CN108676082A - 一种β淀粉样肽1-42的固相合成法 - Google Patents

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徐红岩
竺剑峰
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Binhai Gl Peptide Co Ltd
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Shanghai GL peptide Ltd
Binhai Gl Peptide Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种β淀粉样肽1‑42的固相合成法，主要解决现有合成方法存在的工艺复杂、成本高、收率低等技术问题。本发明合成法具体包括如下步骤：（1）固相合成Fmoc‑Ala‑HMP‑TentaGel树脂；（2）根据β淀粉样肽1‑42的肽序在所述的Fmoc‑Ala‑HMP‑TentaGel树脂上偶联氨基酸或Hmb（Dmb）氨基酸得到β淀粉样肽1‑42树脂肽；（3）所述的β淀粉样肽1‑42多肽树脂经裂解得到β淀粉样肽1‑42粗品。本发明采用的制备β淀粉样肽1‑42的工艺方法具有操作简便、粗肽纯度高、综合收率高的特点，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。

Description

一种β淀粉样肽1-42的固相合成法
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及β淀粉样肽1-42的固相合成法。
背景技术
β淀粉样肽1-42，英文名称为 β-Amyloid(1-42)，分子 式 :C203H311N55O60S1，分子量： 4514.10，其肽序为 ：NH2-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val- Gly- Gly-Val-Val-Ile-Ala-COOH。
阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种发病率高、危害极大的中枢神经系统退行性疾病，主要临床症状是智力进行性减退，特征性病理学改变是老年斑，神经元纤维缠结，以海马、皮层区域为主的神经元数目减少。常发于老年人群，随着目前国家人口老龄化的日益严重，开展AD的研究具有重大的社会效益。
β淀粉样肽1-42（简称Aβ）是存在于阿尔茨海默病患者脑组织中的特异性病理改变之物，同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。近年来，抑制Aβ的聚集及降低其毒性已成为AD治疗的重要策略。Aβ抗体与Aβ42肽、tau蛋白等联合检测可用于AD的早期辅助诊断。
目前β淀粉样肽1-42的常规制备方法有生物法和化学法两种，生物法是通过基因蛋白表达来制备，CN200810025285公开了一种制备β淀粉样肽1-42的方法，生物法由于其工艺复杂，可变因素多，成本昂贵，不利于后期产业化。而常规的化学合成法由于其序列第29-42位氨基酸的极度疏水性，容易形成β折叠构象，会导致氨基被包裹在折叠肽序中不易暴露出来，加大了后续氨基酸的偶联难度，同时也降低了茚三酮检测的灵敏性，容易造成假阴性的现象。导致偶联不完全，缺省肽杂质的产生，后续纯化难度增加，收率降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的β淀粉样肽1-42的固相合成法，解决现有技术存在的缺陷。
一种β淀粉样肽1-42的固相合成法，包括如下步骤：
（1）固相合成Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂；
（2）根据β淀粉样肽1-42的肽序在所述的Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂上偶联氨基酸得到β淀粉样肽1-42树脂肽：NH2-Asp(Otbu)-Ala-Glu(Otbu)-Phe-Arg(Pbf)-His(Trt)-Asp(Otbu)-Ser(tbu)-Gly-Tyr(tbu)-Glu(Otbu)-Val-His(Trt)-His(Trt)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Val-Phe-Phe-Ala21-Glu(Otbu)-Asp(Otbu)-Val-Gly25-Ser(tbu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly29-Ala30-Ile-Ile-Gly33-Leu-Met-Val- Gly37- Gly38-Val-Val-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；肽序中Ala21 和Ala30中一个或两个用带Hmb/Dmb基团的Ala偶联，Gly25、Gly29、Gly33、Gly37和Gly38中一个或多个用带Hmb/Dmb基团的Gly偶联；
带Hmb/Dmb基团的Gly为：Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH或Fmoc-Dmb-Gly-OH；带Hmb/Dmb基团的Ala为： Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Ala-OH或Fmoc-Dmb-Ala-OH；其结构如式I,II,III,IV所示：
式I
式II
式III
式IV
（3）所述的β淀粉样肽1-42多肽树脂经裂解得到β淀粉样肽1-42粗品。
具体合成步骤如下：
（1）取HMP-TentaGel树脂用DCM浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Ala-OH，选择TBTU/HOBT/DIEA作为催化剂，选择体积比为1:1的DMF/NMP混合溶液作为溶剂，反应2-8小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应0.5-2小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂；
HMP-TentaGel树脂的取代度为1.0mmol/g ，Fmoc-Ala-OH，TBTU，HOBT和DIEA的摩尔比为1:1:1:2。
（2）在步骤1所获得的Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂中，加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH,选择DIC/HOBT/DIEA作为缩合剂，DMF做溶剂，反应2-4小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42多肽树脂。
Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂的取代度在0.3mmol/g-0.5mmol/g之间，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Ile-OH的量为树脂摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的2倍，DIC/HOBT的量是树脂摩尔量的2倍，DIEA的量是树脂摩尔量的4倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
保护氨基酸加入顺序为： Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH。
在一些实施例中，Ala21用带Hmb基团的Ala偶联，Gly25，Gly29，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Ala21，Ala30用带Hmb基团的Ala偶联，Gly25， Gly37用带Hmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Ala21，Ala30用带Dmb基团的Ala偶联，Gly25， Gly37用带Dmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Gly29，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Gly25，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Gly29，Gly33，Gly38用带Dmb基团的Gly偶联。
在一些实施例中，Gly25，Gly33，Gly38用带Dmb基团的Gly偶联。
（3）在所得到的β淀粉样肽1-42树脂肽中加入切肽试剂，反应2-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入冰乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品。
切肽试剂选用体积比切肽试剂选用体积比TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2%的混合试剂。
本发明中一些常用缩写具有以下含义
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
DIEA： N,N-二异丙基乙胺
Fmoc：芴甲氧羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5磺酰基
Trt：三苯甲基
Tbu：叔丁基
Otbu：叔丁氧基
Boc：叔丁氧羰基
Asn：天冬酰胺
Tyr：酪氨酸
Gly：甘氨酸
Ala：丙氨酸
Ser：丝氨酸
Asp：天冬氨酸
Arg：精氨酸
His：组氨酸
Gln：谷氨酰胺
Leu：亮氨酸
Ile：异亮氨酸
Phe：苯丙氨酸
Lys：赖氨酸
Glu：谷氨酸
Val：缬氨酸
Met：蛋氨酸
Pip：哌啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮
DCM：二氯甲烷
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
EDT:乙二硫醇。
本发明的有益效果是：在研究中意外发现，将HMP-TentaGel 树脂作为固相载体，由于该树脂是一种具有聚乙二醇凝胶网状结构的高聚物，溶胀性优于普通的王树脂、二氯树脂，偶联反应中能实现充分溶剂化，可以大大提高氨基酸的偶联效率；并采用带Hmb/Dmb的Gly和Ala偶联到多肽序列中，由于Hmb（Dmb）基团不但取代了该氨基酸的酰胺氢，还因为其加大了氨基酸的空间位阻而导致其后面几个氨基酸难以形成氢键，从而达到破坏β折叠二级结构的形成，大大降低肽链缩聚现象的产生，减少残肽的形成，提高了纯化收率。根据实验本发明的精肽收率达到18.5%-23.5%，优于常规方法（约6.5%），同时，发明的精肽纯度达到了98%，在提高收率的同时还提高了纯度。
附图说明
图1为本发明产品MS图。
图2为本发明产品HPLC图。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1
本实施例中仅Ala21选择用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Ala-OH为偶联氨基酸，Gly25，Gly29，Gly33，Gly38选择用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应4小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应1小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽86.5g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽86.5g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品44.5g，HPLC检测粗品纯度42.5%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品8.3g，总收率达到18.5%。经图1、图2验证正确。
实施例2
本实施例中仅Ala21，Ala30用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Ala-OH为偶联氨基酸，Gly25， Gly37选择用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应6小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应1.5小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽85.2g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽85.2g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品43.8g，HPLC检测粗品纯度46.5%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品8.9g，总收率达到19.7%。经图1、图2验证正确。
实施例3
本实施例中仅Ala21，Ala30用Fmoc-Dmb-Ala-OH为偶联氨基酸，Gly25， Gly37选择用Fmoc-Dmb-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应8小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应0.5小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应4小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽86.7g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽86.7g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤6次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品43.5g，HPLC检测粗品纯度48.7%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品9.5g，总收率达到21.1%。经图1、图2验证正确。
实施例4
本实施例中仅Gly29，Gly33，Gly38选择用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应2小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应2小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽88.5g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽88.5g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品45.2g，HPLC检测粗品纯度51.7%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品10.6g，总收率达到23.5%。经图1、图2验证正确。
实施例5
本实施例中仅Gly25，Gly33，Gly38选择用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应4小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应1小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽89g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽89g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品44.8g，HPLC检测粗品纯度46.5%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品10.1g，总收率达到22.5%。经图1、图2验证正确。
实施例6
本实施例中仅Gly29，Gly33，Gly38选择用Fmoc-Dmb-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应4小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应1小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽85.3g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽85.3g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品42.2g，HPLC检测粗品纯度38.9%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品8.5g，总收率达到18.9%。经图1、图2验证正确。
实施例7
本实施例中仅Gly25，Gly33，Gly38选择用Fmoc-Dmb-Gly-OH为偶联氨基酸；
（1）制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中，加入DCM浸泡30分钟，抽干，加入Fmoc-Ala-OH 3.74g（12mmol），TBTU 3.86g（12mmol）， HOBT 1.63g（12mmol） DIEA 3.1g（24mmol），加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解，通氮气鼓泡反应4小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应1小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol Loading=0.45mmol/g）。
（2）制备β淀粉样肽1-42树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g（10mmol）中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽试剂，通氮气鼓泡反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH 7.07g（20mmol）,DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol），加入DMF溶解，通氮气鼓泡反应3小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42树脂肽85.5g；
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol，缩合剂的量都为DIC 2.53g（20mmol），HOBT 2.71g（20mmol），DIEA 5.17g（40mmol）。
（3）制备β淀粉样肽1-42
取步骤（2）中β淀粉样肽1-42树脂肽85.5g置于2L的圆底烧瓶中，加入0.9L切割试剂，配比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入4.5L乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤5次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品43.5g，HPLC检测粗品纯度40.7%，再经高效液相色谱分离纯化、冻干后得到β淀粉样肽1-42精品9.0g，总收率达到20.0%。经图1、图2验证正确。
以上只是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种β淀粉样肽1-42的固相合成法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）固相合成Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂；
（2）根据β淀粉样肽1-42的肽序在所述的Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂上偶联氨基酸得到β淀粉样肽1-42树脂肽：NH2-Asp(Otbu)-Ala-Glu(Otbu)-Phe-Arg(Pbf)-His(Trt)-Asp(Otbu)-Ser(tbu)-Gly-Tyr(tbu)-Glu(Otbu)-Val-His(Trt)-His(Trt)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Val-Phe-Phe-Ala21-Glu(Otbu)-Asp(Otbu)-Val-Gly25-Ser(tbu)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Gly29-Ala30-Ile-Ile-Gly33-Leu-Met-Val- Gly37- Gly38-Val-Val-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；
肽序中Ala21 和Ala30中一个或两个用带Hmb/Dmb基团的Ala偶联，Gly25、Gly29、Gly33、Gly37和Gly38中一个或多个用带Hmb/Dmb基团的Gly偶联；
（3）所述的β淀粉样肽1-42多肽树脂经裂解得到β淀粉样肽1-42粗品。
2.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，步骤（1）具体内容包括如下步骤
取HMP-TentaGel树脂用DCM浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Ala-OH，选择TBTU/HOBT/DIEA作为催化剂，选择体积比为1:1的DMF/NMP混合溶液作为溶剂，反应2-8小时，抽干，用DMF洗涤3次，再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液，反应0.5-2小时，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂。
3.根据权利要求2所述的合成法，其特征在于，HMP-TentaGel树脂的取代度为1.0mmol/g， Fmoc-Ala-OH，TBTU，HOBT和DIEA的摩尔比为1:1:1:2。
4.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，步骤（2）具体内容包括如下步骤：
在步骤（1）所获得的Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂中，加入脱帽试剂，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤5次，抽干；加入Fmoc-Ile-OH,选择DIC/HOBT/DIEA作为缩合剂，DMF做溶剂，反应2-4小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Ile-Ala-HMP-TentaGel 树脂；然后再加入脱冒试剂，脱保护反应，再依次加入保护氨基酸，如此反复，直至连完最后一个天冬氨酸，脱保护反应，DMF洗涤5次，甲醇洗涤2次收缩树脂，抽真空干燥24小时，得到β淀粉样肽1-42多肽树脂。
5.根据权利要求4所述的合成法，其特征在于，Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂的取代度在0.3mmol/g-0.5mmol/g之间，脱帽试剂为体积比20%的PIP/DMF混合溶液，Fmoc-Ile-OH的量为Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂摩尔量的2倍，每一步保护氨基酸的量的是Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂摩尔量的2倍，DIC/HOBT的量是Fmoc-Ala-HMP-TentaGel树脂摩尔量的2倍，DIEA的量是Fmoc-Ala-HMP-TentaGel树脂摩尔量的4倍。
6.根据权利要求4所述的合成法，其特征在于，所述加入保护氨基酸的顺序为： Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH。
7.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Ala21用带Hmb基团的Ala偶联，Gly25，Gly29，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
8.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Ala21，Ala30用带Hmb基团的Ala偶联，Gly25， Gly37用带Hmb基团的Gly偶联。
9.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Ala21，Ala30用带Dmb基团的Ala偶联，Gly25， Gly37用带Dmb基团的Gly偶联。
10.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Gly29，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
11.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Gly25，Gly33，Gly38用带Hmb基团的Gly偶联。
12.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Gly29，Gly33，Gly38用带Dmb基团的Gly偶联。
13.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，所述Gly25，Gly33，Gly38用带Dmb基团的Gly偶联。
14.根据权利要求1所述合成法，其特征在于，带Hmb/Dmb基团的Gly为：Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Gly-OH或Fmoc-Dmb-Gly-OH；带Hmb/Dmb基团的Ala为： Fmoc-(Fmoc-Hmb)-Ala-OH或Fmoc-Dmb-Ala-OH。
15.根据权利要求1所述的合成法，其特征在于，步骤（3）具体内容包括如下步骤：
在步骤（2）所得到的β淀粉样肽1-42树脂肽中加入切肽试剂，反应2-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入冰乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤数次，真空干燥，获得β淀粉样肽1-42粗品。
16.根据权利要求15所述的合成法，其特征在于，切肽试剂选用体积比切肽试剂选用体积比TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2%的混合试剂。
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