CN116284224B

CN116284224B - 一种结合Claudin 18.2的环肽及其应用

Info

Publication number: CN116284224B
Application number: CN202310530284.4A
Authority: CN
Inventors: 任发政; 刘平; 林伟林; 章奕欣; 李依璇; 王鹏杰
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2043-05-12
Also published as: CN116284224A

Abstract

本发明公开了与Claudin 18.2结合的环肽化合物Fzrcycl A和Fzrcycl B。两种环肽化合物在凝胶阻滞，酶联免疫吸附测定法与细胞实验中表现出了较强的亲和力。本发明还包括包含所述肽的药物组合物以及所述肽配体在诊断、预防、抑制或治疗由Claudin 18.2相关疾病或病症中的用途。

Description

一种结合Claudin 18.2的环肽及其应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及与Claudin 18.2结合环肽及其在Claudin 18.2相关疾病中诊断或治疗的用途。

背景技术

环肽（Cyclic peptide）是指包含环状键序列的多肽链，空间结构相对稳定，具有多种生物活性，与抗体相比有靶点占有率高，特异性强，亲和力强，稳定性高等特点。近年来被广泛应用于靶向蛋白作为药物（如环孢素，Cyclosporin A），抗菌（如万古霉素，Vancomycin），研究胞内肌动蛋白微丝（如鬼笔环肽，Phalloidin）等。

Claudin 18.2（紧密连接蛋白18.2）是Claudin 18的剪接变体，属于紧密连接蛋白四次跨膜蛋白家族。紧密连接蛋白在上皮细胞的连接处表达，建立细胞旁屏障且控制细胞间分子的流动，在细胞信号传导和上皮细胞极性维持中起关键作用[Singh et al. 2017]。在正常胃组织中黏膜的紧密连接处, Claudin 18.2的表达埋藏在超分子复合物中，然而在高达80%胃癌细胞表面上都能够发现Claudin 18.2的暴露，在许多其它类型的肿瘤中也异常活化，如胰腺癌、食管癌、卵巢癌和肺癌[Sahin et al.2008; Tureci et al.2011]。因此Claudin18.2 成为了癌症诊断新的潜在靶点。尽管抗Claudin 18.2 抗体（如 IMAB362）和嵌合抗原受体（如 CT041）已经研究了多年，与抗体研究开发相比，该靶点领域的肽类亲和物却进展缓慢，尚未有公开报道[Zeisel et al.2019]。所以开发与表达Claudin 18.2细胞相亲和的环肽具有重要的应用价值。

发明内容

此前与表达Claudin 18.2的细胞相亲和的环肽尚未有报道。Fzrcycl A和Fzrcycl B是首先通生物信息学构建（7x10¹⁶环肽库），再利用小分子芯片合成技术（PCT：WO2021191247A1）合成（23125个环肽），以荧光标记的与Claudin 18.2（-VLP）（CL2-H52P7）作为靶点蛋白筛选出的最具亲和力的环肽化合物。固相人工合成线状化合物并环化成环肽后，FzrcyclA 和FzrcyclB与 Claudin 18.2的作用通过凝胶阻滞（EMSA），酶联免疫吸附（Elisa）等方法证实筛选结果。据后续免疫荧光成像(IF)及流式分选(FACS)实验我们还证明此两种化合物可用于亲和高表达Claudin 18.2的生物标记。

具体的，本发明提供如下具体产品及其应用：

第一方面，一种环肽，其特征在于，所述环肽序列为C20-dCys-Asp-Trp-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys或C20-dCys-Asp-F1-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys，所述环肽经由位于位置2、7和12的半胱氨酸残基环化。

在一些实施例中，如下Fmoc-保护的天然氨基酸被使用

在一些实施例中，如下Fmoc-保护的非天然氨基酸或羧酸化合物被使用。

在一个具体的实施例中，所述环肽环化由1,3,5-三(溴甲基)苯介导。在一个具体的实施例中，所述环肽的结构为：

在一个具体的实施例中，所述环肽的Lys含生物素修饰。在一个具体的实施例中，提供包含上述环肽和药学上可接受的载体的药物组合物或制剂。

在另外一个具体的实施例中，所述环肽的结构为：

在另外一个具体的实施例中，所述环肽的Lys含生物素修饰。在另外一个具体的实施例中，提供包含上述环肽和药学上可接受的载体的药物组合物或制剂。

在一个具体的实施例中，所述环肽为C20-dCys-Asp-Trp-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys(biotin)-NH2（SEQ ID NO:1），

其中，

C20为2-(4-溴苯基)-6-(4-氯苯基)吡啶-4-羧酸（2-(4-Bromophenyl)-6-(4-chlorophenyl) pyridine-4-carboxylic acid）

dCys为D-半胱氨酸(D-cysteine)；

环肽组合物（Cyclized peptides compound）: 1,3,5-Tris(溴甲基)-苯(1,3,5-Tris(brommethyl)-benzol)；

O2Oc为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)；

在另一个具体的实施例中，所述环肽C20-dCys-Asp-F1-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys(biotin)-NH2(SEQ ID NO:2)；

其中，

C20为2-(4-溴苯基)-6-(4-氯苯基)吡啶-4-羧酸

（2-(4-Bromophenyl)-6-(4-chlorophenyl) pyridine-4-carboxylic acid）；

F1为Fmoc-组氨酸(苄基)-OH

(Fmoc-His(Bzl)-OH)；

dCys:为D-半胱氨酸

(D-cysteine)；

O2Oc为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid)。

本发明的第二个方面是提供上述环肽在Claudin 18.2相关疾病中诊断或治疗的用途。在一个具体的实施例中，所述疾病为胃癌。在另一个具体的实施例中，疾病为乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、非小细胞肺癌、胰腺癌或食管癌。在一个具体的实施例中，环肽偶联毒性分子。

本发明的有益效果为：通过提供与Claudin 18.2结合的环肽，相对于现有技术的抗体，靶点占有率高，特异性强，亲和力强，稳定性高。

附图说明

图1 环肽与CLDN18.2的结合验证示意图。

图2FzrcyclA的合成过程。

图3 Fzrcycl A 质谱（LC-MS）确认结果。

图4 FzrcyclB的合成过程。

图5 Fzrcycl B 质谱（LC-MS）确认结果。

图6凝胶阻滞证实 Fzrcycl A（Fzrcycl B）与Claudin 18.2（-VLP）亲和。

图7酶联免疫吸附实验测定环肽与Claudin 18.2的亲和力。

图8免疫荧光证实Fzrcycl A和Fzrcycl B在高表达Claudin 18.2 细胞系上有明显亲和现象。

图9流式细胞术证实Fzrcycl A和Fzrcycl B在高表达Claudin 18.2 细胞系上有明显亲和现象。

具体实施方式

以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

实施例1. 合成环肽FzrcyclA和 FzrcyclB

1. 所用试剂

DMF=N，N-二甲基甲酰胺；DCM=二氯甲烷；HBTU=苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐; HOBT=1-羟基苯并三唑;DIPEA= N,N-二异丙基乙胺；Piperidine= 六氢吡啶；NMM= N-甲基吗啉；Acetic anhydride = 乙酸酐；TIPS= 三异丙基硅烷；TFA= 三氟乙酸；DTT= 二硫苏糖醇；FA= 甲酸；ACN= 乙睛；HEPES= 4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

2. 起始线性多肽的合成

采用Fmoc固相合成法，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用Piperidin将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接了上去。序列连接完毕后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。

多肽合成由INTAVIS多肽合成仪完成，具体合成的循环步骤如下：

a)树脂溶胀

将Rink-Amide-AM树脂加入反应管中，加入DCM静置30 min，真空抽出DCM完成树脂溶胀；

b)Fmoc去保护

将20% Piperidine（在DMF中）加入到反应管中震荡30 min，用于去掉保护Fmoc基团，并用DMF清洗树脂3次；

c)缩合反应

将Fmoc和侧链保护的氨基酸，HBTU，HOBT，DMF和DIPEA（在DMF中）按照比例混合后加入固相反应管中，室温反应90 min进行缩合反应，并用DMF清洗树脂3次；

d)末端氨基封闭

加入2% Acetic anhydride/2% DIPEA（inDMF）保护未反应氨基酸基团，并用DMF清洗树脂3次。

3. 线性肽游离及回收步骤

完成所需直链肽合成后，用DCM清洗树脂3次，并抽真空干燥过夜；加入由90% TFA/5% TIPS/5% 苯酚（inDCM）进行复配的Cocktail切割液；在室温下震荡2-4 h；反应结束后，将切割液抽滤，将滤液逐滴加入到10倍-20°C无水乙醚中过夜。抽滤干燥后的粗品肽用DMSO进行重溶。

4. RP-HPLC纯化步骤

使用Waters Alliance HPLC/Phenomenex Aqua 5 µm C18 125 Å, LC Column250 x 4.6 mm柱对粗品肽溶液进行分离纯化，流动相A：0.1% TFAinH2O；流动相B：0.1%TFAinACN；色谱条件为5% B-100% B，0.5 ml/min 3min。通过 LC-MC鉴定后的纯品肽真空冻干。

5. 线性肽环合步骤

将纯品肽（反应浓度1mM）与1,3,5-三（溴甲基）苯（滴加）按照3：1摩尔比在DMSO/HEPES（HEPES，100 mM， pH 8.0）中进行混合。反应后的环肽经RP-HPLC再次纯化，LC-MC鉴定(图3，图5)，真空冻干。

环肽Fzrcycl A 和 Fzrcycl B的分子式分别为C20-dCys-Asp-Trp-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys(biotin)-NH2（C20:2-(4-Bromophenyl)-6-(4-chlorophenyl) pyridine-4-carboxylic acid；dCys: D-cysteine；Cyclizedpeptides compound: 1,3,5-Tris(brommethyl)-benzol；O2Oc: two repeats ofethylene glycol）和C20-dCys-Asp-F1-Asp-Val-dCys-Trp-Val-Arg-Arg-dCys-Asn-O2Oc-Lys(biotin)-NH2（C20:2-(4-Bromophenyl)-6-(4-chlorophenyl) pyridine-4-carboxylic acid；F1:Fmoc-His(Bzl)-OH；dCys: D-cysteine；Cyclized peptidescompound: 1,3,5-Tris(brommethyl)-benzol；O2Oc: two repeats of ethyleneglycol）。

实施例2环肽FzrcyclA和 FzrcyclB的凝胶阻滞

将以下试剂按照分组条件（见图6）组合：1μlFzrcyclA,FzrcyclB, Cycl 7（1 mM）；0.5 μlStreptavidin-Cy5（Thermofisher，0.5 mg/ml）；0.3 μlClaudin18.2（-VLP）（Acrobiosystem，450μg/ml），混合液用0.1% BSA的PBS缓冲液稀释到8μl，并在37 °C孵育2h。加入2 μl 5x非变性上样缓冲液后在10%聚丙烯酰胺电泳胶内上样，在Tris-Gly电泳缓冲液内，低温（4°C）条件下，恒压80V进行4 h电泳，电泳结束后在荧光可见光凝胶成像系统下进行观察，拍照。

通过非变性胶电泳证明当在Claudin 18.2（-VLP）和荧光标记得亲和素（Streptavidin-Cy5）中加入分别加入环肽Fzrcycl A 和 Fzrcycl B可以形成复合物。下图电泳图通过Streptavidin-Cy5的条带表明复合物的分子量，分子量越大，电泳迁移慢，条带越靠上。当复合物较大时，会有样品卡在上样孔的现象发生。当在Streptavidin-Cy5中加入Claudin 18.2（–VLP）时，条带没有发生变化，说明没有复合物产生。当在Streptavidin-Cy5中加入Claudin 18.2（–VLP）和环肽Fzrcycl A/Fzrcycl B时，条带明显上移，并且可在上样孔中观察到带荧光标记的复合物。当在Streptavidin-Cy5中加入Claudin 18.2（–VLP）和环肽 Cycl 7（与Fzrcycl A/Fzrcycl B结构相同但氨基酸序列不同），条带发生了较弱的迁移（图6）。表明环肽Fzrcycl A/Fzrcycl B 与Claudin 18.2（-VLP）表现强亲和力。

实施例3 酶联免疫吸附

将 Claudin18.2（-VLP）在Elisa包被液（15 mmol/L,35 mmol/l NaHCO3,7.7mmol/L NaN3）中稀释至0.5 μg/ml，用于4°C条件下过夜包被96孔可拆卸酶标板（100 μl/孔）。经Elisa洗涤液（0.05% Tween-20 在 PBS中）洗涤三次后，用Elisa封闭液(2% BSA 在洗涤液中)室温2 h封闭，封闭后重复上述步骤进行洗涤。将在稀释液（0.5% BSA 在洗涤液中）中滴定浓度的环肽（图7）分别在孵育在孔板中（4°C过夜），每个条件3个重复。洗涤孔板后加入Streptavidin-HRP（Beyotime，1：1000）室温孵育2 h后洗涤，再加入200 μl显色液（10 mg/ml TMB in 50 mmol/L NaHPO₄, 25 mmol/L citric acid），37°C 20 min后加入50μl终止液（1M sulfuric acid）用酶标仪读取OD 450 nm。数据通过Excel导出后用Oringin10 进行分析，非线性拟合数据后可得出解离常数K_d。通过这种方法我们计算出Fzrcycl A/Claudin 18.2（-VLP）和 Fzrcycl B/Claudin 18.2（-VLP）解离常数（K_d）分别为 12.5 ±0.32 nM 和 6.9 ± 0.45 nM （图7）。Cycl 7 与 Claudin18.2（-VLP）的亲和力远弱于前两者。

实施例4 免疫荧光和流式细胞术

将Fzrcycl A， Fzrcycl B和Cycl 7与贴壁的人源胃癌细胞系NUGC-4分别进行孵育，洗掉未亲和的化合物后加入Streptavidin-Cy5与在细胞上的环肽形成带荧光标记的复合物。最后加入DAPI对细胞核进行染色并用LEICA荧光显微镜进行拍照。经过结果显示Fzcycl A 和 Fzrcycl B（Streptavdin-Cy5标记）能够与细胞（DAPI标记）合并（Merge）后完全重影，与之相比Cycl 7则没有在细胞上标记成功（图8）。这个实验证明Fzcycl A和Fzrcycl B能够亲和在Claudin18.2 高表达的细胞上。

为了进一步证明环肽Fzrcycl A/Fzrcycl B与高表达Claudin 18.2细胞表现强亲和力，并获得量化结果，我们使用了流式细胞术这种技术。首先我们将Fzrcycl A， FzrcyclB和Cycl 7与未被胰蛋白酶处理过的人源贴壁胃癌细胞系NUGC-4和KATOIII分别进行孵育，洗掉未亲和的化合物后加入Streptavidin-Cy5，与在细胞上的环肽形成带荧光标记的结合物。将不同组的细胞用Beckman CytoFlEX流式细胞仪的APC通道对Cy5的荧光强度进行测量。经过环肽Fzcycl A和 Fzrcycl B（Streptavidin-Cy5标记）孵育细胞的荧光强度明显高于Cycl 7孵育的和空白对照，这个结果说明环肽Fzcycl A和 Fzrcycl B能够与Claudin18.2高表达细胞进行亲和（图9）。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种环肽，其结构式如式I或式II所示，

式I:

，

式II

。

2.一种药物组合物，包含根据权利要求1中所述的环肽和药学上可接受的载体。

3.权利要求1中所述的环肽在制备Claudin 18.2相关疾病诊断试剂中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，所述环肽偶联毒性分子。

5.根据权利要求3所述的用途，所述疾病为癌症。

6.根据权利要求5所述的用途，所述疾病为乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌或食管癌。