CN112986440A - 一种Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Fmoc‑Cys(trt)‑OH有关物质检测方法，其参数条件如下：检测波长为220nm，所用流动相为乙腈和水，同时添加TFA的离子对溶液，梯度变化中乙腈体积含量为50~100~50％，水的体积含量为50~0~50％；检测时所用的色谱柱的固定相为十八烷基硅烷。本发明提供的Fmoc‑Cys(trt)‑OH有关物质检测方法，检测速度较快，结果准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。

Description

一种Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及多肽领域，具体涉及一种Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质的检测方法。
背景技术
FMOC-半胱氨酸(TRT)，Fmoc-Cys(trt)-OH，又名N-[(9H-芴-基甲氧基)羰基]-S-(三苯甲基)-L-半胱氨酸；芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸；FMOC-S-TRITYL-L-半胱氨酸；FMOC-L-半胱氨酸(TRT)；(ChemicalbookR)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(三苯甲基硫代)丙酸；Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸；FMOC-S-苯甲基-L-半胱氨酸。
Fmoc-Cys(trt)-OH的结构式如下所示：
Figure BDA0002958428960000011
L-半胱氨酸是一种生物体内常见的氨基酸，是合成多肽的重要原料。为含硫α-氨基酸之一，遇硝普盐(nitroprusside)呈紫色(因SH而显色)，存在于许多蛋白质、谷胱甘肽中，与Ag+，Hg+，Cu+等金属离子可形成不溶性的硫醇盐(mercaptide)。即R-S-M′，R-S-M″-S-R(M′，M″各为1价、2价金属)，分子式C3H7NO2S，分子量121.16，无色晶体，溶于水、乙醇、乙酸和氨水，不溶于乙醚、丙酮、乙酸乙酯、苯、二硫化碳和四氯化碳。在中性和弱碱性溶液中能被空气氧化成胱氨酸。
半胱氨酸衍生物包括多种半胱氨酸类药物。半胱氨酸盐酸盐，临床上用于肝炎及重金属中毒等。半胱氨酸是组成谷胱甘肽的天然成分之一，分子中含有活泼的巯基(-SH)，对巯基蛋白酶、受毒害的肝实质细胞，具有保护作用，并能刺激造血机能，增加白细胞和促进皮肤损伤的修复。半胱氨酸的衍生物乙酰半胱氨酸、半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酸及羧甲半胱氨酸，为呼吸道黏液溶解剂，并具有促进受损支气管黏膜的修复作用。
在Fmoc-Cys(trt)-OH的合成工艺中，难免会引入一系列的杂质如异构体杂质等，这些杂质统称为有关物质其存在会严重影响Fmoc-Cys(trt)-OH成品的质量。因此，对Fmoc-Cys(trt)-OH的有关物质进行严格的质量控制具有重要的现实意义。
本发明在充分研究Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质的基础上，开发其检测方法，从而从源头上控制了多肽药物杂质的限度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种操作方便快捷、结果准确的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，参数条件如下：
检测波长为220nm，所用流动相为乙腈和水，同时添加TFA的离子对溶液，梯度变化中乙腈体积含量为50～100～50％，水的体积含量为50～0～50％；检测时所用的色谱柱的固定相为十八烷基硅烷。
优选的，所述有关物质检测方法中色谱柱可以选自Kromasil 100A C18 5u 250*4.6mm，SinoChrom ODS-BP 5μ4.6mmx250mm或Symmetry Shield RP18 5um 4.6*250mm。
优选的，所述有关物质检测方法中柱温为20～40℃，流动相流速为0.8～1.2ml/min。
进一步的，所述有关物质检测方法中柱温为25℃，流动相流速为1ml/min。
优选的，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。
优选的，所述有关物质检测方法中不使用对照品溶液，而直接采用面积归一化法计算Fmoc-Cys(trt)-OH的纯度。
优选的，所述有关物质检测方法中TFA的离子对溶液的添加量为0.1％(体积比)。
优选的，有关物质检测方法中洗脱梯度变化为：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 50 50
20 0 100
25 0 100
26 50 50
32 50 50
本发明中化合物的中文命名与结构式有冲突的，以结构式为准；结构式有明显错误的除外。
本发明提供的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，检测速度较快，结果准确，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。
说明书附图
图1是本发明具体实施方式提供的Fmoc-Cys(trt)-OH的高效液相色谱图；
图2是本发明具体实施方式提供的空白溶液的高效液相色谱图；
图3是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-β-Ala-OH的高效液相色谱图；
图4是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-Cys(trt)-Cys(trt)-OH的高效液相色谱图；
图5是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-β-Ala-Cys(trt)-OH的高效液相色谱图；
图6是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-Cys-OH的高效液相色谱图；
图7是本发明具体实施方式提供的所有混合物的混合溶液的高效液相色谱图；
图8是本发明具体实施方式提供的对比例的高效液相色谱图；
图9是本发明具体实施方式提供的含有Fmoc-Cys(trt)-OH及杂质Hosu、Fmoc-OH、Fmoc-OSU的混合溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实例说明本发明，但不限制本发明。在本领域内，技术人员对本发明所做的简单替换或改进均属于本发明所保护的技术方案内。
1、仪器及试剂
高效液相色谱仪：赛默飞U3000，四元泵，自动进样器，UV检测器，Chromeleon 7工作站，电子天平BT25S型(赛多利斯，十万分之一)，SinoChrom ODS-BP 5μ4.6mmx250mm。Fmoc-Cys(trt)-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Cys-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-Cys(trt)-Cys(trt)-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-Cys(trt)-OH(吉尔生化)，杂质Fmoc-β-Ala-OH(吉尔生化)，乙腈(色谱纯，国药)，三氟乙酸(AR，成都化学试剂厂)，重蒸馏水(自制)。
杂质峰、溶剂峰及主峰保留时间的确定
所述杂质列表
Figure BDA0002958428960000031
Figure BDA0002958428960000041
色谱条件采用：
检测波长：220nm，柱温：25℃，进样量：10μl
流动相：A:100％H2O加0.1％TFA B:100％ACN加0.1％TFA
梯度B相变化0min50％～20min 100％～25min 100％～26min 50％～32min 50％～32min Stop分别注入Fmoc-Cys(trt)-OH溶液、空白溶液(流动相)，杂质Fmoc-Cys-OH溶液，杂质Fmoc-Cys(trt)-Cys(trt)-OH溶液，杂质Fmoc-β-Ala-Cys(trt)-OH溶液，杂质Fmoc-β-Ala-OH溶液，以及所有混合物的混合溶液，Fmoc-Cys(trt)-OH的保留时间约为13.1min左右(如图1所示)，空白溶液(如图2所示)，杂质Fmoc-β-Ala-OH的保留时间约为5.9min左右(如图3所示)，杂质Fmoc-Cys(trt)-Cys(trt)-OH的保留时间约为18.3min左右(如图4所示)，杂质Fmoc-β-Ala-Cys(trt)-OH的保留时间约为11.4min左右(如图5所示)，杂质Fmoc-Cys-OH的保留时间约为5.0min左右(如图6所示)。所有混合物的混合溶液出峰情况(如图7所示)，本方法能够很好的分离Fmoc-Cys(trt)-OH及其有关物质，从而有效的控制Fmoc-Cys(trt)-OH的质量。
实施例2
色谱条件采用：
检测波长：220nm，柱温：25℃，进样量：10μl
流动相：A:100％H2O加0.1％TFA B:100％ACN加0.1％TFA
梯度B相变化0min50％～20min 100％～25min 100％～26min 50％～32min50％～32min Stop分别注入Fmoc-Cys(trt)-OH溶液、空白溶液(流动相)，杂质Hosu溶液，杂质Fmoc-OH溶液，杂质Fmoc-osu溶液以及所有混合物的混合溶液(见图9)，Hosu的保留时间约为2.6min左右，杂质Fmoc-OH的保留时间约为5.5min左右，杂质Fmoc-osu的保留时间约为6.8min左右，Fmoc-Cys(trt)-OH的保留时间约为12.9min左右，所有混合物的混合溶液出峰情况(如图9所示)，本方法能够很好的分离Fmoc-Cys(trt)-OH及其有关物质，从而有效的控制Fmoc-Cys(trt)-OH的质量。
对比例
色谱条件采用：
检测波长：220nm，柱温：35℃，进样量：10μl
流动相：A:100％H2O加0.1％TFA B:100％ACN加0.1％TFA
梯度B相变化0min 70％～20min 100％～25min 100％～26min 70％～32min70％～32min Stop。
进Fmoc-Cys(trt)-OH，杂质Fmoc-Cys-OH，杂质Fmoc-Cys(trt)-Cys(trt)-OH，杂质Fmoc-β-Ala-Cys(trt)-OH，杂质Fmoc-β-Ala-OH的混合物的混合溶液。见图8，杂质Fmoc-β-Ala-OH与杂质Fmoc-Cys-OH未分开。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于参数条件如下：
检测波长为220nm或210nm，214nm，254nm等，所用流动相为乙腈和水，同时添加TFA的离子对溶液，梯度变化中乙腈体积含量为50～100～50％，水的体积含量为50～0～50％；检测时所用的色谱柱的固定相为十八烷基硅烷。
2.如权利要求1所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中色谱柱可以选自Kromasil 100A C18 5u 250*4.6mm，SinoChrom ODS-BP 5μ4.6mmx250mm或Symmetry Shield RP18 5um 4.6*250mm。
3.如权利要求1所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中柱温为20～40℃，流动相流速为0.8～1.2ml/min。
4.如权利要求3所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中柱温为25℃，流动相流速为1ml/min。
5.如权利要求1所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。
6.如权利要求1所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中不使用对照品溶液，接采用面积归一化法计算Fmoc-Cys(trt)-OH的纯度。
7.如权利要求1所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，所述有关物质检测方法中TFA的离子对溶液的添加量为0.1％。
8.如权利要求1～7任一项所述的Fmoc-Cys(trt)-OH有关物质检测方法，其特征在于，有关物质检测方法中洗脱梯度变化为：
时间(min) 流动相A％ 流动相B％ 0 50 50 20 0 100 25 0 100 26 50 50 32 50 50
。
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