CN1167114A - 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 - Google Patents
不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1167114A CN1167114A CN 97110848 CN97110848A CN1167114A CN 1167114 A CN1167114 A CN 1167114A CN 97110848 CN97110848 CN 97110848 CN 97110848 A CN97110848 A CN 97110848A CN 1167114 A CN1167114 A CN 1167114A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leu
- calcitonin
- thr
- ala
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及式(I)新的不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法,其降低血钙的作用以及用于治疗骨质疏松症、Paget’s症、骨痛及各种高血钙症等。
Description
本发明涉及不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物,制备它们的方法,及它们治疗骨质疏松症、Paget’s症、骨痛、各种高血钙症及与血钙过高引起的有关疾病中的用途。
天然降钙素能治疗骨质疏松症,Paget’s症、骨痛、各种高血钙症等。天然降钙素都是由32个氨基酸残基组成的单链多肽,目前已知的天然降钙素包括人、猪、牛、鸡、鼠、鱼等动物的降钙素。不同种属的天然降钙素其氨基酸残基不同,但都包括由1,7位半胱氨酸形成的二硫键,C-端都是脯氨酰胺结构。在天然降钙素中,以鱼类(鲑、鳗)的活性最高,鲑鱼降钙素(Salmon calcitonin,sCT)和鳗鱼降钙素(Eel calcitonin,eCT)的活性约是人降钙素(Human calcitonin,hCT)的30倍(Epand R M,Caulfield M P.Calcitonin and parathyroid hormone receptors,In:Comprehensive Medicinal Chemistry,Emmett J T,Ed;Pergamon:Oxford;Vol.3:1023-1045,1990.)。
sCT和eCT的氨基酸序列如下:
Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-
1 7
Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-
Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (sCT)
32
Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-
1 7
Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-
Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2 (eCT)
32
天然降钙素中1,7位Cys形成的二硫键对人、鼠等的降钙素是活性必须基团,不含二硫键的hCT类似物基本没有活性。但是二硫键对鱼的降钙素活性影响不大,例如用其它环取代sCT或eCT中的二硫环[Fujii,S,Yamamoto I,shimizu F,et al.Preparation of calcitonin derivatives andcalcium metabolism-improving agents.Eur Pat Apll EP 397,985(1990).],以及用Cys(Acm)或Ala取代sCT或eCT中的1,7位Cys而形成的非环状类似物[Orlowski R C,Epand R M,Stafford A R,et al.biologicallypotent analogues of salmon calcitonin which do not contain an N-terminaldisulfide bridged ring structure.Eur J Biochem,1987,162(2):399.]都保持活性。天然降钙素的稳定性差,其中在溶液中的不稳定性与二硫键的不稳定性有关且天然降钙素的来源也很有限。因此寻找合成简单,成本低廉,稳定性好并同时具有与天然降钙素活性基本相同的降钙素类似物,是十分必要的。
本发明的目的是寻找易人工合成且保持有天然降钙活性的降钙素类似物。
本发明者经广泛深入研究,现已发现具下面通式(I)的新降钙素类似物,其不仅合成简单,而且保持了与天然降钙素基本相同的活性。本发明因此得以完成。
因此,本发明第一方面涉及的是新的不含二硫键的通式(I)sCT及eCT类似物。
AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-
Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-Y
-Thr-Pro-NH2 (I)
其中:AA1,AA2可相同或不同且为选自Ala,Val,Leu,lle,Gly,Phe,Met,Trp的天然非极性氨基酸,条件是AA1和AA2不能同时为Ala;
m,n=0,1;
X=-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-;
Y为选自Gly,Ala,D-Ala,Sar的氨基酸残基。其中在通式(I)中,主要是用一些天然非极性氨基酸残基,如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(lle)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)等取代天然sCT和eCT中1,7位的半胱氨酸(Cys),形成不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼的降钙素类似物。新的通式(I)类似物的结构与现有的含二硫键及非环状类似物相比,结构变化除了1,7位Cys残基被取代外,30位的Gly残基也可用Ala,D-Ala及Sar等取代,以改变C-端肽键的特性,有利于肽的酶稳定性。有些通式(I)中类似物由于缺失某些氨基酸残基(Ser2,Leu19,Gln20,Thr21,Tyr22),其氨基酸序列可缩短。
本发明第二方面涉及的是通式(I)降钙素类似物的制备方法。该方法按固相合成方法进行。该方法包括:采用固相合成方法以BHA或MBH作固相载体,氨基酸的α-氨基用Fmoc保护,首先将Fmoc-Pro与树脂偶联,然后通过DCC/HOBt复合缩合剂依次接肽,接肽完成后,先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合试剂脱除侧链保护基,再用HF把肽从BHA或MBHA树脂上切下。
sCT及eCT的类似物都采用固相法(SPPS)合成。文献报道中的CT类似物的合成一般是采用对甲基二苯甲基氨基树脂(MBHA)或二苯甲基氨基树脂(BHA)为固相载体,氨基酸的α-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保护的合成路线,肽合成完后,一次用无水HF脱除侧链保护基及把肽从树脂上切下[Orlowski R C,Seyler J K,Stahl G L,et al.Analogs ofcalcitonin.US Pat 4,604,238(1986).]本发明合成方法中固相载体采用的是MBHA或BHA,氨基酸的α-氨基用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作保护基,一些氨基酸的侧链基团用对酸敏感的保护基作保护,例如丝氨酸(Ser),苏氨酸(Thr)和缬氨酸(Tyr)的侧链羟基,以及谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的侧链羧基都用叔丁基(But)酯保护;赖氨酸(Lys)的ε-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保护,组氨酸(His)的咪唑基用三苯甲基(Trt)保护;精氨酸(Arg)的侧链胍基用4-甲氧-2,3,6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)保护。
氨基酸的缩合反应采用1-羟基苯并三氮唑(HOBt)活化酯方法完成,缩合是否完全通过茚三酮方法检验。
接肽完成后,首先和TFA/三甲基溴硅烷(TMSBr)/苯甲硫醚(8∶1.5∶2,v/v/v)处理全保护肽以脱除侧链保护基,再用无水氟化氢(HF)把肽从树脂上切下。
从树脂上切下的肽粗品经冷冻干燥后,先用葡聚糖凝胶色谱柱(Sephadex G-25)脱盐,再用HPLC进一步纯化。
本发明中的合成方法,特别是采用先脱除侧链保护基再把肽从树脂上切下的二步“脱保护/切除”方法,使合成的产物纯度高,总产率提高很大。
本发明再一方面涉及的本发明通式(I)天然降钙素类似物用于降低包括人等哺乳动物的血钙浓度,及用于治疗与哺乳动物中高血症有关的症状或疾病,如骨质疏松症,Paget’s症及骨痛等。本发明式(I)降钙素在实验中显示出在水溶液中良好的稳定性及良好的降钙活性。表1是三个肽在大鼠体内测得的降钙活性。
表1
肽 降钙活性(lU/mg) 降钙活性95%可信度
(lU/mg)
sCT 4726 3418~6446[Val1,Ala7]sCT 4331 3114~5829[Val1,Ala7,Ala30]sCT 5053 4128~6191[Val1,Ala7,des19-22]sCT 3327 2454~4247
在本说明书及权利要求书中,氨基酸及其它缩写词的缩写如下说明:
Ser:丝氨酸,Asn:天门酰胺,Leu:亮氨酸,Thr:苏氨酸Val:缬氨酸,Gly:甘氨酸,Lys:赖氨酸,Gln:谷氨酰胺Glu:谷氨酸,His:组氨酸,Tyr:酪氨酸,Pro:脯氨酸Arg:精氨酸,Ile:异亮氨酸,Phe:苯丙氨酸,Met:蛋氨酸Try:色氨酸,Sar:氮甲基甘氨酸或N-甲基甘氨酸(文中除表明为D-氨基酸外,其它氨基酸的构型都为L-构型)DCM:二氯甲烷 DMF:N,N-二甲基甲酰胺MeOH:甲醇 TFA:三氟乙酸 DIPEA:二异丙基乙胺DCC:N,N’-二环己基碳二亚胺 HoBt:1-羟基苯骈三氮唑HPLC:高效液相色谱 HF:氟化氢 FAB-MS:快原子轰击质谱
下面的实施例用来进一步说明本发明但不意味着对本发明有任何限制。
实施例1:[Val1,Ala7]sCT的固相合成A.Fmoc-Pro与MBHA树脂的连接:
1.0g MBHA树脂(0.55mmol/g)放入肽反应器中,依次经过下列处理:
1.洗:DCM,12ml,2×1分钟。
2. 5%DIPEA/DMF,10m,2×5分钟。
3.洗:DMF,12ml,1分钟;DCM,12ml,4×1分钟。
4.加入556.7mg(1.65mmol)Fmoc-Pro,用8ml的DMF溶解,在0-5℃加入340.0mg(1.65mmol)DCC的4ml DCM溶液,在0-5℃反应1小时后,在室温振摇6小时。
5.洗:DMF,12ml,1分钟;DCM/MeOH(1/1),15ml,1分钟;DCM,12ml,3×1分钟。
6.加入2ml 5%DIPEA/DMF,1ml醋酐,8ml DCM,室温反应2小时
7.洗:同上述3。B.固相接肽:
缩合反应A
1. 25%哌啶/DMF,8ml,2×15分钟。
2.洗:DMF,12ml,2×1分钟;DCM,12nl,3×1分钟。
3. 1.65mmol Fmoc保护氨基酸溶于8ml DMF,在0-5℃下加入223.0mg(1.65mmol)的HOBt,溶解后再加入340.0mg(1.65mmol)DCC溶于4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分钟,再于室温放置10分钟后,加入反应器中,在室温振摇2小时。
4.洗:DMF,12ml,1分钟;DCM/MeOH(1/1),12ml,1分钟;DCM,12ml,3×1分钟。
5.茚三酮检测,若为阳性,继续用缩合反应B缩合一次。
缩合反应B
1. 0.8mmol Fmoc保护氨基酸溶于6ml DMF中,在0-5℃下加入108.0mg(0.8mmol)的HOBt,溶解后再加入165.0mg(0.8mmol)DCC溶于4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分钟,再于室温放置10分钟后,加入反应器中,在室温振摇2小时。
2.同缩合反应A中4。
3.茚三酮检测,若为阳性,继续用缩合反应B再缩合一次。
表2是合成[Val1,Ala7]sCT所需的氨基酸及缩合反应类型:
表2氨基酸序号 氨基酸 分子量 氨基酸用量 缩合
mmol mg 反应32 Fmoc-L-Pro-MBHA 0.55 1000.031,27,25 Fmoc-L-Thr(But) 397.5 1.65 655.9 A30,28 Fmoc-L-Gly 297.3 1.65 490.5 A29 Fmoc-L-Ser(But) 383.4 1.65 632.6 A26 Fmoc-L-Asn 354.4 1.65 584.8 A24 Fmoc-L-Arg(Mtr).lPE 608.7 1.65 1000.0 A23 Fmoc-L-Pro 337.4 1.65 556.7 A22 Fmoc-L-Tyr(But) 459.3 1.65 757.8 A
0.80 367.4 B21,6 Fmoc-L-Thr(But) 397.5 1.65 655.9 A
0.80 318.0 B20,14 Fmoc-L-Gln 368.4 1.65 607.9 A
0.80 294.7 B19,16,12,9,4 Fmoc-L-Leu 353.4 1.65 583.1 A
0.80 282.7 B18,11 Fmoc-L-Lys(Boc) 468.6 1.65 773.2 A
0.80 374.9 B17 Fmoc-L-His(Trt) 619.7 1.65 1022.5 A
0.80 495.8 B15 Fmoc-L-Glu(OBut) 425.5 1.65 702.1 A
0.80 340.4 B13,5,2 Fmoc-L-Ser(But) 383.4 1.65 632.6 A
0.80 306.7 B10 Fmoc-L-Gly 297.3 1.65 490.5 A
0.80 237.8 B8,1 Fmoc-L-Val 339.4 1.65 560.0 A
0.80 271.5 B7 Fmoc-L-Ala 311.3 1.65 513.6 A
0.80 249.0 B3 Fmoc-L-Asn 354.4 1.65 584.7 A
0.80 283.5 BC.侧链保护基的脱除:
接肽完成后,首先用25%的哌啶DMF溶液脱除N-端Fmoc基团,用DMF和DCM洗涤。在-5-0℃冷却下加入冷至0℃的TFA/TMSBr/苯甲硫醚(8/1.5/2,v/v/v)混合溶液20-30ml,45分钟后抽滤除去,依次用DCM,MeOH,DMF,DCM洗。D.肽从树脂上的切下:
1.0g脱除侧链保护基的树脂,放入HF裂解器中,加入1ml苯甲醚,在-5-0℃下通入无水HF10-12ml,于0-5℃搅拌45分钟后减压抽去HF,用冷的无水乙醚洗。用30ml的20%醋酸分三次洗树脂,再用水洗,合并醋酸与水的滤液,冷冻干燥。E.肽的纯化鉴定:
100mg经HF裂解下的粗肽,用5ml去离子水溶解,上Sephadex G-25柱(1.5×120cm),用0.2N的醋酸洗脱。用紫外检测,波长214nm。收集流出组分,冷冻干燥。
以上纯化的肽,再用反相HPLC方法纯化分析鉴定[HPLC系统:Waters 600E泵;C18柱(7u,8×250,大连物化所);SP UV1000检测仪,紫外波长214nm;SP Data-Getintegrator记录仪;流动相:A-0.1%TFA/H2O,B-70%CH3CN/H2O(0.1%TFA),梯度:B在20分钟内由0%升至60%,10分钟内再降至0%]。经HPLC纯化的肽,经FAB-MS鉴定,分子离子峰为:3398.5(M+1),肽的理论分子量为3397.8。大鼠体内降钙活性测定:
药品剂量取7.2和18mU/100g的两个剂量组,皮下注射给药。用2.2法随机及交叉实验设计,每组10只雄性大鼠,给药前禁食17小时,给药后1小时取血离心,取血清测定血钙,比较供试品与标准品的血钙下降程度,计算生物效价和可信限。具体实验参照文献[Findlay DM,MichelangeliVP,Orlowski RC.biological activities and receptor interactions of des-leu16 salmon and des-phe16 human calcitonin,Endocrinology,1983;112:1288.钱德明,沈根全,柯若伦。用大鼠血钙法测定降钙素生物效价的探讨,药物分析杂志,1994;4(3):30.]方法完成。结果见表1所示。
Claims (4)
1.结构为通式(I)的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物
AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-
1 7
Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-
Y-Thr-Pro-NH2(I)
30
其中:AA1,AA2为选自Ala,Val,Leu,lle,Gly,Phe,Met,Trp的天然非极性氨基酸,条件是AA1和AA2不能同时为Ala,
m,n=0,1;
X=-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-;
Y为选自Gl,Ala,D-Ala,Sar的氨基酸残基
2.制备权利要求1要求的通式(I)降钙素类似物的方法,包括:采用固相合成方法,以BHA或MBH为固相载体,氨基酸的α-氨基用Fmoc保护,首先将Fmoc-Pro与树脂偶联,然后通过DCC/HOBt复合缩合剂依次接肽,接肽完成后,先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合试剂脱除侧链保护基,再用HF把肽从BHA或MBHA树脂上切下。
3.权利要求1的降钙素类似物用于降低血钙浓度。
4.权利要求1的降钙素类似物用于治疗骨质疏松症,Paget’s症,骨痛及各种高血钙症等。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN97110848A CN1064051C (zh) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN97110848A CN1064051C (zh) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1167114A true CN1167114A (zh) | 1997-12-10 |
CN1064051C CN1064051C (zh) | 2001-04-04 |
Family
ID=5171559
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN97110848A Expired - Fee Related CN1064051C (zh) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1064051C (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008151512A1 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. | Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives |
CN103254305A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-08-21 | 青岛国大生物制药股份有限公司 | 醋酸鲑降钙素的制备方法 |
US9593149B2 (en) | 2014-09-04 | 2017-03-14 | Novo Nordisk A/S | Amylin and calcitonin receptor agonist |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CS89491A3 (en) * | 1990-04-09 | 1992-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Hybrid calcitonin |
JPH083196A (ja) * | 1994-06-21 | 1996-01-09 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | カルシトニン誘導体及びその用途 |
-
1997
- 1997-04-30 CN CN97110848A patent/CN1064051C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008151512A1 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. | Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives |
EP2168602A1 (en) * | 2007-06-12 | 2010-03-31 | Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. China | Site-specific pegylated linear salmon calcitonin derivatives |
JP2010533129A (ja) * | 2007-06-12 | 2010-10-21 | 中国人民解放▲軍▼▲軍▼事医学科学院毒物▲薬▼物研究所 | 部位特異的なペグ化をされた直鎖状のサケカルシトニン類似体 |
EP2168602A4 (en) * | 2007-06-12 | 2014-10-29 | Inst Pharm & Toxicology Amms | LINEAR, PEGYLATED, SITE-SPECIFIC SALMON CALCITONIN DERIVATIVES |
US9464128B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-10-11 | Institute Of Pharmacology And Toxicology Academy Of Military Medical Sciences P.L.A. | Site-specific pegylated linear salmon calcitonin analogues |
CN103254305A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-08-21 | 青岛国大生物制药股份有限公司 | 醋酸鲑降钙素的制备方法 |
CN103254305B (zh) * | 2013-05-31 | 2014-10-01 | 青岛国大生物制药股份有限公司 | 醋酸鲑降钙素的制备方法 |
US9593149B2 (en) | 2014-09-04 | 2017-03-14 | Novo Nordisk A/S | Amylin and calcitonin receptor agonist |
US10174082B2 (en) | 2014-09-04 | 2019-01-08 | Novo Nordisk A/S | Amylin and calcitonin receptor agonist |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1064051C (zh) | 2001-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH0532696A (ja) | 副甲状腺ホルモン誘導体 | |
HU222249B1 (hu) | Eljárás amilin agonista peptidszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására | |
AU6751290A (en) | Synthetic calcitonin peptides | |
EP0914340B1 (en) | hGH-RH(1-29)NH2 ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY | |
CA2351665C (en) | Antagonistic analogs of gh-rh inhibiting igf-i and -ii | |
RU2335506C2 (ru) | Пептидные аналоги gh-rh с антагонистическим действием, способ снижения уровня gh, способ снижения уровня igf-i и igf-ii, применение для ингибирования роста раковых клеток, фармакологически приемлемая композиция (варианты) | |
WO1997042223A9 (en) | hGH-RH(1-29)NH2 ANALOGUES HAVING ANTAGONISTIC ACTIVITY | |
KR20150005904A (ko) | 강력한 작용제 효과를 지닌 신규한 gh-rh 유사체 | |
CA2718146A1 (en) | Novel n- and c-terminal substituted antagonistic analogs of gh-rh | |
JPH09506616A (ja) | 拮抗活性を有するhGH−RH(1−29)NH▲下2▼の類似体 | |
CN1126759C (zh) | 含d-2-烷基色氨酸、能促进生长激素释放的寡肽化合物 | |
CN1121413C (zh) | 含d-2-烷基色氨酸的能促进生长激素释放的多肽化合物 | |
JPS61191698A (ja) | 新規な環状ヘキサペプチドlhrh拮抗剤 | |
CN1041159A (zh) | 肽化合物 | |
CN1064051C (zh) | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 | |
EP0842193B1 (en) | Somatostatin-analogous cyclic peptides with inhibitory activity on growth hormone | |
US9464128B2 (en) | Site-specific pegylated linear salmon calcitonin analogues | |
AU673147B2 (en) | Amylin agonist peptides and uses therefor | |
EP0324130A2 (en) | 8-Glycine, 16-X, Des-19-Leucine-Calcitonin | |
JPH09221500A (ja) | カルシトニン類似体 | |
CS246162B1 (cs) | Peptid s aktivitou hormonu uvolňujícího luteinizační a folikuly stimulující hormon |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20010404 Termination date: 20160430 |