CN103048396B - 一种精氨酸含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种精氨酸含量的测定方法，所述方法包括：1、取精氨酸原料和对照品溶于水中，分别制成对照溶液和供试品溶液；2、应用氰基柱采用高效液相色谱法检测精氨酸含量，以乙腈和磷酸盐的水溶液为流动相，检测波长为199nm，分别取等体积的对照溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用外标法计算精氨酸原料含量。本发明避免了精氨酸滴定方法的不专属，避免了衍生化的繁琐，为精氨酸检测提供了快速、准确、重复性好的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种物质含量的测定方法，特别涉及一种精氨酸含量的测定方法，属医药技术领域。
背景技术
精氨酸是一种α氨基酸，亦是20种普遍的天然氨基酸之一。精氨酸可以显著提高耐力，刘慧莉等人研究显示长期补充精氨酸可以提高骨骼肌中NO含量，增加肌糖原储量，延长运动时间，提高运动耐力。
目前精氨酸的相关制剂及原料的检测方法主要以滴定、旋光或衍生化为主。
中国药典、日本药典、美国药典采用高氯酸滴定精氨酸原料，英国药典、欧洲药典采用盐酸滴定精氨酸原料，上述5种药典采用滴定法，专属性不强，容易受杂质干扰影响含量结果。
日本药典、中国药典对精氨酸注射液中精氨酸的含量检测采用旋光度法，旋光度法专属性也不强，容易受有旋光的杂质干扰而影响含量测定结果。
美国药典中记载精氨酸胶囊中精氨酸的含量检测方法为采用辛烷磺酸钠为离子对试剂，用高效液相色谱法检测胶囊中精氨酸含量，该方法虽然专属性强于滴定方法，但对色谱柱伤害较大，离子对试剂会对色谱柱造成不可逆的伤害，离子对试剂和固定相结合产生不可逆吸附，进而影响固定相活性位点。比如十八烷基硅胶键合色谱柱，离子对试剂会影响色谱柱键合，从而达到分析样品的作用，这种反应对色谱柱影响很大，而且离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，会大大缩短色谱柱的使用寿命。
另外，采用离子对试剂，容易造成实验条件不稳定。离子对试剂的浓度与其样品的保留时间有直接的影响，而且离子对试剂对pH值比较敏感，配制流动相时要求精确度较高，否则直接影响实验的重复性和重现性。
中国药典中记载精氨酸片中精氨酸的含量测定方法为衍生化方法，以2，4-二硝基氟苯乙腈为衍生化试剂，经过避光衍生化反应，稀释，注入色谱仪检测含量，衍生化反应虽然也提高专属性，但衍生化反应容易损坏色谱柱，缩短色谱柱使用寿命，衍生化反应容易受衍生化试剂用量、种类、衍生化时间、温度等条件影响，方法的精密度、准确度、重现性等容易受到影响。
中国专利申请号为201010513639.1的专利文件公开了在线衍生测定氨基酸含量的方法，该方法同样具有衍生化反应的缺点，损害色谱柱，方法的精密度、准确度、重现性等容易受到诸多条件的影响等等。
王润玲等人在《高效液相色谱法测定布洛芬精氨酸盐的含量》一文中公开了布洛芬精氨酸盐含量检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂( YWG-C18 4. 6×250mm )；以磷酸二氢钠380mg与磷酸氢二钠50mg，加水溶解成1000ml , 用磷酸调pH 至3.0, 取出250ml加甲醇750ml , 作为流动相；检测波长为220nm; 流速1ml/ min；进样20μl。根据该方法采用DAD检测器进行验证，配置布洛芬的对照溶液、精氨酸的对照溶液、布洛芬精氨酸的供试品溶液，检测波长选择199nm(精氨酸的最大吸收)、220nm，将上述溶液按照公开的液相条件注入色谱仪，发现精氨酸在色谱柱基本无保留，与溶剂峰重叠。布洛芬的pKa为5.2，在pH3.0条件下，布洛芬精氨酸盐分解为布洛芬和精氨酸，精氨酸极性很强，在C18色谱柱上基本无保留，另外，精氨酸在220nm处基本无吸收，王等人公开的方法在220nm条件下检测，其实只是检测布洛芬的含量，掩盖了精氨酸检测不到的事实。
庄苒在《柱前衍生化HPLC 法测定复方布洛芬缓释胶囊中精氨酸的含量》一文中公开了精氨酸的含量检测方法，该方法仍然采用衍生化试剂对精氨酸进行含量测定。
中国专利申请号为201010297845.3的专利文件公开了应用氨基柱采用高效液相色谱法测定精氨酸的含量，该方法具有较强的专属性，但采用氨基柱容易引起精氨酸的拖尾，即引起对称因子偏小，也就是不对称因子偏大，另外，采用该流动相条件，氨基柱容易受到损害，缩短使用寿命。
由于目前精氨酸含量的测定方法专属性不强，容易受杂质干扰影响含量结果，而且易损害色谱柱，方法的精密度、准确度、重现性等易受到诸多条件的影响等等，存在一定局限性和弊端所以急需一种新的精氨酸含量的测定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种精氨酸含量的测定的方法，该方法操作简单、专属性强、准确度高。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种精氨酸含量的测定方法，它应用氰基柱采用高效液相色谱法对精氨酸进行含量测定。
上述含量的测定方法，采用高效液相色谱法所用的流动相为乙腈和磷酸盐溶液，所述磷酸盐溶液与乙腈的体积比为10：90～60：40，优选25：75～35：65。
上述含量的测定方法，所述磷酸盐溶液，其中磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，浓度为5-100mmol/L，所述磷酸盐溶液中加入体积百分比为0.1%-5%的三乙胺、氨水、二乙胺、乙二胺中的一种或几种。
上述含量的测定方法，所述磷酸盐溶液的pH为2.0～7.0，优选3.0～4.5。
上述含量的测定方法，检测波长为199nm，柱温为25～45℃，流速为0.5～2.0ml/min。
不同于以往的精氨酸含量的测定方法，本发明采用一种新颖的检测方法，创造性的提供一种操作简单、专属性强、准确度高的方法，该方法不同于各国药典及相关专利及文献中公开的含量测定方法。
本专利发明人在采用氰基柱对精氨酸进行含量测定时，发现直接以乙腈-水为流动相，对供试品和对照品进行液相检测，在最大吸收波长条件下，在2个小时内无明显色谱峰出现，氰基柱基线一直很平，重复三针均无色谱峰出现。
本文以中国专利申请号为201010297845.3的专利文件为对比文献，也进行了对比研究，发现采用氨基柱，到一定时间后发现色谱图上基线上扬，出现很大的鼓包，峰型极其不好，理论板数趋于零。
分析原因可能为采用氰基柱时，以乙腈-水为流动相系统，色谱柱键合氰基的硅胶封尾不完全，硅胶上部分裸露的羟基在流动相为乙腈-水的环境下与氨基酸的氨基发生反应，导致精氨酸直接吸附在色谱柱上而不出峰。
采用氨基柱时，在乙腈-水的流动相系统条件下，氨基酸的羧酸直接与氨基柱上的氨基键合成盐而造成峰型极其不好。
经过对氨基柱、氰基柱的分离原理分析、键合硅胶的性质研究、精氨酸的分子结构和理化性质研究以及大量的科学试验，本专利发明人巧妙的解决了氰基柱吸附精氨酸的现象。当采用氰基柱时，采用流动相中的铵离子封闭色谱柱上硅胶上部分裸露的羟基，从而防止氨基酸的氨基与羟基结合，影响色谱峰峰型。
但采用氨基柱时，虽然采用对比文献加入磷酸氢二铵， 并调整溶液的pH，使铵离子封闭硅胶上部分裸露的羟基，氢离子封闭色谱柱上的氨基，但仍然无法完全防止精氨酸的氨基和羧基与色谱柱反应结合，而影响色谱峰峰型，采用对比文献的方法精氨酸的色谱峰对称因子偏小，即不对称因子偏大，造成该现象就是由于精氨酸仍然与氨基柱吸附引起的。
采用新的色谱条件后，采用氰基柱，精氨酸的色谱峰出峰良好，理论板数、对称因子、保留时间等参数均能满足含量测定要求，因而能实现本发明的发明目的。
附图说明
图1是序号11的液相色谱图；
图2是序号12的液相色谱图；
图3是序号13的液相色谱图；
图4是序号14的液相色谱图；
图5是序号15的液相色谱图；
图6是序号16的液相色谱图；
图7是序号17的液相色谱图；
图8是序号18的液相色谱图；
图9是序号27的液相色谱图；
图10是序号28的液相色谱图；
图11是序号29的液相色谱图；
图12是序号30的液相色谱图；
图13是序号31的液相色谱图；
图14是序号32的液相色谱图；
图15是序号33的液相色谱图；
图16是序号34的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，本发明所列举实施例仅用于说明本发明，而并非是要局限本发明专利的保护范围。
实施例1
精氨酸含量检测的色谱条件初筛。乙腈与水或磷酸盐比例见表1，检测波长：199nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：5μl。
表1 初筛条件及结果
| 序号 | 色谱柱 | 乙腈 | 水 | 磷酸盐溶液 | 主峰保留时间 |
| 1 | 氰基柱 | 70 | 30 | 0 | 不出峰 |
| 2 | 氰基柱 | 60 | 40 | 0 | 不出峰 |
| 3 | 氰基柱 | 80 | 20 | 0 | 不出峰 |
| 4 | 氰基柱 | 70 | 0 | 30 | 约5分钟 |
| 5 | 氰基柱 | 65 | 0 | 35 | 约3分钟 |
| 6 | 氨基柱 | 70 | 30 | 0 | 基线上漂，出馒头峰 |
| 7 | 氨基柱 | 60 | 40 | 0 | 基线上漂，出馒头峰 |
| 8 | 氨基柱 | 80 | 20 | 0 | 基线上漂，出馒头峰 |
| 9 | 氨基柱 | 70 | 0 | 30 | 约30分钟 |
| 10 | 氨基柱 | 65 | 0 | 35 | 约25分钟 |
实施例2
采用氰基柱优化色谱条件。色谱柱：Venusil XBP-CN 氰基柱（4.6mm×250mm，5μm）；采用磷酸氢二铵为磷酸盐溶液，pH调节、流速、柱温见表2，检测波长：199nm；进样量：5μl。
表2 色谱条件3因素2水平的试验设计方案
| 序号 | 乙腈比例(%) | 波长(nm) | pH值 | 流速(ml/min) | 柱温(℃) |
| 11 | 70 | 199 | 3.0 | 1.5 | 35 |
| 12 | 70 | 199 | 3.0 | 1.5 | 25 |
| 13 | 70 | 199 | 3.0 | 0.8 | 25 |
| 14 | 70 | 199 | 3.0 | 0.8 | 35 |
| 15 | 70 | 199 | 4.0 | 1.5 | 35 |
| 16 | 70 | 199 | 4.0 | 0.8 | 25 |
| 17 | 70 | 199 | 4.0 | 1.5 | 25 |
| 18 | 70 | 199 | 4.0 | 0.8 | 35 |
分别统计8组实验精氨酸的保留时间、不对称因子、理论板数、柱压力，结果见表3。
表3 因子设计的试验结果
| 序号 | 保留时间(min) | 不对称因子 | 理论板数 | 柱压力(Mpa) |
| 11 | 3.14 | 1.1936 | 4498 | 9.8 |
| 12 | 3.073 | 1.2676 | 4845 | 10.9 |
| 13 | 5.56 | 1.3690 | 5379 | 5.9 |
| 14 | 5.973 | 1.3161 | 6172 | 5 |
| 15 | 3.693 | 1.3193 | 5233 | 9.9 |
| 16 | 6.353 | 1.4066 | 6057 | 5.8 |
| 17 | 3.427 | 1.3284 | 4670 | 11 |
| 18 | 6.9 | 1.3987 | 6623 | 5 |
序号为11-18的液相色谱图分别见图1-图8。
实施例3
采用氰基柱优化色谱条件。色谱柱：Venusil XBP-CN 氰基柱（4.6mm×250mm，5μm）；磷酸盐为加入0.1%三乙胺，然后用磷酸调节pH，有机相比例、pH调节、流速、柱温见表4，检测波长：199nm；进样量：5μl。统计保留时间。
表4 色谱条件试验设计方案及结果
| 序号 | 乙腈比例(%) | 波长(nm) | pH值 | 流速(ml/min) | 柱温(℃) | 保留时间（min） |
| 19 | 90 | 199 | 2.0 | 0.5 | 25 | 12.3 |
| 20 | 40 | 199 | 3.0 | 1.0 | 25 | 2.9 |
| 21 | 70 | 199 | 3.0 | 1.0 | 25 | 4.673 |
| 22 | 70 | 199 | 3.9 | 1.0 | 30 | 5.273 |
| 23 | 70 | 199 | 5.5 | 1.5 | 35 | 3.356 |
| 24 | 70 | 199 | 4.0 | 2.0 | 25 | 2.891 |
| 25 | 70 | 199 | 6.0 | 1.0 | 45 | 5.033 |
| 26 | 65 | 199 | 7.0 | 0.8 | 35 | 5.102 |
比较例4
采用氨基柱优化色谱条件。色谱柱：Ultimate 氨基柱（4.6mm×250mm，5μm）；磷酸盐为磷酸氢二铵水溶液，然后用磷酸调节pH，有机相比例、pH调节、流速见表5，检测波长：199nm；柱温：30℃；进样量：10μl。统计保留时间、对称因子、理论板数。
表5 色谱条件试验设计方案及结果
序号为27-34的液相色谱图分别见图9-图16。
综合比较氰基柱与氨基柱测定精氨酸的液相色谱图，发现，采用氰基柱所得的液相色谱图比氨基柱所得的液相色谱峰型要好，氨基柱检测的色谱峰存在明显的前沿和拖尾，这种现象就是由于精氨酸与氨基柱上的氨基吸附结合而引起的。另外，氰基柱所得色谱峰整体比氨基柱所得色谱峰的不对称因子偏小。从理论板数、保留时间、不对称因子的剧烈波动，也可以看出氨基柱检测精氨酸耐用性差，而氰基柱不存在上述现象，因而氰基柱更适合检测精氨酸含量。
实施例5
采用氰基柱检测精氨酸。色谱柱：Venusil XBP-CN 氰基柱（4.6mm×250mm，5μm）；磷酸盐为加入0.1%三乙胺，然后用磷酸调节pH，有机相比例、pH调节、流速、柱温见表6，检测波长：199nm；进样量：5μl。统计保留时间。
表6 不同乙腈比例的精氨酸保留时间
| 序号 | 乙腈比例(%) | 波长(nm) | pH值 | 流速(ml/min) | 柱温(℃) | 保留时间（min） |
| 35 | 75 | 199 | 3.2 | 1.0 | 30 | 7.201 |
| 36 | 70 | 199 | 3.2 | 1.0 | 30 | 5.005 |
| 37 | 65 | 199 | 3.2 | 1.0 | 30 | 4.359 |
Claims (3)
1.一种精氨酸含量的测定方法，其特征在于，它应用氰基柱采用高效液相色谱法对精氨酸进行含量测定；
所述高效液相色谱法采用的流动相为乙腈和磷酸盐溶液，所述磷酸盐溶液与乙腈的体积比为25：75～35：65；
所述磷酸盐溶液为磷酸氢二铵溶液或加入体积比为0.1%-5%的三乙胺的磷酸盐溶液；
所述磷酸盐溶液的pH为3.0~4.0。
2.根据权利要求1所述含量的测定方法，其特征在于，磷酸盐溶液的浓度为5-100mmol/L。
3.根据权利要求2所述的含量的测定方法，其特征在于，检测波长为199nm，柱温为25～45℃，流速为0.5～2.0ml/min。
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