CN101671663A - 玉米芯固定化脂肪酶制备方法及其产品 - Google Patents

玉米芯固定化脂肪酶制备方法及其产品 Download PDF

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本发明公开了一种玉米芯固定化脂肪酶制备方法及其产品，这种固定化脂肪酶制备步骤包括：(1)将玉米芯粉碎至粒度为30－100目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用氢氧化钾溶液浸泡后用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后柠檬酸溶液浸泡，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入三羟甲基氨基甲烷溶液，置于50℃－80℃温度下活化，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得到玉米芯载体；(2)将步骤(1)制备的玉米芯载体与脂肪酶酶液混合均匀，在30℃－42℃下固定6－12小时，取出固定化的载体，用磷酸盐溶液清洗载体表面未被吸附的脂肪酶，干燥后得到玉米芯固定化脂肪酶产品。本发明的玉米芯固定化脂肪酶的酶活力回收率达23.4％－55.3％，催化效能高，使用寿命长。

Description

玉米芯固定化脂肪酶制备方法及其产品
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法。
背景技术
脂肪酶是一种甘油酯水解酶，已广泛应用于食品、医药、日用化工和造纸等领域。特别是最近随着能源供应的日趋紧张，脂肪酶在生物柴油的转化方面引起了人们的广泛关注，许多专家学者尝试着用脂肪酶催化植物油、地沟油和动物油等合成生物柴油。为解决游离酶的缺陷，人们发明了酶固定化技术。与游离酶相比，固定化酶不仅保持了酶高效和专一的催化特点，而且还能大大提高酶的稳定性，容易回收重复利用，因此，酶固定化技术一直是研究的热点。脂肪酶常用的固定化载体包括天然多孔材料、各类凝胶、合成树脂、复合改性材料和磁性微球等。目前，市场上也有许多商品化的固定化脂肪酶，例如以高分子合成树脂载体，采用共价结合法的固定化脂肪酶活力较高，但是，生产成本高，生产过程酶活损失大，导致产品固定化酶价格很高，使得工业大规模生产受到限制。因此要发展生物酶法转化生物柴油的规模化生产，如何降低脂肪酶生产成本是关键之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能降低成本，充分利用自然资源，生产中酶活损失小的玉米芯固定化脂肪酶及其产品。
玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米芯粉碎至粒度为30-100目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用氢氧化钾溶液浸泡后用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后柠檬酸溶液浸泡，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入三羟甲基氨基甲烷溶液，置于50℃-80℃温度下活化，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得到玉米芯载体；
(2)将步骤(1)制备的玉米芯载体与脂肪酶酶液混合均匀，在30℃-42℃下固定6-12小时，取出固定化的载体，用磷酸盐溶液清洗载体表面未被吸附的脂肪酶，干燥后得到玉米芯固定化脂肪酶产品。
上述步骤(1)中用于浸泡玉米芯粉末的氢氧化钾溶液的浓度为25％-50％，浸泡的时间为10-20小时。用于浸泡玉米芯粉末的柠檬酸溶液的浓度为2％-5％，浸泡时间10-20小时。三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为2％-7％，于50℃-80℃温度下的活化时间为3-5小时。上述步骤(2)中玉米芯载体与脂肪酶液体混合的比例为：每公斤玉米芯载体配5-20升的脂肪酶酶液。清洗载体表面未被吸附的脂肪酶所用的是磷酸盐溶液。所述脂肪酶液为脂肪酶粗酶配置的溶液或微生物发酵后得到的含有脂肪酶的液体。
本发明玉米芯固定化脂肪酶制备方法及其产品有如下优点：(1)所用玉米芯载体为农作物废弃物，资源丰富，价格低，绿色环保，很适合作工业化生产的原料，玉米芯作为固定化脂肪酶的载体使用时，还具有容易自然分解，对环境污染小的优点；(2)玉米芯的主要成分为纤维素、半纤维素、木质素及少量无机硅，经粉碎机粉碎后，在显微镜下观察有许多孔状结构，因此，具有很好的吸附性能。(3)活化玉米芯时引入了大量的氨基、羟基和羧基，有利于脂肪酶的交联吸附；(4)本发明方法制备固定化脂肪酶的工艺简单，成本相对较低，有利于大规模的工业化生产。
具体实施方式
以下用具体实施例对本发明技术方案作进一步的说明：
实施例中用的脂肪酶为绿微康生物工程有限公司生产的青霉脂肪酶粗酶粉(10000lu/g)。脂肪酶液的配制方法为：取定量的脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液中(酶粉∶缓冲液为1∶10，单位Kg/L)，混合均匀，离心，上清液即为本工艺所需的脂肪酶液。配制脂肪酶酶液所用的是pH值为4.8-6.8的K2HPO4-KH2PO4磷酸盐溶液。所述脂肪酶液也可以采用微生物发酵后得到的含有脂肪酶的液体。
实施例1
本实施方式制备玉米芯固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)将玉米芯粉碎至粒度为60目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用浓度20％的氢氧化钾溶液浸泡20小时，再用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后用浓度1％柠檬酸溶液浸泡20小时，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入2％三羟甲基氨基甲烷溶液，(酸碱处理后的玉米芯粉末与三羟甲基氨基甲烷溶液的配比为每公斤玉米芯粉加10升三羟甲基氨基甲烷溶液)，置于50℃温度下活化5小时，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得玉米芯载体。
(2)取0.5kg上述玉米芯载体于4L pH值4.8磷酸盐配制的脂肪酶溶液中混合均匀，即玉米芯粉与脂肪酶酶液的配比为：每公斤玉米芯粉用8升脂肪酶酶液，在30℃下固定6小时，取出固定化的载体，用磷酸盐溶液洗涤载体表面未被吸附的脂肪酶后过滤，干燥后得固定化脂肪酶产品，经检测酶活回收率达到33.4％。
实施例2
本实施方式制备玉米芯固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)将玉米芯粉碎至粒度为30目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用浓度50％的氢氧化钾溶液浸泡10小时，再用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后用浓度5％柠檬酸溶液浸泡10小时，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入7％三羟甲基氨基甲烷溶液(玉米芯粉与三羟甲基氨基甲烷溶液的配比为每公斤玉米芯粉加10升三羟甲基氨基甲烷溶液)，置于80℃温度下活化3小时，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得玉米芯载体。
(2)取0.5kg上述玉米芯载体于5.5L pH值4.8磷酸盐配制的脂肪酶溶液中混合均匀，即玉米芯粉与脂肪酶酶液的配比为：每公斤玉米芯粉用11升脂肪酶酶液，在36℃下固定9小时，取出固定化的载体，用pH值4.8磷酸盐溶液洗涤载体表面未被吸附的脂肪酶后过滤，干燥后得固定化脂肪酶产品，经检测酶活回收率达到26.7％。
实施例3
本实施方式制备玉米芯固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：
(1)玉米芯载体的制备：将玉米芯粉碎至粒度为100目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用浓度25％的氢氧化钾溶液浸泡12小时，再用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后用浓度3％柠檬酸溶液浸泡12小时，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入5％三羟甲基氨基甲烷溶液(玉米芯粉∶三羟甲基氨基甲烷溶液为1∶10，单位Kg/L)，置于60℃温度下活化4小时，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得玉米芯载体。
(2)固定化脂肪酶的制备：固定化脂肪酶的制备：取0.5kg上述玉米芯载体于7L pH值6.8磷酸盐配制的脂肪酶溶液中混合均匀，即玉米芯粉与脂肪酶酶液的配比为：每公斤玉米芯粉用14升脂肪酶酶液，在42℃下固定12小时，取出固定化的载体，用pH值6.8磷酸盐溶液洗涤载体表面未被吸附的脂肪酶后过滤，干燥后得固定化脂肪酶产品，经检测酶活回收率达到48.8％。
实施例4-9操作方法同实施例1-3，各工艺参数按表1所示。
表1.实施例4~9工艺参数表
  参数  实施例4   实施例5  实施例6  实施例7  实施例8  实施例9
  玉米芯粉粒度(目)  30   60  100  30  60  100
  氢氧化钾(％)  30   35  25  40  40  45
  氢氧化钾溶液浸泡时间(小时)  15   15  12  12  13  14
  柠檬酸(％)  3   5  2  4  5  3
  柠檬酸溶液浸泡时间(小时)  15   15  12  12  13  14
  三羟甲基氨基甲烷(％)  7   4  5  6  4  5
  三羟甲基氨基甲烷溶液活化时间(小时)  3   4  3  4  4  3
  活化温度(℃)  50   50  60  80  70  60
  酶液/载体比(L/kg)  20∶1   11∶1  11∶1  14∶1  8∶1  5∶1
  酶固定化pH  4.8   5.8  6.8  5.8  5.8  6.8
  酶固定化温度(℃)  42   30  42  36  42  36
  酶固定化时间(小时)  6   12  9  6  12  9
  活力回收率(％)  23.4   36.4  55.3  30.7  34.9  52.5

Claims (8)

1.一种玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玉米芯粉碎至粒度为30-100目的粉末，玉米芯粉末先用去离子水洗涤滤去水分，后用氢氧化钾溶液浸泡后用去离子水洗涤至中性滤去水分，然后柠檬酸溶液浸泡，用去离子水洗涤至中性去水分后，再加入三羟甲基氨基甲烷溶液，置于50℃-80℃温度下活化，活化结束取出样品用去离子水洗涤去水分，干燥后得到玉米芯载体；
(2)将步骤(1)制备的玉米芯载体与脂肪酶酶液混合均匀，在30℃-42℃下固定6-12小时，取出固定化的载体，用磷酸盐溶液清洗载体表面未被吸附的脂肪酶，干燥后得到玉米芯固定化脂肪酶产品。
2.根据权利要求1所述玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中用于浸泡玉米芯粉末的氢氧化钾溶液的浓度为20％-50％，浸泡的时间为10-20小时。
3.根据权利要求1所述玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中用于浸泡玉米芯粉末的柠檬酸溶液的浓度为1％-5％，浸泡时间10-20小时。
4.根据权利要求1所述玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为2％-7％，于50℃-80℃温度下的活化时间为3-5小时。
5.根据权利要求1所述的玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中玉米芯载体与脂肪酶液体混合的比例为：每公斤玉米芯载体配5-20升的脂肪酶酶液。
6.根据权利要求1所述玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中清洗载体表面未被吸附的脂肪酶所用的是磷酸盐溶液。
7.根据权利要求1所述玉米芯固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶液为脂肪酶粗酶配置的溶液或微生物发酵后得到的含有脂肪酶的液体。
8.一种根据权利要求1-7之一所述方法制备的玉米芯固定化脂肪酶。
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