CN109836470B - 一种自动合成多肽分子内二硫键的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自动合成多肽分子内二硫键的方法，包括以下步骤：（a）预先利用多肽固相合成技术获得含有目标多肽的肽树脂，其中，所述目标多肽的巯基应用Mmt保护基保护；（b）将肽树脂置于多肽固相合成仪中，加入含有1vol%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，反应30~200 min，以脱去巯基的Mmt保护基；（c）步骤（b）之后，加入DMF和[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液，反应2~4h；（d）将步骤（c）所得产物干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽，然后在得到的切割液中加入乙醚，经沉淀、过滤后，得到含有分子内二硫键的目标多肽。本发明所涉及的合成步骤基本都能在多肽固相合成仪和切割仪上自动进行，同时配合[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2的使用，大大提高了多肽的合成效率和合成产率。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成多肽分子内二硫键的方法，具体的说是一种自动合成多肽分子内二硫键的方法。
背景技术
多肽分子内二硫键可以维持多肽的二维结构，提高多肽的药物活性，选择性以及抗水解性能。目前，含有分子内二硫键的多肽类药物如催化素，加压素，生长抑素等已经在临床上用于各种疾病的治疗。同时，大量的含分子内二硫键的、具有药物和生理活性的多肽处于各阶段的临床研究中。因此，合成多肽分子内二硫键是此类多肽药物合成的重要步骤。
多肽类药物分子内二硫键的合成是精细有机化工及药物化学中的一个重要反应。通常在溶液中均相氧化含有巯基基团的多肽是合成多肽分子内二硫键的主要方法。合成步骤包括：（1）利用固相多肽合成法合成含有Trt保护巯基的多肽；（2）利用切割试剂把多肽从树枝上切割下来，同时脱掉巯基的Trt保护基，得到含有巯基的多肽溶液；（3）在切割液中加入冰乙醚，使含巯基的多肽沉淀；（4）过滤，得到固体的含有巯基的多肽；（5）把得到的含有巯基的多肽溶解于适当的溶剂中，加入氧化剂氧化多肽中的巯基，得到多肽分子内二硫键；（6）色谱分离去除氧化剂及其产物，得到含有分子内二硫键的多肽溶液；（7）冻干，得到固体的含有分子内二硫键的多肽粉末。上述合成过程中，固相合成含有Trt保护巯基的肽树脂在多肽固相合成仪上自动完成，多肽的切割在自动切割仪上完成，其它步骤则需要大量的人力操作才能进行。因此，目前合成含有多肽分子内二硫键的多肽的合成步骤繁琐，大大限制了多肽分子内二硫键合成的原子经济性。
因此，如果能开发一种自动化程度较高的多肽分子内二硫键的合成方法，则能大大降低使用该类氧化剂来合成药物分子内二硫键的成本支出，提高合成反应的原子经济性。
发明内容
本发明的目的是提供一种自动合成多肽分子内二硫键的方法，以解决现有多肽分子内二硫键合成产率低、原子经济性差的问题。
本发明的目的是这样实现的：
一种自动合成多肽分子内二硫键的方法，包括以下步骤：
（a）预先利用多肽固相合成技术获得含有目标多肽的肽树脂，其中，所述目标多肽的巯基应用Mmt保护基保护；
（b）将肽树脂置于多肽固相合成仪中，加入含有1vol%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，反应30~200 min，以脱去巯基的Mmt保护基，反应结束后，分别用二氯甲烷和DMF进行洗涤；
（c）步骤（b）之后，加入DMF和[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液，反应2~4h，反应结束后，依次用体积比为1~5∶1的DMF/H2O、DMF和乙醚溶液进行洗涤；
（d）将步骤（c）所得产物干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽，然后在得到的切割液中加入乙醚，经沉淀、过滤后，得到含有分子内二硫键的目标多肽。
步骤（a）中，所述目标多肽为催产素、精氨酸加压素或iRGD肽；其中，被保护的催产素的氨基酸序列为：C(Mmt)YIQNC(Mmt)PLG-NH2；被保护的精氨酸加压素的氨基酸序列为：C(Mmt)YFQNC(Mmt)PRG-NH2；被保护的iRGD肽的氨基酸序列为：C(Mmt)RGDKGPDC(Mmt)-NH2。
步骤（a）中，多肽固相合成所用的树脂为Fmoc-Rink-amide resin。
步骤（c）中，加入的DMF和[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液的体积比为5~20∶1，所述[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液的浓度为0.05 mol/L。
步骤（c）中， [Pt(phen)(en)Cl2]Cl2的用量与目标多肽的摩尔比为1.5~2.0∶1。
步骤（d）中，所述切割试剂为：6vol%的水、 2vol%的三异丙基硅烷和92vol%的三氟乙酸。
本发明所涉及的合成步骤基本都能在多肽固相合成仪和切割仪上自动进行，同时配合[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2的使用，大大提高了多肽的合成效率和合成产率，降低了生产成本，适宜推广应用。
本发明所涉及的氧化剂四价铂配合物[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2，可以在合成结束后，在反应介质DMF中加入乙醚，使四价铂配合物[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2和其还原产物二价铂配合物沉淀出来，进行再生后，四价铂配合物可以循环使用，进一步提高了生产的经济性。
附图说明
图1 自动合成含有分子内二硫键多肽的流程图。
图2为本发明所得催产素(oxytocin)的色谱图。
图3为本发明所得精氨酸加压素（arginine vasoprssin）的色谱图。
图4为本发明所得iRGD肽的色谱图。
图5为本发明所得催产素的质谱图。
图6为本发明所得精氨酸加压素的质谱图。
图7为本发明所得iRGD肽的质谱图。
具体实施方式
本发明可适用于多种多肽的分子内二硫键的合成，其中，含目标多肽的肽树脂可根据需要依照现有方法自行在多肽固相合成仪中合成，也可预先在市场上购买，本发明实施例的肽树脂预先购自(南京肽业生物有限公司，南京)，本发明实施例中未提及的操作均按本领域的常规操作实施。
实施例1
称取催产素树脂0.1g， 加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100 µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，然后加入12 mLDMF和1 mL浓度为0.05 mol/L的[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液，反应2h。反应结束后，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽，切割液中加入乙醚，沉淀，过滤，得到催产素。对所得产物进行色谱和质谱分析，结果如图1、图5所示，催产素的纯度为95%。
实施例2
称取精氨酸加压素树脂0.1g，加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100 µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，然后加入12 mL DMF和1 mL浓度为0.05 mol/L的[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液。反应4h。反应结束，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽。切割液中加入乙醚，沉淀，过滤，得到精氨酸加压素。对所得产物进行色谱和质谱分析，结果如图2、图6所示，精氨酸加压素的纯度为85%。
实施例3
称取iRGD多肽树脂0.1g， 加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，然后加入12 mL DMF和1 mL浓度为0.05 mol/L的[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液。反应4h。反应结束，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽。切割液中加入乙醚，沉淀，过滤，得到iRGD多肽。对所得产物进行色谱和质谱分析，结果如图3、图7所示，iRGD多肽的纯度为98%。
对比实施例1
称取iRGD多肽树脂0.1g， 加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，然后加入12 mL DMF和1 mL浓度为0.02 mol/L的氯代丁二酰亚胺溶液。反应2h。反应结束，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽。切割液中加入乙醚，沉淀，过滤，得到iRGD多肽。iRGD多肽的纯度为60%。
对比实施例2
称取iRGD多肽树脂0.1g， 加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，再加入12 mL DMF和1 mL浓度为0.05 mol/L的K2[Pt(CN)4Cl2]溶液。反应10h。反应结束，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽。切割液中加入乙醚，沉淀，过滤。分析发现含有还原型的iRGD多肽没有被氧化。iRGD多肽的纯度为78%。
对比实施例3
称取iRGD多肽树脂0.1g，加入到多肽固相合成仪50mL玻璃瓶中，设置程序，自动加入10mL二氯甲烷和100µl 三氟乙酸，反应30 min。反应结束，分别用二氯甲烷和DMF各洗涤3次，再加入12 mL DMF和1 mL浓度为0.05 mol/L的[Pt(en)2Cl2]Cl2溶液。反应10h。反应结束，分别依次用体积比为1:1的DMF/H2O，DMF，乙醚溶液各洗涤3次。干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽。切割液中加入乙醚，沉淀，过滤。分析发现含有还原型的iRGD多肽没有被氧化。iRGD多肽的纯度为55%。
以上实施例及实验数据表明，[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2能够用于不同结构的多肽分子内二硫键的全自动合成，其得到的多肽的纯度远大于利用氯代丁二酰亚胺及其他氧化剂合成所得多肽的纯度。而本领域技术人员公知传统的液相中合成多肽分子内二硫键键需要大量的人工操作，自动化程度较低，多肽的合成成本较高。因此，本发明提供的利用多肽合成仪和多肽切割仪，并配合使用[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2氧化剂的自动合成方法，使合成此类多肽所需人工操作大大减少，提高了含分子内二硫键多肽的合成效率。使此类多肽的合成原子经济性得到了很大的提高。
Claims (5)
1.一种自动合成多肽分子内二硫键的方法，其特征是，包括以下步骤：
（a）预先利用多肽固相合成技术获得含有目标多肽的肽树脂，其中，所述目标多肽的巯基应用Mmt保护基保护；所述目标多肽为催产素、精氨酸加压素或iRGD肽；被保护的催产素的氨基酸序列为：C(Mmt)YIQNC(Mmt)PLG-NH2；被保护的精氨酸加压素的氨基酸序列为：C(Mmt)YFQNC(Mmt)PRG-NH2；被保护的iRGD肽的氨基酸序列为：C(Mmt)RGDKGPDC(Mmt)-NH2；
（b）将肽树脂置于多肽固相合成仪中，加入含有1vol%三氟乙酸的二氯甲烷溶液，反应30~200 min，以脱去巯基的Mmt保护基，反应结束后，分别用二氯甲烷和DMF进行洗涤；
（c）步骤（b）之后，加入DMF和[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液，反应2~4h，反应结束后，依次用体积比为1~5∶1的DMF/H2O、DMF和乙醚溶液进行洗涤；
（d）将步骤（c）所得产物干燥后，在多肽自动切割仪上切割多肽，然后在得到的切割液中加入乙醚，经沉淀、过滤后，得到含有分子内二硫键的目标多肽。
2.根据权利要求1所述的自动合成多肽分子内二硫键的方法，其特征是，步骤（a）中，多肽固相合成所用的树脂为Fmoc-Rink-amide resin。
3.根据权利要求1所述的自动合成多肽分子内二硫键的方法，其特征是，步骤（c）中，加入的DMF和[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液的体积比为5~20∶1，所述[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2溶液的浓度为0.05 mol/L。
4.根据权利要求1所述的自动合成多肽分子内二硫键的方法，其特征是，步骤（c）中，[Pt(phen)(en)Cl2]Cl2的用量与目标多肽的摩尔比为1.5~2.0∶1。
5.根据权利要求1所述的自动合成多肽分子内二硫键的方法，其特征是，步骤（d）中，切割所用试剂为：6vol%的水、 2vol%的三异丙基硅烷和92vol%的三氟乙酸。
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