；
(4)采用共价固定化的方式将皱褶假丝酵母脂肪酶固定化于步骤(3)所述的活化的六方介孔硅上，得到所述固定化脂肪酶催化剂。
在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述硅源为正硅酸四乙酯和/或正硅酸四丁酯，硅源用于形成二氧化硅骨架。
在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述模板剂为十二胺、十六胺和十八胺中的一种或多种，模板剂选长链胺，为了在骨架中占据孔位，除去模板剂后可成孔。
在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述硅源和模板剂的摩尔比为1：0.1-0.3。
在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，所述醇溶液为醇的水溶液。
在本发明的一个实施例中，在步骤(1)中，还包括对所述六方介孔硅用无水乙醇或丙酮作为萃取剂索式提取除去模板剂。索氏提取则是通过使用少量提取剂乙醇可以有效除去模板剂；并不是所有的介孔硅都适用索式提取，本发明采用的模板剂和硅源之间以氢键相互作用，因此易于在二氧化硅骨架形成之后索氏提取除去模板剂；其它二氧化硅的硅源和模板剂往往通过离子键结合，高温煅烧才是除去模板剂的有效方法。
在本发明的一个实施例中，在步骤(2)中，所述氨基硅烷为3-氨基丙基三乙氧基硅烷和/或3-氨基丙基甲氧基硅烷。氨基硅烷的硅羟基与二氧化硅HMS的硅羟基进行脱水缩合，因此能够使得HMS表面接上氨基硅烷，即HMS表面氨基改性为HMS-NH2。
在本发明的一个实施例中，在步骤(2)中，所述氨基硅烷和六方介孔硅的体积质量比为0.5-3：1mL/g。
在本发明的一个实施例中，在步骤(3)中，所述交联剂为己二醛、戊二醛、丁二醛和乙二醛中的一种或多种。交联剂在常温下能与氨基发生席夫碱反应，生成碳氮双键，从而以化学键的方式结合载体和酶，使得酶不容易脱落，且选用的交联剂在生物交联剂领域中成本低、处理方式简单，有工业化应用的潜力。
在本发明的一个实施例中，在步骤(3)中，所述交联剂和氨基改性的六方介孔硅的体积质量比为10-40：1μL/g。
本发明的第二个目的是提供一种所述的制备方法制得的固定化脂肪酶催化剂。
本发明的第三个目的是提供一种所述的固定化脂肪酶催化剂在催化大豆油水解中的应用。
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的固定化脂肪酶催化剂采用化学共价固定化方法对脂肪酶进行固定化，即利用双功能交联剂连接氨基功能化的介孔硅与脂肪酶通过化学键进行连接，增强了固定化作用。
(2)本发明所述的固定化脂肪酶催化剂将酶共价负载于介孔硅，有利于提高酶的环境耐受性和稳定性，同时避免由于脂肪酶溶于水而流失，从而提高了酶的重复利用率。
(3)本发明所述的载体介孔硅HMS的制备条件为低温常压条件，且利用索氏提取法代替煅烧法除去模板剂，能耗降低，同时萃取剂可重复利用。因此，载体的制备成本相对较低，制备条件简易温和，且实现了脂肪酶的重复利用，是具有潜在竞争力的绿色合成及应用路线。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明实施例1的合成路线图。
图2为本发明测试例1中BSA的浓度-吸光度标准曲线图。
图3为本发明测试例2中p-NP的浓度-吸光度标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
参照图1所示，一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)在250mL三口烧瓶中加入2.31g十二胺，20mL乙醇和80mL去离子水，置于45℃油浴中进行300rpm电动搅拌，逐滴加入13.4mL四硅酸正乙酯和12mL乙醇的混合物，继续在上述条件下反应4h后，室温下静置18h，9000rpm离心3min，水和乙醇分别洗涤3次，80℃烘干12h，取1g烘干后固体，用100mL无水乙醇回流索式提取8h，得到六方介孔硅(HMS)。
(2)在250mL单口烧瓶中加入1g上述所得到的HMS，加入48mL甲苯，置于85℃油浴中进行600rpm磁力搅拌10min充分分散，逐滴滴加2mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷，继续在上述条件下回流反应12h，冷却至室温后，9000rpm离心3min，乙醇洗涤3次，80℃烘干12h，得到HMS-NH2。
(3)在100mL单口烧瓶中加入1g上述所得到的HMS-NH2，加入46mL去离子水，在室温下进行600rpm磁力搅拌10min充分分散，逐滴滴加4mL25％戊二醛水溶液，继续在上述条件下搅拌4h，9000rpm离心3min，去离子水洗涤3次，80℃烘干12h，得到HMS-CHO。
(4)在50mL单口烧瓶中加入1g上述所得到的HMS-CHO，加入20mL0.02g/mL皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)的磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6.7)，在室温下进行600rpm磁力搅拌24h，30℃烘干48h，得到固定化脂肪酶HMS-CRL。
实施例2
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同同实施例1，将步骤(1)中的静置时间调整为24h，得到HMS。
实施例3
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同同实施例1，将步骤(2)中HMS、甲苯和3-氨基丙基三乙氧基硅烷的加入量分别调整为2g、96mL和4mL，得到HMS-NH2。
实施例4
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同同实施例1，将步骤(3)中HMS-NH2、去离子水和戊二醛的加入量分别调整为2g、96mL和4mL，得到HMS-NH2。
实施例5
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同实施例1，将步骤(1)中的硅源调整为正硅酸四丁酯，得到HMS。
实施例6
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同实施例1，将步骤(2)中的氨基硅烷改为3-氨基丙基甲氧基硅烷，得到HMS-NH2。
实施例7
一种固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，具体包括以下步骤：
基本同实施例1，将步骤(3)中的交联剂改为丁二醛，得到HMS-CHO。
对比例1
基本同实施例1，步骤(2)中不加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，结果显示在步骤(3)中无法连接上戊二醛，脂肪酶无法进行固定化，说明对HMS表面进行氨基功能化是后期固定化脂肪酶的必要步骤。
对比例2
基本同实施例1，步骤(3)中不加入戊二醛，结果显示脂肪酶无法进行固定化，说明步骤(3)中的戊二醛起了交联剂的作用。
对比例3
分别使用实例1中的HMS、HMS-NH2和HMS-CHO用于水解活性测定，结果显示上述三种载体均无催化活性，说明步骤(4)中脂肪酶能够固定化于载体上。
测试例1
采用Braford法测定脂肪酶的酶固载量。在实施例1的基础上，分别将步骤(4)中固定化前后的CRL溶液各稀释10倍后，取25μL与100μL考马斯亮蓝溶液混合，用酶标仪测定其在595nm处的吸光度，根据牛血清白蛋白(BSA)的浓度-吸光度标准曲线，如图1所示，按照下式计算固定化前后CRL溶液的浓度，其中c0和c1分别为为固定化前后CRL溶液的浓度。结果显示，固定化前后酶溶液的吸光度分别为0.642和0.345，计算得到酶固载量为5.79mg/g，说明脂肪酶CRL能够固定化于载体上。
测试例2
(1)取0.03g对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于10mL异丙醇与90mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6.7)中，加入0.5gTritonX-100，得到p-NPP底物溶液，在4℃下保存。
(2)取0.1g实施例1的HMS-CRL与4mLp-NPP底物溶液分别在40℃下预热5min后混合，160rpm振荡10min后离心，取上清液，稀释5倍后，用酶标仪测定上清液在405nm处的吸光度，根据对硝基苯酚的浓度-吸光度标准曲线如图2所示，得到对硝基苯酚(p-NP)的浓度，从而计算得到酶活，并以第一次剩余活性为100％为基准计算不同循环使用次数对应的剩余活性。酶活的定义为在实验条件下催化水解p-NPP产生1μmol对硝基苯酚所需的酶制剂的质量，单位为U/g。
(3)向离心后的沉淀中继续加入4mLp-NPP底物溶液，重复上述过程5次，计算得到循环使用对HMS-CRL酶活的影响，如表1所示，表1为催化剂固定化脂肪酶HMS-CRL的酶活测定结果。结果显示，该催化剂循环使用5次后酶活剩余量为69％，达到催化剂重复回收利用的效果。
表1
测试例3
在150mL锥形瓶中加入1.84g底物大豆油和1mL磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝6.7)，在恒温水浴摇床中40℃预热10min后，加入0.184g实施例1的固定化脂肪酶催化剂，在40℃和振荡转速为200rpm的条件下反应24h，以酚酞为指示剂，用氢氧化钾溶液滴定反应体系的酸值，计算得到水解率。以水解率作为指标，所得的催化性能如表2所示，表2为固定化脂肪酶催化剂催化的反应结果。结果显示，催化剂HMS-CRL能够对大豆油进行水解并且性能较为稳定，水解率达到90％。
表2
测试例4
测定固定化脂肪酶催化剂的循环利用性能。在测试例3反应完成后，将固定化脂肪酶催化剂过滤，洗涤，将该催化剂循环使用，继续反应12h，以水解率作为指标，所得的催化性能如表3所示，表3为固定化脂肪酶催化剂催化的反应结果。结果显示，在重复利用后，催化剂活性有所降低，在分离过程中有部分催化剂的损失以及酶的失活，但5次使用后仍能保持一定活性，因此在实际催化大豆油水解应用中，该催化剂具有一定重复循环使用的性能。
表3
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)将硅源、模板剂溶于醇溶液，30-60℃反应3-5h后，静置18-24h，得到六方介孔硅；
(2)将氨基硅烷和步骤(1)所述的六方介孔硅80-110℃下回流反应10-14h，得到氨基改性的六方介孔硅；
(3)将交联剂和步骤(2)所述的氨基改性的六方介孔硅反应3-6h，得到活化的六方介孔硅；
(4)采用共价固定化的方式将皱褶假丝酵母脂肪酶固定化于步骤(3)所述的活化的六方介孔硅上，得到所述固定化脂肪酶催化剂。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述硅源为正硅酸四乙酯和/或正硅酸四丁酯；所述模板剂为十二胺、十六胺和十八胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述硅源和模板剂的摩尔比为1：0.1-0.3。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，还包括对所述六方介孔硅用无水乙醇或丙酮作为萃取剂索式提取除去模板剂。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述氨基硅烷为3-氨基丙基三乙氧基硅烷和/或3-氨基丙基甲氧基硅烷。
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述氨基硅烷和六方介孔硅的体积质量比为0.5-3：1mL/g。
7.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述交联剂为己二醛、戊二醛、丁二醛和乙二醛中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述交联剂和氨基改性的六方介孔硅的体积质量比为10-40：1μL/g。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的固定化脂肪酶催化剂。
10.如权利要求9所述的固定化脂肪酶催化剂在催化大豆油水解中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1792787A (zh) * | 2005-11-22 | 2006-06-28 | 南开大学 | 一种介孔二氧化硅材料的制备方法 |
| JP2011015611A (ja) * | 2009-06-10 | 2011-01-27 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体 |
| CN104593278A (zh) * | 2015-02-04 | 2015-05-06 | 厦门大学 | 固定化脂肪酶的制备方法 |
| CN111729686A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-02 | 上海应用技术大学 | 一种以介孔氧化硅hms为载体的环己烯选择性氧化催化剂及其制备方法与应用 |
| CN111849958A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-30 | 北京西峰科技有限责任公司 | 一种固载化脲酶及其制备方法与应用 |
-
2022
- 2022-03-17 CN CN202210263957.XA patent/CN114457064A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1792787A (zh) * | 2005-11-22 | 2006-06-28 | 南开大学 | 一种介孔二氧化硅材料的制备方法 |
| JP2011015611A (ja) * | 2009-06-10 | 2011-01-27 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | シリカ系メソ多孔体−光学異性相互変換酵素複合体 |
| CN104593278A (zh) * | 2015-02-04 | 2015-05-06 | 厦门大学 | 固定化脂肪酶的制备方法 |
| CN111729686A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-02 | 上海应用技术大学 | 一种以介孔氧化硅hms为载体的环己烯选择性氧化催化剂及其制备方法与应用 |
| CN111849958A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-30 | 北京西峰科技有限责任公司 | 一种固载化脲酶及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CHUNFENG WANG等: "Improvement of the activation of lipase from Candida rugosa following physical and chemical immobilization on modified mesoporous silica", 《MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING: C》 * |
| GANAPATI D.YADAV等: "Synthesis of reusable lipases by immobilization on hexagonal mesoporous silica and encapsulation in calcium alginate: Transesterification in non-aqueous medium", 《MICROPOROUS AND MESOPOROUS MATERIALS》 * |
| PEDRO REIS等，: "Mesoporous materials as host for an entrapped enzyme", 《MICROPOROUS AND MESOPOROUS MATERIALS》 * |
| 方梅: "介孔分子筛固定褶皱假丝酵母脂肪酶及其催化性能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
| 王磊等: "介孔SiO_2的改性及对诺维信漆酶的交联固定化", 《无机化学学报》 * |
| 范修霖等: "皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL）催化水解大豆油优化工艺及机理研究", 《中国油脂》 * |
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