MX2011005363A - Peptidos para inhibicion del factor alfa de necrosis tumoral y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con péptidos para inhibición del Factor Alfa de Necrosis Tumoral (TNF-alfa o TNF-a) y el proceso para la preparación de los mismos. La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende los péptidos para inhibición del TNF-alfa de la presente invención y los usos de los mismos para tratar trastornos inflamatorios producidos por el TNF-alfa.

Description

PÉPTIDOS PARA INHIBICIÓN DEL FACTOR ALFA DE NECROSIS TUMORAL Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con péptidos biológicamente activos y un proceso para la preparación de los mismos. La presente invención, se relaciona además con péptidos para inhibición del factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a o TNF-alfa) y el proceso para la preparación de los mismos. La presente invención, se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende las moléculas peptidicas y los usos de la misma para tratar un trastorno inflamatorio producido por el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a o TNF-alfa) tal como artritis reumatoide, artritis psoriática, enfermedad de Crohn, y sepsis etc.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las citoquinas son una clase de proteínas de señalización producidas por células inmunoactivadas es decir, células B, células T y monocitos y macrófagos. Las citoquinas incluyen la familia de interleuquinas (IL-1 hasta IL-23) , interferones (alfa, beta y gamma) y TNF-a y ß (Janeway CA et al. 1999, Immunobiology, 4a Ed. New York, Garland, 1999; Roitt I et al. 2002, Immunology 5a ed. London, Mosby, 2002) . Se han sugerido funciones importantes para IL-1 y TNF-a como mediadores clave de la respuesta inflamatoria en enfermedades similares a sepsis y condiciones autoinmunes, similares a RA, trastornos dermatológicos, enfermedad inflamatoria del intestino, (Locksley R et al. 2001, Cell 104 (4) .487-501, Feldmann M et al 1996, Ann. Rev. Immunol. 14: 397-440; Buchan G et al. 1988, Clin. Exp. Immunol. 73:449-455; Canto E et al. 2006, Clin. Immunol. 119 (2 ): 156-165; Fantuzzi F et al. 2008, Expert Opi . Ther. Targets 12(9): 1085-96) . Los estudios para la regulación de citoquinas han sugerido además que TNF-a es la citoquina más importante responsable de la patología inflamatoria (Feldmann et al, 1999, Ann. Rheum. Dis. 58: (Suppl 1) 127-131).

El TNF-alfa se descubrió originalmente como una molécula que provoca necrosis hemorrágica de tumores en ratones (Carswell et al., 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 72:3666) . Una segunda línea de investigación de una proteína sérica conocida como "caquectina", considerada será la responsable de la condición de caquexia, condujo al descubrimiento eventual de que la caquectina fue idéntica al TNF-alfa (Beutler et al., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:625). Actualmente se ha establecido al TNF-alfa como un suministrador inflamatorio ampliamente activo implicado en diversas condiciones clínicas.

El TNF-alfa es una proteina de peso molecular 17 kD producida por diversos tipos celulares, en particular macrófagos activados. El TNF-alfa se sintetiza inicialmente como una proteina transmembrana dispuesta en trímeros estables. Posteriormente se escinde mediante la enzima convertidora del TNF-alfa con metaloproteasa (TACE) para formar el TNF soluble homotrimérico (sTNF) que se acopla a sus receptores cognados (TNFRI, p55 y TNFRII, p75), expresados en todos lados. La expresión en todos lados de los receptores del TNF junto con los efectores célula-específicos explica la amplia variedad de respuestas celulares producidas por el TNF-alfa, algunas de las mismas son dañinas y amenazan la vida. Estos receptores cuando se mudan de células mononucleares, disminuyen los niveles del TNF-a mediante la limpieza y accionamiento como inhibidores naturales .

El TNF-alfa induce una amplia variedad de respuestas celulares, muchas de las cuales dan por resultado en consecuencias dañinas. Por ejemplo, el TNF-alfa induce caquexia que es una condición que resulta de la pérdida de grasa y depleción proteinica total en el cuerpo, acompañados por una ingestión insuficiente de alimentos debida a la anorexia. La caquexia comúnmente se observa en pacientes con cáncer, y también se ha observado en pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) . Además, la inyección de altas dosis del TNF-alfa en animales produce la mayoría de los síntomas de choque séptico. También se ha mostrado que el TNF-alfa desempeña una función en enfermedades autoinmunes tales como, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, psoriasis, artritis psoriática, hipersensibilidad, enfermedades complejas inmunes y enfermedad de injerto contra hospedero así como también rechazo de transplante. La implicación del TNF-alfa se ha implicado en la malaria y fibrosis pulmonar. Por lo tanto, es de considerable interés y beneficio terapéutico para dirigirse al bloqueo de la producción del TNF-alfa en condiciones de enfermedad.

Tratamiento de los trastornos asociados con el TNF Los métodos para neutralizar los efectos adversos del TNF-alfa se han enfocado en el uso de los anticuerpos anti-TNF y TNF-R soluble. En modelos animales, el tratamiento de los trastornos inflamatorios asociados con el TNF-alfa con anticuerpos específicos para el TNF-alfa ha mostrado eficacia terapéutica (Williams et al., 1992, Proc.

Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:9784-88; Baker et al., 1994, Eur.

J. Immunol. 24:2040; Suitters et al., 1994, J. Exp. Med. 179:849). Se han considerado formas quiméricas de los anticuerpos anti-TNF para utilizarse en ensayos clínicos en humanos (Lorenz et al., 1996, J. Immunol. 156:1646; Walker et al., 1996, J. Infect. Dis. 174:63; Tak et al, 1996, Arthritis Rheumat. 39:1077). Adicionalmente, las proteínas de fusión del receptor del TNF solubles se han introducido como antagonistas del TNF en pacientes humanos (Peppel et al., 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Williams et al., 1995, Immunol. 84:433; Baumgartner et al., 1996, Arthritis Rheumat. 39 (Suppl. ) S74) .

La patente de los Estados Unidos No. 6265535 se relaciona con los péptidos cíclicos y análogos peptídicos designados a partir de un bucle de unión de un miembro de la superfamilia del receptor del TNF que interfiere con las interacciones de unión entre el TNF-alfa y el receptor del TNF, que exhiben actividades inhibidoras in vitro así como también in vivo, para antagonizar con las actividades biológicas no deseables del TNF in vivo. Esta invención prefiere los péptidos ciclizados ya que los bucles y retornos en juego son funciones realmente importantes en las interacciones proteína-proteína. En modalidades específicas, los péptidos cíclicos se han sido designado desde tres bucles de unión de TNF-R p55 que se unen con TNF-oc e inhiben la unión de TNF-oc a sus receptores celulares. La mayoría de modalidades preferidas tienen al menos 7 aminoácidos y no hay sugerencia de que péptidos lineales menores pudieran ser útiles como inhibidores del TNF-alfa.

La patente de los Estados Unidos 6344443, se relaciona con un método para inhibir la unión del TNF-alfa a los receptores del TNF y la función del TNF-a al administrar una cantidad efectiva de un péptido inhibidor. La patente se relaciona con los péptidos que se unen a los receptores del TNF e interfieren con la capacidad del TNF-a para unirse y activar los receptores del TNF-a celulares. En particular, esta invención se relaciona con el uso de péptidos que tengan 7 y 12 residuos de aminoácidos para inhibir la unión del TNF-alfa a los receptores del TNF y la función del TNF. El documento 43 apunta a la selección de péptidos pequeños que podrían unirse a los receptores del TNF. La molécula menor que se ha identificado tiene una secuencia de 7 aminoácidos de largo. No hay sugerencia de que péptidos menores adicionales podrían ser útiles como inhibidores del TNF-alfa.

La patente de los Estados Unidos 6143866, se relaciona con un péptido inhibidor del TNF derivado de la orina. La patente se relaciona además con las formas purificadas del inhibidor de TNF que son activas contra el TNF-alfa. La patente se relaciona además con las formas purificadas del inhibidor del TNF que podrían ser valiosas como preparaciones farmacéuticas que exhiben actividad contra el TNF. Además se relaciona con una proteína de 30 kDa y una proteína de 40 kDa que se han obtenido en sus formas purificadas. Las secuencias de aminoácidos expuestas para estas proteínas no son menores de 15 aminoácidos de largo, por lo tanto no hay sugerencia de que péptidos menores adicionales podrían ser útiles como inhibidores del TNF-alfa.

La patente de los Estados Unidos 6048543, se relaciona con el uso de al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de glicina, alanina y serina, o las sales fisiológicamente aceptables del mismo, en la preparación de un medicamento o formulación nutritiva para la disminución de los niveles del factor de necrosis tumoral (TNF) en pacientes en cuyos niveles estén elevados más allá de aquellos que suministren una homeostasis fisiológico e inflamación local. La patente expone que la disminución de los niveles del TNF se puede alcanzar mediante la inhibición o disminución de, la producción del TNF mediante células del tipo macrófago o la liberación del TNF mediante células del tipo macrófago o la unión del TNF mediante receptores del TNF. La patente se relaciona con el uso de sólo glicina, alanina y serina en la preparación de un medicamento o formulación nutritiva para la disminución de los niveles del TNF. La patente no expone ningún uso de combinación de aminoácidos o péptidos que contengan la combinación de aminoácidos .

La patente de los Estados Unidos 6107273, se relaciona con compuestos antagonista del TNF-a que comprenden una superficie molecular que prácticamente es similar a al menos una superficie molecular del TNF-a humano seleccionado del grupo de superficies moleculares del TNF-a humano. Los compuestos de la invención, tienen una porción enlazante unida en ambos extremos y una porción separadora. El compuesto de la invención, expone los péptidos para inhibición del TNF-alfa que tienen 25 aminoácidos de largo con una porción enlazante y una porción separadora. Los compuestos antagonista del TNF-a de la patente 213 se unen al receptor del TNF p55 y/o al receptor del TNF p75 e inhiben la citotoxicidad producida por el TNF-a. La patente "273 no sugiere los péptidos menores sin las porciones separadoras.

Los terapéuticos actualmente disponibles en esta área se han designado para neutralizar el TNF-a al utilizar receptores del TNF solubles o anticuerpos anti-TNF monoclonales (Piguet et al. 1992, Immunology 77:510-514; Elliot et al. 1993, Arthritis Rheum. 36: 1681-90). Éstos se unen al TNF-a en circulación limitando asi una accesibilidad posterior al TNF-R sobre la superficie celular y posterior activación de trayectorias inflamatorias. Las terapias disponibles para bloquear los niveles del TNF-alfa son (1) Infliximab (Remicade) : un anticuerpo monoclonal del TNF-alfa anti-humano quimérico humano de ratón (2) Humira: un anticuerpo monoclonal anti TNF-alfa totalmente humano (3) Etanercept: una proteina de fusión dimérica del P75sTNF-RII soluble fusionado a la porción Fe de IgG humano. Aunque estas moléculas han mostrado eficacia en diversos trastornos autoinmunes, las mismas adolecen de ciertas limitaciones, a saber, deficiente biodisponibilidad, estabilidad, inducción de graves reacciones inmunes y altos costos. Podría ser pertinente proporcionar medios alternativos para bloquear la actividad del TNF-alfa.

Las secuencias de anticuerpos anti-TNF o receptores del TNF se han utilizado para síntesis de fragmentos de péptidos biológicamente activos (Weisong Q et al 2006, Mol. Immunol. 43:660-66; Zhang J et al. 2003, Biochem. Biophy. Res. Comm. 7:1181-87; Aoki et al. 2006, J. Clin. Invest. 116(6): 1525-34); aunque estos son bastante y relativamente insolubles. Esto resalta la necesidad de un compuesto inhibidor del TNF-alfa mejorado posiblemente en la forma de una molécula pequeña.

En un estudio, Takasaki et al, 1997 (Nat Biotechnol. 1997, Nov; 15 (12) : 1266-70) estudiaron análogos peptídicos designados a partir de tres bucles de unión del TNF-R1. Estos péptidos se generaron con base en las secuencias de aminoácidos que forman los bucles de unión. Una de las secuencias peptidicas cíclicas P9 (secuencia SENL) en el bucle 1 del dominio 3 en el TNF-R1 (residuos 107-114) se encontró que será la más promisoria para la actividad de bloqueo del TNF-alfa. La secuencia WSENL de WP9 se utilizó como molde por Takasaki et al., para designar los péptido-miméticos cíclicos WP9Q, WP9ELY, WP9Y, y WP9QY. El péptido-mimético WP9QY mostró valores terapéuticos y redujo la gravedad de la encefalomielitis experimental autoinmune (EAE) y la artritis reumatoide (RA) en ratones. Sin embargo, su solubilidad relativamente deficiente en amortiguadores fisiológicos es un factor limitante en su uso como un terapéutico humano potencial (Takasaki et al. 1997, Nat . Biotechnol. Nov. 15(12) : 1266-70) . Aunque, la ciclización y aromatización de un péptido mejoraron la estabilidad y biodisponibilidad, se observó por Takasaki et al., 1997, incluso poco o ningún efecto sobre la solubilidad mejorada o actividad mejorada. Takasaki estableció que WP9QY es el péptido-mimético menor desarrollado hasta la fecha y se podría utilizar como un compuesto líder para la siguiente generación de inhibidores no peptídicos. Por lo tanto, esta referencia sugiere a un experto en la técnica tratar los inhibidores del TNF no peptídicos con base en el péptido menos conocido en ese momento.

Esta observación recalca la necesidad por desarrollar inhibidores del TNF-a de próxima generación mejorados dirigidos al diseño de un péptido que tenga solubilidad en un amortiguador fisiológico, mejor estabilidad y biodisponibilidad con menos efectos secundarios y costo reducido .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, se proporciona un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula : Xi—X2— 3 o las sales farmacéuticamente aceptables y derivados del mismo, en donde Xi, X2 son cada uno independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácido individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2--X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xlr X2 . son cada uno independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácido individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofílicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteína.

La presente invención, se relaciona además con el uso de péptidos biológicamente activos de la presente invención para el tratamiento de condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-a. La presente invención, también se relaciona con una composición farmacéutica que comprende los péptidos biológicamente activos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, muestra la actividad anti-TNF-a de los péptidos que emplean un bioanálisis L929. Los números 1-10 sobre el eje X denotan los péptidos de la secuencia ID-1 a 10. El eje Y denota la inhibición porcentual Media±SE de la citotoxicidad producida por el TNF-alfa de tres experimentos independientes, cada uno ejecutado por duplicado. En el eje X, "+ve" denota el control positivo es decir, un péptido inhibitorio del TNF-alfa conocido es decir, SQYL cíclico (cy Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu) .

La figura 2, muestra la comparación del péptido lineal de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6; el péptido cíclico de la secuencia ID-9 y la secuencia ID-10 y el control positivo es decir, el péptido WSQYL cíclico (cy Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu) para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-a. Los resultados se han expresado como la inhibición porcentual MedialSE de la citotoxicidad producida por el TNF-alfa de tres experimentos independientes, cada uno ejecutado por triplicado.

La figura 3, muestra la comparación de la inhibición de la citotoxicidad producida por el TNF-alfa mediante el péptido de la secuencia ID-6 y Etanercept (Et) . Los resultados se han expresado como la inhibición porcentual Media+SE de la citotoxicidad producida por el TNF-alfa de dos experimentos independientes, cada uno ejecutado por triplicado .

Las figuras 4a y 4b, muestran la cuantificación de unión de los péptidos con el TNF-alfa mediante citometría de flujo. En la figura 4a, se presenta un análisis con clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) de la unión del TNF-alfa a receptores celulares en presencia del péptido con la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6. El eje X denota el porcentaje MediatSE de células positivas para la expresión del TNF-R1 de tres experimentos independientes. Los números 1-5 sobre el eje X en el diagrama de barra (figura 4a) o en el histograma citométrico de flujo (figura 4b) son como sigue: 1 = células U937 teñidas con IgG FITC anti-ratón como anticuerpo secundario, 2 = células U937 teñidas con el anticuerpo del receptor del TNF anti-humano de ratón e IgG FITC anti-ratón, 3 = células U937 tratadas con el TNF-alfa recombinante y teñidas con el anticuerpo del receptor del TNF anti-humano de ratón e IgG FITC anti-ratón, 4 = células U937 tratadas con un complejo del TNF-alfa recombinante con la secuencia ID-2 y teñidas con el anticuerpo del receptor del TNF anti-humano de ratón e IgG FITC anti-ratón, 5 = células U937 tratadas con un complejo del TNF-alfa recombinante con la secuencia peptidico ID-6 y teñidas con el anticuerpo del receptor del TNF anti-humano de ratón e IgG FITC anti-ratón.

Las figuras 5a y 5b, muestran la unión del péptido de la secuencia ID-6 a TNF-R1 en células U937: En la figura 5a, se presenta el análisis con clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) de la unión del péptido con la secuencia ID-6 a TNF-R1 expresado en células U937. El eje Y denota el porcentaje MediaiSE de células positivas para la expresión del TNF-R1 de dos experimentos independientes. Los números en el eje X en el diagrama de barras (figura 5a) o en el histograma de citometria de flujo (figura 5b) representa las siguientes muestras: 1: células U937 sin tratar, 2: células U937 + TNF-cc, 3: células U937 + el péptido de la secuencia ID-6.

La figura 6, muestra la estimación de los niveles de IgG anti-colágeno a partir del suero del vehículo (CFA) , control (PBS) y ratones inmunizados con colágeno.

La figura 7, muestra la media de los valores de espesor de patas en el tarsal derecho antes del tratamiento (Pre Tx) y después del tratamiento (Post Tx) con diferentes dosis y el programa de péptido con la secuencia ID-6 en un modelo murino de artritis inducida por colágeno. Cada grupo incluyó 4-5 animales. Los valores en el eje Y representan la MediaiSE del espesor de la pata en los grupos respectivos. Los grupos de animales se representan en el eje X por orden alfabético, a saber, A: ratones artríticos tratados con 1.25 mg/kg del péptido con la secuencia ID-6 a un programa de tres veces a la semana seguido por una vez cada semana durante tres semanas , B: ratones artríticos tratados con 2.5 mg/kg del péptido con la secuencia ID-6 a un programa de tres veces a la semana seguido por una vez cada semana durante tres semanas , C: ratones artríticos tratados con 5 mg/kg del péptido con la secuencia ID-6 a un programa de tres veces a la semana seguido por una vez cada semana durante tres semanas, D: ratones artríticos tratados con 7.5 mg/kg del péptido con la secuencia ID-6 a un programa de una dosis cada semana durante cuatro semanas, E: ratones artríticos tratados con 7.5 mg/kg del péptido con la secuencia ID-6 a un programa de una dosis en la primera semana seguida por una segunda dosis después de 3 semanas, F: ratones artríticos tratados con PBS como control, G: animales control es decir, ratones C57BL/6 macho sanos, los valores p se han calculado antes y después del tratamiento. ** indica el valor p<0.01, * indica p<0.05.

Las figuras 8a y 8b, muestran la Media+SE de los valores del espesor de las patas en el tarsal izquierdo (figura 8a) y derecho (figura 8b) antes del tratamiento (pre Tx) y después del tratamiento (Post Tx) con el péptido de la secuencia ID-6, el péptido de la secuencia ID-2 y Etanercept (Et) . Los animales tratados con PBS se consideran como animales sin tratar y control denota los ratones C57BL/6 macho sanos, los valores p se han calculado antes y después del tratamiento. ** indica el valor p<0.01, * indica p<0.05, La figura 8c, muestra las proporciones comparativas de anticolágeno IgGl/IgG2a después de la terapia en animales tratados con el péptido de la secuencia ID-6, el péptido de la secuencia ID-2 y Etanercept (Et) . Los animales tratados con PBS se consideran como animales sin tratar y control denota los ratones C57BL/6 macho sanos, los valores p se han calculado antes y después del tratamiento. ** indica el valor p<0.01, * indica p<0.05.

Las figuras 9a y 9b, muestran la media de los valores de espesor de las patas en el tarsal derecho (figura 9a) y la articulación derecha (figura 9b) antes (pre Tx) y después del tratamiento (Post Tx) con el péptido de la secuencia ID-6 y Etanercept (Et) . Los animales tratados con PBS se consideran como animales sin tratar. Cada grupo incluyó 3 animales.

La figura 9c, muestra la marca clínica comparativa antes del tratamiento (pre Tx) y después del tratamiento (Post Tx) con el péptido de la secuencia ID-6 y Etanercept (Et) en un modelo de ratas de artritis inducida por un adyuvante. Los animales tratados con PBS se consideran como animales sin tratar. Cada grupo incluyó 3 animales, los valores p se han calculado antes y después del tratamiento. ** indica el valor p<0.01, * indica p<0.05.

La figura 10, muestra fotografías representativas de la hinchazón de patas y articulaciones en ratas artríticas antes y después del tratamiento con la secuencia ID-6, Etanercept o PBS como control negativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofílieos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteína.

La presente invención también se relaciona con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina.

La presente invención se relaciona además con péptidos biológicamente activos que actúan como inhibidores del TNF-alfa. Los péptidos biológicamente activos de acuerdo con la presente invención pueden actuar mediante diferentes mecanismos similares a por ejemplo, de manera enunciativa, lo siguiente : a) Los péptidos de la presente invención se pueden unir al TNF-alfa para formar un complejo, dando por resultado en la prevención de la unión del TNF-alfa a los receptores del TNF-Rl. b) Los péptidos de la presente invención se pueden unir directamente a los receptores del TNF-Rl y pueden evitar que el TNF-alfa se una a los receptores del TNF-Rl.

La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: i— 2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisterna.

La presente invención también se relaciona con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-a, que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina.

La presente invención se relaciona con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2--X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos .

La presente invención se relaciona con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi— 2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se ¦ pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina, y en donde i, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos .

La presente invención se relaciona con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-a que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xlf X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xl X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprenden Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu, y en donde ??, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: i—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde ??, X2 cada uno son independientemente 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu; X3 es un residuo de aminoácidos individual; y los aminoácidos se pueden seleccionar del grupo que comprende Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 y X3 cada uno son independientemente un residuo de aminoácido individual seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu.

La presente invención se relaciona con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi, X2 y X3 cada uno son independientemente un residuo de aminoácido individual seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu .

La presente invención se relaciona con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionados del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionados del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr, y en donde Xlf X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionados del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos; y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se relaciona además con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-a que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—¾ o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es 0-2 aminoácidos seleccionados del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionados del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr, y en donde Xi, X2 y X3 cuando se toman juntos no son menores que 2 aminoácidos.

La presente invención se relaciona además con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si X es Trp entonces X2 es Ser o Gln.

La presente invención se relaciona además con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: i—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Trp entonces X2 es Ser o Gln.

La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Trp entonces X2 es Ser o Gln, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se relaciona además con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-cc que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Trp entonces X2 es Ser o Gln.

La presente invención se relaciona además con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde i es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Ser entonces X2 es Asn o Gln.

La presente invención se relaciona además con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde ?? es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Ser entonces X2 es Asn o Gln.

La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Ser entonces X2 es Asn o Gln, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se relaciona además con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-oc que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2— 3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si i es Ser entonces X2 es Asn o Gln.

La presente invención se relaciona además con un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: X1--X2--X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Gln entonces X2 es Asn o Tyr.

La presente invención se relaciona además con un péptido para inhibición del TNF-a que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Gln entonces X2 es Asn o Tyr.

La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica que comprende un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde ?? es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Gln entonces X2 es Asn o Tyr, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se relaciona además con el método para tratar condiciones de enfermedad relacionadas con el TNF-a que comprende administrar un péptido biológicamente activo que tiene la fórmula: Xi—X2—X3 o las sales y derivados farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Xi es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Trp, Ser, Gln; X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Ser, Gln, Asn, y Tyr; y X3 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que comprende Gln, Leu, y Tyr; con la condición de que si Xi es Gln entonces X2 es Asn o Tyr.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "péptido", se refiere a polímeros formados por sub-unidades de aminoácidos que se presentan en la naturaleza unidas mediante enlaces peptídicos. El término "aminoácido" también hace referencia a porciones que tienen porciones similares a los péptidos que se presentan en la naturaleza pero que tienen porciones que no se presentan en la naturaleza. De esta forma, los péptidos pueden tener aminoácidos o enlaces alterados. El término, péptido biológicamente activo se refiere al péptido que muestra cualquier tipo/cantidad de efecto farmacológico o biológico cuando se administra a mamíferos.

El término, "aminoácido/residuos de aminoácido" utilizado anteriormente pueden ser L-aminoácidos codificados genéticamente, aminoácidos codificados no genéticamente que se presentan en la naturaleza, L-aminoácidos sintéticos o D- enantiómeros de todos lo anteriores o sales/derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las notaciones de aminoácidos utilizados en la presente para los veinte L- aminoácidos codificados genéticamente y los aminoácidos no codificados comunes son convencionales y son como sigue: Tabla - 1 Aminoácido símbolo de una Abreviatura sola letra Alanina A Ala Arginina R Arg Aparagina N Asn Ácido aspártico D Asp Cisteina C Cys Glutamina Q Gln Ácido glutámico E Glu Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I lie Leucina L Leu Lisina K Lys etionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val ß-alanina bAla Ácido 2 , 3-diaminopropionico Dpr Ácido a-aminoisobutirico Aib N-metilglicina (sarcosina) MeGly Ornitina Orn Citrulina Cit t-butilalanina t-BuA t-butilglicina t-BuG N-metilisoleucina Melle Fenilglicina Phg Ciclohexilalanina Cha Norleucina Nle Naftilalanina Nal Piridilananina 3-benzotienilalanina 4-clorofenilalanina Phe (4-C1) 2-fluorofenila1aniña Phe (2-F) 3-fluorofenilalanina Phe (3-F) 4-fluorofenilalanina Phe (4-F) Penicilamina Pen Ácido 1, 2, 3, 4-tetrahidro-Tic-isoquinolina-3-carboxilico ß-2-tienilalanina Thl Sulfóxido de metionina MSO Homoarginina hArg N-acetilisina AcLys Ácido 2, -diaminbutirico Dbu p-aminofenialanina Phe (pNH2) N-metilvalina MeVal Homocisteina hCys Homoserina hSer Ácido e-aminhexanoico Aha Ácido d-aminvalérico Ava Ácido 2, 3-diaminobutirico Dab Los péptidos que se abarcan dentro del alcance de la invención se definen parcialmente en los términos de residuos de aminoácidos de las clases designadas. Los aminoácidos en general se pueden categorizar en tres clases principales: aminoácidos hidrofilicos, aminoácidos hidrofóbicos y aminoácidos similares a cisteina, dependiendo principalmente de las características de la cadena lateral del aminoácido. Estas clases principales se pueden dividir adicionalmente en subclases. Los aminoácidos hidrofilicos incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, básicas o polares y los hidrofóbicos incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas o apolares. Los aminoácidos apolares se pueden subdivididir adicionalmente para incluir, entre otros, aminoácidos alifáticos.

"Aminoácido hidrofóbico" , se refiere a un aminoácido que tenga una cadena lateral que está sin cargar a un pH fisiológico y que se repele mediante solución acuosa. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos codificados genéticamente incluyen lie, Leu y Val. Los ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos codificados no genéticamente incluyen t-BuA.

"Aminoácido aromático" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tenga una cadena lateral que contenga al menos un anillo que tenga un sistema . pi . -electrónico conjugado (grupo aromático) . El grupo aromático se puede sustituir además con grupos de sustituyentes tales como grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, hidroxilo, sulfanilo, nitro y amino, asi como también otros. Los ejemplos de aminoácidos aromáticos codificados genéticamente incluyen fenilalanina, tirosina y triptófano. Los aminoácidos aromáticos codificados no genéticamente encontrados comúnmente incluyen fenilglicina, 2. naftilalanina, .beta. -2-tienilalanina, ácido 1, 2 , 3, 4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilico, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina y 4-fluorofenilalanina .

"Aminoácido apolar" se refiere a un aminoácido hidrofóbico que tenga una cadena lateral que en general está sin cargar a un pH fisiológico y que no sea polar. Los ejemplos de aminoácidos apolares codificados genéticamente incluyen, glicina, prolina y metionina. Los ejemplos de aminoácidos apolares no codificados incluyen Cha.

"Aminoácido alifático" se refiere a un aminoácido apolar que tenga una cadena recta saturada o insaturada de la cadena lineal, ramificada o del hidrocarburo cíclico. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos codificados genéticamente incluyen Ala, Leu, Val e lie. Los ejemplos de aminoácidos alifáticos no codificados incluyen Nle.

"Aminoácido hidrofílico" se refiere a un aminoácido que tenga una cadena lateral que se atraiga por solución acuosa. Los ejemplos de aminoácidos hidrofilicos codificados genéticamente incluyen Ser y Lys . Los ejemplos de aminoácidos hidrofilicos no codificados incluyen Cit y hCys.

"Aminoácido de carácter ácido" se refiere a un aminoácido hidrofilico que tenga un valor pK de la cadena lateral menor de 7. Los aminoácidos de carácter ácidos típicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico debido a la pérdida de un ion de hidrógeno. Los ejemplos de aminoácidos de carácter ácido codificados genéticamente incluyen ácido aspártico (aspartato) y ácido glutámico (glutamato) .

"Aminoácido básico" se refiere a un aminoácido hidrofilico que tenga un valor pK en cadena lateral mayor a 7. Los aminoácidos básicos típicamente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con un ion hidrónio. Los ejemplos de aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen arginina, lisina e histidina. Los ejemplos de aminoácidos básicos codificados no genéticamente incluyen ornitina, ácido 2,3-diaminopropionico, ácido 2 , 4-diaminobutírico y homoarginina .

"Aminoácido polar" se refiere a un aminoácido hidrofilico que tenga una cadena lateral que esté sin cargar a pH fisiológico, aunque tiene un enlace en el cual el par de electrones compartidos en común por dos átomos se mantiene más cercanamente por uno de los átomos. Los ejemplos de aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen asparagina y glutamina. Los ejemplos de aminoácidos polares codificados no genéticamente incluyen citrulina, N-acetilisina y sulfóxido de metionina.

"Aminoácido similar a cisteina" se refiere a un aminoácido que tenga una cadena lateral capaz de formar un enlace covalente con una cadena lateral de otro residuo de aminoácido, tal como un enlace disulfuro. Típicamente, los aminoácidos similares a cisterna en general tienen una cadena lateral que contiene al menos un grupo tiol (SH) . Los ejemplos de aminoácidos similares a cisteina codificados genéticamente incluyen cisteina. Los ejemplos de aminoácidos similares a cisteina codificados no genéticamente incluyen homocisteína y penicilamina .

Como se apreciará por aquellos que tengan experiencia en la técnica, la clasificación anterior no es absoluta. Diversos aminoácidos exhiben más de una propiedad característica, y por lo tanto se pueden incluir en más de una categoría. Por ejemplo, la tirosina tiene tanto un anillo aromático como un grupo hidroxilo polar. De esta forma, la tirosina tiene propiedades duales y se puede incluir en las categorías tanto aromáticas como polares. De manera similar, además de ser capaz de formar enlaces disulfuro, la cisteina también tiene carácter apolar. De esta forma, mientras que no se clasifique estrictamente como un aminoácido hidrofóbico o apolar, en muchos casos la cisteina se puede utilizar para conferir hidrofobicidad a un péptido .

Ciertos aminoácidos encontrados comúnmente que no se codifican genéticamente de los cuales los péptidos y análogos peptidicos de la invención que se pueden componer, incluyen, de manera enunciativa: . beta . -alanina (b-Ala) y otros omega-aminoácidos tales como, ácido 3-aminopropiónico (Dap), ácido 2 , 3-diaminopropiónico (Dpr), ácido 4-aminobutirico y etc.; ácido . alpha . -aminoisobutirico (Aib) ; ácido . epsilon . -aminohexanoico . (Aha) ; ácido . delta. -aminovalérico (Ava) ; N-metilglicina o sarcosina (MeGly) ; ornitina (Orn) ; citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA) ; t-butilglicina (t-BuG) ; N-metilisoleucina (Melle) ; fenilglicina (Phg) ; ciclohexilalanina (Cha); norleucina (Nle) ; 2-naftilalanina (2-Nal); 4-clorofenilalanina (Phe (4-C1) ) ; 2- fluorofenilalanina (Phe(2-F)); 3-fluorofenilalanina (Phe(3- F) ) ; 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilico (Tic); . beta . -2-tienilalanina (Thl) ; sulfóxido de metionina (MSO) ; homoarginina (hArg) ; N-acetilisina (AcLys) ; ácido 2,3- diaminobutirico (Dab) ; ácido 2, 3-diaminobutirico (Dbu) ; p-aminofenilalanina (Phe (pNH. sub.2) ) ; N-metilvalina (MeVal) ; homocisteina (hCys) y homoserina (hSer) . Estos aminoácidos también quedan convenientemente en las categorías definidas anteriormente .

Las clasificaciones de los aminoácidos codificados y no codificados genéticamente descritos anteriormente se resumen en la tabla 2, más adelante. Se debe entender que la tabla 2 es para fines ilustrativos únicamente y no pretende ser una lista exhaustiva de residuos de aminoácidos que pueden comprender los péptidos y análogos peptídicos descritos en la presente. Otros residuos de aminoácidos que son útiles para producir los péptidos y análogos peptídicos descritos en la presente se pueden encontrar, por ejemplo, en Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc., y las referencias citadas en la presente. Los aminoácidos no mencionados específicamente en la presente se pueden certificar convenientemente en las categorías descritas anteriormente con base en el comportamiento conocido y/o sus propiedades químicas y/o físicas características en comparación con los aminoácidos identificados específicamente.

Tabla 2 De preferencia, los péptidos biológicamente activos incluyen de manera enunciativa, las siguientes secuencias: Secuencia ID-1: Trp-Se —Gln ( SQ) Secuencia ID-2: Trp—Ser—Leu ( SL) Secuencia ID-3: Trp—Gln— yr (WQY) Secuencia ID-4: Ser—Gln—Tyr (SQY) Secuencia ID-5: Ser—Gln—Leu (SQL) Secuencia ID-6: Ser—Asn— yr (SNY) Secuencia ID-7: Gln—Tyr—Leu (QYL) Secuencia ID-8: Gln—Asn—Tyr (QNY) Secuencia ID-9: Trp-Ser-Leu CY cíclico (cy WSL) Secuencia ID-10: Ser-Asn-Tyr CY cíclico (cy SNY) Secuencia ID-11: Trp—Gln—Gln ( QQ) Secuencia ID-12: Trp—Asn—Gln (WNQ) Secuencia ID-13: Trp—Tyr—Gln (WYQ) Secuencia ID-14: Trp-Gln-Leu ( QL) Secuencia ID-15: Trp— sn—Leu (WNL) Secuencia ID-16: Trp—Tyr—Leu (WYL) Secuencia ID-17: Trp—Ser—Tyr (WSY) Secuencia ID-18: Tip— sn—Tyr (WNY) Secuencia ID-19: Trp—Tyr—Tyr (WYY) Secuencia ID-20: Ser—Ser—Gln (SSQ) Secuencia ID-21: Ser—Gln—Gln (SQQ) Secuencia ID-22: Ser—Asn—Gln (SNQ) Secuencia ID-23: Ser—Ser—Leu (SSL) Secuencia ID-24: Ser—Asn—Leu (SNL) Secuencia ID-25: Ser—Tyr—Leu (SYL) Secuencia ID-26: Ser—Ser--Tyr (SSY) Secuencia ID-27: Ser--Tyr--Gln (SYQ) Secuencia ID-28: Ser—Ty —Tyr (SYY) Secuencia ID-29: Gln--Ser—Gln (QSQ) Secuencia ID-30: Gln—Gln--Gln (QQQ) Secuencia ID-31: Gln—Asn—Gln (QNQ) Secuencia ID-32: Gln—Tyr—Gln (QYQ) Secuencia ID-33: Gln—Ser—Leu (QSL) Secuencia ID- 34 : Gln--Gln--Leu (QQL) Secuencia ID- 35: Gln--Asn--Leu (QNL) Secuencia ID- 36: Gln--Ser--Tyr (QSY) Secuencia ID-•37: Gln--Gln--Tyr (QQY) Secuencia ID-¦38: Gln--Tyr--Tyr (QYY) De mayor preferencia, los péptidos biológicamente activos incluyen, de manera enunciativa, Ser—Asn--Tyr (SNY) es decir, la secuencia ID-6 y Trp—Ser—Leu ( SL) es decir, la secuencia ID-2.

Los péptidos de la presente invención pueden ser lineales o cíclicos, de preferencia los péptidos son lineales .

Además, se utilizó como control positivo para antagonista del TNF-a en un estudio in vitro una secuencia de péptido con WSQYL cíclico (cy Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu CY) con actividad conocida del inhibidor TNF-alfa.

En los péptidos de acuerdo con la presente invención, el símbolo "—" entre los residuos de aminoácido Xn en general designa un inter-enlace estructural. De esta forma, el símbolo "— " por lo general designa un enlace amida (—C (0)—NH) . Se debe entender, sin embargo, que en todos los péptidos descritos en las modalidades específicas en la presente, uno o más enlaces amida opcionalmente se pueden reemplazar con un enlace distinto al amida, de preferencia una amida sustituida o un isóptero de un enlace amida.

El término TNF-alfa o TNF-oc (mencionado anteriormente o en lo sucesivo) significa lo mismo, es decir, TNF-alfa o factor-alfa de necrosis tumoral.

Los péptidos de la presente invención, se pueden sintetizar mediante cualquier método conocido en la técnica. De preferencia, los péptidos novedosos de la presente invención se sintetizaron mediante técnicas en fase sólida utilizando la estrategia Fmoc en un sintetizador automático para péptidos (Applied Biosystems 433 A Peptide Synthesizer) a escala 1.00 mmol . Los péptidos se ensamblan del término C al término N. Los péptidos se sintetizaron usando resina Wang. La resina empleada para la síntesis fue resina Wang (malla 100-200) obtenida de Novabiochem (sustitución de la resina 1.2 mmol/g) .

Se utilizaron porciones químicas para proteger las cadenas laterales reactivas de los péptidos durante el procedimiento de síntesis. El grupo amino N-terminal se protegió mediante el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). La cadena lateral de leucina se utilizó sin proteger. La cadena lateral triptófano fue ter-butoxicarbonilo (Boc) protegido. La cadena lateral de asparagina y glutamina fue tritilo (tit) protegido. Serina y tirosina se utilizaron con la protección de t-butilo (tBu) . La cisteína fue S- acetamidometilo (Acm) protegido. El primer aminoácido se cargó sobre la resina Wang utilizando 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y diisopropilcarbodimida (DIC) y se siguió por remate utilizando anhídrido acético. Los reactivos de activación utilizados para el acoplamiento de aminoácidos a la resina hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio/l-hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBt) y diisopropiletilamina (IDEA) . La reacción de acoplamiento se llevó a cabo en NMP. Después de que se completó el ensamble de la cadena peptídico, la resina peptídica se lavó con metanol y se secó. El péptido se escindido a partir de resina y mediante tratamiento con una mezcla de disociación que consistió de ácido trifluoroacético, fenol cristalino, tioanisol, etanoditiol y agua desionizada durante 2-3 hora a temperatura ambiente. El péptido crudo se obtuvo mediante precipitación con éter seco frío. El precipitar luego se filtró y se disolvió en agua y se liofilizó en un liofilizador Vertís. El péptido crudo resultante se purificó mediante HPLC preparativo utilizando una columna en fase inversa Phenomenex C18 (250 x 22.1) utilizando un gradiente de TFA al 0.1% en acetonitrilo y agua. Las fracciones eluidas se volvieron a analizar sobre un sistema de HPLC analítica (Shimadzu Corporation, Japón) utilizando una columna en fase inversa Phenomenex C18 (250 x 4.6). El acetonitrilo se evaporó y las fracciones se liofilizaron para obtener el péptido puro. La identidad de cada péptido se confirmó mediante espectro de masas.

Las formas cíclicas de los péptidos se ciclizaron sobre resina utilizando yodo en dimetilformamida (DMF). La resina se trató con exceso molar séxtuple de yodo en DMF con agitación suave en un agitador automático. El proceso de la reacción se supervisó mediante HPLC. Después del término de la reacción, la resina se inactivo con ácido ascórbico 0.4 M en DMF. La resina luego se lavó con DMF y metanol y se secó in vacuo durante unos cuantos minutos. El péptido ciclizado por último se disoció de la resina y se analizó mediante RP-HPLC. El péptido crudo se purificó mediante HPLC preparativa y se caracterizó mediante espectroscopia de masa por electro-rocío. Los péptidos de la invención se han purificado mediante técnicas conocidas en este campo tales como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad y lo semejante; de preferencia una técnica cromatográfica . De mayor preferencia, los péptidos se pueden purificar sobre un sistema de HPLC de Shimatzu semi-preparativa utilizando una columna RP C-18. Las condiciones reales utilizadas dependen de factores similares a carga neta, hidrofobicidad, hidrofilicidad, etc.

Los péptidos de la presente invención, se pueden analizar mediante técnicas conocidas en este campo, tales como espectrometría de masa, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, electroforesis 2D, cromatografía-filtración en gel (separación con base en el tamaño), intercambio iónico (separación con base en la carga) , secuenciación, especificidad de proteasas, HPLC, cristalografía por rayos X, etc. De mayor preferencia, los péptidos de la presente invención, se han analizado mediante espectrometría de masas.

La pureza de los péptidos se puede determinar mediante cualquier método conocido en este campo. La pureza de los péptidos se puede determinar mediante HPLC en fase inversa. Los péptidos de la presente invención, se analizaron para pureza. Los péptidos de la presente invención, se obtienen con mayor pureza.

Los péptidos de la presente invención, son solubles en agua, amortiguador fisiológico tal como, amortiguador de acetato, amortiguador de fosfato o DMSO que contiene PBS.

Los inhibidores del TNF-alfa de acuerdo con la invención son útiles para el tratamiento de una patología o condición asociada con los niveles del TNF-alfa, en exceso de los niveles presentes en un sujeto sano normal. Estas patologías incluyen, de manera enunciativa: patologías inmunes y autoinmunes agudas y crónicas, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y síndrome de sepsis, incluyendo caquexia; colapso circulatorio y choque que resulta de una infección bacteriana aguda o crónica; procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, incluyendo infecciones bacterianas, virales y por hongos; enfermedad de Crohn, y patologías malignas entre las que se implican tumores que secretan el TNF-alfa.

Formulación y vía de administración Los compuestos de la presente invención se pueden administrar a un sujeto per se o en la forma de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos de la presente invención se pueden elaborar por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grajeas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización . Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de forma convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que faciliten el procesamiento de los péptidos activos o análogos peptídicos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada .

Los portadores armacéuticos adecuados se describen en la más reciente edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se pueden administrar mediante cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Los péptidos de la presente invención, se pueden administrar mediante cualquier vía de administración conocida en la técnica. Las diversas vías de administración incluyen, de manera enunciativa, tópica, parenteral, transmucosal, oral, bucal, rectal, inhalación, nasal, vaginal o sublingual.

Para la administración tópica de los péptidos de la presente invención, se pueden formular, de manera enunciativa, como soluciones, geles, ungüentos, cremas, suspensiones, o lo semejante como es bien conocido en la técnica.

Las formulaciones sistémicas incluyen aquellas designadas para administración mediante inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal, así como también aquellas designadas para administración transdérmica, transmucosal, oral o pulmonar.

Para inyección, los péptidos de la presente invención, se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como, solución de Hank, solución de Ringer, o amortiguador de solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Alternativamente, los péptidos pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógeno, antes de utilizarse .

Para administración transmucosal, en la formulación se utilizan penetrantes adecuados para la barrera que será permeada. Estos penetrantes en general se conocen en la técnica .

Para administración oral, los péptidos se pueden formular fácilmente al combinar los péptidos activos con portadores farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Estos portadores permiten que los péptidos de la invención se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y lo semejante, para ingestión oral por parte de un paciente que será tratado.

Si se desea, las formas sólidas de dosificación se pueden recubrir utilizando técnicas estándar.

Para preparaciones orales liquidas tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones, los portadores excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Adicionalmente, se pueden agregar agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes y lo semej ante .

Para administración bucal, los péptidos pueden tomar la forma de tabletas, trociscos, etc. formulados de forma convencional.

Para administración mediante inhalación, los péptidos para utilizarse de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en la forma de un roció en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para utilizarse en un inhalador o insuflador se pueden formular para que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los péptidos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas para retención, por ejemplo, que contengan, bases convencionales para supositorio tales como, manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los péptidos también se pueden formular como una preparación para depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta forma, por ejemplo, los péptidos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.

Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas para suministro farmacéutico. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se pueden utilizar para suministrar los péptidos y análogos peptídicos de la invención. Ciertos solventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido también se pueden emplear, aunque por lo general al costo de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los péptidos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida. Se han establecido y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica diversos materiales de liberación sostenida. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de las proteínas.

Las sales y derivados farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la presente invención, aquellas sales y derivados que prácticamente conserven la actividad biológica de las bases libres. La sal y los derivados farmacéuticamente aceptables incluyen las sales y derivados que se puedan preparar de acuerdo con el experto en la técnica .

Los péptidos de la presente invención en general se utilizaran en una cantidad efectiva para alcanzar el fin pretendido. Para utilizarse para tratar o prevenir trastornos asociados con el TNF, los péptidos de la presente invención o las composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o se aplican en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por cantidad terapéuticamente efectiva se debe entender una cantidad efectiva para mejorar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia del paciente que será tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva queda dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica, en especial a la luz de la exposición detallada proporcionada en la presente.

La dosificación administrada por supuesto variará dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y vía de administración; la edad, salud, y peso del recipiente; la naturaleza y grado de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado.

Las dosificaciones iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, utilizando técnicas que son bien conocidas en este campo. Alguien con experiencia normal en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos con base en datos de animal.

La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de los péptidos que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones usuales en un paciente para la administración mediante una inyección varían de aproximadamente 0.1 hasta 50 mg/kg/día, de preferencia de aproximadamente 0.5 hasta 10 mg/kg/día. Típicamente, 1 hasta 10 mg por kg al día proporcionadas en dosis ya sea, múltiples veces en un día (6 veces) o una dosis cada tercer día o una forma de liberación sostenida ya sea eficaz para obtener resultados deseados. La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente hasta alcanzar niveles en plasma que sean efectivos para mejorar la condición patológica. Los niveles séricos terapéuticamente efectivos se pueden alcanzar al administrar múltiples dosis al día.

En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva de los péptidos puede no estar relacionada con la concentración en plasma. Alguien con experiencia en la técnica, será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente efectivas sin demasiada experimentación.

La cantidad del péptido administrada por supuesto dependerá del sujeto que será tratado, el peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la forma de administración y el juicio del médico que está prescribiendo.

La terapia se puede repetir intermitentemente mientras que los síntomas sean detectables o incluso cuando no sean detectables. La terapia se puede proporcionar sola o en combinación con otros fármacos.

A todo lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones y patentes con las patentes por número y otras publicaciones por autor y año. Las citas totales para las publicaciones se listan más adelante. Las exposiciones de estas publicaciones y patentes en sus totalidades se incorporan en la presente como referencia en esta solicitud para describir de manera más completa el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención .

La invención se ha descrito de una forma ilustrativa, y se debe entender que la terminología que se ha utilizado pretende estar en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar de limitación.

Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se debe entender que dentro de las reivindicaciones anexas, la invención se puede practicar de otra manera a la descrita específicamente.

Metodología general y resultados Ejemplo - 1: Proceso para la preparación del péptido de la secuencia ID-6: Ejemplo - 1(a) Síntesis del péptido de la secuencia ID-6: El péptido de la secuencia ID-6 se sintetizó utilizando un método para síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos automático o semiautomático siguiendo la química Fmoc-. Para la síntesis se utilizó la resina Wang. La sustitución de la resina varió de 0.6 hasta 1.2 mmol/g. La cadena lateral de tirosina y serina se protegió por el grupo ter-butilo y la cadena lateral de asparagina se protegió por el grupo tritilo. La carga del primer aminoácido tirosina para la resina Wang se llevó a cabo utilizando DIC/HOBt (3-5 eq) y DMAP (1-2 eq) en DMF a temperatura ambiente durante aproximadamente 5-8 horas. La desprotección del grupo Fmoc N-protegido se realizó utilizando piperidina al 20% en DMF durante 20-30 minutos. Se utilizaron 15-20 mi de DMF para 1 mmol de la reacción. Se acopló Fmoc Asp(tBu)-0H (3-5 eq) a la tirosina desprotegida utilizando DIC/HOBt (3-5 eq) a temperatura ambiente durante aproximadamente 3-4 horas en DMF. El término de la reacción se supervisó mediante la prueba Kaiser. La ausencia de color azul en la prueba Kaiser indica el término de la reacción de acoplamiento. La mezcla de reacción se lavó adicionalmente con DMF tres veces. El grupo Fmoc se desprotegió como se describió anteriormente y la mezcla de reacción se lavó adicionalmente con DMF tres veces. De una forma similar, se acopló Fmoc-Ser (tBu) -OH a asparagina y se desprotegió. El rendimiento promedio del péptido ensamblado en fase sólida fue del 90-95%.

Disociación de péptidos a partir resina: Para disociar el péptido de la resina se utilizó una mezcla de reactivos (150 mi) que contuvo TFA: Fenol : TIS : DIT :Agua en la proporción 82.5:5.0:2.5:5.0:5.0. La resina cargada con el péptido de la secuencia ID-6 se mantuvo en el reactivo de disociación bajo un entorno enfriado con hielo durante 15 minutos con agitación constante y luego a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación constante. Después del término de la reacción, la mezcla se filtró a través de un embudo sinterizado y el péptido se precipitó al agregar el di-etil-éter frío al filtrado.

El péptido precipitado se filtró a través del embudo sinterizado, se secó, se disolvió en agua y por último se liofilizó para obtener el péptido crudo. El rendimiento en crudo del péptido fue del 85-90%.

Purificación del péptido El péptido crudo se analizó mediante HPLC analítico utilizando acetonitrilo y agua como eluyente. La purificación del BRC605-1 crudo se realizó en (Shimadzu) HPLC LC-8A utilizando columnas prep C-18 (250 x 50 mm 10 µ) mediante elusión isocrática en una mezcla de acetonitrilo (TFA al 0.1% TFA) agua (TFA al 0.1%) con una magnitud de flujo de 80-120 ml/min y una longitud de onda de detección de 210 nm. Además la fracción purificada se analizó mediante HPLC analítica y se reunieron las fracciones deseadas, se liofilizaron y se caracterizaron. El rendimiento total del método se encontró que será >70%.

Caracterización del péptido Análisis MS - se realizó la caracterización mediante análisis espectral de masas de todos los lotes del péptido de la secuencia ID-6. La masa molecular de cada lote será 383.5 (modo positivo).

Secuenciación de péptidos - se ha realizado una caracterización mediante la secuenciación de péptidos de todos los lotes del péptido de la secuencia ID-6. La secuencia peptidica de cada lote se consulta con la secuencia real .

Ejemplo - 2: inhibición de la citotoxicidad producida por el T F-alfa de células L-929 mediante las secuencias peptidicas : Los péptidos de la presente invención se analizaron para la inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa empleando la linea celular de fibroblastos murinos, L929. La adición del TNF-alfa a células L929 (ATCC) induce citotoxicidad, lo cual se puede estimar mediante la tinción de células viables con tintes vitales similares a TT (bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio, un tetrazol) o violeta cristalina seguido por la extracción de los tintes con metanol. La absorbancia del tinte extraído se puede medir a 595 nm (Hansen et al. 1989, Journal of Immunological Methods, 119: 203-210) . El análisis se realizó como sigue: Células L929 (mantenidas en medio de Eagle modificado con Dulbecco' s suplementado con FCS al 10%) se sembraron a una densidad de 2 x 105 células/ml en una placa microtituladora, y se incubaron con actinomicina D (ACT-D) a una concentración de 1 pg/ml durante 2 horas a 37 °C y C02 al 5%. Se agregó TNF-a (100 pg/ml) preincubado con 75 µ? de la solución de péptidos a 37 °C a células L929 y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5%.

Se utilizó el péptido WSQYL cíclico (cy Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu) como control positivo para la estimación de la inhibición de la citotoxicidad relacionada con el TNF. Se agregó TNF-a (100 pg/ml) preincubado con la solución de péptidos control positivo (75 µ ) a 37 °C a células L929 en cavidades por separado y se incubaron durante la noche a 37°C, C02 al 5%.

Las células vivas de la prueba y las placas con control positivo luego se tiñeron con 100 µ?/cavidad de violeta cristalina al 0.05% y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min., se lavaron con PBS y se mantuvieron durante la noche en secado a temperatura ambiente. La violeta cristalina se extrajo a partir de las células mediante 100 µ? por cavidad de metanol y la absorbancia del tinte de violeta cristalina extraído se estimó a 595 nm. La inhibición porcentual en la citotoxicidad se calculó mediante la siguiente fórmula: ODe^-OD™ La valoración del grado de inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa se realizó empleando 75 µ? de concentración de los péptidos de la presente invención.

Ejemplo - 2(a) Los péptidos de las secuencias ID-1 hasta 10 se analizaron para la inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa. Los péptidos con las secuencias ID-1, 2, 6 y 8 exhibieron mayor inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa en comparación con el control positivo. La inhibición porcentual de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa fue 65+9.2%, 48+6%, 62+6.2%, 51±2.3% (Media+SE % de inhibición, calculado sobre la base de experimentos cada uno ejecutado por duplicado) , respectivamente para el péptido con las secuencias ID 1, 2, 6, y 8.

Ejemplo - 2 (b) Comparación de la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa mediante las formas lineales y cíclicas de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6 Los péptidos lineales de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6 y los péptidos cíclicos con la secuencia ID-9 y la secuencia ID-10 se analizaron para comparar la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa (utilizando el método como se estableció anteriormente) . Se encontró que los péptidos lineales de la secuencia ID-2 y la ID-6 son los supresores más potentes de la citotoxicidad inducida por TNF-alfa que las formas cíclicas de los péptidos de la secuencia ID-9 y la ID-10. Las formas cíclicas de los péptidos de la secuencia ID-9 y la ID-10 exhibieron un grado mínimo de inhibición como se muestra en la figura 2.

Formas lineales y cíclicas del péptido con control positivo es decir, WSQYL cíclico (cy Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu) se analizaron para comparar la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa. De manera interesante, se observó un patrón inverso, es decir, la forma cíclica del péptido control positivo exhibió mayor grado de citotoxicidad inducida por el TNF-alfa (60+10%) mientras que la forma lineal del péptido control positivo fue ineficaz para inducir la inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa (figura 2) .

Se encontró que los péptidos lineales de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6 tienen un potencial inhibidor tan alto como el de las formas cíclicas del control positivo que es un péptido inhibidor del TNF-alfa conocido.

Ejemplo - 2 (c) Comparación de la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa por los péptidos de la secuencia ID-6 y Etanercept (el inhibidor del TNF-alfa conocido y comercializado como "Enbrel") El péptido de la secuencia ID-6 y Etanercept se analizaron para comparar la capacidad para inhibir la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa (utilizando el método como se estableció anteriormente en el ejemplo 2). Se encontró que el péptido es decir, la secuencia ID-6 tuvo una capacidad comparable con la inhibición de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa con la del Etanercept (Figura 3).

Estudios de unión para el péptido Se utilizó una técnica de análisis por citometría de flujo para investigar la unión de los péptidos a TNF-a o TNF-R1 empleando células U937 (una linea de células de leucemia humana que expresan el receptor del TNF) . La unión del péptido a TNF-a evita que el TNF-a interactúe con el TNF-Rl lo cual se puede analizar mediante citometria de flujo. De manera similar, la unión directa del péptido con TNF-R1 reduce las células positivas TNF-R1 porcentuales que se pueden analizar mediante citometria de flujo.

Ejemplo - 3: Inhibición de la unión de TNF-a a su receptor del TNF- Rl sobre células por los péptidos : El TNF-alfa se une a su receptor cognado TNF-R1 sobre células U937 (ATCC) conduciendo a una reducción en las células positivas porcentuales para TNF-R1. Los péptidos de unión al TNF-alfa se unen al TNF-alfa y evitan la interacción del TNF-alfa con TNF-R1. Las células positivas porcentuales para TNF-R1 se pueden cuantificar mediante tinción con el anticuerpo anti-TNF-Rl conjugado con fluorocromo.

Los péptidos de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6, se analizaron para la inhibición del TNF-alfa que se une a su receptor del TNF-Rl sobre células U93 . Se estimo la inhibición del TNF-alfa que se une al TNF-Rl sobre las células U937 mediante los péptidos con la secuencia ID-2 o la secuencia ID-6, utilizando un clasificador de células activado fluorescente (FACS, FACSCALIBUR, Becton Dickinson, USA) .

Las células U937 (mantenidas en medio RPMI-1640 (Sigma Aldrich, USA) , suplementado con FCS al 10% se suspendieron en PBS que contuvo BSA al 0.5% (albúmina de suero bovino) y NaN3 al 0.05% (amortiguador de unión) a una densidad de 1 x 105 células por 100 µ? de amortiguador. El TNF-a (5 ng) se preincubó con soluciones (50 µ?) de péptidos (secuencia ID-2 y secuencia ID-6) en PBS en tubos por separado durante 1 hora a 37 °C. El complejo del péptido TNF-alfa luego se agregó a las células U937 y se incubó durante 1 hora a 4°C. Las células U937 (1 x 105) se incubaron en un tubo por separado (como un experimento paralelo) con el TNF-alfa (5 ng) durante 1 hora a 4°C. Las células luego se lavaron en amortiguador de unión y se agregaron 5 µ? (1 mg/ml) de un anticuerpo del receptor del TNF anti-ratón humano (número de clon HTR-9, Novus Biologicals) , a las células durante 1 hora a 4°C. Estas células luego se lavaron con amortiguador de unión y se tiñeron con 10 µ? (10 pg/ml) del anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado fluorescente (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de dos lavados con amortiguador de unión, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson) . Las salidas se ajustaron sobre la población de células viva, y el grado de inhibición de la unión del TNF-a/célula por los péptidos se calculó sobre la base de las células positivas porcentuales para la expresión del TNF-Rl.

Se encontró que aproximadamente el 78±1% de las células U937 sin tratar fueron positivas para la expresión del TNF-Rl. La preincubación de las células U937 con el TNF-alfa dio por resultado en la reducción en el número de células positivas para la expresión del TNF-Rl al 32±10% (Figura 4a y 4b). La preincubación de las células U937 con un complejo de péptidos de la secuencia ID-2 y el TNF-alfa dio por resultado en un número de células positivas para la expresión del TNF-Rl al 37±8.5%. La preincubación de las células U937 con un complejo de la secuencia ID-6 y el TNF-alfa dio por resultado en un número de células positivas para la expresión del TNF-Rl al 57±8% (figuras 4a y 4b) .

El resultado anterior claramente muestra que los péptidos de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6 se unen al TNF-alfa y evitan la unión del TNF-alfa al TNF-Rl y existe una reducción menor en las células positivas para el receptor del TNF-Rl en comparación con el TNF-alfa sin tratar.

Ejemplo -4 Evaluación de la unión del péptido al TNF-Rl en células U937 mediante citometrxa de flujo: Las células U937 se utilizaron para cuantificar la unión de los péptidos al TNF-Rl. El TNF-alfa con la adición a células U937 se une a su receptor cognado TNF-Rl sobre las células U937 que conduce a una reducción en las células positivas porcentuales para el TNF-Rl. Los péptidos para inhibición del TNF-alfa de acuerdo con la presente invención se unen al TNF-Rl y reducen las células positivas del TNF-Rl después de la incubación de las células U937 con los péptidos .

El péptido de la secuencia ID-6 se analizó para la unión del péptido al TNF-Rl en células U937 utilizando citometrxa de flujo. Las células U937 se incubaron con el péptido de la secuencia ID-6 para demostrar la unión directa del péptido de la secuencia ID-6 al receptor del TNF-Rl. Después de la incubación con el péptido de la secuencia ID-6 (250 µ?) y el TNF-alfa (10 ng) por separado, las células U937 se lavaron dos veces y se tiñeron con 5 µ? (1 mg/ml) de un anticuerpo del receptor del TNF anti-ratón humano (número de clon HTR-9, Novus Biologicals) durante 1 hora a 4°C. Estas células luego se lavaron con el amortiguador de unión y se tiñeron con 10 µ? (10 µg/ml) del anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceina (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de dos se lavados en el amortiguador de unión, la células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson) . Las salidas se ajustaron sobre la población de células vivas, y el grado de unión al TNF-Rl se calculó sobre la base de las células positivas porcentuales para la expresión del TNF-Rl.

Se encontró que la expresión del TNF-Rl sobre células U937 sin tratar fue del 83%. La incubación de las células U937 con el TNF-alfa recombinante (10 ng) dio por resultado en la reducción en las células positivas porcentuales para el TNF-Rl al 31.6%. La incubación de las células U937 con el péptido de la secuencia ID-6 dio por resultado en la reducción en las células positivas porcentuales para el TNF-Rl al 32% (Figura 5) . La reducción en las células positivas porcentuales para la expresión del TNF-Rl después de la incubación con la secuencia ID-6 se encontró comparable con el TNF-alfa que claramente indica la unión de los péptidos al TNF-Rl.

Ejemplo - 5 Eficacia in vivo de los péptidos en modelos de ratón de artritis reumatoide: Ejemplo - 5 (a) desarrollo del modelo de ratón para artritis : Ratones macho C57BL/6 obtenidos del hogar para animales en Lalru, Panacea Biotec se utilizaron para desarrollar un modelo murino de artritis reumatoide. Los ratones se inmunizaron intradérmicamente con 150 g de colágeno tipo-II de pollo (Sigma) emulsionado en adyuvante de Freunds completo (CFA) (Sigma) . El dia 17 después de la inmunización primaria, se administró a los animales una inmunización de refuerzo con 100 iq de colágeno tipo II de pollo en adyuvante de Freunds incompleto (Ethan Shevach, Curr. Prot. Immunol. 2002: 15.0.1-15.0.6; Inglis J et al., 2008 Nature Protocols, 4:612-618). El aumento en el espesor de las patas en comparación con los controles (ratones macho C57BL/6 sanos) y la presencia de los anticuerpos IgG anticolágeno fueron los parámetros para valorar el desarrollo de la artritis. El espesor de las patas en los animales se midió utilizando un Vernier Calipers digital y los anticuerpos anti-colágeno se midieron en el suero de ratón en el día 35 después de la inmunización.

Ejemplo - 5 (b) niveles IgG anti-colágeno en suero de rató : Se recubrió colágeno tipo II de pollo (sigma) sobre placas ELISA a 1 µ?/p?? en PBS y se incubó durante la noche a 4°C. Después de tres lavados en PBS-Tween 20 0.05% (PBS-T), se agregó suero proveniente del colágeno, vehículo (CFA) y PBS (control) ratones inyectados a cavidades por separado a una dilución de 1:100. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de 5 lavados en PBS-T se agregó HRP IgG anti-ratón de conejo (Bethyl Laboratories) a las cavidades a diluciones 1:10000 y se incubó a la temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de lavar la placa en PBS-T, se agregó como sustrato OPD (orto-fenildiamina) y se observó de un desarrollo de color. El desarrollo de color se detuvo mediante HC1 2N. La absorbancia se registró a 490 nm (Ethan Shevach, Curr. Prot. Immunol . 2002: 15.0.1-15.0.6). Los ratones inmunizados con colágeno exhibieron niveles séricos elevados del IgG anti-colágeno en comparación con el vehículo (CFA) y el grupo control (inyectado con PBS) (figura 6) .

Ejemplo - 5 (c) optimización de la dosificación y programa en modelo murino : La determinación de la dosis óptima y el programa del péptido con la secuencia ID-6 se realizó en un modelo murino de artritis inducida por colágeno (como se preparó anteriormente) . Los ratones artríticos se asignaron aleatoriamente de acuerdo con el espesor de la pata y se dividieron en grupos por separado de 4-5 animales para la administración intravenosa del péptido de la secuencia ID-6. La tabla - 3 muestra la dosis y programa de administración para los diferentes grupos: Tabla - 3 Se ha encontrado que los péptidos de la secuencia ID-6 cuando se administran a 7.5 mg/kg una vez cada semana durante 4 semanas indujeron una disminución insignificante del espesor de las patas en comparación con el observado en los animales control. Además se observó que los péptidos de la secuencia ID-6 cuando se administran a un programa de dosificación de 5 mg/kg tres veces a la semana seguido por una vez cada semana durante 3 semanas indujeron una reducción significativa del espesor de las patas en comparación con los animales control. Por lo tanto, 5 mg/kg tres veces a la semana seguido por una dosificación de una vez cada semana durante 3 semanas se seleccionó como la dosis óptima (figura 7) .

Ejemplo - 5 (d) eficacia comparativa del péptido de la secuencia ID-6, ID-2 y Etanercept en modelo murino: La eficacia del péptido con la secuencia ID-6 y la secuencia ID-2 se comparó con Etanercept (el agente para inhibición del TNF-alfa comercializado y aprobado con el nombre comercial "Enbrel") utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno (según se preparó como se describió anteriormente) . Los péptidos de la secuencia ID-6, la secuencia ID-2 y Etanercept se administraron intravenosamente a los ratones artríticos a una dosis de 5 mg/kg tres veces en la primera semana seguido por una vez cada semana durante tres semanas.

Se observó que la administración del péptido con la secuencia ID-6 y Etanercept dieron por resultado en una disminución significativa del espesor de las patas y fue comparable con los animales control normales (ratones macho C57BL/6 sanos control) (p< 0.01) (figura 8a). La administración del péptido de la secuencia ID-2 también dio por resultado en una disminución significativa del espesor de las patas (p< 0.05) (figura 8a). Los resultados claramente indican que los péptidos de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6 tuvieron una eficacia comparable con la de Etanercept.

Ejemplo 5(e) - Estudio comparativo para determinar las proporciones de IgGl/lgG2a después de la terapia en animales tratados con los péptidos de la secuencia ID-2 , secuencia ID-6 y Etanercept.

El desarrollo de la enfermedad en la artritis inducida por colágeno se acompaña por un aumento en respuesta de Thl o pro-inflamatoria. Se midieron los niveles de IgGl/IgG2a para determinar si el tratamiento con los péptidos de la presente invención y Etanercept mejoraron la enfermedad clínica en el modelo murino al disminuir la respuesta Thl. Una proporción menor de IgGl/IgG2a podría indicar una sub- regulación de la respuesta Thl o pro-inflamatoria.

Los péptidos de la secuencia ID-2 y la secuencia ID-6, Etanercept, PBS se administraron intravenosamente a los ratones artríticos a una dosis de 5 mg/kg tres veces en la primera semana seguido por una vez cada semana durante tres semanas. Se encontró que la administración de los péptidos con la secuencia ID-6 y Etanercept dio por resultado en una menor proporción de IgGl/IgG2a después de la terapia en comparación con los animales artríticos sin tratar (los animales tratados con PBS se consideraron como animales sin tratar) (figura 8b). Los animales artríticos sin tratar (animales tratados con PBS se consideraron como animales sin tratar) exhibieron una mayor proporción de IgGl/IgG2a debida una inflamación en aumentó. Esto sugiere que el tratamiento con el péptido de la secuencia ID-6 induce una remisión terapéutica al disminuir la respuesta Thl en ratones artríticos y da por resultado en una menor proporción de IgGl/IgG2a, que es comparable con la proporción IgGl/IgG2a en los animales control (ratones macho C57BL/6 sanos control) .

Ejemplo — 6 Eficacia in vivo del péptido de la secuencia ID-6 en modelo de rata de artritis inducida por adyuvante: La eficacia in vivo del péptido con la secuencia ID-6 se evaluó en un modelo de rata de artritis inducida por "adyuvante". Este modelo se utiliza ampliamente para desarrollar y probar fármacos anti-inflamatorios . La artritis por adyuvante (AA) en ratas imita las características de la artritis inflamatoria en seres humanos (Pearson et al, 1956, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112:95-10). La AA se indujo en ratas Wistar macho mediante la inmunización intradérmica con 150 de adyuvante de freunds completo seguido por una inmunización de refuerzo en el dia 7 con el adyuvante de freunds incompleto.

La artritis se evaluó en los animales mediante un mareaje clínico y la medición del espesor de las patas y articulaciones utilizando calibradores Vernier digitales. La marca clínica se asignó de acuerdo con los siguientes criterios : 0 = sin eritema o hinchazón 1 = ligero eritema o hinchazón de uno de los pulgares u otro dedo 2 = eritema e hinchazón de más de un pulgar u otro dedo 3 = eritema e hinchazón del tobillo o muñeca 4 = eritema e hinchazón completos de los pulgares u otros dedos y tobillo o muñera e incapacidad para doblar el tobillo o muñeca.

A las ratas artríticas se les administró el péptido de la secuencia ID-6 a una dosis de 2.5 mg/kg, una vez al día durante 6 días en la primera semana seguida por 3 dosis cada tercer día en la segunda semana. Otro grupo de animales artríticos recibió Etanercept (Et) de una forma similar. Se observó una disminución del espesor de las patas en los animales que recibieron ya sea el péptido de la secuencia ID-6 o Etanercept en comparación con las ratas artríticas sin tratar (las ratas tratadas con PBS se consideran como ratas artríticas sin tratar) (figura 9a) . También se observó una disminución significativa de la marca clínica con el péptido de la secuencia ID-6 o el tratamiento con Etanercept (p< 0.05) (figura 9b, 10). En general, los resultados sugieren que la eficacia del péptido de la secuencia ID-6 fue comparable con Etanercept en la reducción del espesor de las patas o la marca clínica en ratas artríticas (figura 9(a) y (b) .

Se debe observar que en el sentido en el que se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno", "una" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un péptido para inhibición del TNF-oc caracterizado porque tiene la fórmula: X1--X2— 3 o las sales y derivados del mismo, en donde Xi, X2 y X3 cada uno son independientemente un residuo de aminoácido individual seleccionado del grupo que comprende de Trp, Ser, Gln, Asn, Tyr y Leu.

2. El péptido para inhibición del TNF-a de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de la Secuencia ID No. 1-8 y la Secuencia ID No. 11-38.

3. El péptido para inhibición del TNF-a de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de la Secuencia ID No. 1, 2, 6, 8.

4. Un proceso para la preparación de un péptido para inhibición del TNF-a de conformidad con la reivindicación 1-3, caracterizado porque el péptido se prepara mediante síntesis en fase sólida.

5. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el péptido para inhibición del TNF-a de conformidad con la reivindicación 1-3, y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Un método para tratar las condiciones de enfermedades relacionados con el TNF-a caracterizado porque comprende administrar un péptido para inhibición del TNF-a de conformidad con la reivindicación 1-3.

7. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la composición se puede administrar por via tópica, parenteral, transmucosal , oral, bucal, rectal, inhalación intranasal, rectal, vaginal o lingual.