CN111849958A - 一种固载化脲酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种固载化脲酶及其制备方法和应用。所述固载化脲酶，包括：载体；脲酶，所述脲酶负载在所述载体上；其中，所述载体为硅胶、硅酸镁、氧化铝、SBA‑1、SBA‑2、SBA‑3、SBA‑15、HMS、MCM‑41、MCM‑48、MCM‑50、SAPO‑34中的一种或两种以上。所述载体的介孔孔径为5～15nm。本发明提供的固载化脲酶，采用物理吸附的方式将脲酶固载在特定的载体上，未对脲酶结构进行调整，不仅保持了脲酶的活性，而且操作简单，易实现工业化操作，同时可以将脲酶与载体分开放置、保存，在使用前进行固载化操作，极大地降低储存和运输成本。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种固载化脲酶及其制备方法和应用。
背景技术
脲酶能高效的分解水溶液中的尿素，在医疗、生化分析、污水处理等领域具有广泛的应用前景。脲酶具有高的神经毒性，游离的脲酶溶于水，难以从水体系中回收和移除，不仅使用成本高，而且具有潜在的安全风险，对其在工业领域的应用造成限制。将脲酶固载于不溶于水的载体上，有利于脲酶的回收利用，降低成本和安全风险。脲酶的固定化方式有吸附、包埋、共价修饰、交联等。采用包埋的方式操作复杂，不利于大规模工业化使用。采用共价键修饰，酶与载体作用力强，不易脱落，但是共价键或交联的方式修饰会对酶的结构造成影响，降低酶的活性，且固载效率低，成本高。此外，这些固载方式存在固载酶保存的问题。固载后的脲酶体积大，半衰期短，通常不超过三个月，且对保存方式有特殊要求，导致保存成本高，不利于使用和运输。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种固载化脲酶及其制备方法和应用。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
一种固载化脲酶，包括：
载体；
脲酶，所述脲酶负载在所述载体上；
其中，
所述载体为硅胶、硅酸镁、氧化铝、SBA-1、SBA-2、SBA-3、SBA-15、HMS、MCM-41、MCM-48、MCM-50、SAPO-34中的一种或两种以上。
优选的，上述固载化脲酶中，所述脲酶的负载量低于0.1wt％，进一步优选为0.005～0.05wt％。
优选的，上述固载化脲酶中，所述载体的介孔孔径为5～15nm，进一步优选为6～9nm。
优选的，上述固载化脲酶中，所述载体的比表面积为50～500m2/g。
优选的，上述固载化脲酶中，所述载体的介孔孔体积为0.1～1.0cm3/g。
优选的，上述固载化脲酶中，所述载体的粒径为80～500目，更优选为200～500目，进一步优选为320～500目。
优选的，上述固载化脲酶中，所述载体为酸性γ-氧化铝，所述酸性γ-氧化铝的pH值为3.5～5.5，进一步优选为4.1～4.8。本发明中，所述酸性γ-氧化铝的pH值为将1g酸性γ-氧化铝加入3mL去离子水中得到的悬浮液的pH。
本发明还提供了一种上述固载化脲酶的制备方法，包括以下步骤：将所述载体和脲酶混合均匀，加水润湿，静置处理一段时间，从而得到所述固载化脲酶；优选静置处理10min以上。
本发明还提供了另一种上述固载化脲酶的制备方法，包括以下步骤：将脲酶溶于水得到脲酶溶液，将所述脲酶溶液加入所述载体中，静置处理一段时间，从而得到所述固载化脲酶；优选静置处理10min以上。
优选的，上述制备方法中，所述脲酶溶液的浓度为0.01～10mg/mL；和/或，所述脲酶与所述载体的质量比小于1:1000，优选为1:2000～1:20000。
本发明还提供了上述固载化脲酶或上述制备方法制备得到的固载化脲酶在分解溶液中尿素中的应用。
本发明所取得的有益效果：
本发明提供了一种固载化脲酶，采用物理吸附的方式将脲酶固载在特定的载体上，未对脲酶结构进行调整，不仅保持了脲酶的活性，而且操作简单，易实现工业化操作，同时可以将脲酶与载体分开放置、保存，在使用前进行固载化操作，极大地降低储存和运输成本。
附图说明
图1为实施例中所使用的γ-氧化铝的孔径分布图。
图2为不同pH的γ-氧化铝的脲酶固载测试结果对比。
图3为实施例13中脲酶析出率随时间变化图。
图4为试验例1中不同pH值下的尿素分解率。
图5为试验例2中填充柱连续工作性能。
图6为试验例3中填充柱的循环性能。
图7为试验例4中固载化脲酶储存稳定性测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的实验原料和相关设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所使用的γ-氧化铝经BET测试，比表面积为130.13m2/g，孔径为9.05nm，孔体积为0.32cm3/g，孔径分布如图1所示，将1g所述γ-氧化铝加入3mL水中得到的悬浮液pH为9.82。
实施例1
称取12g粉碎为200-300目粒径的γ-氧化铝装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集30min内所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表1。
其中，尿素分解率＝铵离子浓度*稀释倍数/2/尿素初始浓度*100％；
脲酶总析出率＝析出脲酶的活度/添加脲酶总活度*100％。
表1
实施例2
称取30gγ-氧化铝，加入50mL去离子水中，搅拌30min，过滤，放入管式炉中，250℃煅烧4h，冷却后即得。
取1g所得氧化铝与3mL去离子水混合，测试pH＝8.55。
称取12g粉碎为200-300目粒径的所得氧化铝，装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集30min内所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表2。
表2
实施例3
取30gγ-氧化铝，加入50mL去离子水中，向其中加入6mL冰乙酸，搅拌2h，过滤，去离子水洗涤三次，干燥后，放入管式炉中，250℃煅烧4h，冷却后即得。
取1g所得氧化铝与3mL去离子水混合，测试pH＝6.55。
取12g粉碎为200-300目粒径的所得氧化铝装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集30min内所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表3。
表3
实验例4盐酸处理对氧化铝固载脲酶的能力的影响
取30gγ-氧化铝放入50mL去离子水中，在机械搅拌下加入0.5mL浓盐酸(37％)，用pH计监测悬浊液pH值的变化，pH值随搅拌时间的延长，逐渐升高。当pH值达到设定值后，过滤得活性氧化铝，用50mL去离子水洗涤三次，干燥后，放入管式炉中，250℃煅烧4h，冷却后即得。取1g所得氧化铝与3mL去离子水混合，测试pH，结果见表4。
表4
由表4可知，与盐酸混合后，氧化铝-盐酸混合液的pH值与处理时间相关，随着处理时间的增加，pH值逐渐升高，表明氧化铝与盐酸发生反应，盐酸不断的消耗。煅烧后，氧化铝都呈现出酸性，且与盐酸反应时间越久，氧化铝的酸性越强。
将所得的氧化铝按照实施例1的方法，分别用于脲酶固载测试实验，结果如图2所示(图2中横坐标为煅烧处理后的pH)。
未加酸处理的γ-氧化铝与水悬浊液的pH值在9.82，其脲酶吸附性能较差，脲酶总析出率为9.78％。由图2可知，酸处理后的不同pH值的氧化铝对脲酶的固载性能明显不同。当氧化铝pH在3.58到5.55之间时，对脲酶均展现出吸附能力，且固载脲酶均对尿素具有高的分解效率。氧化铝的pH值为4.1到4.8之间，固载脲酶的总析出率及尿素的分解效率均展现出较好的性能，且它们的变化趋势相似，均存在峰值。在pH＝4.57时，处理后的氧化铝固载脲酶的性能最佳，脲酶的总析出率降到最低，且尿素分解效率最高。
实施例5
称取10g粉碎为200-300目粒径的实施例2中煅烧所得氧化铝与4mg脲酶混合均匀，填装至内径为2cm的柱子中，其中柱子下端预先填充2g氧化铝。填充后，压实，向其中加入水溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表5。
表5
实施例6
称取18g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装填至内径为2cm柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液10mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表6。
表6
实施例7
称取25g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装填至内径为2cm柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液10mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表7。
表7
实施例8
称取36g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装填至内径为2cm柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液20mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表8。
表8
实施例9
称取12g粉碎为320-500目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表9。
表9
实施例10
称取12g 200-300目的硅胶(青岛海洋化工公司，0190009)装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表10。
表10
实施例11
称取12g SBA-15(先丰纳米，100931)装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表11。
表11
实施例12
称取12g MCM-41(卓然环保，20190605)装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的磷酸缓冲液(pH＝7.0)淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，每10min取流出液1mL加1M盐酸1mL萃灭，测试铵离子浓度，计算尿素分解率。收集所有流出液，混匀后，取4mL加入到0.4M尿素的磷酸盐缓冲液中(pH＝7)，37℃振荡，每10min测试铵离子浓度变化，共测试5次，基于不同时间段的浓度通过线性拟合计算出析出脲酶活度，计算脲酶总析出率，具体结果见表12。
表12
实施例13
称取12g 200-300目的硅酸镁(阿拉丁试剂，G1903034)装填至内径为2cm的柱子中压实，向其中加入0.5mg/mL脲酶溶液7mL，静置10min，得到固载化脲酶柱。
用含有25mmol/L的尿素的溶液淋洗上述脲酶柱，控制流速为15ml/min，收集流出液，120min后停止淋洗，测试不同时间流出液中脲酶的总活度，计算脲酶不同时间的析出率，结果如图3所示。试验例1不同pH值下的尿素分解率
称取4g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装填至内径为2cm的柱子中压实，然后从填充柱上部加入3mL 0.4mg/mL脲酶的磷酸缓冲液，静置10min，待脲酶溶液完全浸润材料后用磷酸缓冲液以7.5mL/min的流速冲洗填充柱30mim,冲洗过后，用不同pH的100mM尿素的磷酸缓冲液以7.5mL/min的流速淋洗填充柱，温度控制在37℃，每5min取样，连续取30min，采用离子色谱检测铵根浓度，计算尿素平均分解率(即每次尿素分解率结果的算术平均值)。
图4为不同pH值下的尿素平均分解率对比，其中，数据进行了归一化处理，以得到的最高平均分解率为1。由图4可知，固载化脲酶的最适pH值工作范围在5左右，当pH在强酸性时(pH<3)脲酶活性很低。同时，固载化脲酶的较优pH值工作范围为弱酸性(pH为5-7左右)。
试验例2固载化脲酶连续工作性能测试
称取4g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，填充装柱，然后从填充柱上部加入3mL 0.4mg/mL脲酶的磷酸缓冲液，静置10min，待脲酶溶液完全浸润材料后用磷酸缓冲液以7.5mL/min的流速冲洗填充柱30mim,冲洗过后，用pH值为5的含100mM尿素的磷酸缓冲液以前述流速进行性能测试，温度控制在37℃,每隔5min取样1mL加入1mL 1M HCl淬灭反应，采用离子色谱检测铵根浓度，计算尿素分解率。图5为填充柱连续工作性能，其中，数据进行了归一化处理。由图5可知，固载脲酶性能稳定，连续工作2h后出现性能衰减，4h后性能开始稳定，持续运行8h性能保持80％左右。
试验例3固载化脲酶循环工作性能测试
称取4g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，填充装柱，然后从填充柱上部加入3mL 0.4mg/mL脲酶的磷酸缓冲液,静置10min，待脲酶溶液完全浸润材料后用磷酸缓冲液以7.5mL/min的流速冲洗填充柱30mim,冲洗过后，用pH值为5的含100mM尿素的磷酸缓冲液以前述流速进行性能测试，温度控制在37℃,每隔5min取样1mL加入1mL 1M HCl淬灭反应，取样5次，采用离子色谱检测铵根浓度，计算尿素平均分解率。测试完成后，用磷酸缓冲液冲洗5min,放置1h，重复用pH值为5的含100mM尿素的磷酸缓冲液进行性能测试操作，循环7次，图4为填充柱的循环性能，其中，数据进行了归一化处理，以首次循环得到的尿素平均分解率为1。由图6可知，循环7次后固载化脲酶性能仍然保持在85％以上。
试验例4固载化脲酶储存稳定性测试
取4g粉碎为200-300目粒径的实施例4中煅烧所得氧化铝(pH设定值为5.03,煅烧后的pH＝4.57)，装入填充柱中，然后从填充柱上部加入3mL 0.4mg/mL脲酶的磷酸缓冲液。静置10min脲酶溶液完全浸润材料后，用磷酸缓冲液(20mM PBS)以7.5mL/min的流速冲洗填充柱30min。将填充柱两端塞紧后，放入4℃冰箱储存，平行填充10支固载化脲酶柱。在3/7/14/21/30d时，取出填充柱进行尿素分解实验，图4为固载化脲酶储存稳定性测试结果，其中，数据进行了归一化处理。由图7可知，随着存放时间的增加，固载化脲酶的活性逐渐衰减，到30天时固载脲酶的活性仍然在70％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种固载化脲酶，其特征在于，包括：
载体；
脲酶，所述脲酶负载在所述载体上；
其中，
所述载体为硅胶、硅酸镁、氧化铝、SBA-1、SBA-2、SBA-3、SBA-15、HMS、MCM-41、MCM-48、MCM-50、SAPO-34中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的固载化脲酶，其特征在于，所述脲酶的负载量低于0.1wt％，优选为0.005～0.05wt％。
3.根据权利要求1或2所述的固载化脲酶，其特征在于，所述载体的介孔孔径为5～15nm，优选为6～9nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固载化脲酶，其特征在于，所述载体的比表面积为50～500m2/g，和/或，所述载体的介孔孔体积为0.1～1.0cm3/g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固载化脲酶，其特征在于，所述载体的粒径为80～500目，优选为200～500目，进一步优选为320～500目。
6.根据权利要求1-5任一项所述的固载化脲酶，其特征在于，所述载体为酸性γ-氧化铝，所述酸性γ-氧化铝的pH值为3.5～5.5，优选为4.1～4.8。
7.一种权利要求1-6任一项所述固载化脲酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述载体和脲酶混合均匀，加水润湿，静置处理一段时间，从而得到所述固载化脲酶；优选静置处理10min以上。
8.一种权利要求1-6任一项所述固载化脲酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将脲酶溶于水得到脲酶溶液，将所述脲酶溶液加入所述载体中，静置处理一段时间，从而得到所述固载化脲酶；优选静置处理10min以上。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述脲酶溶液的浓度为0.01～10mg/mL；和/或，所述脲酶与所述载体的质量比小于1:1000，优选为1:2000～1:20000。
10.权利要求1-6任一项所述固载化脲酶或权利要求7-9任一项制备方法制备得到的固载化脲酶在分解溶液中尿素中的应用。
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| US4885207A (en) * | 1987-07-13 | 1989-12-05 | Uop | Biocompatible protein or ligand immobilization system |
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