JPH0160780B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は新規なヒトα型インターフエロン抗体
の製造法に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合
IUPAC、IUBの規定或いは当該分野における慣
用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。ま
たアミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければL体を示すものとする。 Ser:セリン Leu:ロイシン Thr:スレオニン Asn:アスパラギン Gln:グルタミン Glu:グルタミン酸 Arg:アルギニン Lys:リジン Tyr:チロシン OB2l:ベンジルオキシ基 Z:カルボベンゾキシ基 NHS:N−ヒドロキシコハク酸イミド基 Tos:p−トルエンスルホニル基 Bos:第3級ブトキシカルボニル基 インターフロンは、生体の細胞がウイルス感染
を受けた時に産生する抗ウイルス性糖蛋白質乃至
は蛋白質であり、その利用によればウイルス性疾
患の予防または治療が可能であるとされ、近年注
目を集めつつある。現在解明されているヒトのイ
ンターフエロンは、β型インターフエロン
(Fibro blast interferon)、α型インターフエロ
ン(Leucocytes interferon、Lympho blastoid
interferon)及びγ型イターフエロン(Immune
interferon)に分類される。しかしながらこれら
のインターフエロンを単一な糖蛋白質乃至は蛋白
質にまで糖製する技術は未だ確立されていない。 本発明者らはヒトのα型インターフエロンに対
して特異的に反応する抗体を利用すれば、抗原−
抗体反応によつてヒトα型シンターフエロンを精
製出来ると考え、この着想から感度よくヒトα型
インターフエロンを選択し、該インターフエロン
に対して特異的反応性を示す坑体を得るべく鋭意
研究を進めてきた。その過程において、ヒトα型
インターフエロンの1種であるヒトリムホブラス
トイドインターフエロンのC末端ペプチド鎖を有
するある種のペプチドを合成し、これをハプテン
として抗原を合成するに成功し、該抗原からヒト
α型インターフエロンに対し特異的反応性を有す
る所望の抗体が収得できることを見出した。本発
明はこの新しい知見に基づき完成されたものであ
る。 即ち本発明は、一般式 R−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−Glu
−OH (1) 〔式中Rは水素原子、H−Thr−Asn−Leu−
Gln基、H−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln基、又はH−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−
Asn−Leu−Gln基を示す。〕 で表わされるヒトリムホブラストイドインターフ
エロンのC末端ペプチドからなる群から選ばれた
化合物と、担担体との複合体からなるヒトα型イ
ンターフエロン抗原を哺乳動物に投与し、生成す
る抗体を採取することを特徴とするヒトα型イン
ターフエロン抗体の製造法に係る。 本発明によれば、入手容易な市販のアミノ酸を
利用して簡単な操作で容易に合成できる上記一般
式(1)で表わされるペプチドと、通常担体とからな
り、認識部位が明確でしかも大量に製造され得る
上記特定のヒトα型インターフエロン抗原を用い
ることに基づいて、天然のα型インターフエロン
を抗原とする場合に比し、大量にしかも安定して
ヒトα型インターフエロンに対し特異性の高い抗
体を収得できる。かくして得られる抗体は、これ
を例えばアフイニテイクロマトグラフイー用担体
と結合させて、該クロマトグラフに利用してヒト
α型インターフエロンの糖製に有用である。 上記一般式(1)で表わされるペプチドは、ヒトリ
ムホブラストイドインターフエロンのC末端ペプ
チド鎖に相当するペプチドである。これは通常の
ペプチド合成法、具体的には、「ザペプチド
(Thr Peptides)」第1巻(1966年)〔Schro¨der
and Luhke著、Academic press、New York、
U.S.A.〕あるいは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、
丸善株式会社(1975年)〕に記載される如き方法
に従い、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル
法(p−ニトロフエニルエステル法、N−ヒドロ
キシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエ
ステル法等)、ウツドワード試薬Kを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC/
アデイテイブ(HONB、HOBt、HOSu)法など
により製造できる。上記方法においては、固相合
成法及び液相合成法のいずれをも適用できるが、
液相合成法が好ましい。通常ペプチドは、上記し
た一般のポリペプチドの合成法に従い、例えば末
端アミノ酸に順次1個づつアミノ酸を縮合させる
所謂ステツプワイズ法により、又は数個のフラグ
メントに分けてカツプリングさせていく方法によ
り製造される。より詳細には上記ペプチドは、そ
の結合の任意の位置で2分される2種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料とを、ペプチド合成の常
套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有
する場合、その保護基を常套手段で脱離させるこ
とにより製造し得る。 上記ペプチドの合成反応工程でリジンは通常保
護しておくのが望ましい場合が多い。また上記反
応の最終工程では、通常ペプチドの構成アミノ酸
残基の少なくとも一つが保護された保護ペプチド
からすべての保護基を脱離する。更に上記合成反
応工程では、反応に関与すべきでない官能基は、
通常の保護基により保護され、反応終了後保護基
は脱離される。また反応に関与する官能基は、通
常活性化される。之等各反応方法は公知であり、
それに用いられる試薬等も公知のものから適宜選
択し得る。 アミノ基の保護基としては、例えばカルボベン
ゾキシ、tert−ブチルオキシカルボニル、tert−
アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカ
ルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル、2−クロル−ベンジルオキシカルボニル、ア
ダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、o−ニトロフエニル
スルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイルな
どが挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は、例えばアルキルエステル(例メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、tert−ブチルなどのアル
キルエステル)、ベンジルエステル、p−ニトロ
ベンジルエステル、p−メトキシベンジルエステ
ル、p−クロルベンジルエステル、ベンズヒドリ
ルエステル、カルボベンゾキシヒドラジド、tert
−ブチルオキシカルボニルヒドラジド、トリチル
ヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。 アルギニンのグアニジノ基保護基としては、例
えばニトロ、トシル、p−メトキシベンゼンスル
ホニル、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシ
カルボニル、アダマンチルオキシカルボニル等が
挙げられる。また、そのグアニジノ基は適当な酸
例えばベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン
酸、塩酸、硫酸などの塩の形で保護してもよい
い。 スレオニン及びセリンの水酸基は、例えばエス
テル化またはエーテル化によつて保護することが
できるが必ずしも保護する必要はない。このエス
テル化に適する基としては、例えばアセチル等の
低級アルカノイル、ベンゾイル等のアロイル、ベ
ンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボ
ニル等の炭酸から誘導される基等が挙げられる。
またエーテル化に適する基としては、例えばベン
ジル、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル等で
ある。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル(メチルアルコ
ール、エチルアルコール、ベンジルアルコール、
ペンタクロロフエノール、p−ニトロフエノー
ル、N−ヒドロキシサクシンイミド、N−ヒドロ
キシベンズトリアゾール、N−ヒドロキシ−5−
ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等と
のエステル)等が挙げられる。尚ペプチド結合形
成反応は、縮合剤例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、カルボジイミダゾール等のカルボジイ
ミダド試薬やテトラエチルピロホスフイト等の存
在下に実施し得る場合もある。 上記一般式(1)で表わされるペプチドは、Rで示
される基の種類に応じて、より具体的には以下に
示す〔〕〜〔〕の方法に従い製造される。 〔〕 Rが水素原子を示す場合
の製造法に関する。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合
IUPAC、IUBの規定或いは当該分野における慣
用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。ま
たアミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければL体を示すものとする。 Ser:セリン Leu:ロイシン Thr:スレオニン Asn:アスパラギン Gln:グルタミン Glu:グルタミン酸 Arg:アルギニン Lys:リジン Tyr:チロシン OB2l:ベンジルオキシ基 Z:カルボベンゾキシ基 NHS:N−ヒドロキシコハク酸イミド基 Tos:p−トルエンスルホニル基 Bos:第3級ブトキシカルボニル基 インターフロンは、生体の細胞がウイルス感染
を受けた時に産生する抗ウイルス性糖蛋白質乃至
は蛋白質であり、その利用によればウイルス性疾
患の予防または治療が可能であるとされ、近年注
目を集めつつある。現在解明されているヒトのイ
ンターフエロンは、β型インターフエロン
(Fibro blast interferon)、α型インターフエロ
ン(Leucocytes interferon、Lympho blastoid
interferon)及びγ型イターフエロン(Immune
interferon)に分類される。しかしながらこれら
のインターフエロンを単一な糖蛋白質乃至は蛋白
質にまで糖製する技術は未だ確立されていない。 本発明者らはヒトのα型インターフエロンに対
して特異的に反応する抗体を利用すれば、抗原−
抗体反応によつてヒトα型シンターフエロンを精
製出来ると考え、この着想から感度よくヒトα型
インターフエロンを選択し、該インターフエロン
に対して特異的反応性を示す坑体を得るべく鋭意
研究を進めてきた。その過程において、ヒトα型
インターフエロンの1種であるヒトリムホブラス
トイドインターフエロンのC末端ペプチド鎖を有
するある種のペプチドを合成し、これをハプテン
として抗原を合成するに成功し、該抗原からヒト
α型インターフエロンに対し特異的反応性を有す
る所望の抗体が収得できることを見出した。本発
明はこの新しい知見に基づき完成されたものであ
る。 即ち本発明は、一般式 R−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−Glu
−OH (1) 〔式中Rは水素原子、H−Thr−Asn−Leu−
Gln基、H−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln基、又はH−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−
Asn−Leu−Gln基を示す。〕 で表わされるヒトリムホブラストイドインターフ
エロンのC末端ペプチドからなる群から選ばれた
化合物と、担担体との複合体からなるヒトα型イ
ンターフエロン抗原を哺乳動物に投与し、生成す
る抗体を採取することを特徴とするヒトα型イン
ターフエロン抗体の製造法に係る。 本発明によれば、入手容易な市販のアミノ酸を
利用して簡単な操作で容易に合成できる上記一般
式(1)で表わされるペプチドと、通常担体とからな
り、認識部位が明確でしかも大量に製造され得る
上記特定のヒトα型インターフエロン抗原を用い
ることに基づいて、天然のα型インターフエロン
を抗原とする場合に比し、大量にしかも安定して
ヒトα型インターフエロンに対し特異性の高い抗
体を収得できる。かくして得られる抗体は、これ
を例えばアフイニテイクロマトグラフイー用担体
と結合させて、該クロマトグラフに利用してヒト
α型インターフエロンの糖製に有用である。 上記一般式(1)で表わされるペプチドは、ヒトリ
ムホブラストイドインターフエロンのC末端ペプ
チド鎖に相当するペプチドである。これは通常の
ペプチド合成法、具体的には、「ザペプチド
(Thr Peptides)」第1巻(1966年)〔Schro¨der
and Luhke著、Academic press、New York、
U.S.A.〕あるいは「ペプチド合成」〔泉屋ら著、
丸善株式会社(1975年)〕に記載される如き方法
に従い、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル
法(p−ニトロフエニルエステル法、N−ヒドロ
キシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエ
ステル法等)、ウツドワード試薬Kを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC/
アデイテイブ(HONB、HOBt、HOSu)法など
により製造できる。上記方法においては、固相合
成法及び液相合成法のいずれをも適用できるが、
液相合成法が好ましい。通常ペプチドは、上記し
た一般のポリペプチドの合成法に従い、例えば末
端アミノ酸に順次1個づつアミノ酸を縮合させる
所謂ステツプワイズ法により、又は数個のフラグ
メントに分けてカツプリングさせていく方法によ
り製造される。より詳細には上記ペプチドは、そ
の結合の任意の位置で2分される2種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料とを、ペプチド合成の常
套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有
する場合、その保護基を常套手段で脱離させるこ
とにより製造し得る。 上記ペプチドの合成反応工程でリジンは通常保
護しておくのが望ましい場合が多い。また上記反
応の最終工程では、通常ペプチドの構成アミノ酸
残基の少なくとも一つが保護された保護ペプチド
からすべての保護基を脱離する。更に上記合成反
応工程では、反応に関与すべきでない官能基は、
通常の保護基により保護され、反応終了後保護基
は脱離される。また反応に関与する官能基は、通
常活性化される。之等各反応方法は公知であり、
それに用いられる試薬等も公知のものから適宜選
択し得る。 アミノ基の保護基としては、例えばカルボベン
ゾキシ、tert−ブチルオキシカルボニル、tert−
アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカ
ルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル、2−クロル−ベンジルオキシカルボニル、ア
ダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、o−ニトロフエニル
スルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイルな
どが挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は、例えばアルキルエステル(例メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、tert−ブチルなどのアル
キルエステル)、ベンジルエステル、p−ニトロ
ベンジルエステル、p−メトキシベンジルエステ
ル、p−クロルベンジルエステル、ベンズヒドリ
ルエステル、カルボベンゾキシヒドラジド、tert
−ブチルオキシカルボニルヒドラジド、トリチル
ヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。 アルギニンのグアニジノ基保護基としては、例
えばニトロ、トシル、p−メトキシベンゼンスル
ホニル、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシ
カルボニル、アダマンチルオキシカルボニル等が
挙げられる。また、そのグアニジノ基は適当な酸
例えばベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン
酸、塩酸、硫酸などの塩の形で保護してもよい
い。 スレオニン及びセリンの水酸基は、例えばエス
テル化またはエーテル化によつて保護することが
できるが必ずしも保護する必要はない。このエス
テル化に適する基としては、例えばアセチル等の
低級アルカノイル、ベンゾイル等のアロイル、ベ
ンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボ
ニル等の炭酸から誘導される基等が挙げられる。
またエーテル化に適する基としては、例えばベン
ジル、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル等で
ある。 カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル(メチルアルコ
ール、エチルアルコール、ベンジルアルコール、
ペンタクロロフエノール、p−ニトロフエノー
ル、N−ヒドロキシサクシンイミド、N−ヒドロ
キシベンズトリアゾール、N−ヒドロキシ−5−
ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等と
のエステル)等が挙げられる。尚ペプチド結合形
成反応は、縮合剤例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、カルボジイミダゾール等のカルボジイ
ミダド試薬やテトラエチルピロホスフイト等の存
在下に実施し得る場合もある。 上記一般式(1)で表わされるペプチドは、Rで示
される基の種類に応じて、より具体的には以下に
示す〔〕〜〔〕の方法に従い製造される。 〔〕 Rが水素原子を示す場合
【表】
|
↓ A〓Glu〓B(15)
↓ A〓Glu〓B(15)
【表】
〔〕 RがH−Thr−Asn−Leu−Gln基を示す場
合
合
【表】
〔〕RがH−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln基を示す場合
Gln基を示す場合
【表】
【表】
〔〕 RがH−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−
Asn−Leu−Gln基を示す場合
Asn−Leu−Gln基を示す場合
【表】
〔上記〔〕〜〔〕において、Aはアミノ基の
保護基、Bは水酸基又はカルボキシル基の活性
基、Cはアルギニンのグアニジノ基の保護基、D
はリジンのε−アミノ基の保護基、Eはグルタミ
ン酸のγ−カルボキシル基の保護基及びFはカル
ボキシル基の保護基を示す。〕 上記においてAの好ましいものとしては、
Boc、Z、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル基等を、Bの好ましいものとしては、N−ヒド
ロキシサクシンイミド、p−ニトロフエニルエス
テル等の活性エステル残基、イソブチルオキシカ
ルボニル基等の混合酸無水物残基、アジド等を、
Cの好ましいものとしては、ニトロ、トシル等
を、Dの好ましいものとしては、トシル等を、E
の好ましいものとしては、ベンジルオキシ等を、
またFの好ましいものとしてはアルキルエステル
残基、tert−ブトキシカルボニルヒドラジド等を
夫々例示できる。 上記方法〔〕においてアミノ酸2とアミノ酸
3との反応は、溶媒の存在下に行ない得る。溶媒
としては、ペプチド縮合反応に使用し得ることが
知られている各種のもの例えば無水または含水の
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロル
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、N−
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を用い得る。アミノ
酸3とアミノ酸2との使用割合としては、特に限
定されないが、通常前者に対して後者を等量〜5
倍量、好ましくは等量〜1.5倍量使用するのがよ
い。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され
得ることが知られている範囲、通常約−40〜約60
℃、好ましくは約−20〜約40℃の範囲から適宜選
択される。反応時間は一般に数分〜30時間程度で
ある。 方法〔〕におけるペプチド5とアミノ酸6と
の反応、ペプチド8とアミノ酸9との反応、ペプ
チド11とアミノ酸12との反応、ペプチド14とアミ
ノ酸15との反応及びアミノ酸6とアミノ酸45との
反応は、上記アミノ酸2とアミノ酸3との反応と
同様にして行ない得る。また方法〔〕における
アミノ酸18とアミノ酸19との反応、ペプチド21と
アミノ酸22との反応、ペプチド24とアミノ酸25と
の反応及びペプチド27とペプチド28との反応、方
法〔〕におけるアミノ酸19とアミノ酸31との反
応、ペプチド33とアミノ酸6との反応及びペプチ
ド35とペプチド36との反応、並びに方法〔〕に
おけるペプチド39とアミノ酸40との反応及びペプ
チド42とペプチド36との反応も亦上記と同様にし
て行ない得る。 上記各反応により得られるペプチド4,7,
10,13,16,20,23,26,29,32,34,37及び43
の有する保護基Aの離脱反応は、常法により行な
われる。該方法としては、例えば還元的方法(例
パラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素
添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元)、アシドリシス(例トリフルオロ酢酸、弗化
水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸に
よるアシドリシス)等が挙げられる。 上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧1
気圧、0〜40℃にて行ない得る。触媒の使用量
は、通常100mg〜1g程度でよく、一般に1〜48
時間程度で反応は終了する。また上記アシドリシ
スは、無溶媒下、通常0〜30℃程度好ましくは0
〜20℃にて約15分〜1時間程度を要して行ない得
る。酸の使用量は原料化合物に対し通常5〜10倍
量程度するのがよい。更に上記液体アンモニア中
金属ナトリウムによる還元は、反応溶液がパーマ
ネントブルーに30秒〜10分間程度呈色しているよ
うな量の金属ナトリウムを用い、通常−40〜−70
℃程度にて行ない得る。 またペプチド10の保護基C及びペプチド16,
29,37及び45の保護基D、ペプチド4及び6の保
護基E並びにペプチド26,34,43及び46の保護基
Fは、夫々上記還元的方法によつて、同様に脱保
護することができる。 上記方法1乃至に利用されるアミノ酸2,
3,6,9,15,18,19,22,25,31,40及び45
は、公知の市販品でよく、またペプチド12,27,
35及び42は公知の市販品又は混合酸無水物法、ア
ジド化法等により得られるものを利用できる。 上記混合酸無水物法は、適当な溶媒中塩基性化
合物の存在下、アルキルハロカルボン酸、例えば
クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻
酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブ
チル等を用いて行なわれる。塩基性化合物として
は、例えばトリエチルアミン、トリメチルアミ
ン、ピリジン、ジメチルアニリン、N−メチルモ
ルホリン、1,5−ジアザビシクロ〔4,3,
0〕ノネン−5(DBN)、1,5−ジアザビシク
ロ〔5,4,0〕ウンデセン−5(DBU)、1,
4−ジアザビシクロ〔2,2,2〕オクタン
(DABCO)等の有機塩基や炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリ
ウム等の無機塩基を使用できる。また溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用の各種溶媒、具体的に
は塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエ
ステル類、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド等の非プロトン性極性溶媒などを使用できる。
反応は通常−20〜100℃好ましくは−20〜50℃に
おいて行なわれ、反応時間は一般に5分〜10時間
好ましくは5分〜2時間である。 またアジド化法は、まず活性化されたカルボキ
シル基、例えばメチルアルコール、エチルアルコ
ール、ベンジルアルコール等のアルコールで活性
化されたカルボキシル基にヒドラジン水和物を適
当な溶媒中にて反応させることにより行なわれ
る。溶媒としては例えばジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド又はこれらの
混合溶媒等を使用できる。ヒドラジン水和物の使
用量は、活性化されたカルボキシル基に対して通
常5〜20倍モル量好ましくは5〜10倍モル量とす
るのがよい。反応は通常50℃以下、好ましくは−
20〜30℃にて行なわれる。斯くして末端アミノ酸
のカルボキシル基部分がヒドラジンで置換された
化合物(ヒドラジン誘導体)を製造し得る。末端
アミノ酸のカルボキシル基部分がアジドで置換さ
れた化合物は、酸存在下、適当な溶媒中、上記で
得られるヒドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反応
させることにより製造される。酸としては通常塩
酸が用いられる。溶媒としは例えばジオキサ、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又は
これらの混合溶媒等を使用できる。また亜硝酸化
合物としては例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イ
ソアミル、塩化ニトロシル等を使用することがで
きる。斯かる亜硝酸化合物は、ヒドラジ量誘導体
に対して通常等モル〜2倍モル、量好ましくは等
モル〜1.5倍モル量用いられる。反応は通常−20
〜0℃、好ましくは−20〜−10℃にて行なわれ、
一般に5〜10分程度で反応は終了する。 前記方法〔〕におけるペプチド28は、ペプ
チド16の保護基A及びEを脱離することによ
り、また、前記方法〔〕におけるペプチド36
は、ペプチド29の保護基Aを脱離することにより
夫々収得できる。之等の脱保護基反応は、上述し
た方法に従えばよい。 上記のようにして製造された一般式(1)のペプチ
ドは反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽
出、分配、カラムクロマトグラフイー等により単
離精製される。 かくして一般式(1)で表わされる合成ペプチド即
ちヒトリンホブラストイドインターフエロンのC
末端ペプチドを得る。 かくして得られる合成ペプチドは、これに
125、131等の放射性ヨードを導入することによ
り、ラジオイムノアツセイ法(RIA法)において
用いられる標識抗原の製造用原料である標識ペプ
チドとして利用できる。上記放射性ヨードの導入
は、通常のヨード化法、例えばクロラミTを用い
る酸化的ヨード化法〔W.Y.Hunter and F.C.
Greenwood;Nature、194、P495(1962)、
Biochem.J.89、P114(1963)参照〕等により行な
われる。具体的には例えば適当な溶媒例えば
0.2Mリン酸緩衝液(PH=7.4)等の溶媒中、クロ
ラミンTの存在下室温付近にて10〜30秒程度で行
なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラミ
ンTの使用割合は、例えばチロシン当り放射性ヨ
ード1個を導入する場合には、ペプチド中に含ま
れるチロシン分子1ナノモルに対して放射性ヨー
ドを1ミリキユーリー程度、クロラミンTを10〜
100ナノモル程度用いるのがよく、またチロシン
当り放射性ヨード個を導入する場合には、ペプチ
ド中に含まれるチロシン分子1ナノモルに対して
放射性ヨードを2ミリキユーリー程度、クロラミ
ンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。斯
くして製造される放射性ヨードにより標識化され
たペプチドは、通常の分離手段例えば抽出、分
配、カラムクロマトグラフイー、透析等により単
離精製される。このようにして得られるペプチド
は必要ならば凍結乾燥させて保存しておくことも
できる。 以下上記一般式(1)で表わされる合成ペプチドを
ハプテンとして利用するヒトα型インターフエロ
ン抗原の製造方法につき詳述する。 ヒトα型インターフエロン抗原は、上記ペプチ
ドの少なくとも1種をハプテンとし、これをハプ
テン−担体結合試薬の存在下に、適当な担体と反
応させることにより製造される。 上記方法においてハプテンに結合される担体と
しては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子
の天然若しくは合成蛋白質を広く使用できる。該
担体としては、例えば馬血清アルブミン、牛血清
アルブミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アル
ブミン、ヒツジ血清アルブミン等の動物の血清ア
ルブミン類、馬血清グロブリン、牛血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類、馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチ
ログロブリン等の動物のチログロブリン類、馬ヘ
モグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ
ロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブ
リン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘモシ
アニン類、回虫より抽出された蛋白質(アスカー
リス抽出物、特開昭56−16414号公報、J.
Immun.、111、260〜268(1973)、J.Immun.、
122、302〜308(1979)、J.Immun.、98、893〜900
(1967)及びAm.J.Physiol.、199、575〜578
(1960)に記載されたものまたはこれらを更に精
製したもの)、ポリリジン、リグルタミン酸、リ
ジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニ
チンを含む共重合体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合
させる、例えばグリオキサール、マロンジアルデ
ヒド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類、チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばN,N′−o−フエニレンジマレイミ
ド、N,N′−m−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、4
−(マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル化合物、アミノ基と
カルボキシル基とをアミド結合させる通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばN,
N−ジシクロヘキシルカルボジイミド、N−エチ
ル−N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−
エチル−3−ジイソプロピルアミノカルボジイミ
ド、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニ
ル−4−エチル)カルボシイミド等のカルボジイ
ミド類等の脱水縮合剤を挙げることができる。ま
た上記ハプテン−担体結合試薬としては、p−ジ
アゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリー
ルカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組み合わせたもの
も使用可能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH7〜10の通常の緩衝液中好ましくはPH8〜9の
緩衝液中で、0〜40℃好ましくは室温付近で行な
われる。該反応は通常約1〜24時間好ましくは3
〜5時間で完結する。上記において用いられる代
表的緩衝液としては、次のものを例示できる。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸水素カリウム−0.05M四ホウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を2〜6倍重量好まし
くは3〜5倍重量、及びハプテン−担体結合試薬
を5〜10倍モル程度用いるのがよい。上記反応に
よりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担体と
ハプテンとが結合したペプチド−担体複合体から
成るヒトα型インターフエロン抗原が収得され
る。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈殿法等により容易に
単離精製できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法
により保存できる。 かくしてヒトα型インターフエロンのC末端ペ
プチドの少なくとも1種と、担体との複合体から
成る所望のヒトα型インターフエロン抗原を得
る。該抗原は、通常蛋白質1モルに対しペプチド
が平均5〜20モル結合したものであり、いずれも
引き続き再現性よく、ヒトα型インターフエロン
に対する特異性の高い抗体の作成を可能とするも
のである。特に上記蛋白質に対するペブチドの結
合モル比が1:8〜15のものは、特異性が一層高
く高力価、高感度の抗体を作成し得るものであり
好ましい。 上記で得られる抗原による抗体の作成は、以下
の如くして行なわれる。即ち上記抗原を哺乳動物
に投与し、生体内に産生されを抗体を採取するこ
とにより行なわれる。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常兎やモルモツトを用いるの
が望ましい。抗体の産生に当つては、上記により
得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃度に
希釈し、フロインドの補助液(Complete
Freund′s Adjuvant)と混合して懸濁液を調整
し、之を哺乳動物体に投与すればよい。例えば兎
に上記懸濁液を皮内注射(抗原の量として0.5〜
5mg/回)し、以後2週間毎に2〜10ケ月好まし
くは4〜6ヶ月間投与し免疫化させればよい。抗
体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量
産出される時期、通常上記最終投与1〜2週間経
過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心分
離後血清を分離採取することにより行なわれる。
上記によれば、用いる抗原の特殊性に基づいて、
ヒトα型インターフエロンに対して優れた特異性
を有し、高力価、高感度の抗体を収得できる。 かくして得られるヒトα型インターフエロン抗
体は、例えばこれをRIA法に利用してヒトα型イ
ンターフエロンの定量を高精度をもつて可能とす
る。また該抗体は、これを酵素または蛍光物質で
標識することによつてエンザイムイムノアツセイ
(EIA)法、フローレツセンスイムノアツセイ
(FIA)法等に使用できる。さらに該抗体は公知
の不溶化させる物質と反応させて不溶化抗体とす
ることもできる。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
1のペプチド、これを利用した抗原及び該抗原か
らの抗体の製造例を挙げるか、本発明はこれに限
定されるものではない。 尚各製造例におけるRf値はシリカゲル上の薄
層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用いて
測定したものである。 Rf〓…1−ブタノール−酢酸−水(4:1:
5) Rf〓…1−ブタノール−ピリジン−酢酸−水
(15:10:3:12) <ペプチドの合成> 製造例 1 1 Z−Lys(Tos)−Gln(OBzl)−OBzlの製造 H−Glu(OBzl)−OBzl・Tos4.18gをジメチ
ルホルムアミド(DMF)30mlに溶解し、トリ
エチルアミン(TEA)1.21mlを加え、撹拌下
冷却する。一方Z−Lys(Tos)−OH4.35gをテ
トラヒドロフラン(THF)30mlに溶解し、N
−メチルモルホリン0.98mlを加え−15℃に冷却
し、撹拌下クロロ蟻酸イソブチル1.27mlを滴下
する。滴下30秒後該液に上記で調製した冷
DMF溶液を加え、この混合液を0℃下に5分
間、次いで40℃の水浴中で1分間、更に15℃下
に30分間撹拌する。反応液よりTHF及びDMF
を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出する。
抽出液を1Nクエン酸、飽和食塩水、飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗
浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチ
ルを留去する。得られる油状残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、これを酢酸エチル−エ
ーテルより再沈殿させて目的物5.37gを得る。 Rf〓=0.96 Rf〓=0.90 元素分析値(C40H45N3O9Sとして) 計算値(%) C64.59 H6.10 N5.65 実測値(%) C64.13 H5.95 N5.63 2(a) H−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Lys(Tos)−Glu(OBzl)−OBzl5.21g
をメタノール80mlと10%酢酸20mlとの混液に
溶解し、パラジウムブラツク少量を加えH2
ガス導入下1夜撹拌する。反応終了後触媒を
吸引過により去し、液を減圧蒸留し、
残渣を水に注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.29 Rf〓=0.52 2(b) Z−Ser−Lys(Qos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−NHNH2 2.13gをDMF20mlに
溶解し、6N塩酸/ジオキサン4.20mlを加え、
−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル
1.13mlをえる。反応液がヒドラジドテスト陰
性になつた後TEA3.53mlの冷DMF1.20ml溶
液を少量宛滴下し中和させる。このアジドを
含む溶液を、上記(a)で得たH−Lys(Tos)−
Glu−OH及びTEA1.96mlの冷DMF溶液に加
え、混合液を−10〜−15℃下2時間、次いで
4℃下20時間撹拌する。DMFを減圧留去し、
残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を
1Nクエン酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧
留去する。得られる残渣にエチルエーテルを
加えて固化させ、酢酸エチル−エーテルより
再沈殿させて、目的物4.14gを得る。 Rf〓=0.64 Rf〓=0.65 元素分析値(C29H38N4O11S・1/2H2Oとし
て) 計算値(%) C52.80 H5.96 N8.49 実測値(%) C52.87 H5.69 N8.46 3(a) H−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 4.03gを
メタノール60mlと10%酢酸40との混液に溶
解し、パラジウムブラツク少量を加えH2ガ
ス導入下1夜撹拌する。反応終了後触媒を吸
引過により去し、液を減圧蒸留し、残
渣を水に注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.23 Rf〓=0.48 3(b) Z−Arg(NO2)−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHの製造 上記(a)で得たH−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHをDMF20mlに溶解し、TEA1.74mlを加
え、撹拌下冷却する。一方Z−Arg(NO2)−
OH2.41gをTHF20mlに溶解し、N−メチル
モルホリン0.70mlを加え−15℃に冷却し、撹
拌下クロロ蟻酸イソブチル0.86mlを滴下す
る。滴下30秒後該液に上記で調製した冷
DMF溶液を加え、この混合液を0℃下に5
分間、次いで40℃の水浴中で1分間、更に15
℃下に30分間撹拌する。反応液よりTHF及
びDMFを減圧留去し、残渣を2%酢酸飽和
ブタノールで抽出する。抽出液をn−ブタノ
ール飽和の2%酢酸で5回洗浄し、減圧蒸留
し、水に置き換えて酢酸を留去し、更にメタ
ノールに置き換えて水を留去する。得られる
油状残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、これを酢酸エチル−メタノールより再沈
殿させて目的物4.09gを得る。 Rf〓==0.42 Rf〓=0.65 元素分析値(C35H49N9O14S・1/2H2Oとし
て) 計算値(%) C48.83 H5.85 N14.64 実測値(%) C49.22 H6.05 N14.11 4 Z−Ser−Leu−NHNH2の製造 Z−Ser−NHNH22.54gをDMR20mlに溶解
し、6N塩酸/ジオキサン5.00mlを加え、−15℃
に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル1.34mlを加
える。反応液がヒドラジドテスト陰性になつた
後TEA4.20mlの冷DME1.40ml溶液を少量宛滴
下し中和させる。このアジドを含む溶液を、H
−Xeu−OC2H5・HCl 1.96g及びTEA 1.40ml
の冷DMF溶液15mlに加え、混合液を−10〜−
15℃下2時間、次いで4℃下20時間撹拌する。
DMFを減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチル層を1Nクエン酸、飽和食塩水、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水
で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、
酢酸エチルを減圧留去する。得られる残渣に石
油エーテルを加えデカンテーシヨンにより洗浄
する。油状物質をデシケーター内で減圧乾燥
し、乾燥物をメタノール50mlに溶かし、氷冷下
100%ヒドラジン1水和物2.50mlを加え、室温
下20時間放置し、メタノールを減圧留去する。
残渣にエチルエーテルを加えて固化させ、これ
をデシケースー内で乾燥後、水洗過して過剰
剰のヒドラジン1水和物を除去し、メタノール
−酢酸エチルから再沈殿させて、目的物22.68
gを得る。 Rf〓0.73 Rf〓=0.76 元素分析値(C17H26N4O5として) 計算値(%) C55.73 H7.15 N15.29 実測値(%) C55.72 H7.01 N15.42 5(a) H−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの
製造 Z−Arg(NO2)−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OH 2.00gをメタノール30mlと50%酢酸30ml
との混液に懸濁し、パラジウム少量を加え
H2ガス導入36時間撹拌する。反応終了後触
媒を吸引過により去し、液を減圧蒸留
し、残渣を水に注ぎ凍結乾燥し、18時間後再
度水に溶かして凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.05 Rf〓=0.41 5(b) Z−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−NHNH21.03gをDMF15
mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサン1.41mlを
加え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソア
ミル0.38mlを加える。反応液がヒドラジドテ
スト陰性になつた後TEA1.18mlの冷
DMF0.40ml溶液を少量宛滴下し中味させる。
このアジドを含む溶液を、上記(a)で得たH−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH及び
TEA0.66mlの冷DMF溶10mlに加え、混合液
を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下20時
間撹拌する。DMFを減圧留去し、残渣を水
飽和のn−ブタノールで抽出し、ブタノール
層をn−ブタノール飽和水で5回洗浄し、減
圧留去する。得られる残渣にエチルエーテル
を加えて固化させ、メタノール−酢酸エチル
より再沈殿させて、目的物1.92gを得る。 Rf〓=0.33 Rf〓0.69 元素分析値(C44H66N10O15S・2H2Oとして) 計算値(%) C50.66 H6.76 N13.43 実測値(%) C50.57 H6.51 N13.34 6(a) H−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OHの製造 Z×Ser−Leu−Afg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OH1.84gをメタノール30mlと10%酢
酸30mlとの混液に懸濁し、パラジウムブラツ
ク少量を加えH2ガス導入下13時間撹拌する。
反応終了後触媒を吸引過により去し、
液を減圧蒸留し、残渣を水に注ぎ凍結乾燥し
て目的物を得る。 Rf〓=0.09 Rf〓=0.53 6(a) Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 上記(a)で得たH−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys(Tos)−Glu−OHをDMF20mlに溶解し、
TEA0.51mlを氷冷下に加え、更にBoc−Glu
(OBzl)−ONHS 0.95gを加え、混合液を室
温下24時間撹拌する。DMFを減圧留去し、
残渣を水飽和のn−ブタノールで抽出し、ブ
タノール層をn−ブタノール飽和水で5回洗
浄する。ブタノール層を減圧留去し、得られ
る残渣にエチルエーテルを加えて固化させ、
メタノール酢酸エチルより再沈殿させて、目
的物1.70gを得る。 Rf〓=0.42 Rf〓=0.60 元素分析値(C53H81N11O18S・2H2Oとして) 計算値(%) C51.82 H6.97 N12.55 実測値(%) C51.27 H6.58 N12.47 7(a) Bnc−Glu−Ser−Leu−Arg−Sr−Lys
(Tos)−Glu−OH製造 Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OH150mgをメタノール
30mlと10%酢酸30mlとの混液に溶解し、パラ
ジウムブラツク少量を加えH2ガス導入下18
時間撹拌する。反応終了後触媒を吸引過に
より去し、液を減圧蒸留し、残渣に水を
注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 7(b) H−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OHの製造 上記(a)で得たBBoc−Glu−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHをTHFに
溶解し、室温で15分間放置する。無水エーテ
ル約30mlを加え、析出物を過し、無水エー
テルで洗浄後、水酸化カリウム−五酸化リン
を入れたデシケーター内で減圧乾燥して、目
的物を得る。 7(c) H−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−
Glu−OHの製造 上記(b)で得たH−Glu−Ser−Leu−Arg−
Ser−Lys(Tos)−Glu−OHを、予め金属ナ
トリウムで乾燥した液体アンモニアに溶解
し、撹拌下に金属ナトリウムの小片を溶液が
青色を30秒〜1分間保つまで加える。更に結
晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発留去後、
溶出液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG
−25ゲルによりゲル過して、目的物58mgを
得る。以下これを「ペプチドA」と呼ぶ。 Rf〓=0.04 Rf〓=0.34 元素分析値(C34H61N11O14・C2H4O2・
3H2Oとして) 計算値(%) C44.95 H7.44 N16.02 実測値(%) C45.05 H7.11 N15.84 8(a) H−Gln−NHNHBocの製造 Z−Gln−NHNHBoc 16.00gをメタノー
ル100mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量
を加えH2ガス導入下8時間撹拌する。反応
終了後触媒を吸引過により去し、を減
圧蒸留し、残渣をデシケーター内で減圧乾燥
して目的物を得る。 Rf〓=0.37 Rf〓=0.58 8(b) Z−Leu−Gln−NHNHBocの製造 上記(a)で得たH−Gln−NHNHBocを
THF50mlに溶解し、氷冷下Z−Leu−
ONHS 5.51gを加え、室温下18時間撹拌す
る。THFを減圧留去し、残渣を酢酸エチル
で抽出し、酢酸エチル層を1Nクエン酸、飽
和食塩水、飽和炭酸水ナトリウム水溶液及び
飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、酢酸エチルを留去する。得られ
る油状残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、これをメタノール−エチルエーテルより
再沈殿させて目的物6.04gを得る。 Rf〓=0.81 Rf〓=0.86 元素分析値(C24H37N5O7として) 計算値(%) C56.79 H7.35 N13.80 実測値(%) C56.67、H7.15 N13.75 9(a) H−Leu−Gln−NHNHBocの製造 Z−Leu−Gln−NHNHBoc 2.79gをメタ
ノール80mlに懸濁し、パラジウムブラツク少
量を加えH2ガス導入下32時間撹拌する。反
応終了後触媒を吸引過により去し、液
を減圧留去し、残渣をデシケーター内で減圧
乾燥して、目的物を得る。 Rf〓=0.33 Rf〓=0.66 9(b) Z−Asn−Leu−Gln−NHNHBocの製造 上記(a)で得たH−Leu−Gln−NHNHBo
をDMF30mlに溶解し、撹拌下冷却する。一
方、Z−Asn−OH 1.61gをTHF30mlに溶
解し、N−メチルモルホリン0.62mlを加え−
15℃に冷却し、撹拌下クロロ蟻酸イソブチル
0.80mlを滴下する。滴下30秒後該液に上記で
調整した冷DMF溶液を加え、この混合液を
0℃下に5分間、次いで40℃の水浴中で1分
間、更に15℃下に30分間拌する。反応液より
THF及びDMFを減圧留去し、残渣を酢酸エ
チルで抽出する。抽出液を1Nクエン酸、飽
和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及
び飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥後、酢酸エチルを留去する。得ら
れる油状残渣にエチルエーテルを加えて固化
させ、メタノール−酢酸エチルで再沈殿させ
て目的物2.55gを得る。 Rf〓=0.63 Rf〓=0.77 元素分析値(C28H43N7O9として) 計算値(%) C53.10 H6.97 H15.77 実測値(%) C53.67 H6.63 H15.68 10(a) Z−Thr−ONHSの製造 Z−Thr−OH 1.28gをTHF30mlに溶解
し、これにNHS 0.58gを加え、氷冷し、次
いでN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(DCC)1.05gを加える。この混合液を4
℃で24時間撹拌し、析出物を去し、液を
減圧留去し、残渣エチルエーテルを加え、デ
カンテーシヨン洗浄する。得られる油状物質
をデシケーター内にて減圧乾燥して目的物を
得る。 10(b) H−Asn−Leu−Gln−NHNHBocの製造 Z−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc 2.43g
をメタノール80mlに懸濁し、パラジウムブラ
ツク少量を加え、H2ガス導入下18時間撹拌
する。反応終了後触媒を吸引過により去
し、液を減圧留去し、デシケーター内で減
圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.31 Rf〓=0.64 10(c) Z×Thr−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc
の製造 上記(b)で得たH−Asn−Leu−Gln−
NHNHBocをDMF30mlに溶解し、この溶液
に上記(a)で得たZ−Thr−ONHSのDMF20
ml溶液を氷冷下に加え、混合液を室温下18時
間撹拌する。DMFを減圧留去して得られた
残渣に1Nクエン酸を加えて固化し、メタノ
ール−酢酸エチルより再沈殿させて、目的物
2.12gを得る。 Rf〓=0.82 Rf〓=0.79 元素分析値(C32H50N8O11として) 計算値(%) C53.18 H6.97 N15.50 実測値(%) C52.85 H6.95 N15.28 11(a) Z−Thr−Asn−Leu−Gln−NHNH2の製
造 Z−Thr−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc
0.91gをTFA8mlに溶解し、室温下15分間放
置する。無水エーテル80mlを加えて析出物を
すばやく過し、無水エーテルで洗浄後、水
酸化カリウム−五酸化リンを入れたデシケー
ター内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.34 11(b) H−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lyg(Tos)−Glu−OHの製造 Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OH 1.00gをTFA8mlに
溶解し、室温下15分間放置する。無水エーテ
ル80mlを加えて析出物をすばやく過し、無
水エーテルで洗浄後、水酸化カリウム−五酸
化リンを入れたデシケーター内で減圧乾燥し
て目的物を得る。 Rf〓=0.24 Rf〓=0.44 11(c) Z−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu(OBzl)−
Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHの製造 上記(a)で得たZ−Thr−Asn−Leu−Gln
−NHNH2をDMF10mlに溶解し、6N塩酸/
ジオキサン0.63mlを加え、−15℃に冷却し、
撹拌下亜硝酸イソアミル0.17mlを加える。反
応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA0.53mlの冷DMF0.40ml溶液を少量宛滴
下し中和させる。このアジドを含む溶液を、
上記(b)で得たH−Glu(OBzl)−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH及び
TEA0.4mlの冷DMF溶液10mlに加え、混合
液を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下18
時間撹拌反応させる。さらに上記(a)と同様に
してZ−Thr−Asnn−Leu−Gln−
TNHNBoc 1.16gをTFAで処理して得た反
応物を上記反応混合物に加え24時間同温度下
に撹拌反応させるDMFを減圧留去し、残渣
を水飽和のn−ブタノールで抽出し、n−ブ
タノール飽和の水で5回洗浄し、減圧蒸留す
る。残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、メタノール酢酸エチルより再沈殿させ更
に熱メタノールで洗浄して、目的物を得る。 11(d) H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−
Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの製
造 上記(c)で得たZ−Thr−Asn−Leu−Gln
−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Gln−OHをメタノール50ml及び30
%酢酸50mlとの混液に懸濁させ、パラジウム
ブラツク少量を加え、H2ガス導入下18時間
撹拌する。反応終了後触媒を吸引過により
去し、液を減圧濃縮し、メタノールを完
全に留去後、得られる濃縮を、50%酢酸を溶
出液とするセフアデツクスG−25によりゲル
過して、目的とするフラクシヨンを集め凍
結乾燥して目的物740mgを得る。 Rf〓=0.17 Rf〓=0.35 元素分析値(C66H99N17O23・C2H4O2・
2H2Oとして) 計算値(%) C48.91 H7.08 N15.64 実測値(%) C48.82 H6.63 N15.74 12 H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu
−Arg−Ser−Lys−Gln−OHの製造 H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu
−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 51.0mgを、
予め金属ナトリウムで乾燥した液体アンモニア
に溶解し、撹拌下に金属ナトリウムの小片を溶
液が青色を30秒〜1分間保つまで加える。更に
結晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発留去後、溶
出液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG−25
ゲルによりゲル過して、目的とするフラクシ
ヨンを集め、これを濃縮後水を加えて凍結乾燥
して、目的物32mgを得る。以下これを「ペプチ
ドB」と呼ぶ。 Rf〓=0.01 Rf〓=0.37 元素分析値(C53H93N17O21・C2H4O.3H2Oと
して) 計算値(%) C46.57 H7.32 N16.79 実測値(%) C46.10 H6.98 N16.82 13 Z−Leu−Ser−OCH3の製造 H−Ser−OCH3・HC 1.81gのDMR25
mlに溶解し、TEA1.62mlを加え−10℃に氷冷
する。撹拌下Z−Leu−ONHS 4.21gを加え、
室温で18時間撹拌続ける。DMFを減圧留去し、
残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチ
ルを減圧留去する。得られる残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、酢酸エチル−エーテル
より再沈殿させて、目的物2.68gを得る。 Rf〓=0.81 Rf〓=0.82 元素分析値(C18H26N2O6として) 計算値(%) C59.00 H7.15 N7.65 実測値(%) C58.62 H7.03 N7.65 14(a) H−Leu−Ser−OCH3・HCの製造 Z−Leu−Ser−OCH3 4.20gをメタノー
ル40mlと1N塩酸11.46mlとの混液に懸濁さ
せ、パラジウムブラツク少量を加え、H2ガ
ス導入下18時間撹拌する。反応終了後触媒を
吸引過により去し、液を減圧蒸留し、
更に水を加え減圧蒸留する操作を3回繰返
す。残渣を五酸化リンを入れたデシケーター
内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.38 14(b) Z−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 Z−Ser−NHNH2 3.19gをDMF25mlに
溶解し、6N HC/ジオキサン6.30mlを加
え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミ
ル1.69mlを加える。反応液がヒドラジドテス
ト陰性になつた後TEA5.29mlの冷DMF1.76
ml溶液を少量宛滴下し中和させる。このアジ
ドを含む溶液を、上記(a)で得たH−Leu−
Ser−OCH3・HC及びTHA1.60mlの冷
DMF溶液20mlに加え、混合液を−10〜−15
℃下2時間、次いで4℃下18時間撹忰する。
DMFを減圧留去し、残渣に水を加えて固化
させ、メタノール−酢酸エチルより再沈殿さ
せて、目的物4.11gを得る。 Rf〓=0.76 Rf〓=0.79 元素分析値(C21H31N3O8として) 計算値(%) C55.62 H6.89 N9.27 実測値(%) C55.48 H6.92 N9.18 15 Z−Ser−Leu−Ser−NHNH2の製造 Z−Ser−Leu−Ser−OCH3 2.00gをメタノ
ール40mlに溶解し、氷冷下100%NH2NH2・
H2O 1.10mlを加え、室温で18時間放置する。
反応終了後、溶媒を減圧留去し、エーテルを加
えて固化させ、過剰のNH2NH2・H2Oを水を
加えて除去し、メタノール−酢酸エチルより再
沈殿させて目的物1.91gを得る。 Rf〓=0.43 Rf〓=0.73 元素分析値(C20H31N5O7として) 計算値(%) C52.97 H6.89 N15.44 実測値(%) C52.85 H6.70 N15.44 16(a) Z−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−Ser−NHNH2 70.42mgを
DMF5mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサンの
DMF10倍希釈液0.78mlを加え、−15℃に冷却
し、撹拌下亜硝酸イソアミルのDMF10倍希
釈液0.20mlを加え、反応液がヒドラジドテス
ト陰性になつた後、TEAのDMF10倍希釈液
0.65mlを少量宛滴下し中和させる。このアジ
ドを含む溶液を、上記11(d)で得たH−Thr−
Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−
Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 151mgとTEAの
DMF 10倍希釈液0.29mlの冷DMF5ml溶液に
加え、混合液を−10〜−15℃下2時間、次い
で4℃下18時間撹拌する。更にZ−Ser−
Leu−Ser−NHNH2 117.36mgを加え、24時
間反応させる。 DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のn−
ブタノールで抽出し、n−ブタノール飽和の
水で10回、更にn−ブタノール飽和の2%酢
酸で5回洗浄し、減圧濃縮し、水を加えて更
に減圧濃縮し、完全にn−ブタノールを留去
後、凍結乾燥する。これを酢酸エチル−エー
テルで沈殿させて目的物を得る。 16(b) H−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−
Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OH 150mgを予め金属ナトリ
ウムで乾燥した液体アンモニアに溶解し、撹
拌下金属ナトリウムの小片を溶液が青色を30
秒〜1分間保つまで加える。更に結晶NH4C
を加え、過剰のナトリウムを中和し、室温
でアンモニアを完全に蒸発後、溶出液に50%
酢酸を用いたセフアデツクスG−25ゲルによ
りゲル過して、フラクシヨンを集めこれを
濃縮後水を加えて凍結乾燥して、目的物94mg
を得る。以下これを「ペプチドC」と呼ぶ。 Rf〓=0.02 Rf〓=0.39 元素分析値(C65H120N20O26・C2H4O2・
H2Oとして) 計算値(%) C48.19 H7.24 N16.78 実測値(%) C47.93 H6.93 N16.49 17(a) Z−Tyr−OSuの製造 Z−Tyr−OH 1.04gをTHF30mlに溶解
し、N−ヒドロキシサクシンイミド0.38gを
加え、氷冷後更にDCC0.68gを氷冷下に加
え、混合物を4℃で18時間撹拌する。析出物
を吸引過により除き、液を減圧濃縮し、
残渣にエチルエーテルと石油エーテルとを加
えてデカンテーシヨン、乾燥して目的物を得
る。 17(b) H−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 参考例14(b)で得たZ−Ser−Leu−Ser−
OCH3 1.00gをメタノール20mlと10%酢酸20
mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量を加
え、H2ガス導入下14時間撹拌する。反応終
了後触媒を吸引過により去し、液を減
圧濃縮後水を加えて凍結乾燥して目的物を得
る。 Rf〓=0.35 Rf〓=0.65 17(c) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 上記(b)で得たH−Ser−Leu−Ser−OCH3
をDMF10mlに溶解し、TEA0.31mlを氷冷下
に加え、この溶液に上記(a)で得たZ−Tyr−
OSuの冷DMF溶液を撹拌下に加える。混合
液を室温下18時間撹拌し、DMFを減圧留去
し、残渣に水を加えて固化させ、メタノール
エーテル次いでメタノール酢エチルから再沈
殿させて目的物1.08gを得る。 Rf〓=0.78 Rf〓=0.82 元素分析値(C30H40N4O10として) 計算値(%) C58.43 H6.54 N9.09 実測値(%) C58.14 H6.58 N9.16 17(d) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−NHNH2の製
造 Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−OCH3 1.00g
をメタノールに溶解し、氷冷下100%
NH2NH2・H2O 0.82mlを加え、室温で18時
間放置する。メタノールを減圧留去し、残渣
にエチルエーテルを加えて固化させ、水洗に
より過剰のNH2NH2・H2Oを除去し、メタ
ノール−エーテルで再沈殿後熱メタノールで
洗浄して目的物0.81gを得る。 Rf〓=0.45 Rf〓=0.76 元素分析値(C29H40N6O9として) 計算値(%) C56.48 H6.54 N13.63 実測値(%) C56.12 H6.57 N13.58 18(a) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−
Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−NHNH2 42.3
mgをDMF4mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサ
ンのDMF10倍希釈液0.34mlを加え、−15℃に
冷却し、撹拌亜硝酸イソアミルのDMF10倍
希釈液0.09mlを加え、反応液がヒドラジンテ
スト陰性になつた後、TEAのDMF10倍希釈
液0.29mlを少量ずつ滴下し中和させる。この
アジドを含む溶液を、H−Thr−Asn−Leu
−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OH 50.0mgとTHAのDMF10
倍希釈液0.10の冷DMF4ml溶液に加え、混合
液を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下18
時間撹拌する。更にZ−Tyr−Ser−Leu−
Ser−NHNH2 42.3mgを加え24時間反応させ
る。DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のn
−ブタノール30mlで抽出し、抽出液をn−ブ
タノール飽和水で10回、次いでn−ブタノー
ル飽和の2%酢酸で5回洗浄する。有機層を
集め減圧濃縮し、n−ブタノールを留去後、
凍結乾燥し、酢酸エチル−エーテルで再沈殿
させて目的物を得る。 18(b) H−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−
Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys−Glu−OHの製造 上記(a)で得たZ−Tyr−Ser−Leu−Ser−
Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHを予め金
属ナトリウムで乾燥した液体アンモニアに溶
解し、撹拌下金属ナトリウムの小片を溶液が
青色を30並〜1分間保つまで加える。更に結
晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発後、溶出
液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG−25
ゲルによりゲル過して、フラクシヨンを集
め目的物33mgを得る。以下これを「ペプチド
D」と呼ぶ。 Rf〓=0.02 Rf〓=0.35 元素分析値(C74H123N21O28・C2H4O2・
4H2Oとして) 計算値(%) C47.71 H7.30 N15.79 実測値(%) C47.32 H7.24 N15.82 <抗原の製造> 製造例 1 ペプチドの合成製造例7(c)で得たペプチドAの
5mg及び牛血清アルブミン(以下「BSA」と略
記する)の15mgを酢酸アンモニウム緩衝液(0.1
モル、PH7.0)2mlにとかす。この溶液に0.1モル
のグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、室温
で5時間撹拌する。その後反応混合物を48時間、
4℃で水1で透析する。透析中5回水を交換す
る。その後、ペプチド−蛋白質複合体を含有する
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原(以下「抗原」と呼ぶ)15mgを得る。 この抗原は、BSA1モルに対してペプチドA
が平均10モル結合したものである。尚このペプチ
ドAとBSAとの結合率は、得られる抗原を更
にセフアデツクスG−50(溶出液:生理食塩水、
検出:OD280nm、流出速度:3ml/時間、分取
量:1mlずつ)でゲル過した際、未反応BSA
及びペプチドAの存在は認められないことより、
該ゲル過によつてBSAに結合したペプチドA
のフラクシヨンと他の生成体(ペプチドAの2量
体)のフラクシンとを分離し、ペプチド2量体の
標準濃度の検量線を作成して、上記2量体の量を
求め、これを出発原料として用いたペプチドAの
量から差し引いた値がすべてBSAに結合してい
るとして求めたものである。以下の抗原製造例に
より得られる各抗原についても同様である。 製造例 2 ペプチド合成製造例12で得たペプチドBの5mg
及びBSAの5mgを酢酸アンモニ緩衝液(0.1モル、
PH7.0)2mlにとかす。この溶液に0.1モルのグル
タールアルデヒド0.11mlを加え、室温で5時間撹
拌する。その後反応混合物を48時間、4℃で水1
で透析する。透析中5回水を交換する。その
後、ペプチド−蛋白質複合体を含む溶液を凍結乾
燥してヒトα型インターフエロン抗原(以下「抗
原」と呼ぶ)9mgを得る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドBが平均9モル結合したものである。 製造例 3 ペプチド合成製造例16(b)で得たペプチドCの5
mg及びBSA25mgを水4mlに溶解する。この溶液
にジシクロヘキカカーボジイミ(DCC)200mgを
加、室温で5時間撹拌する。次に反応混合物を水
2を用い4℃にて48時間要して透析する。透析
中5回水を交換する。その後ペプチド−蛋白質複
合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトα型インター
フエロン抗原(以下「抗原」と呼ぶ)28mgを得
る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドCが平均12モル結合したものである。 製造例 4 ペプチド合成製造例18(b)で得たペプチドDの4
mg及びBSAの20mgを酢酸アンモニウム緩衝液
(0.1モル、PH7.0)2mlに溶かす。この溶液に0.1
モルのグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、
室温で5時間撹拌する。その後反応混合物を48時
間、4℃で水1で透析する。透析中5回水を交
換する。その後、ペプチド−蛋白質複合体を含む
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原(以下「抗原」と呼ぶ)22mgを得る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドDが平均9モル結合したものである。 <抗体の製造> 製造例 1 抗原の製造例3で得た抗原の100μgを1.5ml
の生理食塩水に溶液後、之にフロインド補助液
1.5mlを加えて調製した懸濁液を、7羽の兎(2.5
〜3.0Kg)に皮下投与し、2週間毎に6回同量投
与する。更にその後1カ月毎に3回、最初投与し
た量と同量を投与する。最終投与後7日経過して
のち試験動物から採血し、遠心分離して抗血清を
採取して、ヒトα型インターフエロン抗体(以下
「抗体」と呼ぶ)を得る。 製造例 2〜4 抗原の製造例1、2及び4で得た抗原、及
びを用い、上記製造例1と夫々同様にしてヒト
α型インターフエロン抗体(抗体、及び)
を夫々得る。 Γ標識ペプチドの製造 H−Thr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu
−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−Glu
−OH即ちペプチドDをクロラミンTを用いる方
法で以下の通り標識化する。 即ち上記ペプチド5μgの0.5モルのリン酸塩緩
衝液(PH7.0)20μにNa〔125〕(carrier fvee
N.E.N.)1ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩
衝液を加え、次にクロラミンT70mg/mlの0.5モル
リン酸塩緩衝液20μを加える。室温で30秒間撹
拌して60mg/mlのメタ重亜硫酸ナトリウム
(Na2S2O5)の0.5Mリン酸塩緩衝液50μを加え
ることで反応を終わらせる。次いで反応液に1%
の冷沃化ナトリウム水溶液100μを加え、反応
混合物をセフアデツクスG−25のカラム(1.0×
30cm)にかけ(溶出液0.25%BSA、10mM
EDTA及び0.02%NaN3を含む0.05モルリン酸塩
緩衝液、PH7.4)、125で標識されたペプチドDを
得る。 Γ力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩で10、102、
103、104、105……倍に希釈(イニシヤル)し、
これらの夫々100μに、125標識ペプチド(上
記で得られる標識ペプチドを約9500cpmになるよ
うに希釈したもの)0.1ml及び0.05モルリン酸塩
緩衝液(PH=7.4)〔0.25%BSA、10mM EDTA
及び0.02%NaN3を含む〕0.2mlを加え、4℃で24
時間インキユベートし、生成した抗体と125標
識抗原との結合体を、デキストラン−活性炭法及
び遠心分離法(4℃、30分間、3000rpm)により
未反応(結合しない)125標識ペプチドから分
離し、その放射線をカウントし、各希釈濃度にお
ける抗体の125標識ペプチドとの結合率(%)
を測定する。縦軸に抗体の125標識ペプチドと
の結合率(%)及び横軸に抗体の希釈倍率(イニ
シヤル濃度)をとり、各々の濃度において結合率
をプロツトする。結合率が50%となる抗体の希釈
倍率即ち抗体の力価を求める。その結果抗体の
力価は、50000であつた。 Γ抗体のヒトα型インターフエロン特異性試験 供試試料として各種濃度のヒトβ型インターフ
エロン(東京都総合臨床研究所製、比活性3×
106U/mgプロテイン)、ペプチドの合成製造例16
(b)で得たペプチドC即ちヒトα型インターフエロ
ンのペプチド鎖及びヒトα型インターフエロン
〔林原研究所製、リムホブラストイドインターフ
エロン〕を使用する。また標準希釈剤として0.25
%BSA、5mM EDTA及び0.02%のNaN3を含む
0.05モルリン酸塩緩衝液(PH7.4)を使用する。 各々の試験管に、標準希釈剤0.2ml、供試試料
0.1ml、抗体の製造例3で得た抗体の0.1ml及び
125標識ペプチド(上記で得られる標識ペプチ
ドを約2800cpmになるように希釈したもの)0.1
mlを入れ、4℃で72時間インキユベートした後、
ノーマルブタ血清(normal porcine serum)を
0.1ml加え、次いでデキストランで被膜した活性
炭の懸濁液0.5mlを加え、4℃で30分間放置し、
次に4℃、3000rpmの条件下に30分間遠心分離を
行ない、抗体と125標識ペプチドとの結合体及
び未反応(結合しない)125標識ペプチドを分
離し、その放射線をカウントし、用いた抗体の力
価に相当する結合率(Bo)を100%として、供試
試料の濃度及び希釈率における抗体と125標識
ペプチドとの結合体(B)の百分率を求める。得られ
る結果より抗体は、ヒトα型インターフエロン
に対する反応性とヒトβ型インターフエロンに対
する反応性において明確に区別され、このことよ
りβ型インターフエロンに低交叉性の、特異性の
高い抗体であることが判る。 また抗体、及びについても同様の試験を
行なつた結果抗体と略々同様にヒトα型インタ
ーフエロンに対し特異性の高い抗体であることが
確認された。
保護基、Bは水酸基又はカルボキシル基の活性
基、Cはアルギニンのグアニジノ基の保護基、D
はリジンのε−アミノ基の保護基、Eはグルタミ
ン酸のγ−カルボキシル基の保護基及びFはカル
ボキシル基の保護基を示す。〕 上記においてAの好ましいものとしては、
Boc、Z、p−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル基等を、Bの好ましいものとしては、N−ヒド
ロキシサクシンイミド、p−ニトロフエニルエス
テル等の活性エステル残基、イソブチルオキシカ
ルボニル基等の混合酸無水物残基、アジド等を、
Cの好ましいものとしては、ニトロ、トシル等
を、Dの好ましいものとしては、トシル等を、E
の好ましいものとしては、ベンジルオキシ等を、
またFの好ましいものとしてはアルキルエステル
残基、tert−ブトキシカルボニルヒドラジド等を
夫々例示できる。 上記方法〔〕においてアミノ酸2とアミノ酸
3との反応は、溶媒の存在下に行ない得る。溶媒
としては、ペプチド縮合反応に使用し得ることが
知られている各種のもの例えば無水または含水の
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロル
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、N−
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を用い得る。アミノ
酸3とアミノ酸2との使用割合としては、特に限
定されないが、通常前者に対して後者を等量〜5
倍量、好ましくは等量〜1.5倍量使用するのがよ
い。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され
得ることが知られている範囲、通常約−40〜約60
℃、好ましくは約−20〜約40℃の範囲から適宜選
択される。反応時間は一般に数分〜30時間程度で
ある。 方法〔〕におけるペプチド5とアミノ酸6と
の反応、ペプチド8とアミノ酸9との反応、ペプ
チド11とアミノ酸12との反応、ペプチド14とアミ
ノ酸15との反応及びアミノ酸6とアミノ酸45との
反応は、上記アミノ酸2とアミノ酸3との反応と
同様にして行ない得る。また方法〔〕における
アミノ酸18とアミノ酸19との反応、ペプチド21と
アミノ酸22との反応、ペプチド24とアミノ酸25と
の反応及びペプチド27とペプチド28との反応、方
法〔〕におけるアミノ酸19とアミノ酸31との反
応、ペプチド33とアミノ酸6との反応及びペプチ
ド35とペプチド36との反応、並びに方法〔〕に
おけるペプチド39とアミノ酸40との反応及びペプ
チド42とペプチド36との反応も亦上記と同様にし
て行ない得る。 上記各反応により得られるペプチド4,7,
10,13,16,20,23,26,29,32,34,37及び43
の有する保護基Aの離脱反応は、常法により行な
われる。該方法としては、例えば還元的方法(例
パラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素
添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元)、アシドリシス(例トリフルオロ酢酸、弗化
水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸に
よるアシドリシス)等が挙げられる。 上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧1
気圧、0〜40℃にて行ない得る。触媒の使用量
は、通常100mg〜1g程度でよく、一般に1〜48
時間程度で反応は終了する。また上記アシドリシ
スは、無溶媒下、通常0〜30℃程度好ましくは0
〜20℃にて約15分〜1時間程度を要して行ない得
る。酸の使用量は原料化合物に対し通常5〜10倍
量程度するのがよい。更に上記液体アンモニア中
金属ナトリウムによる還元は、反応溶液がパーマ
ネントブルーに30秒〜10分間程度呈色しているよ
うな量の金属ナトリウムを用い、通常−40〜−70
℃程度にて行ない得る。 またペプチド10の保護基C及びペプチド16,
29,37及び45の保護基D、ペプチド4及び6の保
護基E並びにペプチド26,34,43及び46の保護基
Fは、夫々上記還元的方法によつて、同様に脱保
護することができる。 上記方法1乃至に利用されるアミノ酸2,
3,6,9,15,18,19,22,25,31,40及び45
は、公知の市販品でよく、またペプチド12,27,
35及び42は公知の市販品又は混合酸無水物法、ア
ジド化法等により得られるものを利用できる。 上記混合酸無水物法は、適当な溶媒中塩基性化
合物の存在下、アルキルハロカルボン酸、例えば
クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻
酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブ
チル等を用いて行なわれる。塩基性化合物として
は、例えばトリエチルアミン、トリメチルアミ
ン、ピリジン、ジメチルアニリン、N−メチルモ
ルホリン、1,5−ジアザビシクロ〔4,3,
0〕ノネン−5(DBN)、1,5−ジアザビシク
ロ〔5,4,0〕ウンデセン−5(DBU)、1,
4−ジアザビシクロ〔2,2,2〕オクタン
(DABCO)等の有機塩基や炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリ
ウム等の無機塩基を使用できる。また溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用の各種溶媒、具体的に
は塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエ
ステル類、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド等の非プロトン性極性溶媒などを使用できる。
反応は通常−20〜100℃好ましくは−20〜50℃に
おいて行なわれ、反応時間は一般に5分〜10時間
好ましくは5分〜2時間である。 またアジド化法は、まず活性化されたカルボキ
シル基、例えばメチルアルコール、エチルアルコ
ール、ベンジルアルコール等のアルコールで活性
化されたカルボキシル基にヒドラジン水和物を適
当な溶媒中にて反応させることにより行なわれ
る。溶媒としては例えばジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド又はこれらの
混合溶媒等を使用できる。ヒドラジン水和物の使
用量は、活性化されたカルボキシル基に対して通
常5〜20倍モル量好ましくは5〜10倍モル量とす
るのがよい。反応は通常50℃以下、好ましくは−
20〜30℃にて行なわれる。斯くして末端アミノ酸
のカルボキシル基部分がヒドラジンで置換された
化合物(ヒドラジン誘導体)を製造し得る。末端
アミノ酸のカルボキシル基部分がアジドで置換さ
れた化合物は、酸存在下、適当な溶媒中、上記で
得られるヒドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反応
させることにより製造される。酸としては通常塩
酸が用いられる。溶媒としは例えばジオキサ、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又は
これらの混合溶媒等を使用できる。また亜硝酸化
合物としては例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イ
ソアミル、塩化ニトロシル等を使用することがで
きる。斯かる亜硝酸化合物は、ヒドラジ量誘導体
に対して通常等モル〜2倍モル、量好ましくは等
モル〜1.5倍モル量用いられる。反応は通常−20
〜0℃、好ましくは−20〜−10℃にて行なわれ、
一般に5〜10分程度で反応は終了する。 前記方法〔〕におけるペプチド28は、ペプ
チド16の保護基A及びEを脱離することによ
り、また、前記方法〔〕におけるペプチド36
は、ペプチド29の保護基Aを脱離することにより
夫々収得できる。之等の脱保護基反応は、上述し
た方法に従えばよい。 上記のようにして製造された一般式(1)のペプチ
ドは反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽
出、分配、カラムクロマトグラフイー等により単
離精製される。 かくして一般式(1)で表わされる合成ペプチド即
ちヒトリンホブラストイドインターフエロンのC
末端ペプチドを得る。 かくして得られる合成ペプチドは、これに
125、131等の放射性ヨードを導入することによ
り、ラジオイムノアツセイ法(RIA法)において
用いられる標識抗原の製造用原料である標識ペプ
チドとして利用できる。上記放射性ヨードの導入
は、通常のヨード化法、例えばクロラミTを用い
る酸化的ヨード化法〔W.Y.Hunter and F.C.
Greenwood;Nature、194、P495(1962)、
Biochem.J.89、P114(1963)参照〕等により行な
われる。具体的には例えば適当な溶媒例えば
0.2Mリン酸緩衝液(PH=7.4)等の溶媒中、クロ
ラミンTの存在下室温付近にて10〜30秒程度で行
なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラミ
ンTの使用割合は、例えばチロシン当り放射性ヨ
ード1個を導入する場合には、ペプチド中に含ま
れるチロシン分子1ナノモルに対して放射性ヨー
ドを1ミリキユーリー程度、クロラミンTを10〜
100ナノモル程度用いるのがよく、またチロシン
当り放射性ヨード個を導入する場合には、ペプチ
ド中に含まれるチロシン分子1ナノモルに対して
放射性ヨードを2ミリキユーリー程度、クロラミ
ンTを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。斯
くして製造される放射性ヨードにより標識化され
たペプチドは、通常の分離手段例えば抽出、分
配、カラムクロマトグラフイー、透析等により単
離精製される。このようにして得られるペプチド
は必要ならば凍結乾燥させて保存しておくことも
できる。 以下上記一般式(1)で表わされる合成ペプチドを
ハプテンとして利用するヒトα型インターフエロ
ン抗原の製造方法につき詳述する。 ヒトα型インターフエロン抗原は、上記ペプチ
ドの少なくとも1種をハプテンとし、これをハプ
テン−担体結合試薬の存在下に、適当な担体と反
応させることにより製造される。 上記方法においてハプテンに結合される担体と
しては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子
の天然若しくは合成蛋白質を広く使用できる。該
担体としては、例えば馬血清アルブミン、牛血清
アルブミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アル
ブミン、ヒツジ血清アルブミン等の動物の血清ア
ルブミン類、馬血清グロブリン、牛血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類、馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチ
ログロブリン等の動物のチログロブリン類、馬ヘ
モグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ
ロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブ
リン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘモシ
アニン類、回虫より抽出された蛋白質(アスカー
リス抽出物、特開昭56−16414号公報、J.
Immun.、111、260〜268(1973)、J.Immun.、
122、302〜308(1979)、J.Immun.、98、893〜900
(1967)及びAm.J.Physiol.、199、575〜578
(1960)に記載されたものまたはこれらを更に精
製したもの)、ポリリジン、リグルタミン酸、リ
ジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオルニ
チンを含む共重合体等を挙げることができる。 ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合
させる、例えばグリオキサール、マロンジアルデ
ヒド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類、チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばN,N′−o−フエニレンジマレイミ
ド、N,N′−m−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、4
−(マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル化合物、アミノ基と
カルボキシル基とをアミド結合させる通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばN,
N−ジシクロヘキシルカルボジイミド、N−エチ
ル−N′−ジメチルアミノカルボジイミド、1−
エチル−3−ジイソプロピルアミノカルボジイミ
ド、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニ
ル−4−エチル)カルボシイミド等のカルボジイ
ミド類等の脱水縮合剤を挙げることができる。ま
た上記ハプテン−担体結合試薬としては、p−ジ
アゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリー
ルカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組み合わせたもの
も使用可能である。 上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH7〜10の通常の緩衝液中好ましくはPH8〜9の
緩衝液中で、0〜40℃好ましくは室温付近で行な
われる。該反応は通常約1〜24時間好ましくは3
〜5時間で完結する。上記において用いられる代
表的緩衝液としては、次のものを例示できる。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸水素カリウム−0.05M四ホウ酸ナ
トリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を2〜6倍重量好まし
くは3〜5倍重量、及びハプテン−担体結合試薬
を5〜10倍モル程度用いるのがよい。上記反応に
よりハプテン−担体結合試薬を仲介させて担体と
ハプテンとが結合したペプチド−担体複合体から
成るヒトα型インターフエロン抗原が収得され
る。 反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈殿法等により容易に
単離精製できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法
により保存できる。 かくしてヒトα型インターフエロンのC末端ペ
プチドの少なくとも1種と、担体との複合体から
成る所望のヒトα型インターフエロン抗原を得
る。該抗原は、通常蛋白質1モルに対しペプチド
が平均5〜20モル結合したものであり、いずれも
引き続き再現性よく、ヒトα型インターフエロン
に対する特異性の高い抗体の作成を可能とするも
のである。特に上記蛋白質に対するペブチドの結
合モル比が1:8〜15のものは、特異性が一層高
く高力価、高感度の抗体を作成し得るものであり
好ましい。 上記で得られる抗原による抗体の作成は、以下
の如くして行なわれる。即ち上記抗原を哺乳動物
に投与し、生体内に産生されを抗体を採取するこ
とにより行なわれる。 抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常兎やモルモツトを用いるの
が望ましい。抗体の産生に当つては、上記により
得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃度に
希釈し、フロインドの補助液(Complete
Freund′s Adjuvant)と混合して懸濁液を調整
し、之を哺乳動物体に投与すればよい。例えば兎
に上記懸濁液を皮内注射(抗原の量として0.5〜
5mg/回)し、以後2週間毎に2〜10ケ月好まし
くは4〜6ヶ月間投与し免疫化させればよい。抗
体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量
産出される時期、通常上記最終投与1〜2週間経
過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心分
離後血清を分離採取することにより行なわれる。
上記によれば、用いる抗原の特殊性に基づいて、
ヒトα型インターフエロンに対して優れた特異性
を有し、高力価、高感度の抗体を収得できる。 かくして得られるヒトα型インターフエロン抗
体は、例えばこれをRIA法に利用してヒトα型イ
ンターフエロンの定量を高精度をもつて可能とす
る。また該抗体は、これを酵素または蛍光物質で
標識することによつてエンザイムイムノアツセイ
(EIA)法、フローレツセンスイムノアツセイ
(FIA)法等に使用できる。さらに該抗体は公知
の不溶化させる物質と反応させて不溶化抗体とす
ることもできる。 以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
1のペプチド、これを利用した抗原及び該抗原か
らの抗体の製造例を挙げるか、本発明はこれに限
定されるものではない。 尚各製造例におけるRf値はシリカゲル上の薄
層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用いて
測定したものである。 Rf〓…1−ブタノール−酢酸−水(4:1:
5) Rf〓…1−ブタノール−ピリジン−酢酸−水
(15:10:3:12) <ペプチドの合成> 製造例 1 1 Z−Lys(Tos)−Gln(OBzl)−OBzlの製造 H−Glu(OBzl)−OBzl・Tos4.18gをジメチ
ルホルムアミド(DMF)30mlに溶解し、トリ
エチルアミン(TEA)1.21mlを加え、撹拌下
冷却する。一方Z−Lys(Tos)−OH4.35gをテ
トラヒドロフラン(THF)30mlに溶解し、N
−メチルモルホリン0.98mlを加え−15℃に冷却
し、撹拌下クロロ蟻酸イソブチル1.27mlを滴下
する。滴下30秒後該液に上記で調製した冷
DMF溶液を加え、この混合液を0℃下に5分
間、次いで40℃の水浴中で1分間、更に15℃下
に30分間撹拌する。反応液よりTHF及びDMF
を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出する。
抽出液を1Nクエン酸、飽和食塩水、飽和炭酸
水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗
浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチ
ルを留去する。得られる油状残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、これを酢酸エチル−エ
ーテルより再沈殿させて目的物5.37gを得る。 Rf〓=0.96 Rf〓=0.90 元素分析値(C40H45N3O9Sとして) 計算値(%) C64.59 H6.10 N5.65 実測値(%) C64.13 H5.95 N5.63 2(a) H−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Lys(Tos)−Glu(OBzl)−OBzl5.21g
をメタノール80mlと10%酢酸20mlとの混液に
溶解し、パラジウムブラツク少量を加えH2
ガス導入下1夜撹拌する。反応終了後触媒を
吸引過により去し、液を減圧蒸留し、
残渣を水に注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.29 Rf〓=0.52 2(b) Z−Ser−Lys(Qos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−NHNH2 2.13gをDMF20mlに
溶解し、6N塩酸/ジオキサン4.20mlを加え、
−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル
1.13mlをえる。反応液がヒドラジドテスト陰
性になつた後TEA3.53mlの冷DMF1.20ml溶
液を少量宛滴下し中和させる。このアジドを
含む溶液を、上記(a)で得たH−Lys(Tos)−
Glu−OH及びTEA1.96mlの冷DMF溶液に加
え、混合液を−10〜−15℃下2時間、次いで
4℃下20時間撹拌する。DMFを減圧留去し、
残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を
1Nクエン酸及び飽和食塩水で洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧
留去する。得られる残渣にエチルエーテルを
加えて固化させ、酢酸エチル−エーテルより
再沈殿させて、目的物4.14gを得る。 Rf〓=0.64 Rf〓=0.65 元素分析値(C29H38N4O11S・1/2H2Oとし
て) 計算値(%) C52.80 H5.96 N8.49 実測値(%) C52.87 H5.69 N8.46 3(a) H−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 4.03gを
メタノール60mlと10%酢酸40との混液に溶
解し、パラジウムブラツク少量を加えH2ガ
ス導入下1夜撹拌する。反応終了後触媒を吸
引過により去し、液を減圧蒸留し、残
渣を水に注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.23 Rf〓=0.48 3(b) Z−Arg(NO2)−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHの製造 上記(a)で得たH−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHをDMF20mlに溶解し、TEA1.74mlを加
え、撹拌下冷却する。一方Z−Arg(NO2)−
OH2.41gをTHF20mlに溶解し、N−メチル
モルホリン0.70mlを加え−15℃に冷却し、撹
拌下クロロ蟻酸イソブチル0.86mlを滴下す
る。滴下30秒後該液に上記で調製した冷
DMF溶液を加え、この混合液を0℃下に5
分間、次いで40℃の水浴中で1分間、更に15
℃下に30分間撹拌する。反応液よりTHF及
びDMFを減圧留去し、残渣を2%酢酸飽和
ブタノールで抽出する。抽出液をn−ブタノ
ール飽和の2%酢酸で5回洗浄し、減圧蒸留
し、水に置き換えて酢酸を留去し、更にメタ
ノールに置き換えて水を留去する。得られる
油状残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、これを酢酸エチル−メタノールより再沈
殿させて目的物4.09gを得る。 Rf〓==0.42 Rf〓=0.65 元素分析値(C35H49N9O14S・1/2H2Oとし
て) 計算値(%) C48.83 H5.85 N14.64 実測値(%) C49.22 H6.05 N14.11 4 Z−Ser−Leu−NHNH2の製造 Z−Ser−NHNH22.54gをDMR20mlに溶解
し、6N塩酸/ジオキサン5.00mlを加え、−15℃
に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル1.34mlを加
える。反応液がヒドラジドテスト陰性になつた
後TEA4.20mlの冷DME1.40ml溶液を少量宛滴
下し中和させる。このアジドを含む溶液を、H
−Xeu−OC2H5・HCl 1.96g及びTEA 1.40ml
の冷DMF溶液15mlに加え、混合液を−10〜−
15℃下2時間、次いで4℃下20時間撹拌する。
DMFを減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出
し、酢酸エチル層を1Nクエン酸、飽和食塩水、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水
で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、
酢酸エチルを減圧留去する。得られる残渣に石
油エーテルを加えデカンテーシヨンにより洗浄
する。油状物質をデシケーター内で減圧乾燥
し、乾燥物をメタノール50mlに溶かし、氷冷下
100%ヒドラジン1水和物2.50mlを加え、室温
下20時間放置し、メタノールを減圧留去する。
残渣にエチルエーテルを加えて固化させ、これ
をデシケースー内で乾燥後、水洗過して過剰
剰のヒドラジン1水和物を除去し、メタノール
−酢酸エチルから再沈殿させて、目的物22.68
gを得る。 Rf〓0.73 Rf〓=0.76 元素分析値(C17H26N4O5として) 計算値(%) C55.73 H7.15 N15.29 実測値(%) C55.72 H7.01 N15.42 5(a) H−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの
製造 Z−Arg(NO2)−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OH 2.00gをメタノール30mlと50%酢酸30ml
との混液に懸濁し、パラジウム少量を加え
H2ガス導入36時間撹拌する。反応終了後触
媒を吸引過により去し、液を減圧蒸留
し、残渣を水に注ぎ凍結乾燥し、18時間後再
度水に溶かして凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.05 Rf〓=0.41 5(b) Z−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−NHNH21.03gをDMF15
mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサン1.41mlを
加え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソア
ミル0.38mlを加える。反応液がヒドラジドテ
スト陰性になつた後TEA1.18mlの冷
DMF0.40ml溶液を少量宛滴下し中味させる。
このアジドを含む溶液を、上記(a)で得たH−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH及び
TEA0.66mlの冷DMF溶10mlに加え、混合液
を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下20時
間撹拌する。DMFを減圧留去し、残渣を水
飽和のn−ブタノールで抽出し、ブタノール
層をn−ブタノール飽和水で5回洗浄し、減
圧留去する。得られる残渣にエチルエーテル
を加えて固化させ、メタノール−酢酸エチル
より再沈殿させて、目的物1.92gを得る。 Rf〓=0.33 Rf〓0.69 元素分析値(C44H66N10O15S・2H2Oとして) 計算値(%) C50.66 H6.76 N13.43 実測値(%) C50.57 H6.51 N13.34 6(a) H−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OHの製造 Z×Ser−Leu−Afg−Ser−Lys(Tos)−
Glu−OH1.84gをメタノール30mlと10%酢
酸30mlとの混液に懸濁し、パラジウムブラツ
ク少量を加えH2ガス導入下13時間撹拌する。
反応終了後触媒を吸引過により去し、
液を減圧蒸留し、残渣を水に注ぎ凍結乾燥し
て目的物を得る。 Rf〓=0.09 Rf〓=0.53 6(a) Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OHの製造 上記(a)で得たH−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys(Tos)−Glu−OHをDMF20mlに溶解し、
TEA0.51mlを氷冷下に加え、更にBoc−Glu
(OBzl)−ONHS 0.95gを加え、混合液を室
温下24時間撹拌する。DMFを減圧留去し、
残渣を水飽和のn−ブタノールで抽出し、ブ
タノール層をn−ブタノール飽和水で5回洗
浄する。ブタノール層を減圧留去し、得られ
る残渣にエチルエーテルを加えて固化させ、
メタノール酢酸エチルより再沈殿させて、目
的物1.70gを得る。 Rf〓=0.42 Rf〓=0.60 元素分析値(C53H81N11O18S・2H2Oとして) 計算値(%) C51.82 H6.97 N12.55 実測値(%) C51.27 H6.58 N12.47 7(a) Bnc−Glu−Ser−Leu−Arg−Sr−Lys
(Tos)−Glu−OH製造 Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OH150mgをメタノール
30mlと10%酢酸30mlとの混液に溶解し、パラ
ジウムブラツク少量を加えH2ガス導入下18
時間撹拌する。反応終了後触媒を吸引過に
より去し、液を減圧蒸留し、残渣に水を
注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 7(b) H−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OHの製造 上記(a)で得たBBoc−Glu−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHをTHFに
溶解し、室温で15分間放置する。無水エーテ
ル約30mlを加え、析出物を過し、無水エー
テルで洗浄後、水酸化カリウム−五酸化リン
を入れたデシケーター内で減圧乾燥して、目
的物を得る。 7(c) H−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−
Glu−OHの製造 上記(b)で得たH−Glu−Ser−Leu−Arg−
Ser−Lys(Tos)−Glu−OHを、予め金属ナ
トリウムで乾燥した液体アンモニアに溶解
し、撹拌下に金属ナトリウムの小片を溶液が
青色を30秒〜1分間保つまで加える。更に結
晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発留去後、
溶出液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG
−25ゲルによりゲル過して、目的物58mgを
得る。以下これを「ペプチドA」と呼ぶ。 Rf〓=0.04 Rf〓=0.34 元素分析値(C34H61N11O14・C2H4O2・
3H2Oとして) 計算値(%) C44.95 H7.44 N16.02 実測値(%) C45.05 H7.11 N15.84 8(a) H−Gln−NHNHBocの製造 Z−Gln−NHNHBoc 16.00gをメタノー
ル100mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量
を加えH2ガス導入下8時間撹拌する。反応
終了後触媒を吸引過により去し、を減
圧蒸留し、残渣をデシケーター内で減圧乾燥
して目的物を得る。 Rf〓=0.37 Rf〓=0.58 8(b) Z−Leu−Gln−NHNHBocの製造 上記(a)で得たH−Gln−NHNHBocを
THF50mlに溶解し、氷冷下Z−Leu−
ONHS 5.51gを加え、室温下18時間撹拌す
る。THFを減圧留去し、残渣を酢酸エチル
で抽出し、酢酸エチル層を1Nクエン酸、飽
和食塩水、飽和炭酸水ナトリウム水溶液及び
飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、酢酸エチルを留去する。得られ
る油状残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、これをメタノール−エチルエーテルより
再沈殿させて目的物6.04gを得る。 Rf〓=0.81 Rf〓=0.86 元素分析値(C24H37N5O7として) 計算値(%) C56.79 H7.35 N13.80 実測値(%) C56.67、H7.15 N13.75 9(a) H−Leu−Gln−NHNHBocの製造 Z−Leu−Gln−NHNHBoc 2.79gをメタ
ノール80mlに懸濁し、パラジウムブラツク少
量を加えH2ガス導入下32時間撹拌する。反
応終了後触媒を吸引過により去し、液
を減圧留去し、残渣をデシケーター内で減圧
乾燥して、目的物を得る。 Rf〓=0.33 Rf〓=0.66 9(b) Z−Asn−Leu−Gln−NHNHBocの製造 上記(a)で得たH−Leu−Gln−NHNHBo
をDMF30mlに溶解し、撹拌下冷却する。一
方、Z−Asn−OH 1.61gをTHF30mlに溶
解し、N−メチルモルホリン0.62mlを加え−
15℃に冷却し、撹拌下クロロ蟻酸イソブチル
0.80mlを滴下する。滴下30秒後該液に上記で
調整した冷DMF溶液を加え、この混合液を
0℃下に5分間、次いで40℃の水浴中で1分
間、更に15℃下に30分間拌する。反応液より
THF及びDMFを減圧留去し、残渣を酢酸エ
チルで抽出する。抽出液を1Nクエン酸、飽
和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及
び飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥後、酢酸エチルを留去する。得ら
れる油状残渣にエチルエーテルを加えて固化
させ、メタノール−酢酸エチルで再沈殿させ
て目的物2.55gを得る。 Rf〓=0.63 Rf〓=0.77 元素分析値(C28H43N7O9として) 計算値(%) C53.10 H6.97 H15.77 実測値(%) C53.67 H6.63 H15.68 10(a) Z−Thr−ONHSの製造 Z−Thr−OH 1.28gをTHF30mlに溶解
し、これにNHS 0.58gを加え、氷冷し、次
いでN,N−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(DCC)1.05gを加える。この混合液を4
℃で24時間撹拌し、析出物を去し、液を
減圧留去し、残渣エチルエーテルを加え、デ
カンテーシヨン洗浄する。得られる油状物質
をデシケーター内にて減圧乾燥して目的物を
得る。 10(b) H−Asn−Leu−Gln−NHNHBocの製造 Z−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc 2.43g
をメタノール80mlに懸濁し、パラジウムブラ
ツク少量を加え、H2ガス導入下18時間撹拌
する。反応終了後触媒を吸引過により去
し、液を減圧留去し、デシケーター内で減
圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.31 Rf〓=0.64 10(c) Z×Thr−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc
の製造 上記(b)で得たH−Asn−Leu−Gln−
NHNHBocをDMF30mlに溶解し、この溶液
に上記(a)で得たZ−Thr−ONHSのDMF20
ml溶液を氷冷下に加え、混合液を室温下18時
間撹拌する。DMFを減圧留去して得られた
残渣に1Nクエン酸を加えて固化し、メタノ
ール−酢酸エチルより再沈殿させて、目的物
2.12gを得る。 Rf〓=0.82 Rf〓=0.79 元素分析値(C32H50N8O11として) 計算値(%) C53.18 H6.97 N15.50 実測値(%) C52.85 H6.95 N15.28 11(a) Z−Thr−Asn−Leu−Gln−NHNH2の製
造 Z−Thr−Asn−Leu−Gln−NHNHBoc
0.91gをTFA8mlに溶解し、室温下15分間放
置する。無水エーテル80mlを加えて析出物を
すばやく過し、無水エーテルで洗浄後、水
酸化カリウム−五酸化リンを入れたデシケー
ター内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.34 11(b) H−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lyg(Tos)−Glu−OHの製造 Boc−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser
−Lys(Tos)−Glu−OH 1.00gをTFA8mlに
溶解し、室温下15分間放置する。無水エーテ
ル80mlを加えて析出物をすばやく過し、無
水エーテルで洗浄後、水酸化カリウム−五酸
化リンを入れたデシケーター内で減圧乾燥し
て目的物を得る。 Rf〓=0.24 Rf〓=0.44 11(c) Z−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu(OBzl)−
Ser−Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−
OHの製造 上記(a)で得たZ−Thr−Asn−Leu−Gln
−NHNH2をDMF10mlに溶解し、6N塩酸/
ジオキサン0.63mlを加え、−15℃に冷却し、
撹拌下亜硝酸イソアミル0.17mlを加える。反
応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA0.53mlの冷DMF0.40ml溶液を少量宛滴
下し中和させる。このアジドを含む溶液を、
上記(b)で得たH−Glu(OBzl)−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH及び
TEA0.4mlの冷DMF溶液10mlに加え、混合
液を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下18
時間撹拌反応させる。さらに上記(a)と同様に
してZ−Thr−Asnn−Leu−Gln−
TNHNBoc 1.16gをTFAで処理して得た反
応物を上記反応混合物に加え24時間同温度下
に撹拌反応させるDMFを減圧留去し、残渣
を水飽和のn−ブタノールで抽出し、n−ブ
タノール飽和の水で5回洗浄し、減圧蒸留す
る。残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、メタノール酢酸エチルより再沈殿させ更
に熱メタノールで洗浄して、目的物を得る。 11(d) H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−
Leu−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHの製
造 上記(c)で得たZ−Thr−Asn−Leu−Gln
−Glu(OBzl)−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Gln−OHをメタノール50ml及び30
%酢酸50mlとの混液に懸濁させ、パラジウム
ブラツク少量を加え、H2ガス導入下18時間
撹拌する。反応終了後触媒を吸引過により
去し、液を減圧濃縮し、メタノールを完
全に留去後、得られる濃縮を、50%酢酸を溶
出液とするセフアデツクスG−25によりゲル
過して、目的とするフラクシヨンを集め凍
結乾燥して目的物740mgを得る。 Rf〓=0.17 Rf〓=0.35 元素分析値(C66H99N17O23・C2H4O2・
2H2Oとして) 計算値(%) C48.91 H7.08 N15.64 実測値(%) C48.82 H6.63 N15.74 12 H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu
−Arg−Ser−Lys−Gln−OHの製造 H−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu
−Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 51.0mgを、
予め金属ナトリウムで乾燥した液体アンモニア
に溶解し、撹拌下に金属ナトリウムの小片を溶
液が青色を30秒〜1分間保つまで加える。更に
結晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発留去後、溶
出液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG−25
ゲルによりゲル過して、目的とするフラクシ
ヨンを集め、これを濃縮後水を加えて凍結乾燥
して、目的物32mgを得る。以下これを「ペプチ
ドB」と呼ぶ。 Rf〓=0.01 Rf〓=0.37 元素分析値(C53H93N17O21・C2H4O.3H2Oと
して) 計算値(%) C46.57 H7.32 N16.79 実測値(%) C46.10 H6.98 N16.82 13 Z−Leu−Ser−OCH3の製造 H−Ser−OCH3・HC 1.81gのDMR25
mlに溶解し、TEA1.62mlを加え−10℃に氷冷
する。撹拌下Z−Leu−ONHS 4.21gを加え、
室温で18時間撹拌続ける。DMFを減圧留去し、
残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチ
ルを減圧留去する。得られる残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、酢酸エチル−エーテル
より再沈殿させて、目的物2.68gを得る。 Rf〓=0.81 Rf〓=0.82 元素分析値(C18H26N2O6として) 計算値(%) C59.00 H7.15 N7.65 実測値(%) C58.62 H7.03 N7.65 14(a) H−Leu−Ser−OCH3・HCの製造 Z−Leu−Ser−OCH3 4.20gをメタノー
ル40mlと1N塩酸11.46mlとの混液に懸濁さ
せ、パラジウムブラツク少量を加え、H2ガ
ス導入下18時間撹拌する。反応終了後触媒を
吸引過により去し、液を減圧蒸留し、
更に水を加え減圧蒸留する操作を3回繰返
す。残渣を五酸化リンを入れたデシケーター
内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓=0.38 14(b) Z−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 Z−Ser−NHNH2 3.19gをDMF25mlに
溶解し、6N HC/ジオキサン6.30mlを加
え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミ
ル1.69mlを加える。反応液がヒドラジドテス
ト陰性になつた後TEA5.29mlの冷DMF1.76
ml溶液を少量宛滴下し中和させる。このアジ
ドを含む溶液を、上記(a)で得たH−Leu−
Ser−OCH3・HC及びTHA1.60mlの冷
DMF溶液20mlに加え、混合液を−10〜−15
℃下2時間、次いで4℃下18時間撹忰する。
DMFを減圧留去し、残渣に水を加えて固化
させ、メタノール−酢酸エチルより再沈殿さ
せて、目的物4.11gを得る。 Rf〓=0.76 Rf〓=0.79 元素分析値(C21H31N3O8として) 計算値(%) C55.62 H6.89 N9.27 実測値(%) C55.48 H6.92 N9.18 15 Z−Ser−Leu−Ser−NHNH2の製造 Z−Ser−Leu−Ser−OCH3 2.00gをメタノ
ール40mlに溶解し、氷冷下100%NH2NH2・
H2O 1.10mlを加え、室温で18時間放置する。
反応終了後、溶媒を減圧留去し、エーテルを加
えて固化させ、過剰のNH2NH2・H2Oを水を
加えて除去し、メタノール−酢酸エチルより再
沈殿させて目的物1.91gを得る。 Rf〓=0.43 Rf〓=0.73 元素分析値(C20H31N5O7として) 計算値(%) C52.97 H6.89 N15.44 実測値(%) C52.85 H6.70 N15.44 16(a) Z−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−Ser−NHNH2 70.42mgを
DMF5mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサンの
DMF10倍希釈液0.78mlを加え、−15℃に冷却
し、撹拌下亜硝酸イソアミルのDMF10倍希
釈液0.20mlを加え、反応液がヒドラジドテス
ト陰性になつた後、TEAのDMF10倍希釈液
0.65mlを少量宛滴下し中和させる。このアジ
ドを含む溶液を、上記11(d)で得たH−Thr−
Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−
Ser−Lys(Tos)−Glu−OH 151mgとTEAの
DMF 10倍希釈液0.29mlの冷DMF5ml溶液に
加え、混合液を−10〜−15℃下2時間、次い
で4℃下18時間撹拌する。更にZ−Ser−
Leu−Ser−NHNH2 117.36mgを加え、24時
間反応させる。 DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のn−
ブタノールで抽出し、n−ブタノール飽和の
水で10回、更にn−ブタノール飽和の2%酢
酸で5回洗浄し、減圧濃縮し、水を加えて更
に減圧濃縮し、完全にn−ブタノールを留去
後、凍結乾燥する。これを酢酸エチル−エー
テルで沈殿させて目的物を得る。 16(b) H−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−
Glu−OHの製造 Z−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OH 150mgを予め金属ナトリ
ウムで乾燥した液体アンモニアに溶解し、撹
拌下金属ナトリウムの小片を溶液が青色を30
秒〜1分間保つまで加える。更に結晶NH4C
を加え、過剰のナトリウムを中和し、室温
でアンモニアを完全に蒸発後、溶出液に50%
酢酸を用いたセフアデツクスG−25ゲルによ
りゲル過して、フラクシヨンを集めこれを
濃縮後水を加えて凍結乾燥して、目的物94mg
を得る。以下これを「ペプチドC」と呼ぶ。 Rf〓=0.02 Rf〓=0.39 元素分析値(C65H120N20O26・C2H4O2・
H2Oとして) 計算値(%) C48.19 H7.24 N16.78 実測値(%) C47.93 H6.93 N16.49 17(a) Z−Tyr−OSuの製造 Z−Tyr−OH 1.04gをTHF30mlに溶解
し、N−ヒドロキシサクシンイミド0.38gを
加え、氷冷後更にDCC0.68gを氷冷下に加
え、混合物を4℃で18時間撹拌する。析出物
を吸引過により除き、液を減圧濃縮し、
残渣にエチルエーテルと石油エーテルとを加
えてデカンテーシヨン、乾燥して目的物を得
る。 17(b) H−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 参考例14(b)で得たZ−Ser−Leu−Ser−
OCH3 1.00gをメタノール20mlと10%酢酸20
mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量を加
え、H2ガス導入下14時間撹拌する。反応終
了後触媒を吸引過により去し、液を減
圧濃縮後水を加えて凍結乾燥して目的物を得
る。 Rf〓=0.35 Rf〓=0.65 17(c) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−OCH3の製造 上記(b)で得たH−Ser−Leu−Ser−OCH3
をDMF10mlに溶解し、TEA0.31mlを氷冷下
に加え、この溶液に上記(a)で得たZ−Tyr−
OSuの冷DMF溶液を撹拌下に加える。混合
液を室温下18時間撹拌し、DMFを減圧留去
し、残渣に水を加えて固化させ、メタノール
エーテル次いでメタノール酢エチルから再沈
殿させて目的物1.08gを得る。 Rf〓=0.78 Rf〓=0.82 元素分析値(C30H40N4O10として) 計算値(%) C58.43 H6.54 N9.09 実測値(%) C58.14 H6.58 N9.16 17(d) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−NHNH2の製
造 Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−OCH3 1.00g
をメタノールに溶解し、氷冷下100%
NH2NH2・H2O 0.82mlを加え、室温で18時
間放置する。メタノールを減圧留去し、残渣
にエチルエーテルを加えて固化させ、水洗に
より過剰のNH2NH2・H2Oを除去し、メタ
ノール−エーテルで再沈殿後熱メタノールで
洗浄して目的物0.81gを得る。 Rf〓=0.45 Rf〓=0.76 元素分析値(C29H40N6O9として) 計算値(%) C56.48 H6.54 N13.63 実測値(%) C56.12 H6.57 N13.58 18(a) Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−
Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys(Tos)−Glu−OHの製造 Z−Tyr−Ser−Leu−Ser−NHNH2 42.3
mgをDMF4mlに溶解し、6N塩酸/ジオキサ
ンのDMF10倍希釈液0.34mlを加え、−15℃に
冷却し、撹拌亜硝酸イソアミルのDMF10倍
希釈液0.09mlを加え、反応液がヒドラジンテ
スト陰性になつた後、TEAのDMF10倍希釈
液0.29mlを少量ずつ滴下し中和させる。この
アジドを含む溶液を、H−Thr−Asn−Leu
−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys
(Tos)−Glu−OH 50.0mgとTHAのDMF10
倍希釈液0.10の冷DMF4ml溶液に加え、混合
液を−10〜−15℃下2時間、次いで4℃下18
時間撹拌する。更にZ−Tyr−Ser−Leu−
Ser−NHNH2 42.3mgを加え24時間反応させ
る。DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のn
−ブタノール30mlで抽出し、抽出液をn−ブ
タノール飽和水で10回、次いでn−ブタノー
ル飽和の2%酢酸で5回洗浄する。有機層を
集め減圧濃縮し、n−ブタノールを留去後、
凍結乾燥し、酢酸エチル−エーテルで再沈殿
させて目的物を得る。 18(b) H−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−
Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−
Lys−Glu−OHの製造 上記(a)で得たZ−Tyr−Ser−Leu−Ser−
Thr−Asn−Leu−Gln−Glu−Ser−Leu−
Arg−Ser−Lys(Tos)−Glu−OHを予め金
属ナトリウムで乾燥した液体アンモニアに溶
解し、撹拌下金属ナトリウムの小片を溶液が
青色を30並〜1分間保つまで加える。更に結
晶NH4Cを加え、過剰のナトリウムを中和
し、室温でアンモニアを完全に蒸発後、溶出
液に50%酢酸を用いたセフアデツクスG−25
ゲルによりゲル過して、フラクシヨンを集
め目的物33mgを得る。以下これを「ペプチド
D」と呼ぶ。 Rf〓=0.02 Rf〓=0.35 元素分析値(C74H123N21O28・C2H4O2・
4H2Oとして) 計算値(%) C47.71 H7.30 N15.79 実測値(%) C47.32 H7.24 N15.82 <抗原の製造> 製造例 1 ペプチドの合成製造例7(c)で得たペプチドAの
5mg及び牛血清アルブミン(以下「BSA」と略
記する)の15mgを酢酸アンモニウム緩衝液(0.1
モル、PH7.0)2mlにとかす。この溶液に0.1モル
のグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、室温
で5時間撹拌する。その後反応混合物を48時間、
4℃で水1で透析する。透析中5回水を交換す
る。その後、ペプチド−蛋白質複合体を含有する
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原(以下「抗原」と呼ぶ)15mgを得る。 この抗原は、BSA1モルに対してペプチドA
が平均10モル結合したものである。尚このペプチ
ドAとBSAとの結合率は、得られる抗原を更
にセフアデツクスG−50(溶出液:生理食塩水、
検出:OD280nm、流出速度:3ml/時間、分取
量:1mlずつ)でゲル過した際、未反応BSA
及びペプチドAの存在は認められないことより、
該ゲル過によつてBSAに結合したペプチドA
のフラクシヨンと他の生成体(ペプチドAの2量
体)のフラクシンとを分離し、ペプチド2量体の
標準濃度の検量線を作成して、上記2量体の量を
求め、これを出発原料として用いたペプチドAの
量から差し引いた値がすべてBSAに結合してい
るとして求めたものである。以下の抗原製造例に
より得られる各抗原についても同様である。 製造例 2 ペプチド合成製造例12で得たペプチドBの5mg
及びBSAの5mgを酢酸アンモニ緩衝液(0.1モル、
PH7.0)2mlにとかす。この溶液に0.1モルのグル
タールアルデヒド0.11mlを加え、室温で5時間撹
拌する。その後反応混合物を48時間、4℃で水1
で透析する。透析中5回水を交換する。その
後、ペプチド−蛋白質複合体を含む溶液を凍結乾
燥してヒトα型インターフエロン抗原(以下「抗
原」と呼ぶ)9mgを得る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドBが平均9モル結合したものである。 製造例 3 ペプチド合成製造例16(b)で得たペプチドCの5
mg及びBSA25mgを水4mlに溶解する。この溶液
にジシクロヘキカカーボジイミ(DCC)200mgを
加、室温で5時間撹拌する。次に反応混合物を水
2を用い4℃にて48時間要して透析する。透析
中5回水を交換する。その後ペプチド−蛋白質複
合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトα型インター
フエロン抗原(以下「抗原」と呼ぶ)28mgを得
る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドCが平均12モル結合したものである。 製造例 4 ペプチド合成製造例18(b)で得たペプチドDの4
mg及びBSAの20mgを酢酸アンモニウム緩衝液
(0.1モル、PH7.0)2mlに溶かす。この溶液に0.1
モルのグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、
室温で5時間撹拌する。その後反応混合物を48時
間、4℃で水1で透析する。透析中5回水を交
換する。その後、ペプチド−蛋白質複合体を含む
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原(以下「抗原」と呼ぶ)22mgを得る。 得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドDが平均9モル結合したものである。 <抗体の製造> 製造例 1 抗原の製造例3で得た抗原の100μgを1.5ml
の生理食塩水に溶液後、之にフロインド補助液
1.5mlを加えて調製した懸濁液を、7羽の兎(2.5
〜3.0Kg)に皮下投与し、2週間毎に6回同量投
与する。更にその後1カ月毎に3回、最初投与し
た量と同量を投与する。最終投与後7日経過して
のち試験動物から採血し、遠心分離して抗血清を
採取して、ヒトα型インターフエロン抗体(以下
「抗体」と呼ぶ)を得る。 製造例 2〜4 抗原の製造例1、2及び4で得た抗原、及
びを用い、上記製造例1と夫々同様にしてヒト
α型インターフエロン抗体(抗体、及び)
を夫々得る。 Γ標識ペプチドの製造 H−Thr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu
−Gln−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−Glu
−OH即ちペプチドDをクロラミンTを用いる方
法で以下の通り標識化する。 即ち上記ペプチド5μgの0.5モルのリン酸塩緩
衝液(PH7.0)20μにNa〔125〕(carrier fvee
N.E.N.)1ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩
衝液を加え、次にクロラミンT70mg/mlの0.5モル
リン酸塩緩衝液20μを加える。室温で30秒間撹
拌して60mg/mlのメタ重亜硫酸ナトリウム
(Na2S2O5)の0.5Mリン酸塩緩衝液50μを加え
ることで反応を終わらせる。次いで反応液に1%
の冷沃化ナトリウム水溶液100μを加え、反応
混合物をセフアデツクスG−25のカラム(1.0×
30cm)にかけ(溶出液0.25%BSA、10mM
EDTA及び0.02%NaN3を含む0.05モルリン酸塩
緩衝液、PH7.4)、125で標識されたペプチドDを
得る。 Γ力価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩で10、102、
103、104、105……倍に希釈(イニシヤル)し、
これらの夫々100μに、125標識ペプチド(上
記で得られる標識ペプチドを約9500cpmになるよ
うに希釈したもの)0.1ml及び0.05モルリン酸塩
緩衝液(PH=7.4)〔0.25%BSA、10mM EDTA
及び0.02%NaN3を含む〕0.2mlを加え、4℃で24
時間インキユベートし、生成した抗体と125標
識抗原との結合体を、デキストラン−活性炭法及
び遠心分離法(4℃、30分間、3000rpm)により
未反応(結合しない)125標識ペプチドから分
離し、その放射線をカウントし、各希釈濃度にお
ける抗体の125標識ペプチドとの結合率(%)
を測定する。縦軸に抗体の125標識ペプチドと
の結合率(%)及び横軸に抗体の希釈倍率(イニ
シヤル濃度)をとり、各々の濃度において結合率
をプロツトする。結合率が50%となる抗体の希釈
倍率即ち抗体の力価を求める。その結果抗体の
力価は、50000であつた。 Γ抗体のヒトα型インターフエロン特異性試験 供試試料として各種濃度のヒトβ型インターフ
エロン(東京都総合臨床研究所製、比活性3×
106U/mgプロテイン)、ペプチドの合成製造例16
(b)で得たペプチドC即ちヒトα型インターフエロ
ンのペプチド鎖及びヒトα型インターフエロン
〔林原研究所製、リムホブラストイドインターフ
エロン〕を使用する。また標準希釈剤として0.25
%BSA、5mM EDTA及び0.02%のNaN3を含む
0.05モルリン酸塩緩衝液(PH7.4)を使用する。 各々の試験管に、標準希釈剤0.2ml、供試試料
0.1ml、抗体の製造例3で得た抗体の0.1ml及び
125標識ペプチド(上記で得られる標識ペプチ
ドを約2800cpmになるように希釈したもの)0.1
mlを入れ、4℃で72時間インキユベートした後、
ノーマルブタ血清(normal porcine serum)を
0.1ml加え、次いでデキストランで被膜した活性
炭の懸濁液0.5mlを加え、4℃で30分間放置し、
次に4℃、3000rpmの条件下に30分間遠心分離を
行ない、抗体と125標識ペプチドとの結合体及
び未反応(結合しない)125標識ペプチドを分
離し、その放射線をカウントし、用いた抗体の力
価に相当する結合率(Bo)を100%として、供試
試料の濃度及び希釈率における抗体と125標識
ペプチドとの結合体(B)の百分率を求める。得られ
る結果より抗体は、ヒトα型インターフエロン
に対する反応性とヒトβ型インターフエロンに対
する反応性において明確に区別され、このことよ
りβ型インターフエロンに低交叉性の、特異性の
高い抗体であることが判る。 また抗体、及びについても同様の試験を
行なつた結果抗体と略々同様にヒトα型インタ
ーフエロンに対し特異性の高い抗体であることが
確認された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 一般式 R−Glu−Ser−Leu−Arg−Ser−Lys−Glu−
OH 〔式中Rは水素原子、H−Thr−Asn−Leu−
Gln基、H−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−
Gln基又はH−Tyr−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn
−Leu−Gln基を示す。〕 で表わされるヒトリムホブラストイドインターフ
エロンのC末端ペプチドからなる群から選ばれた
化合物と担体との複合体からなるヒトα型インタ
ーフエロン抗原を哺乳動物に投与し、生成する抗
体を採取することを特徴とするヒトα型インター
フエロン抗体の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4985882A JPS5835125A (ja) | 1982-03-26 | 1982-03-26 | ヒトα型インタ−フエロン抗体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4985882A JPS5835125A (ja) | 1982-03-26 | 1982-03-26 | ヒトα型インタ−フエロン抗体の製造法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56133129A Division JPS5835155A (ja) | 1981-03-31 | 1981-08-24 | ヒトリムホブラストイドインターフェロンのc末端ペプチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5835125A JPS5835125A (ja) | 1983-03-01 |
JPH0160780B2 true JPH0160780B2 (ja) | 1989-12-25 |
Family
ID=12842743
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4985882A Granted JPS5835125A (ja) | 1982-03-26 | 1982-03-26 | ヒトα型インタ−フエロン抗体の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5835125A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2667830B2 (ja) * | 1987-09-07 | 1997-10-27 | 株式会社クラレ | エチレン−ビニルアルコール系共重合体組成物 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS55113753A (en) * | 1979-02-22 | 1980-09-02 | Toyo Jozo Co Ltd | Parathyroid hormone derivative |
JPS5657753A (en) * | 1979-10-16 | 1981-05-20 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel glucagon fragment, and its use |
-
1982
- 1982-03-26 JP JP4985882A patent/JPS5835125A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS55113753A (en) * | 1979-02-22 | 1980-09-02 | Toyo Jozo Co Ltd | Parathyroid hormone derivative |
JPS5657753A (en) * | 1979-10-16 | 1981-05-20 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel glucagon fragment, and its use |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS5835125A (ja) | 1983-03-01 |
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