JPH0348658A - バイオポリマーおよびエフエクター物質からの化合物およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアミノ基がマレイミド基にそしてカルボキシル
基が活性エステル基に変換されている光学活性なアミノ
酸誘導体の助けにより結合されるバイオポリマーおよび
エフェクター物質から得られる化合物に関する。

ペプチドまたはタンパク質のようなバイオポリマーおよ
びマーカーもしくはエフェクター物質まＩ；は化学的共
有結合による特異的結合パートナ−から製造することの
できる接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が診断および治療
の分野において必要とされている。これらのカップリン
グにおいて用いられる好ましい方法は互いに結合される
成分の特性がカップリングによってまったく変化されて
いないか、でなければ所定のやり方で変化されているよ
うな方法である。酵素イムノアッセイの分野からのタン
パク質接合体の製造に関する既知方法の総説がＩｓｈｉ
ｋａｗａらの論文（Ｊ、　　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、
　２４．２０９〜３２７（１９８３年））に記載されて
いる。免疫毒素の製造方法は例えばＧｈｏｓｅらの総説
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖ
ｏｌ。

９３　２８０〜３３３（１９８３年））に列挙されてい
る。異種二価性試薬を用いる接合体の製造方法はカップ
リングするパートナ−の特異的な制御された結合を可能
にする。タンパク質接合体の場合、ＳＨ基とアミノ基の
結合が確立されている方法がもし反応が正しく行なわれ
るならば副反応のおそれが低いため重要な役割を果たす
。この場合、好ましくはマレイミド、ハロアルキルまた
はｂロアシルおよび活性エステル構造を有する架橋剤が
用いられる。これまで開示されている架橋剤はブリッジ
中にキラルな炭素原子を有しないためブリッジ中に所定
のキラル構造を有する接合体の生成には不適当であった
。その上、短鎖ブリッジング成分を有する架橋剤の場合
、その架橋剤の極性を要求される特定の条件に適合する
ことができない。

本発明の目的は診断および治療のために重要なバイオポ
リマーおよびエフェクター物質からの接合体を立体的に
定義された形態で提供することであり、そして架橋剤は
長さ、易動度（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）および極性に関して
カップリングされる成分の最適カップリング条件に適合
する必要がある。さら５こ、カップリング中に形成した
ブリッジは十分に安定でありそして好適にはあらかじめ
決められた方法で開裂されうる。

すなわち、本発明は式（１） （式中、Ｃ町よ不斉炭素原子であり、 Ｒは天然アミノ酸の側鎖、メチオニンスルホンの側鎖ま
たはシスティン酸の側鎖であり、Ｘはチオールカップリ
ング成分の基でありそして Ｙはアミノカップリング成分の基である）で表わされる
接合化合物に関する。

チオールカップリング成分Ｘ−５Ｈおよびアミノカップ
リング成分Ｙ−ＮＨｔがそれぞれタンパク質である化合
物が好ましい。

Ｘ−５Ｈが酵素、抗体または抗体フラグメントでありそ
してＹ−旧【、が酵素、抗体または抗体フラグメントで
ある化合物が特に好ましい。

酵素はペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたは
ホスファターゼでありそして抗体または抗体フラグメン
トはウサギ、ヒツジ、ヤギまたはマウスから由来するも
のである化合物がとりわけ好ましく、ＣＥＡ％ＡＦＰ、
　ＨＣＧ、　ＴＳＨおよびＨＢｓＡｇに対する抗体また
は抗体７ラグメントが特に好ましい。

Ｒがアミノ酸のアラニン、メチオニンスルホンまたはシ
スティン酸そしてとりわけ好ましくはアミノ酸のアラニ
ンの側鎖である化合物がさらに好ましい。

本発明はまた最初の反応段階においてアミノ成分Ｍ、−
Ｎ）＋２を式（ＩＩ） （式中、Ｃ”ｌま不斉炭素原子であり、Ｒは式（Ｉ）で
定義したとおりでありそしてＲ１は水素または式（Ｉ［
［） （式中　Ｒ３は水素またはＣ１−４のアルキルである）
で表わされる基である） で表わされる化合物の官能性活性エステル基と反応させ
ることによりアミドを生成させそしてマイケル付加によ
る第２反応段階においてチオール成分Ｘ−５Ｈを式（Ｉ
ｔ）の化合物のマレイミド基と反応させることによりチ
オエーテルを生成させることからなる式（Ｉ）の化合物
の製造方法に関する。

本発明はさらに式（■）（式中、ＲおよびＲ１は上記で
定義したとおりである）の化合物に関する。

この場合において好ましい化合物はＲがアミノ酸のアラ
ニン、メチオニンスルホンまたはシスティン酸そしてと
りわけ好ましくはアミノ酸のアラニンの側鎖である化合
物である。

本発明はまた式（１）の化合物の分析、診断または治療
のための使用に関する。この点については、酵素イムノ
アッセイにおける使用が好ましい。

本発明は最後に式（ｎ）の化合物の式（１）の化合物の
製造における使用に関する。

式（ＩＩ）のカップリング剤の製造において、例えば当
業者に知られた方法によりマレイミド基が形成される、
すなわち、第１級アミノ基を無水マレイン酸と反応させ
そして生成したマレオイル誘導体を水の脱離を伴う環化
によってマレイミド誘導体（マレオイル誘導体）が得ら
れる［ＫｅｌｌｅｒおよびＲｕｄ　ｉｎｇｅｒのＨｅ１
ｖｅｔｉｃａ　ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ　５８．５３１
−５４１　（１９７５年）　ＨＲｉｃｈらのＪ、　Ｍｅ
ｄ。

Ｃｈｅｍ、　１８．　１００４−１０１０　（１９７５
年）〕。

〕Ｎ−ヒドロキンスクシンイミまたはスルポーＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル基は例えばカルボキシル
基およびＮ−ヒドロキシスク／ンイミドまたはそのスル
ホン誘導体からの水の脱離によりそしてカルボジイミド
のような試薬を用いて生成される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら
のＪ、　　ＡｍＣｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　８６．１８３
９以下参照（１９６４年）〕。

側５Ｊ４Ｒがマレイミド基または活性エステル基の生成
条件下で副反応が起るような基を含有する場合、これら
の副反応を防止するためそこで適当な置換または修飾を
行なわなければならない。アミノ酸のメチオニンから誘
導された試薬において、酸化−感受性のチオエーテル官
能基は例えはスルホン基に変換されるが、この場合、さ
らに得られた化合物の水における溶解度が改善されると
いう利点が生じる。システィンの場合、水に容易に溶解
しうるＳＨ−保護基例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ
）保護基が用いられ、またはさらに有利にはＳＨ基を酸
化してシスティン酸の生成を伴なってスルポン酸基とし
、コレヲスノ１ホン酸塩としてその相当する異種二価性
試薬の合成に用いることができる。リジンまたはオルニ
チンの場合、タンパク質−修飾試薬として極性で酸安定
性のアミノ−保護基例えばメチルスルホニルオキシカル
ボニル（Ｍｓｃ）　基ｋ　用いるのが好ましい。好適に
はアミノ酸側鎖の保護基は、最初の２つのカップリング
用パートナを結合した後に側鎖上の保護基をその用途に
要求されるカップリング用パートナ−の性質を破壊する
ことなく脱離することができるように選択される。例と
してアミノ−保護基としてのＭｓｃ保護基またはチオー
ルの保護のためのチオピリジル基の使用が挙げられる。

どちらの保護基も多くの場合タンパク質−タンパク質接
合体においてタンパク質を害することなく除去すること
ができる。チオールの保護の場合、遊離されたチオール
官能基は第３のカップリング成分を導入するのに用いる
ことができる。

式（Ｕ）の化合物は当業者に知られている方法による接
合体の製造に使用することができる。

酵素イムノアッセイの分野におけるタンパク質接合体の
製造方法の一覧が例えばＩｓｈｉｋａｗａらのＪ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　　４　、２０９〜３２７　（
１９８３年）に記載されている。免疫毒素の製造方法は
例えばＧｈｏｓｅらのＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏ、ｇｙ、　　Ｖｏｌ、　　９３゜２８０〜３
３３　（１９８３年）に列挙されている。

２つの官能基の間のブリッジ中にキラル炭素原子を有す
る試薬のイムノアッセイにおける使用は開示されていな
い。ブリッジ中に構造−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃｏ−を有す
る誘導体はそれ自体この系列の最も単純な構成員として
示される。このようなマレイミドおよびスクシンイミド
エステルまたはスルホスクンンイミドエステル基を有す
る試薬は予想されるように分子中の疎水性部分が小さい
ため容易に水に溶解しうる。それは上記したようにアミ
ノ酸のアラニンがら製造ｔ　ａことができる。

構成式（Ｉ［）を有する試薬は有利にはイムノアッセイ
において免疫グロブリンと標識酵素を結合するのに使用
することができる。

この場合、チオール基は例えば免疫グロブリンに導入（
ｌｓｈｉｋａｗａら、　１９８３年）することができ、
マレイミド基は酵素のアミノ基と反応させることにより
標識酵素に導入することができそして過剰の試薬を除去
した後、この修飾された免疫グロブリンをカップリング
のために修飾酵素と反応させることができる。

反応を達成する別法として、マレイミド基は免疫グロブ
リンのアミン基を構造式（ＩＩ）の試薬と反応させるこ
とにより導入することができそして探識酵素（例えばＥ
、　　ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ）中にすで
に存在するチオール基ど、または２−イミノチオランの
ような試薬との反応により導入されたチオール基とカン
プリングのために反応させることができる。

免疫グロブリンのＦａｂ’中のヒンジチオールを酵素を
構造式（ｎ）の試薬と反応させることにより得られる酵
素中のマレイミド基と反応させる場合、接合反応（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔ　１ｏｎ）は結合部位そしてまた化学量論
に関して特に特異的な方法で行なうことができる。次に
酵素のカップリングがバラトープ（ｐａｒａＬｏｐｅ）
と反対側のＦａｂ’の末端で行なわれる。類似のケース
として、チオール基は免疫グロブリンのヒンジ部におい
てＮ　元剤により生しさせることができそして酵素のマ
レイミド基と反応させることができる。架橋剤のブリッ
ジング成分における短い距離および低い柔軟性を考慮し
て、あるタンパク質のアミン基が他のタンパク質中のア
ミノ酸のシスティンのＳＨ基と容易に結合することがで
きるということは驚ろくべきことであった。

以下の実施例を用いて構造式（ｎ）の化合物の製造、お
よび構造式（１）の化合物の製造におけるその使用を説
明する。

実施例　ｌ マレオイル−Ｌ−アラニンの製造 Ｌ−アラニン（２６，７ｇ、０．３０モル）を氷酢酸（
３００ｍ１２）中における無水マレイン酸（２９，４ｇ
、０．３０モル）の撹拌された溶液に加えた。３時間の
撹拌後、反応生成物をろ去し、乾燥しそしてアセトン／
ヘキサンから再結晶した。さらに母液を濃縮することに
より結晶が得られた。総収量は３３ｇ（６０％）であっ
た。生成物の融点は１４２〜１４４℃であった。

実施例　２ マレオイル−Ｌ−アラニンの製造 マレオイル−Ｌ−アラニン（４９，２１ｍｍｏｆｆ）　
全乾燥トルエン（１５０ｍ＋２）中で懸濁し、トリエチ
ルアミン（４ｍＱ）を加え、次いで混合物を撹拌しなが
らウォータートラップを用いて還流下６時間沸騰させた
。熱溶液を次にデカンテーションしてオレンジ色の残留
物を得、これを冷却した後ロータリーエバポレーターで
濃縮乾固した。塩酸でｐＨ３に調整した５０ｍＱの水を
粘性の残留物に加え、これをそれぞれ５ｏＴＡａの酢酸
エチルを用いてｐＨ３で５回抽出（各回ともｐＨを再調
整する）した。合一した酢酸エチル相をロータリーエバ
ポレーターで濃縮乾固しそして得られた固体状生成物を
一晩高真空下で乾燥した。収量１．２５９’Ｈ−ＮＭＲ
（２００Ｍ）Ｉｚ、　ＣＤＣＬ；　ＴＭＳ）：　Ｊ　１
．６５　（ｄ。

３Ｈ，Ｉ　＝７．４　Ｈ２，ＣＨ３）、４．８２　（ｑ
、、ｌＨ，Ｉ＝７．４Ｈｚ、　ＣＨ）、６．７４　（ｓ
、　２Ｈ，マレイミド）、８．３０（ｂｓ。

Ｃ００Ｈ）。

実施例　３ マレオイル−Ｌ−アラニン−Ｎ−ヒドロキンスクシンイ
ミドエステル（ＭＡＳ） マレオイル−し−アラニン（２００ｍｇ、１．２．ｔ＋
ｒｖｏＱンおよびＮ−ヒドロキンスクシンイミド（１５
（１＋＋ｇ、１．３ミリモル）をテトラヒドロフラン中
に溶解した。テトラヒドロフラン（ｌ　ｍ１２）中にお
けるシンクロヘキシルカルボジイミド（２５５Ｂ、１．
２ミリモル）の溶液を０°Ｃまで冷却された溶液に撹拌
しながら滴加しそして撹拌を４°Ｃで一晩継続した。得
られた懸濁液をろ去しそしてろ液をロータリーエバポレ
ーターで濃縮乾固した。残留物を２＋ｌＩＱのテトラヒ
ドロフラン中で再懸濁しそして懸濁液をＰ４ガラスフリ
ットを通してろ過した。ろ液をロータリーエバポレータ
ーで′ａ縮乾固しそして得られた固体状生成物を高真空
下で乾燥した。収量３３０ｍｇ ’Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ｃＤｃＱ、；　　ＴＭＳ
）：　　δ１．７７　　（ｄ。

３ＨＩ　＝７．４　Ｈ２，ＣＨ３）、２．８４　（ｓ、
　４Ｈ，スクシンイミジル）　、５．１７　（ｑ、　１
Ｂ、　　Ｉ　＝７．４　Ｈｚ、　ＣＨ）、６．８０　（
ｓ、　２Ｈ，マレイミド）。

実施例　４ マレイミド−抗体の製造 ａ）試薬 実施例３に従って製造されたＭＡＳを用いた。

ホウ酸（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、オーダーＮｏ、１６５）　
、ジオキサ７　（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、オーダーＮ０．３
１１０）、水酸化リチウム（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、オーダ
ーＮｏ、１１６５２）。

ｂ）溶液の調製 一ホウ酸リチウム緩衝液（ｐＨ８，５）ホウ酸（１，２
４ｇ）を水（８０ｍ（２）およびジオキサン（２０ｍＱ
）の混合物中で撹拌した。ホウ酸を溶解しながら固体の
水酸化リチウムを加えてｐｎを調整して８．５とした。

−ＩＩＡｓ溶液 ＭＡＳ（０，０１２４９）をジオキサン（１ｍ１２）中
に溶解し　Ｉこ　。

一リン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０） リン酸二水素ナトリウム−水和物（４１，４ｇ）および
Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ（５−５８ｉ＋）を水（３Ｑ）中に
溶解した。水酸化ナトリウム溶液を用いてｐ）Ｉを調整
して６．０とした。

Ｃ）マレイミド−抗体の製造 接合されるべき抗体（１／１５ＭＩＪン酸塩緩衝化生理
的食塩水２ＳｍＱ中における濃度４ｇ／Ｑ）をホウ酸リ
チウム緩衝液（２５＋＋１２）と混合した。得られた溶
液（ｐＨ７，５）に０．４５ｍＱのＭＡＳ溶液（ＩｇＧ
より３０倍モル過剰のＭＡＳに相当する）を撹拌しなが
ら加えた。室温で１時間インキュベーションした後、リ
ン酸塩Ｍｋ衝液（ｐＨ６，０）で平衡化した５ｅｐｈａ
ｄｅｘＧ−２５カラム上におけるゲルろ過により過剰゛
の試薬を除去した。

実施例　５ チオール−ペルオキシダーゼの製造 ａ）試薬 ペルオキシダーゼ（純度１．　　Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、オーダーＮｏ、８１５４６２）、２
−イミノチオラン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、オーダーＮｏ、
６２５６）、メタノール（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、オーダー
Ｎｏ、６００９）、四ホウ酸二ナトリウムｌＯ水和物（
Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ、オーダーＮｏ、６３０８） ｂ）溶液 一ホウ酸ナトリウム溶液 四ホウ酸二ナトリウム（０，９５２ｇ）を水（１００ｍ
Ｑ）中に溶解した。

−イミノチオラン溶液 ２−イミノチオラン（０，６８８ｇ）をメタノール（５
ｍ１２）中に溶解した。

Ｃ）チオールーベルオキンダーゼの製造ペルオキシダー
ゼ（１６０ｍｇ）をホウ酸ナトリウム緩衝液中に溶解し
そしてイミノチオラン溶液と混合した。反応混合物を室
温で２時間インキュベーションした後、リン酸塩緩衝液
（ｐＨ６，０）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５カラム（実施例４、セクションｂ））上におけるゲル
クロマトグラフィーにより過剰の試薬を除去した。

実施例　６ ベルオキシダーゼ／抗体接合体の製造 ａ）試薬 実施例４および５記載のマレイミド−抗体およびチオー
ル−ペルオキシダーゼ、　ＴＲｌ５　（Ｅ。

Ｍｅｒｃｋ、オーダーＮｏ、９３８２）ｂ）溶液 −ＴＩｌ？ｌＳ緩衝液（ｐＨ７，４） ＴＲＩＳ（１８，１７９）を水（３Ｑ）中に溶解しそし
てｐｉをＨＣｆ２で７，４に調整した。

Ｃ）ベルオキシダーゼ／抗体接合体の製造マレイミド−
抗体溶液およびチオール−ペルオキシダーゼ溶液（抗体
のペルオキシダーゼに対するモル比は１：５）を混合し
た。室温で２時間インキュベーションした後、　ｌ／１
０容量のＮＥＭ溶液を加えて反応を中止した。２０分間
のインキュベーション後、丁１？Ｉｓ緩衝液で平衡化し
た５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム上におけるゲルク
ロマトグラフィーにより過剰の試薬を除去した。

ｄ）接合体の性質 残留する遊離の抗体はＤｕＰｏｎｔ　ＧＦ−２５０カラ
ム上におけるクロマトグラフィーによる１（ＰＬＣ分析
では検出されなかった。ポリクローナル抗体を用いた各
種の接合体を比較した場合、光学分析によりペルオキシ
ダーゼの抗体に対するモル比が２５±０．５の時接合体
ピークが得られた。単クローン性抗体の場合、モル比は
１．５１〜３．５１の範囲で変化することができる。接
合体は特定のアッセイに特異的に用いられる希釈度で酵
素イムノアッセイに直接使用することができる。ゲルク
ロマトグラフィーによる接合体の分別は幾つかの場合に
おいて接合体の特異的反応を改良する。

実施例　７ マレイミドーベルオキンダーゼの製造 ａ）試薬および溶液 Ｎ−エチルモルホリン（９８％純度、Ｒｉｅｄｅｌ　ｄ
ａＨａｅｎ　、オーダーＮｏ、６２０５０）、Ｎ、Ｎ−
ジメチルポルムアミド（Ｒｉｅｄｅｌ　ｄｅ　Ｈａｅｎ
、オーダーＮｏ、　１５４４０）、実施例４〜６記載の
他のすべての試薬および溶液。

ｂ）マレイミド−ペルオキシダーゼの製造ペルオキシダ
ーゼ（１ｇ）を水（６，５ｍ（２）中に溶解した。ジオ
キサン（３，５ｍ＜１）をこの溶液中に混入した。ｐｔ
＋をエチルモルホリンで８．５に調整した。

この溶液をジメチルホルムアミ）’　（０，５＋＋＋ｉ
２）　中ＩニーおけるＭＡｓ（２４ｍｇ）の溶液と混合
した。室温で１時間インキュベーションした後、緩衝液
を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５上におけるゲルろ過によ
りリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）に変えた。

実施例　８ Ｆａｂ’−３Ｈの製造 ヒンジ部に遊離のＳＨ基を有するＦａｂ’を既知の方法
ＣＩｓｈｉｋａｗａらのＪ　、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ　４　、２０９〜３２７　（１９８３年）〕によって
製造した。このために、ペプシンを用いてＩｇＧを開裂
してＦ（ａｂ’）２とした。

１’（ａｂ’）２におけるヒンジのジスルフ斗ドブリッ
ジをメルカプトエチルアミン ル／ジスルフィド交換により還元してチオールとした。

反応混合物から過剰のチオールを除きそして緩衝液をゲ
ルろ過によりリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に変えた。

実施例　９ Ｆａｂ’／ペルオキシダーゼ接合体の製造実施例８かも
得られたＦａｂ’−ＳＨ（２０ｍ（２のリン酸塩緩衝液
中１　００ｍｇ、ｐＨ６．０）を実施例７から得られ／
ニマレイミドーペルオキンダーゼＣＩＯｍ＋２のリン酸
塩緩衝液中−５００ｍ９、ｐＨ６．０）と混合しそして
混合物を３７°Ｃで１時間インキュベートｌ−だ。生成
した接合体を残留するＦａｂ’−ＳＫＩと過剰のペルオ
キシダーゼからＵＩＬｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ　４４（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）上におけるゲルクロマトグラフィ
ーにより分離した。溶離剤としてはＴＲＩＳ緩衝液（　
ｐ　ｌ＋７、４）を用いた。ウサギの抗体の場合、ゲル
クロマトグラフィーにおいてＦａｂ’とベルオキンダゼ
の（１＋１）付加物に相当する接合体が主要部分で溶離
した。生成物はこのアッセイに特異的に用いられる希釈
度で酵素イムノアッセイに直接使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｃ＾＊は不斉炭素原子であり、 Ｒは天然アミノ酸、メチオニンスルホンまたはシステイ
   ン酸の側鎖であり、 Ｘはチオールカップリング成分の基でありそして Ｙはアミノカップリング成分の基である） で表わされる接合化合物。 ２）チオールカップリング成分Ｘ−ＳＨおよびアミノカ
   ップリング成分Ｙ−ＮＨ＿２がそれぞれタンパク質であ
   る請求項１記載の化合物。 ３）Ｘが酵素、抗体または抗体フラグメントでありそし
   てＹが酵素、抗体または抗体フラグメントである請求項
   ２記載の化合物。 ４）Ｒがアミノ酸のアラニン、メチオニンスルホンまた
   はシステイン酸そして好ましくはアミノ酸のアラニンの
   側鎖である請求項１記載の化合物。 ５）最初の反応段階においてアミノ成分Ｙ−ＮＨ＿２を
   式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｃ＾＊は不斉炭素原子であり、 Ｒは天然アミノ酸の側鎖、メチオニンスルホンの側鎖ま
   たはシステイン酸の側鎖であり、官能性マレイミドまた
   は活性エステル基の製造において副反応を導く側鎖は官
   能性マレイミドまたは活性エステル基の製造における副
   反応が防止されるように変換され、そして Ｒ＾１は水素または式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｒ＾３は水素またはＣ＿１＿−＿４のアルキル
   である）で表わされる基である）で表わされる化合物の
   官能性活性エステル基と反応させることによりアミドを
   生成させそしてマイケル付加による第２反応段階におい
   てチオール成分Ｘ−ＳＨを式（II）の化合物のマレイミ
   ド基と反応させることによりチオエーテルを生成させる
   ことからなる請求項１記載の化合物の製造方法。 ６）請求項５記載の式（II）（式中、ＲおよびＲ＾１は
   上記で定義したとおりである）の化合物。 ７）Ｒがアミノ酸のアラニン、メチオニンスルホンまた
   はシステイン酸そして好ましくはアミノ酸のアラニンの
   側鎖である請求項６記載の化合物。 ８）請求項１記載の化合物の分析、診断または治療のた
   めの使用。 ９）請求項１記載の化合物の酵素イムノアッセイにおけ
   る使用。 １０）請求項６記載の化合物の請求項１記載の化合物の
   製造における使用。