JPH08503456A

JPH08503456A - 自由官能性を有する特異的に架橋されたヘモグロビン

Info

Publication number: JPH08503456A
Application number: JP6511549A
Authority: JP
Inventors: クルーガー，ロナルド; ユニバーシティーオブトロントイノベーションズファウンデーションザ
Original assignee: ザユニバーシティオブトロントイノベーションズファウンデーション
Priority date: 1992-11-18
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1996-04-16
Also published as: PL309032A1; DE69323497T2; EP0669940B1; AU683029B2; DE69323497D1; MX9307175A; EP0669940A1; US5399671A; CA2149132A1; SK64195A3; WO1994011399A1; HUT70740A; NZ257513A; RU95112535A; ATE176673T1; HU9501448D0; CZ128695A3; AU5415394A

Abstract

(57)【要約】ヘモグロビンが三官能性の試薬との反応によってその四量体の形態の中にサイト特異的に架橋され、その試薬は静電効果と立体化学的効果と官能基の存在を組み合わせ、その結果、官能基の二つはヘモグロビン上の特定のサイトと反応するが、三番目のサイトは内因性の求核化合物との反応のために自由に残されている。そのような架橋剤の具体例はトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）、ＴＴＤＳであり、これは各々のβサブユニット上の８２番のリジンのアミノ基の間の特異的な架橋をもたらす。架橋剤ＴＴＤＳは架橋反応のために三つの利用可能なカルボキシル基を持っているが、二つだけがそのように反応し、一つの遊離のカルボキシルを外因性の求核試薬のために、例えば、ヘモグロビン産物を身休の循環系を通過する求核性化合物のキャリアとして有用なものにするために残している。

Description

【発明の詳細な説明】自由官能性を有する特異的に架橋されたヘモグロビン技術分野本発明は改良されたヘモグロビン、およびヘモグロビンの改良を行なうための方法と試薬に関する。より具体的に説明すると、本発明は架橋反応を生じさせるためにヘモグロビンのサブユニット上の特定の一級アミノ基を利用するヘモグロビンの架橋、および特異的で、しかも前もって決められた方法で他の反応性の化合物と化学反応し得るそのような架橋ヘモグロビンに関する。背景技術ヘモグロビンは自然界に存在する蛋白質である。赤血球中に含まれるときは、ヘモグロビンは二つのαサブユニットと二つのβサブユニットからなる四つのサブユニットの四量体の形で存在する。各サブユニットは蛋白質鎖とヘム分子を持っており、αサブユニットの蛋白質鎖は既知の配列順序を持つ１４１個のアミノ酸を含んでおり、βサブユニットの蛋白質鎖は既知の配列順序を持つ１４６個のアミノ酸を含んでいる。自然の、生物受容性で、しかも良く研究された蛋白質として、ヘモグロビンは、生物活性物質、薬剤および他の種に属する物を、それらの種をヘモグロビンへ結合させることによって、多分、生休内で移動させ、またそれらの種を循環系へ導入するための物質として興味をそそるものである。しかしながら、自然の赤血球以外の溶液中のヘモグロビンは四量体の形から二量体へ、さらにはサブユニットの単量体へ解離する傾向がある。これらは分子量が低過ぎるので、体内で循環して適切に維持されることはできない。したがって、ヘモグロビンがそのような移動系として発達する前に、ヘモグロビンをその自然の四量体の形に安定化するために、ヘモグロビンのサブユニットの間に化学的な架橋を形成し、かくして循環系にヘモグロビンが適切に維持されるのを確実にすることが必要である。ヘモグロビン産物を生物医学的な用途に正しく受け入れられるようにするためには、その正確な化学的な性質についてのコントロールが必要である。したがって、ヘモグロビンのサブユニットの間で行なわれる全ての架橋はヘモグロビン分子上の特定のサイトまたは化学的な基の間の特異的で、しかも再現可能な化学的な連結によるのが望ましい。例えば、各々が実質的な数の反応性アミノ基を含むヘモグロビンのサブユニットのような大きさを持つ蛋白質については、これを達成することはむつかしい。本発明の一つの目的はサブユニット上の二つの特定のサイトの間で架橋されており、しかも薬剤のような他の化学的な構成要素が化学的に結合することができる反応サイトを供給するヘモグロビンを提供することである。本発明の次の目的はそのような架橋されたヘモグロビンを作るための方法と試薬を提供することである。発明の開示本発明の一つの態様によれば、三つまたはそれ以上の反応性サイトを含む化学的試薬をヘモグロビン上の二つの特定のサイトで反応させ、その試薬の三番目の反応性サイトは他の化合物との次の反応に利用できるように残しておく。この三番目の反応性サイトは、そのサイトがその試薬の他の二つの基と化学的に類似しているという事実に拘らず、如何なるヘモグロビン鎖上の活性サイトとも反応しない。このようなことを達成する試薬は、ヘモグロビン鎖上の一級アミノ基と反応する離脱基を構成する少なくとも三つのかさばった求電子性の陰イオン基を有するコアの炭化水素または置換炭化水素を持っている。しかしながら、実際問題としては、二つの離脱基のみが反応し、三番目の離脱基は他の化合物との反応に利用できるようになっている。そのような有用な試薬は次の一般式に相当する：式中、Ｒは脂肪族、芳香族または脂環族炭化水素基を表し；Ｘ、ＹおよびＺは同じでも良いし、または異なっていても良く、各々はかさ高で、芳香族の求電子性陰イオン離脱基を表わす。本発明は何らかの特定の理論または作用のメカニズムに制限または拘束されるべきであることを意図しているものではないが、本明細書に記述されている試薬はヘモグロビンの架橋に高度の選択性と効率を与える静電性と立体化学的かさ高性と官能基の組み合わせを持っていると考えられる。本発明による試薬はヒトのデオキシヘモグロビンと反応してβサブユニットを各サブユニットの８２番のリジンの位置で架橋する。この試薬上の三番目の反応性基は外来性求核試薬と反応するのに利用できる。添付の図面において、第１図は典型的な試薬トリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）（ｔｒｉｍｅｓｏｙｌｔｒｉｓ（３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ＴＴＤＳの直接的な合成ルートを示す反応計画（ｒｅａｃｔｉｏｎｓｃｈｅｍｅ）であり；第２図はＴＴＤＳを作るための好ましい反応計画であり；第３図は３５℃で２時間反応させた、ＴＴＤＳとデオキシヘモグロビンからの反応産物、下記の実施例３、のＡＸ−３００イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムである。未変性のヘモグロビンは“ααββ”である。ヘモグロビンの修飾によってピークが示されている。“ααβ−８２−８２β”は三量体の官能性（ｔｒｉｍｅｒｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）によって架橋されており、しかも遊離酸に加水分解された三番目のサルチル酸エステル（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）を持っている。“ＤＢＳ”はサルチル酸のエステルが三番目のカルボキシル基ではいまだに無傷であるが、（他の二つの基はヘモグロビンとアミドを形成している）ことを示している。ピークの同定はグロビン鎖分離とペプチド分析によっている；第４図は３５℃におけるＴＴＤＳと一酸化炭素ヘモグロビン（ｃａｒｂｏｎｍｏｎｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）の反応の２時間後における、下記実施例３、のＡＸ−３００プロフィールである；第５図は６０℃で、２時間のＴＴＤＳとデオキシヘモグロビンの反応、下記実施例３、のＡＸ−３００プロフィールである；第６図は６０℃で、２時間のＴＴＤＳと一酸化炭素ヘモグロビンＣＯＨｂの反応、下記実施例３、のＡＸ−３００プロフィールである；第７図は３５℃で、２時間ＴＴＤＳとデオキシヘモグロビンを反応させ、次いで０℃で１５日後に分析した、下記実施例３、のＡＸ−３００プロフィールである；第８図は３５℃で、２時間ＴＴＤＳと一酸化炭素ヘモグロビンを反応させ、次いで０℃で１５日後に分析した、下記実施例３、のＡＸ−３００プロフィールである。第９図はＴＴＤＳで架橋した一酸化炭素ヘモグロビン（ＤＢＳＴ−Ｈｂ）とビオチンヒドラジド（ｂｉｏｔｉｎｈｙｄｒａｚｉｄｅ）の反応からの分離されたサブユニット、下記実施例７の、ＨＰＬＣである。第１０図はＤＢＳＴ−Ｈｂとビオチンヒドラジドの反応から形成された無傷の四量体、下記実施例７、の陰イオン交換クロマトグラム（ＡＸ−３００）である。かくして、本発明で使用される架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｒｅｇｅｎｔｓ）は炭化水素、好ましくは芳香族炭化水素である、コアになる基Ｒと少なくとも三つの求電子性の陰イオン離脱基から成っている。これらの離脱基はアシル−（置換芳香族）基であるのが好ましく、この基の中では置換基はアシル基の求電子性を高めるためにハロゲンおよびカルボキシレートのような電子求引性基であり、このアシル基を通して離脱基がコアの基Ｒに連結している。かくして、好ましい架橋剤は次の一般式に相当する：式中、Ｘ′とＹ′とＺ′は同じでも良いし、または異なっていても良く、各々は少なくとも二つの電子求引性の基を持っている芳香族基から必須的に成る求電子性の陰イオン離脱基を表わしている。適当な電子求引性基の例としてはハロゲン、特に臭素とカルボキシレートが含まれる。本発明による具体的な、最も好ましい架橋剤はトリメソイル＝トリス（３，５ −ジブロモサルチレート）、以下ではＴＴＤＳとして引用する、である。かくして、本発明の具休的な態様によれば、各々のβ鎖の８２番のリジンの間で、次式のトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）から必須的に構成されている架橋剤によって、架橋されたヘモグロビンが提供される：便宜上、この架橋剤を特に引用して本発明を更に説明する。本発明にしたがってトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）をヘモグロビンと反応させると、架橋されたヘモグロビン産物は次に示すように表わすことができる：式中、Ｌｙｓ−８２′と８２−Ｌｙｓは架橋したヘモグロビンのβ鎖を表す。外因性求核試薬との反応に利用できるが、少なくともいくらかの実質的な程度にはヘモグロビン上の基と反応しない遊離のカルボキシル基がＴＴＤＳ残基上に保持されている。ＴＴＤＳによるヘモグロビンの架橋の選択性と効率は静電効果と立体化学的効果と追加の官能基の存在の関数であると考えられている。アミノ基は架橋剤を向ける良い目標であるが、ヘモグロビンの場合は、各α、 β二量体は反応することができる２４個の一級アミノ基を持っており、架橋剤がそれ以上の特異性を持っていない限りさまざまな異なった産物を生成する。陰イオンアシル化剤はヘモグロビン中のある種のアミノ基、特にポリアニオン調節剤、２，３−ジホスホグリセラート（２，３−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）を結合するサイトにあるアミノ基に対する選択性を示すことが知られている。そのようなアシル化剤の電荷がアシル化剤を蛋白質上の陽イオンサイトに向かわせ、これは蛋白質結合サイトにおける会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）について既に知られている静電的コントロールの重要性と一致している。静電効果に加え、立体化学的効果と付加的な官能基の存在を利用することによって、選択性と効率を高めることができる。立体化学的効果は有機試薬の位置選択性（ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を決定するのに重要な役割を果し、そのような効果は蛋白質試薬の選択性を増加することができる。もしも望ましい産物が最も接近できるサイトでの反応から生じるのならば、単一の試薬ＴＴＤＳにおける電荷−方位（ｃｈａｒｇｅ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）と立体化学的なかさと多官能性の組み合わせが選択性と収率の改良につながる。トリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）、ＴＴＤＳは上で説明した全ての特徴を組み合わせた試薬であり：それは陰イオン性で、かさ高で、しかも三官能性である。ＴＴＤＳはデオキシ−および一酸化炭素−ヒトヘモグロビンの両者と反応して、反応が試薬の電荷と立体化学的なかさの両方によって効率的にコントロールされることを示す産物を生成する。付加的な官能基は初期の反応における統計的な利点と架橋を形成する際のエントロピーの利点を与える。ＴＴＤＳとヘモグロビンの反応は各々のβサブユニットの８２番−リジン残基のイプシロンアミノ基に対して高度に選択的である。反応産物のクロマトグラムの積分（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）はこれらの残基の架橋から生じる約８５％の産物の収率を示している。これらは通常はポリアニオンエフェクター、２，３− ジホスホグリセラート（ＤＰＧ）を結合するサイトにある。その残基は、残基のイプシロンアミノ基が蛋白質四量体の大きな空洞中にある一級アルキル鎖の末端にあるので、かさ高な試薬に非常に接近しやすい。デオキシヘモグロビン中では、ＤＰＧ結合サイトは一酸化炭素およびオキシの形に比べて拡大されており、β 鎖を分離し、８２番−リジン残基を移動させる。もしも三番目のジブロモサルチル酸エステル基がデオキシ架橋した種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の中で移動しにくいならば、そのエステル基は、残基がよりフレキシブルである一酸化炭素の形にあるよりも、加水分解のために接近することもむつかしい。他の可能性は、一酸化炭素ヘモグロビン中では、三番目のカルボキシルは立体化学的な制限によってＤＰＧサイトの外に保たれるかも知れないということである。二官能性架橋剤、フマリルビス（３，５−ジブロモサルチレート）、ＦＢＤＳはオキシヘモグロビンと反応し、おもな産物として、イプシロン−アミノ基の間で架橋している（β８２番リジン−フマリル−β′８２番リジン）ヘモグロビンを生じる。デオキシヘモグロビンとＦＢＤＳの反応は主要な産物の混合物を生成する。かくして、ＴＴＤＳの三官能性は同じ離脱基を有する関連した二官能性物質を越えた特異性を付加する。トリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）（ＴＴＤＳ）はヘモグロビンＤＰＧサイトを特異的に攻撃し、αサブユニットを修飾することなく、一つのβサブユニット上の８２番リジンを他のβサブユニット上の８２′番−リジンに架橋させて主要な産物３，５−ジブロモサルチル＝トリメシル−（（８２番−β−リジン）−（８２番−β−リジン））ヘモグロビン、（ＤＢＳＴ−Ｈｂ）を約９５％の収率で生成する。修飾された蛋白質の残りの５％は三重に連結された物質（トリメシルβ−１番−バリンとβ−８２番−リジン）から成っている。後者はデオキシヘモグロビンと、より小さな離脱基を持っている陰イオン性アシル化剤であるトリメソイル＝トリス（メチルホスフェート）の反応における主要な産物である。これらの構造はＨＰＬＣパターンの比較によって同定されている。ＤＢＳＴ−Ｈｂの場合は、三番目のジブロモサルチル酸エステル基は、多分二つの初期の連結が作られた後に生じる立体化学的で、しかも配座的な制限の結果として、未反応の状態で残る。ＤＢＳＴ−Ｈｂ中の残存エステルは、ＨＰＬＣでモニターすると低温での水性貯蔵（ｃｏｌｄａｑｕ中にゆるやかな加水分解を受ける。試薬ＴＴＤＳは二つの方法の中の一つで作ることができる。添付図面第１図に説明されている、試薬の直接的な合成においては、トリエチルアミンを３，５−ジブロモサルチル酸と反応させ、次いでトリメソイルトリクロリドと反応させる。この方法はＴＴＤＳを比較的に低い収率で製造する。添付図面の第２図に説明されている、改良された合成法はカリウムｔ−ブトキシドをｔ− ブチル−３，５−ジブロモサルチレートと反応させ、次いでトリメソイルクロリドを添加することによってトリメソイル＝トリス−（１−ｔ−ブトキシカルボニル−３，５−ジブロモサルチレート）を製造するＤｅｌａｎｅｙ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８４，２２８，６２７の一般的な手法にしたがっている。ＴＴＤＳはそれからカルボキシル基を、例えばトリフルオロ酢酸で脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）することによって形成される。ＴＴＤＳの非常に改良された収率がこの手法によって得られる。ＤＢＳＴ−Ｈｂを形成するためのヘモグロビンとＴＴＤＳの反応は、通常は２，３−ジホスホグリセラートを結合するヘモグロビン中の高度に陽イオン性のサイトにおけるアミノ基の陰イオン性求電子体に対する特有の求核反応性を利用する。ＴＴＤＳによる各βサブユニットからの二つのアミノ基のアシル化によって蛋白質それ自身の上に陰イオン性の求電子サイトが発生する。かくして、その領域における蛋白質の反応性は求核的であることから求電子的へ、また局所電荷は正から負へ変化する。蛋白質は通常はエステル結合を含まないので、導入されたエステルは独特の反応点（ｐｏｉｎｔｏｆｒｅａｃｔｉｏｎ）を提供する。この方法によって、全ての求核試薬のアシル化が効率的になる。説明のために、本発明を次の具体例において更に記述する。物質および方法化学試薬は追加の精製をすることなく使用した。溶媒は使用前に乾燥した。重水素溶媒はＭＳＤＩｓｏｔｏｐｅｓＬｔｄ．とＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙからのものであった。有機試薬と溶媒はＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。新しく合成した試料の純度はＮＭＲ分光学、質量分析法、分析用薄層クロマトグラフィーおよび元素分析の組み合わせで評価した。後者はＧａｌｂｒａｉｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌ，Ｔｅｎｎ．で行なわれた。分子力学混合−傾斜最適化（ｍｉｘｅｄ−ｇｒａｄｉｅｎｔｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、ＴＴＤＳのいくつかの初期に推定した構造に基づく反復的な配座摂動（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）のためのエネルギー最小値（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｍｉｎｉｍａ）を得るために、４８６コンピュータ（ＭＳ−ＤＯＳ）で作動するＨｙｐｅｒＣｈｅｍ（Ａｕｔｏｄｅｓｋ，Ｉｎｃ．のＨｙｐｅｒＣｕｂｅ部門からの、バージョン１．９）を使用した。それはＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ蛋白質データバンクからの情報に基づいてデオキシヘモグロビンの構造を視覚化するのにも使用された。スペクトルおよび運動力学プロトンおよび炭素ＮＭＲスペクトルをＶａｒｉａｎＧｅｍｉｎｉ（２００ＭＨｘ）分光計に記録した。赤外スペクトルはＮｉｃｏｌｅｔ５ＤＸＦＴＩＲ分光計に記録した。紫外スペクトルと運動力学はＭＳ−ＤＯＳ３８６コンピュータにインターフェースで接続されたＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＬａｍｄａ２分光計で行なった。スペクトルをＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＰＥＣＳＳプログラムで集め、ＧｒａＦｉｔ（ＥｒｉｔｈａｃｕｓＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｔｄ．）を用いて運動力学を解析した。生化学的物質ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルと水はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔから入手し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（ＲｏｃｋｆｏｒｄＩｌｌ．）から入手した。ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ）から入手したトリプシンとＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手したブドウ球菌（黄色）Ｖ^*エンドプロティナーゼ＝Ｇｌｕ−Ｃをグロビン鎖の酵素消化に使用した。セファデックスＧ −２５、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）およびＣＭ−セファデックスをＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ヘモグロの修飾とクロマトグラフィー用の緩衝液と発生剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）を作るための他の試薬は全て分析グレードまたはそれ以上であった。ヘモグロビンは、例えばＫａｖａｎａｕｇｈ他によって“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”１９８８，２７，１８０４に記述されているような手法を用いて作った。溶液を５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、このフラスコを水浴に浸漬し、凝縮器の代りに（気体を流すための）排出管と注入管が通過している隔壁が取り付けられている回転式蒸発器に連結した。一酸化炭素ヘモグロブリンの貯蔵液を回転フラスコ中、増湿された酸素の流れの下で、０℃で６０分間、光照射することによってオキシヘモグロビンに変換した。オキシヘモグロビンを、回転フラスコ中のオキシヘモグロビン溶液の上を３５℃で２時間、増湿した窒素の流れを通過させることによって、デオキシヘモグロビンに変換した。実施例１ＴＴＤＳの直接的な合成トリエチルアミン（１．４５ｇ、１５ｍｍｏｌ）を室温で無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の３，５−ジブロモサルチル酸（２．００ｇ）６．７６ｍｍｏｌ）に加えた。１０分撹拌した後に、トリメソイルトリクロリド（０．６ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に滴下した。溶液を室温で２時間撹拌した。沈殿を濾別し、溶媒を真空内で除去した。残渣を酢酸エチル（６０ｍＬ）と０．１Ｎ塩酸（１００ｍＬ）の間で分配した。分離した後、有機相を０．１Ｎ塩酸（２×１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄の上で乾燥し、真空内で濃縮して白色の固体（２．２５ｇ）を生成した。この固体は¹ＨＮＭＲによってＴＴＤＳを含む混合物であるとみなされた。この産物の一部（２８ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｃ−１８逆相カラム、アセトニトリル（０．１％酢酸）溶媒）によって精製した。少量の純粋なＴＴＤＳが単離された（７．０ｍｇ、２５％回収）。ＩＲ（ＫＢｒ）３４１６（ｂｒ．，Ｓ）、２３５５（ｓ）、１７４３（ｓ）、１００２（ｓ）ｃｍ^-1、¹ＨＮＭＲ（アセトン−ｄ₆）δ９．２５（ｓ，３Ｈ，ＡｒＨ）、８．２５（ＡＢ，６Ｈ，ＡｒＨ）、４．４０（ｂｒ，ｓ，３Ｈ，ＣＯ₂Ｈ）。¹³ＣＮＭＲ（アセトン−ｄ⁶）δ１６４．０１（ｓ）、１６３．０２（ｓ）、１４８．５９（ｓ）、１４０．６４（ｓ）、１３７．２０（ｓ）、１３５．１６（ｓ）、１３２．１８（ｓ）、１２８．１７（ｓ）、１２０．６９（ｓ）、１２０．５０（ｓ）；ＭＳ（負ＦＡＢ）１０４３（Ｍ−１）。６当量の塩基（ｂａｓｅ）の存在下におけるトリメソイルクロリドと３当量の３，５−ジブロモサルチル酸の直接的な反応は不完全な反応をもたらす。逆相ＨＰＬＣを使用する混合物の精製は産物を低収率で提供する。実施例２ＴＴＤＳの改良された合成Ｄｅｌａｎｅｙ、Ｋｌｏｔｚおよび共同研究者が前掲引用書に記述した一般的な手法にしたがって、カルボキシル−保護サルチレート、トリメソイル＝トリス（１−ｔ−ブトキシカルボニル−３，５−ジブロモサルチレートを作った。カリウムｔ−ブトキシド（０．３０ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のｔ−ブチル３，５−ジブロモサルチレート（０．９５ｇ）２．６９ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を室温で１５分間撹拌した。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリメソイルトリクロリド（０．２４ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を１５分にわたって滴下した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。エーテル（６０ｍＬ）を加え、混合物を水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄ の上で乾燥し、真空内で濃縮して産物を白色の固体（０．９８ｇ、収率：９０％）として生成した。¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ９．３２（ｓ，３Ｈ，ＡｒＨ）、δ８．０１（ＡＢ，６Ｈ，ＡｒＨ）、１．４２（ｓ，２７Ｈ，（ＣＣＨ₃）₃）。ＦＡＢ−ＭＳ１２１３（Ｍ＋１）。ＩＲ（ｋＢｒ）２９８０（ｍ）、１７７１（ｓ）、１７７２（ｓ）、１１８５（ｓ）。このようにして作ったトリメソイル＝トリス（ｔ−ブトキシカルボニル−３，５−ジブロモナルチレート）（０．８８ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）を無水トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）中に溶解し、室温で１時間保った。ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加えて結晶化させた。溶液を５℃に一晩保った。濾過して産物を集めた（白色結晶、０．６２ｇ、収率：８２％）。この経路で合成された産物の性質は直接的な経路で作られた化合物を精製したものと同じである。Ｃ₃₀Ｈ₁₂Ｏ₁₂Ｂｒ₆：Ｃ３４．５２、Ｈ１．１６、Ｂｒ４５．９３として計算して分析：結果はＣ３４．２６、Ｈ１．４３、Ｂｒ４５．５８であった。この実験の手法にはｔ−ブチルエステルとしての３，５−ジブロモサルチル酸のカルボキシル基の保護、カップリングおよび脱保護が含まれている。トリメソイルトリクロリドとカリウムｔ−ブチル３，５−ジブロモサルチレートの反応はカルボキシルを保護したカップリング産物を高い収率（９０％）で提供する。ｔ −ブチル基は無水トリフルオロ酢酸によって容易に除去されて、８２％の収率で分析的に純粋なＴＴＤＳを生じる。実施例３ＴＴＤＳとヘモグロビンの反応緩衝液中のＴＴＤＳの溶液を、０．１ＭｐＨ７．２ＭＯＰＳ緩衝液中のＴＴＤＳとヘモグロビンの最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭと０．５ｍＭになるように、上述した１ｍＭヘモグロビン溶液に加えた。反応は回転フラスコ中でデオキシまたは一酸化炭素の何れかの形のヘモグロビンを用いて３５℃または６０℃で２〜３時間行なった。デオキシヘモグロビンを用いる反応に対しては、ＴＴＤＳを窒素下の反応容器に導入した。ヘモグロビンをデオキシの状態に保つために、反応中、窒素を回転フラスコ中のヘモグロビン溶液の上に連続的に流した。一酸化炭素ヘモグロビンの反応に対しては、ヘモグロビン溶液を一酸化炭素で飽和させ、それ以上の気体を加えることなく反応を行なった。反応は試薬の添加完了後、さらに２時間続けた。反応後、各試料中のヘモグロビンを４℃でＰｈａｒｍａｃｉａＰＤ−１０セファデックスＧ−２５Ｍのカラムを通過させることによって未反応の試薬から分離し、次いで一酸化炭素を加えて一酸化炭素ヘモグロビンに変換した。無傷の四量体のポリアクリルアミドゲル電気泳動とイオン交換ＨＰＬＣ、分離したグロビン鎖の逆相ＨＰＬＣ、およびペプチドマッピングを目的としたグロビン鎖のトリプシン／Ｇｌｕ−Ｃ消化の組み合わせによって産物を分析した。デオキシヘモグロビンと一酸化炭素ヘモグロビンをＴＴＤＳで３５℃および６０℃で処理した。（無傷のヘモグロビン四量体と修飾された四量体を示す）、２時間反応させた後の（試薬を除いた）反応産物のＡＸ−３００イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラムを第３〜第６図に示す。その上、３５℃で続けられたデオキシヘモグロビンおよび一酸化炭素ヘモグロビン反応混合物を氷の上に１５日間貯蔵し、１週間後にクロマトグラフで、１５日後にＡＸ−３００のカラムを用いて分析した（第７図と第８図は１５日後の産物のクロマトグラムである）。ピークをＣ−４逆相カラムでのグロビン鎖分離とペプチドパターン解析によって同定した。全ての場合に、産物は、アミノ酸分析を含めて、ヘモグロビンとトリメソイル＝トリス（メチルホスフエート）の反応から得られたものと比較することによって同定された。ＴＴＤＳを持ったデオキシヘモグロビンからの産物分布の分析は、最初の架橋した産物はリジンβ８２を他のβ鎖の相当する残基に橋かけするトリメソイル基を持っており、三番目の基は未反応であることを示している。ＴＴＤＳは３５℃で一酸化炭素ヘモグロビンよりもより容易にデオキシヘモグロビンと反応するが、両者は産物としては同一の修飾されたヘモグロビンを形成する。主な違いは、デオキシヘモグロビンは三番目のジブロモサルチレート基をなお存在させて、ずっと多くのβ８２−８２架橋ヘモグロビンを作り出すことである。しかしながら、０℃で１５日後は、デオキシヘモグロビンからの産物も遊離酸として三番目のジメソイルアシル基を持っている。蛋白質の他のアミノ基との反応よりも、むしろこの間に完全な加水分解が起る。６０℃でのＴＴＤＳの一酸化炭素ヘモグロビンおよびデオキシヘモグロビンとの反応は最初の２時間の反応期間の後には完了している。実施例４ＴＴＤＳをヘモグロビン（０．１ＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．２）を架橋するのに使用する条件でＴＴＤＳの加水分解速度を測定した。最初のエステル加水分解は７．１ｈ（Ｋｏｂｓ＝３．２×１０^-5Ｓ^-1）の半減期を持つ一次速度則にしたがう。二番目と三番目のエステル基の加水分解はずっと遅い。ヘモグロビンのアミノ基に対するＴＴＤＳの反応性を推定するために、ｎ−ヘキシルアミンとの反応を測定した（０．１ＭｐＨ７．２緩衝液中、ｋ₂＝３２^-1ｓｅｃ^-1）。例えば、もしもヘモグロビンが１ｍＭで、ＴＴＤＳが２ｍＭの濃度で存在するとすれば、アミノ基のアシル化に対する見掛けの初期一次速度定数は３．２×１０^-2Ｓ^-1 と思われ、約２０秒の半減期に相当する。架橋を形成するための他のアミノ基とのその後の反応は結合される試薬の並進エントロピーの低下のために早いはずである。それ故、ヘモグロビン中の接近できるアミノ基とＴＴＤＳの反応は混合の数分の内に完了し、加水分解は重要な競争プロセスではない。実施例５生物学的接合手法１〜２当量の求核種、すなわちリジンを修飾されたヘモグロビンの緩衝溶液に加え、溶液を３５℃で２時間撹拌した。産物をゲル濾過で単離し、クロマトグラフィーとイオン−スプレイ質量分析法で分析した。残存ＴＴＤＳ上の遊離のカルボキシル基に対するリジンの化学結合が明確に立証された。実施例６生物学的接合次の一般的な実験条件を用いて他の化合物を架橋Ｈｂに結合させることができる。架橋反応直後、架橋Ｈｂ（ＣＯ形態、０．３〜１．４ｍＭ、２．０〜２０ｍＬ、０．１０ＭＭＯＰＳ緩衝液中、ｐＨ７．２）の溶液と導入されるべき化合物（３０〜５００ｍＭ）を０〜２５℃で２〜７２時間インキュベートした。必要に応じ、インキュベーション溶液のｐＨを５．５〜９．５の範囲内に調節した。反応の推移はＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｖｙｄａｃｃ４カラム）で追跡することができる。反応終了後、未反応低分子を除くために反応溶液をセファデックスカラムを通過させた。望みどおりのＨｂ接合物の純粋な試料が得られた。この手法によって次の種類の分子が架橋Ｈｂにうまく接合された：１）次のようなポリヒドロキシルアミン２）次のようなアミノ酸３）次のようなペプチド４）次のような酵素共同因子類似物５）次のようなホルモン実施例７架橋Ｈｂによるビオチンヒドラジドのアシル化ビオチンヒドラジド（１７ｍｇ）を０．５Ｎ塩酸（０．５ｍＬ）と１．０ＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２、０．４ｍＬ）中に溶解した。溶液を５％重炭酸ナトリウム（０．４ｍＬ）で中性にした。上記実施例３に記述された、ＴＴＤＳで架橋された一酸化炭素ヘモグロビン（一酸化炭素ＤＢＳＴＨｂ）（３．０ｍＬ、１．０〜１．２ｍＭ）を導入し、溶液を４℃で１０日間インキュベートした。次いで過剰のビオチンヒドラジドと他の低分子を除くために、溶液をセファデックスＧ−５０カラム中を通過させた。接合された産物を、分離されたグロビン鎖の逆相ＨＰＬＣと無傷の四量体のイオン交換ＨＰＬＣの組み合わせによって分析した。トリメシル− ビオチン−ヘモグロビン接合物を分取イオン交換ＨＰＬＣで分離し、濃縮した。ビオチンヒドラジドとＤＢＳＴ−Ｈｂの反応はアシル化されたビオチンヒドラジドを含む単一の修飾された蛋白質を生成する。アシル化反応の推移を、ヘモグロビンのグロビン鎖を分離する条件下で、逆相ＨＰＬＣ分析で追跡した（第９図）。ビオチンヒドラジド誘導体に対する新しいピークは増加するが、架橋された βサブユニットに相当するピークは減少する。第９図に示されているように、ＤＢＳＴ−Ｈｂの加水分解産物に対するピークも増加する。トリメシル−Ｈｂ−ビオチンヒドラジド産物の形成も、無傷のヘモグロビン四量体を分離する条件下で、陰イオン交換クロマトグラフィーで認めることができる。ＤＢＳＴ−Ｈｂの加水分解産物のピークと共に、接合体が第１０図に示されているクロマトグラム中にピークとして現れる。逆相ＨＰＬＣカラムでアシル化されたビオチンヒドラジドに割りあてられたピークに溶出する物質のリクロマトグラフィーは既に分析された物質と一致した。ビオチン付加物ＳＤＳ−ＰＡＧＥは架橋されたβ鎖のピークだけでなく、未修飾のα鎖のピークも示した。イオンスプレイ質量分析法によれば、架橋されたβ鎖については、ααβ８２ −β′８２：ビオチンヒドラジド接合体によって与えられるピークは３２，１５２．２９±２．１０（計算値３２１５３）であり、未修飾α鎖に対しては１５，１２７．８５±０．６２（計算値１５，１２６）である。ビオチンヒドラジド付加物（ααβ８２−β′８２：ビオチンヒドラジド）、加水分解されたＤＢＳＴ−Ｈｂ（ααβ８２−β′８２：ＯＨ）および自生の、未修飾ＨｂのＣＤおよびＵＶスペクトルは実質上同じであり、架橋され、接合されたＨｂの三次構造は未修飾の自生の蛋白質の三次構造と著しくは異なっていないことを示唆している。実施例８架橋Ｈｂによるグルコサミンのアシル化Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸（１５０ｍｇ）を１．０ｍＬの０．１ＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）中に溶解した。実施例３に記述されたＴＴＤＳで架橋された一酸化炭素ヘモグロビン（２．５ｍＬ、１．０〜１．２ｍＭ）を添加し、生成する溶液を４℃で７日間インキュベートした。トリメシル−ビオチン−ヘモグロビン接合体について上述した方法によって分析と産物の単離を行なった。イオンスプレイ質量分析法で分子の質量を測定した。また接合によって引き起こされる構造の摂動は最小である。イオンスプレイ質量分析法によって、ＤＢＳＴ−Ｈｂとグルコサミンの反応からのアミド（ααβ８２−β′８２：グルコサミン）は架橋されたβ鎖については３２，０７３．４１±１．２７の質量（計算値３２，０７４）および未修飾のα鎖については１５，１２８．４５± １．１２の質量を示した。実施例９ＴＴＤＳ−架橋Ｈｂ（ＤＢＳＴＨｂ）の他のアシル化反応リジン、グリシン（ｇｌｙ）−グリシン−グリシン、ノルエピネフリンおよび α−（１−ニコチンアミド）アセチルヒドラジドをＴＴＤＳ−架橋Ｈｂと反応させ、次いで上記実施例７でビオチン誘導体について記述した手法にしたがって、生成するアミドのクロマトグラフによる分析と単離を行なった。アシル化反応の速度は添加される種の求核性と濃度に依存する。求核性試薬の高い固有の反応性と高い濃度がヘモグロビン付加物の競争加水分解反応の程度を最小限度にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ザユニバーシティーオブトロントイノベーションズファウンデーションカナダ国、エム５ジー２エル３、オンタリオ、トロント、ユニバーシティアベニュー 525

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘモグロビンを次の一般式に相当する架橋剤式中、Ｙは脂肪族、芳香族または脂環族の炭化水素基を表わし、Ｘ、ＹおよびＺは同じでも良いし、または異なっていても良く、各々はかさ高で、芳香族の求電子性陰イオン離脱基を表わす、と反応させることから成る、それそれのβサブユニット上の８２番のリジンの一級アミノ基の間に架橋を有する特異的に架橋された四量体であるヘモグロビンの製造方法。２．架橋剤が次の一般式に相当する請求の範囲第１項記載の方法式中、Ｘ′、Ｙ′およびＺ′は同じでも良いし、または異なっていても良く、各々は少なくとも二つの電子求引性の基を持っている芳香族の核から必須的に成る求電子性陰イオン離脱基を表わす。３．電子求引性の基がハロゲンおよびカルボキシレート並びにそれらの組み合わせより成る群れから選ばれる請求の範囲第２項記載の方法。４．橋剤がトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）である請求の範囲第３項記載の方法。５．ヘモグロビンがヒトのデオキシヘモグロビンとヒトの一酸化炭素ヘモグロビンより成る群れから選ばれる請求の範囲第４項記載の方法。６．形成される特異的に架橋されたヘモグロビンがトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）の残基から導かれる遊離のカルボキシル基を含んでいる請求の範囲第５項記載の方法。７．遊離のカルボキシル基を外因性の求核性試薬と反応させる次の工程をさらに含んでいる請求の範囲第３項記載の方法。８．外因性の求核性試薬がアミンである請求の範囲第７項記載の方法。９．ヘモグロビンが動物のデオキシヘモグロビンと動物の一酸化炭素ヘモグロビンより成る群れから選ばれる請求の範囲第４項記載の方法。１０．それぞれのβサブユニット上の予定された一級アミノ基の間を伸張し、しかもそれらに共有結合している架橋基を有し、該架橋基はさらに外因性の求核性試薬との反応に利用できるカルボキシル基を含んでいる特異的に架橋された四量体であるヘモグロビン。１１．架橋基がそれぞれのβサブユニット上の８２番のリジンの一級アミノ基の間を伸張し、しかもそれらに共有結合している請求の範囲第１０項記載の特異的に架橋された四量体であるヘモグロビン。１２．架橋基がトリメソイル＝トリス（３，５−ジブロモサルチレート）と該一級アミノ基の反応の残基である請求の範囲第１１項記載の特異的に架橋された四量体であるヘモグロビン。