CN107141340A - 一种醋酸特利加压素的合成方法 - Google Patents

一种醋酸特利加压素的合成方法 Download PDF

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CN107141340A CN201710252321.4A CN201710252321A CN107141340A CN 107141340 A CN107141340 A CN 107141340A CN 201710252321 A CN201710252321 A CN 201710252321A CN 107141340 A CN107141340 A CN 107141340A
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孙博
左成
彭熙琳
张鑫
何海艳
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Abstract

本发明公开了一种醋酸特利加压素的合成方法，具体步骤包括，采用缩合剂，将以Fmoc保护的氨基酸单体和氨基类树脂依次偶联，第2位氨基酸单体采用Fmoc‑Pro‑Lys(Boc)‑OH进行偶联，最后一位氨基酸单体采用Fmoc‑Gly‑Gly‑Gly‑OH进行偶联，制备得线性十二肽树脂；将所述线性十二肽树脂氧化为环化十二肽树脂，将所述环化十二肽树脂脱除Fmoc保护基团；将所述脱除Fmoc保护的环化十二肽树脂经裂解、提纯制得精制醋酸特利加压素成品。本发明更易于规模化生产、减少杂质，尤其是缺失肽、异构体的生成，提高产品质量。

Description

一种醋酸特利加压素的合成方法
技术领域
本发明涉及一种醋酸特利加压素的合成方法，具体涉及一种醋酸特利加压素的合成方法。
背景技术
醋酸特利加压素(Terlipressin Acetate)，CAS登记号为14636-12-5，分子式为C52H74N16 O15S2·nC2H4O2，分子量为1227.37，中文化学名为：甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-半胱氨酰-L-酪 氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰氨酰-L-天冬酰氨酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-L-赖氨酰-甘氨酰(4 →9)环二硫化物醋酸盐，化学结构式：Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly -NH2·nCH3COOH。特利加压素是一种人工合成的长效血管加压素制剂，为垂体后叶分泌激 素的类似物，它是一种前体药物，自身几乎没有药理作用，在体内其三甘氨酰基被酶切除， 从而缓慢释放活性代谢产物赖氨酸加压素，发挥临床疗效，且通过注射给药方便。醋酸特利 加压素用于肝硬化并发症(食管胃静脉曲张出血、肝肾综合症、腹水)的治疗，同时还适用 于泌尿生殖道及其他腹腔脏器出血、感染性休克、烧伤、急性肝功能衰竭、心脏骤停等。特 利加压素能改善肝肾功能，逆转HRS，延长HRS患者的生存时间，故延长肝移植的等待时间。 同时，特利加压素是食管静脉曲张出血患者在紧急情况下的重要治疗药物，是唯一被证明延 长食管静脉曲张出血患者生存时间的药物。此外特利加压素在治疗难治性休克、肝硬化腹水、 手术中低血压及小儿心脏骤停有一定作用，具有良好的临床应用前景。
目前特利加压素制备主要都采用固相合成方法，以逐个连接或者片段相结合的方法，但 是都易造成缺失肽如des-Lys、des-Pro等杂质的产生，同时相应的消旋、异构体杂质的不易 控制，从而造成终产品纯化困难、产品质量不易提高的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题现有的逐个固相合成会出现多个氨基末端缺失肽如des-Lys、 des-Pro等杂质的产生，同时相应的消旋、异构体杂质的不易控制，从而造成终产品纯化困难、 产品质量不易提高的缺点，目的在于提供一种醋酸特利加压素的合成方法，更易于规模化生 产、减少杂质，尤其是缺失肽、异构体的生成，提高产品质量，促进规模化生产。
本发明通过下述技术方案实现：
一种醋酸特利加压素的合成方法，包括以下步骤：
步骤A，采用缩合剂，将以Fmoc保护的氨基酸单体和氨基类树脂依次偶联，第2位氨基酸单体采用Fmoc-Pro-Lys(Boc)-OH进行偶联，最后一位氨基酸单体采用 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH进行偶联，制备得线性十二肽树脂；
步骤B，将所述步骤A制备的线性十二肽树脂氧化为环化十二肽树脂，将所述环化十二 肽树脂脱除Fmoc保护基团；
步骤C，将所述步骤B制备的脱除Fmoc保护的环化十二肽树脂经裂解、提纯制得精制 醋酸特利加压素成品。
优选地，所述氨基类树脂为Sieber resin、Rink amide resin、Rink Amide-AMresin和Rink Amide-MBHA resin中的任意一种。
Sieber resin、Rink amide resin、Rink Amide-AM resin、Rink Amide-MBHAresin，其中Sieber resin价格昂贵，Rink Amide-MBHA resin成本较低，且实验结果显示效果更优。
优选地，所述缩合剂是采用DIC和HOBt组合、DCC和HOBt组合、EDCI、NMM和 HOBt组合、HBTU、NMM和HOBt组合、HATU、NMM和HOBt组合中的任意一种组合。
上述缩合剂中，更加优选使用DIC和HOBt组合的缩合剂，是因为采用DIC和HOBt组合的缩合剂进行偶联反应较温和，不易引起氨基酸消旋，且价格便宜，降低成本。
优选地，所述步骤A方法包括如下步骤：
步骤(1)，脱除氨基类树脂上的Fmoc保护基团：
将氨基类树脂用DCM进行溶胀处理，待溶胀完全后，抽掉DCM；然后采用DBLK溶液与溶胀后的氨基类树脂进行脱帽反应；将脱除Fmoc保护基团的氨基类树脂依次用DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF进行洗涤；将洗涤后的脱除Fmoc保护基团的氨基类树脂通过 kaiser检测显阳性；
步骤(2)，第1位氨基酸单体的偶联反应：
所述第1位氨基酸单体为Fmoc-Gly-OH；配制Fmoc-Gly-OH、缩合剂和DMF的混合溶液并加入到所述步骤(2)制备的脱除Fmoc保护基团的氨基类树脂中，通过氮气将树脂被均匀吹起进行偶联反应；通过kaiser检测显阴性，然后可抽掉反应液，最后加DMF洗涤制得Fmoc-Gly-树脂；
步骤(3)，第2～12位氨基酸单体的偶联反应：
将所述步骤(2)制备的Fmoc-Gly-树脂依次与Fmoc-Pro-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH 和Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH氨基酸单体进行偶联反应制备得线性十二肽树脂；且每位氨基酸单 体的偶联反应之前，先采用DBLK溶液与含上一位氨基酸单体的中间树脂进行脱帽反应，然 后用DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF进行洗涤，将洗涤后的中间树脂通过kaiser检测显 阳性；且每次氨基酸单体的偶联反应之后，通过kaiser检测显阴性，然后可抽掉反应液，最 后加DMF洗涤制得中间体树脂。
优选地，所述步骤B的具体步骤包括：
步骤(1)，将所述步骤A制备的线性十二肽树脂用DCM进行溶胀处理；
步骤(2)，采用I2/DMF溶液对溶胀后的线性十二肽树脂进行氧化反应处理制备得环化十 二肽树脂；
步骤(3)，然后采用DBLK溶液与环化十二肽树脂进行脱帽反应；将脱除Fmoc保护基团的环化十二肽树脂依次用DMF、DMF、MeOH和DCM进行洗涤制备得环化十二肽树脂。 将洗涤后的脱除Fmoc保护基团的环化十二肽树脂通过kaiser检测显阳性。
优选地，所述脱帽反应具体步骤包括采用DBLK溶液与溶胀后的氨基类树脂或中间树脂 进行第一次脱帽反应5min，然后采用DMF进行洗涤一次，最后再采用DBLK溶液进行第二 次脱帽反应15min。
优选地，所述偶联反应温度为20～35℃，反应时间为3～4h。
优选地，所述DBLK是质量分数为10％～20％哌啶的DMF溶液。
优选地，所述步骤C中裂解操作的具体步骤包括：将所述步骤B制备的脱除Fmoc保护 基团的环化十二肽树脂加入到裂解液中，室温裂解3～4h后，滤掉树脂残渣得到环化十二肽 的粗肽裂解液；所述裂解液各组分配比为：TFA：EDT：TIS：H2O＝(85～95):(1～3):(1～3):(5～10)。
优选地，所述步骤C中提纯操作的具体步骤包括：
步骤(1)，将所述裂解操作后得到的环化十二肽粗肽裂解液加入冰MTBE中沉降、析出 固体粗肽，然后经过滤、冰MTBE洗涤和干燥，制备得特利加压素粗品。
步骤(2)，将所述步骤(1)获得的特利加压素粗品依次经C18柱进行纯化、浓缩、冻干制备得精制醋酸特利加压素成品。
所述冰MTBE是指温度为0～10℃的甲基叔丁基醚。
步骤(2)的具体步骤包括：
将所述特利加压素粗品经C18柱进行纯化；流动相：A相：1‰TFA，B相：100％乙腈；流速：400mL/min，检测波长：λ＝230nm；将纯化后的溶液通过旋转蒸发仪减压旋去乙腈、冷凝处理制备得一纯特利加压素样品；
将一纯特利加压素样品经C18柱进行纯化；流动相：A相：依次用50mmol/L的NH4Ac水溶液和0.03％HAc水溶液进行脱洗，B相：100％乙腈；流速：400mL/min，检测波长：λ＝230nm； 将纯化后的溶液通过旋转蒸发仪减压旋去乙腈、冷凝浓缩处理制备得特利加压素浓缩液；
将特利加压素浓缩液在-10℃～-40℃温度条件下进行预冻；然后将预冻后的样品进行温 度梯度升华干燥处理和解吸附处理制备得精制醋酸特利加压素成品。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明一种醋酸特利加压素的合成方法，采用了两个易得片段Fmoc-Pro-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH合成特利加压素，减少了合成步骤，减少了杂质des-Lys11、des-Pro10、 des-Gly1,2,3、des-Gly-Gly1,2等缺失肽的生成，同时有利于避免氨基酸消旋作用产生过多异 构体杂质，提高了产品质量，更利于规模化生产；
2、本发明一种醋酸特利加压素的合成方法，通过从树脂种类、氨基酸单体种类、缩合剂 种类等原料控制以减少杂质，尤其是缺失肽、异构体的生成，提高产品质量，更易于规模化 生产；
3、本发明一种醋酸特利加压素的合成方法，采用I2将线性十二肽树脂氧化为环化十二肽 树脂，时间短，过渡液少，肽链不易断开；且提供了裂解液的组分及配比，有利于避免水解 杂质的产生，进一步提高多肽产物的纯度，提高产品质量；最后在沉降提纯过程中，采用冰 MBTE，更加安全易工业化，利于规模化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
实施例
本发明一种醋酸特利加压素的合成方法，醋酸特利加压素肽树脂的制备是采用Rink Amide-MBHA resin(0.67mmol/g)，产于西安蓝晓科技新材料股份有限公司，合成规模为 10.05mmol，需15g Rink Amide-MBHA resin(0.67mmol/g)。所需的Rink Amide-MBHAresin (0.67mmol/g)的重量(g)＝合成规模(mmol)/树脂替代度(mmol/g)。
步骤A，制备线性十二肽树脂：
(1)脱除Rink Amide-MBHA resin树脂上的Fmoc保护基团
选择合适大小的反应柱，并确保柱子清洁干燥。DCM需提前加无水K2CO3干燥。称取15g的Rink Amide-MBHA resin(0.67mmol/g)倒入反应柱中，加入300mLDCM溶涨约10min。待溶涨时间截止后，抽掉DCM，加入200mLDBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2 次，时间分别是5min和15min，两次脱帽反应之间用200mLDMF洗涤，抽掉DMF洗涤液。 待脱帽反应后按照如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗 涤试剂用量约200mL，洗完后抽掉洗涤液。通过kaiser检测显阳性，制备得脱除Fmoc保护 基团的Rink Amide-MBHAresin树脂，进入下一步氨基酸单体偶联循环反应。
表1脱帽反应原料和溶剂配比
(2)第1位氨基酸单体的偶联反应
称取6.0±0.1g Fmoc-Gly-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完 全溶解后值得混合溶液，将装有所述混合溶液的烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后再加入 3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起。在20～35℃温度条件下反应时间3～4h后，取样kaiser检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min左右，进入下一步偶联循环。
表2第1位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
步骤(1)产物 10.05mmol — 1 中间体
Fmoc-Gly-OH 6g ±0.1g 2 原料
DIC 3g ±1mL 2.4 缩合剂
HOBt 3.2g ±0.1g 2.4 缩合剂
DMF 600mL ±30mL — 溶剂
(3)第2～3位氨基酸单体的偶联反应
向所述步骤(2)的产物加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽 掉洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试 剂用量约200mL，洗完后抽掉，kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称取12± 0.1gFmoc-Pro-Lys(Boc)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶解 后，将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后再加入3g DIC于溶液中活化30min后，将反应液倒 入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应时间3～4h，取样 kaiser检测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min 左右，进入下一步偶联循环。
表3第2～3位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
(4)第4位氨基酸单体的偶联反应
向所述步骤(3)的产物加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽 掉洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试 剂用量约200mL，洗完后抽掉，kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称取12± 0.1gFmoc-Cys(Trt)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶解后， 将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后再加入3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液倒入反 应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，20～35℃温度条件下反应3～4h后，取样kaiser检 测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min左右， 进入下一步偶联循环。
表4第4位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
(5)第5位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(4)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉 洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试剂 用量约200mL，洗完后抽掉，kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称取12± 0.1gFmoc-Asn(Trt)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶解后， 将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后再加入3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液倒入反 应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～4h后，取样kaiser 检测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤1min左 右，进入下一步偶联循环。
表5第5位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
步骤(4)产物 10.05mmol — 1 中间体
Fmoc-Asn(Trt)-OH 12g ±0.1g 2 原料
DIC 3g ±1mL 2.4 缩合剂
HOBt 3.2g ±0.1g 2.4 缩合剂
DMF 1400mL ±70mL — 溶剂
DBLK 400mL ±20mL — 脱保护试剂
DCM 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
无水甲醇 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
(6)第6位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(5)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉 洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试剂 用量约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉，kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称 取12±0.1gFmoc-Gln(Trt)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶 解后，将烧杯放入冰浴中冰浴10min,然后再加入3g DIC于溶液中活化30min后，将反应液倒 入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～4h后，取样 kaiser检测，显阴性，则反应完全。可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min 左右，进入下一步偶联循环。
表6第6位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
(7)第7位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(6)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱保护之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉洗 涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试剂用 量约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉。kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称取 8±0.1gFmoc-Phe-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶解后， 将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后再加入3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液倒入反 应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～4h后，取样kaiser 检测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min左 右，进入下一步偶联循环。
表7第7位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
步骤(6)产物 10.05mmol — 1 中间体
Fmoc-Phe-OH 12g ±0.1g 2 原料
DIC 3g ±1mL 2.4 缩合剂
HOBt 3.2g ±0.1g 2.4 缩合剂
DMF 1400mL ±70mL — 溶剂
DBLK 400mL ±20mL — 脱保护试剂
DCM 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
无水甲醇 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
(8)第8位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(7)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉 洗涤液。两次脱完保护抽掉后，按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各一 次，每次洗涤试剂用量约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉。kaiser检测显阳性。在脱 帽反应的间隙，称取9.2±0.1gFmoc-Tyr(tBu)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF 溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后在加入3gDIC于溶液中活化5min 后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～ 4h后，取样kaiser检测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍， 每次洗涤5min左右，进入下一步偶联循环。
表8第8位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
步骤(7)产物 10.05mmol — 1 中间体
Fmoc-Tyr(tBu)-OH 12g ±0.1g 2 原料
DIC 3g ±1mL 2.4 缩合剂
HOBt 3.2g ±0.1g 2.4 缩合剂
DMF 1400mL ±70mL — 溶剂
DBLK 400mL ±20mL — 脱保护试剂
DCM 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
无水甲醇 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
(9)第9位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(8)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱保护之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉洗 涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤一次，每次洗涤试剂用 量约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉，kaiser检测显阳性。在脱帽反应的间隙，称取 12±0.1gFmoc-Cys(Trt)-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶解 后，将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后在加入3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液倒 入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～4h后，取kaiser 检测，显阴性，则反应完全，可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min左 右，进入下一步偶联循环。
表9第9位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
(10)第10～12位氨基酸单体的偶联反应
向步骤(9)产物中加入150mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)进行脱帽反应2次，第 一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min，抽掉 洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF各洗涤次，每次洗涤试剂用 量约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉。kaiser检测显阳性。在脱保护的间隙，称取8.2 ±0.1gFmoc-Gly-Gly-Gly-OH和3.2±0.1gHOBt置烧杯中，加入150mLDMF溶解，待完全溶 解后，将烧杯放入冰浴中冰浴10min，然后在加入3gDIC于溶液中活化30min后，将反应液 倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起，在20～35℃温度条件下反应3～4h后，取样 kaiser检测，显阴性，则反应完全。可抽掉反应液，加入200mLDMF洗涤2遍，每次洗涤5min 左右，最终制得线性十二肽树脂。
表10第10～12位氨基酸单体的偶联反应的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
步骤(9)产物 10.05mmol — 1 中间体
Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH 8.2g ±0.1g 2 原料
DIC 3g ±1mL 2.4 缩合剂
HOBt 3.2g ±0.1g 2.4 缩合剂
DMF 1400mL ±70mL — 溶剂
DBLK 400mL ±20mL — 脱保护试剂
DCM 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
无水甲醇 200mL ±10mL — 洗涤溶剂
步骤B，将所述步骤A制备的线性十二肽树脂氧化为环化十二肽树脂：
将步骤A制备的线性十二肽树脂加入到反应柱中，用二氯甲烷溶胀30min，称取固体碘12.8g，加入至DMF中搅拌溶解制成I2/DMF溶液。将配好的I2/DMF溶液加入到溶胀好的肽树脂中反应4h。反应结束，加入200mL的DBLK(20％哌啶/DMF溶液)2进行脱帽反应2 次，第一次为5min，第二次为15min，两次脱帽反应之间需加入约200mL的DMF洗涤5min， 抽掉洗涤液。按如下洗涤剂顺序DMF、DMF、MeOH和DCM各洗涤次，每次洗涤试剂用量 约200mL，洗涤时间为5min，洗完后抽掉。kaiser检测显阳性。再用200mLMeOH收缩两次， 两次收缩时间依次为5min和10min，收缩后抽掉。用真空抽干至树脂呈流沙状。
表11线性十二肽树脂氧化为环化十二肽树脂的原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
线性十二肽肽树脂 10.05mmol — 1 中间体
碘 12.8g — 5 氧化试剂
DMF 1400mL — — 溶剂
DCM 200mL — — 洗涤溶剂
DBLK 400mL — — 脱保护试剂
MeOH 600mL — — 洗涤溶剂
步骤C，将步骤B制备的样品通过裂解反应制得环化十二肽的粗肽裂解液、再经提纯制 得精制特利加压素：
(1)先裂解试剂配比为TFA:EDT:TIS:H2O＝92.5:2.5:2.5:2.5，按1g环化十二肽树脂需8mL 裂解试剂配比，室温裂解，裂解反应时间为4h；
按上述裂解方案配120mL裂解液(TFA：111mL EDT、水和TIS各3mL)于250mL的 圆底烧瓶中，塞上玻璃塞，放冰箱冷冻30min；
裂解液冷冻完后拿出冰箱，放入搅拌子。将15g肽树脂缓缓加入到裂解液中，待全部加 完后计时，室温裂解3～4h，制得粗肽裂解液。
表12本实施例步骤C所需原料和溶剂配比
原料/溶剂 投料量 允许误差范围 摩尔比 备注
环肽树脂 10.05mmol — — 中间体
TFA 111mL ±1mL 92.5 裂解试剂
EDT 3mL ±0.2mL 2.5 裂解试剂
TIS 3mL ±0.2mL 2.5 裂解试剂
水 3mL ±0.2mL 2.5 裂解试剂
MTBE 6.6L ±0.1L — 沉降，洗涤溶剂
(2)上述粗肽裂解液通过冰冻MTBE溶液进行沉降，然后经过滤、洗涤、干燥制备得特利加压素粗品，具体为：用砂芯漏斗将树脂滤掉，得到含多肽的裂解液。将含多肽的裂解液缓缓加入到500mL的冰MTBE中，会有白色的固体粗肽析出，静置30min后过滤，用冰 的MTBE洗涤3次，经在35～50℃干燥至恒重，制得特利加压素粗品(即环化十二肽粗肽)。
(3)将所述特利加压素粗品依次经液相色谱分离纯化、冻干制得精制醋酸特利加压素成 品，采用DIONEX P680高效液相色谱仪，经常规纯化、冻干法制得精制粗醋酸特利加压素：
将所述特利加压素粗品经C18柱进行纯化；流动相：A相：1‰TFA，B相：100％乙腈；流速：400mL/min，检测波长：λ＝230nm；将纯化后的溶液通过旋转蒸发仪减压旋去乙腈、冷凝处理制备得一纯特利加压素样品；
将一纯特利加压素样品经C18柱进行纯化；流动相：A相：依次用50mmol/L的NH4Ac水溶液和0.03％HAc水溶液进行脱洗，B相：100％乙腈；流速：400mL/min，检测波长：λ＝230nm； 将纯化后的溶液通过旋转蒸发仪减压旋去乙腈、冷凝浓缩处理制备得特利加压素浓缩液；
将特利加压素浓缩液在-10℃～-40℃温度条件下进行预冻；然后将预冻后的样品进行温 度梯度升华干燥处理和解吸附处理制备得精制醋酸特利加压素成品。
实验测得本实施例环化十二条粗肽的纯度HPLC约为92％。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，采用缩合剂，将以Fmoc保护的氨基酸单体和氨基类树脂依次偶联，第2位氨基酸单体采用Fmoc-Pro-Lys(Boc)-OH进行偶联，最后一位氨基酸单体采用Fmoc-Gly-Gly-Gl y-OH进行偶联，制备得线性十二肽树脂；
步骤B，将所述步骤A制备的线性十二肽树脂氧化为环化十二肽树脂，将所述环化十二肽树脂脱除Fmoc保护基团；
步骤C，将所述步骤B制备的脱除Fmoc保护的环化十二肽树脂经裂解、提纯制得精制醋酸特利加压素成品。
2.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述氨基类树脂为Sieber resin、Rink amide resin、Rink Amide-AM resin和Rink Amide-MBHA resin中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述缩合剂是采用DIC和HOBt组合、DCC和HOBt组合、EDCI、NMM和HOBt组合、HBTU、NMM和HOBt组合、HATU、NMM和HOBt组合中的任意一种组合。
4.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述步骤A方法包括如下步骤：
步骤(1)，脱除氨基类树脂上的Fmoc保护基团：
将氨基类树脂用DCM进行溶胀处理，待溶胀完全后，抽掉DCM；然后采用DBLK溶液与溶胀后的氨基类树脂进行脱帽反应；将脱除Fmoc保护基团的氨基类树脂依次用DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF进行洗涤；
步骤(2)，第1位氨基酸单体的偶联反应：
所述第1位氨基酸单体为Fmoc-Gly-OH；配制Fmoc-Gly-OH、缩合剂和DMF的混合溶液并加入到所述步骤(2)制备的脱除Fmoc保护基团的氨基类树脂中，通过氮气将树脂被均匀吹起进行偶联反应；然后可抽掉反应液，最后加DMF洗涤制得Fmoc-Gly-树脂；
步骤(3)，第2～12位氨基酸单体的偶联反应：
将所述步骤(2)制备的Fmoc-Gly-树脂依次与Fmoc-Pro-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH氨基酸单体进行偶联反应制备得线性十二肽树脂；且每位氨基酸单体的偶联反应之前，先采用DBLK溶液与含上一位氨基酸单体的中间树脂进行脱帽反应，然后用DMF、DMF、MeOH、DCM和DMF进行洗涤，且每次氨基酸单体的偶联反应之后，可抽掉反应液，最后加DMF洗涤制得中间体树脂。
5.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述步骤B的具体步骤包括：
步骤(1)，将所述步骤A制备的线性十二肽树脂用DCM进行溶胀处理；
步骤(2)，采用I2/DMF溶液对溶胀后的线性十二肽树脂进行氧化反应处理制备得环化十二肽树脂；
步骤(3)，然后采用DBLK溶液与环化十二肽树脂进行脱帽反应；将脱除Fmoc保护基团的环化十二肽树脂依次用DMF、DMF、MeOH和DCM进行洗涤制备得环化十二肽树脂。
6.根据权利要求4或5任一项所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述脱帽反应具体步骤包括采用DBLK溶液与溶胀后的氨基类树脂或中间树脂进行第一次脱帽反应5min，然后采用DMF进行洗涤一次，最后再采用DBLK溶液进行第二次脱帽反应15min。
7.根据权利要求5所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述偶联反应温度为20～35℃，反应时间为3～4h。
8.根据权利要求4或5任一项所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述DBLK是质量分数为10％～20％哌啶的DMF溶液。
9.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述步骤C中裂解操作的具体步骤包括：将所述步骤B制备的脱除Fmoc保护基团的环化十二肽树脂加入到裂解液中，室温裂解3～4h后，滤掉树脂残渣得到环化十二肽的粗肽裂解液；所述裂解液各组分配比为：TFA：EDT：TIS：H2O＝(85～95):(1～3):(1～3):(5～10)。
10.根据权利要求1所述的一种醋酸特利加压素的合成方法，其特征在于，所述步骤C中提纯操作的具体步骤包括：
步骤(1)，将所述裂解操作后得到的环化十二肽粗肽裂解液加入冰MTBE中沉降、析出固体粗肽，然后经过滤、冰MTBE洗涤和干燥，制备得特利加压素粗品。
步骤(2)，将所述步骤(1)获得的特利加压素粗品依次经C18柱进行纯化、浓缩、冻干制备得精制醋酸特利加压素成品。
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