JPH0224280B2

JPH0224280B2 -

Info

Publication number: JPH0224280B2
Application number: JP57049859A
Authority: JP
Inventors: Fumio Shimizu; Yasukazu Oomoto; Kenichi Imagawa
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-03-26
Filing date: 1982-03-26
Publication date: 1990-05-29
Also published as: JPS5835123A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なヒトα型インターフエロン抗原
の製造法に関る。本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合
IUPAC、IUBの規定或いは当該分野における慣
用記号に従うものとし、その例を次に挙げる。ま
たアミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。 Ser：セリン Leu：ロイシン Thr：スレオニン Asn：アスパラギン Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Arg：アルギニン Lys：リジン Tyr：チロシン OBzl：ベンジルオキシ基Ｚ：カルボベンゾキシ基 NHS：Ｎ―ヒドロキシコハク酸イミド基 Tos：ｐ―トルエンスルホニル基 Bos：第３級ブトキシカルボニル基インターフエロンは、生体の細胞がウイルス感
染を受けた時に産生する抗ウイルス性糖蛋白質乃
至は蛋白質であり、その利用によればウイルス性
疾患の予防または治療が可能であるとされ、近年
注目を集めつつある。現在解明されているヒトの
インターフエロンは、β型インターフエロン
（Fibro blast interferon）、α型インターフエロ
ン（Leucocytes intevferon，Lympho blastoid
interferon）及びγ型インターフエロン
（Immune interferon）に分類される。しかしな
がらこれらのインターフエロンを単一な糖蛋白質
乃至は蛋白質にまで精製する技術は未だ確立され
ていない。本発明者らはヒトのα型インターフエロンに対
して特異的に反応する抗体を利用すれば、抗原―
抗体反応によつてヒトα型インターフエロンを精
製出来ると考え、この着想から感度よくヒトα型
インターフエロンを選択し、該インターフエロン
に対して特異的反応性を示す抗体を得るべく鋭意
研究を進めてきた。その過程において、ヒトα型
インターフエロンの１種であるヒトリムホブラス
トイドインターフエロンのＣ末端ペプチド鎖を有
するある種のペプチドを合成し、これをハプテン
として抗原を合成するに成功し、該抗原からヒト
α型インターフエロンに対し特異的反応性を有す
る所望の抗体が収得できることを見い出した。本
発明はこの新しい知見に基づき完成されたもので
ある。即ち本発明は、一般式Ｒ―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys―Glu―
OH (1) 〔式中Ｒは水素原子、Ｈ―Thr―Asn―Leu―
Gln基、Ｈ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu―
Gln基、又はＨ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―
Asn―Leu―Gln基を示す。〕で表わされるヒトリムホブラストイドインターフ
エロンのＣ末端ペプチドからなる群から選ばれた
化合物をハプテンとし、これをハプテン―担体結
合試薬の存在下に担体と反応させることを特徴と
するヒトα型インターフエロン抗原の製造法に係
る。本発明によれば、入手容易な市販のアミノ酸を
利用して簡単な操作で容易に合成可能な上記一般
式(1)で表わされるペプチドをハプテンとして用い
ることにより、認識部位が明確な一定の抗原を大
量に製造することができる。しかもかくして得ら
れる本発明の抗原からは、天然のα型インターフ
エロンを抗原とする場合に比し、大量にしかも常
に安定して、ヒトα型インターフエロンに対し特
異性の高い抗体を得ることができ、該抗体はこれ
を例えばアフイニテイ―クロマトグラフイー用担
体と結合させて、該クロマトグラフに利用してヒ
トα型インターフエロンの精製に用い得る。上記一般式(1)で表わされるペプチドは、ヒトリ
ムホブラストイドインターフエロンのＣ末端ペプ
チド鎖に相当するペプチドである。これは通常の
ペプチド合成法、具体的には、「ザペプチド
（The Peptides）」第１巻（1966年）〔Schroder
and Luhke著，Academic Press，New York，
U.S.A.〕あるいは「ペプチド合成」〔泉屋ら著，
丸善株式会社（1975年）〕に記載される如き方法
に従い、たとえばアジド法、クロライド法、酸無
水物法、混酸無水物法、DCC法、活性エステル
法（ｐ―ニトロフエニルエステル法、Ｎ―ヒドロ
キシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエ
ステル法等）、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／
アデイテイブ（HONB、HOBt、HOSu）法など
により製造できる。上記方法においては、固相合
成法及び液相合成法のいずれをも適用できるが、
液相合成法が好ましい。通常ペプチドは、上記し
た一般のポリペプチドの合成法に従い、例えば末
端アミノ酸に順次１個づつアミノ酸を縮合させる
所謂ステツプワイド法により、又は数個のフラグ
メントに分けてカツプリングさせていく方法によ
り製造される。より詳細には上記ペプチドは、そ
の結合の任意の位置で２分される２種のフラグメ
ントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応
性アミノ基を有する原料とを、ペプチド合成の常
套手段で縮合させ、生成する縮合物が保護基を有
する場合、その保護基を常套手段で脱離させるこ
とにより製造し得る。上記ペプチドの合成反応工程でリジンは通常保
護しておくのが望ましい場合が多い。また上記反
応の最終工程では、通常ペプチドの構成アミノ酸
残基の少なくとも一つが保護された保護ペプチド
からすべての保護基を脱離する。更に上記合成反
応工程では、反応に関与すべきでない官能基は、
通常の保護基により保護され、反応終了後該保護
基は脱離される。また反応に関与する官能基は、
通常活性化される。之等各反応方法は公知であ
り、それに用いられる試薬等も公知のものから適
宜選択し得る。アミノ基の保護基としては、例えばカルボベン
ゾキシ、tert―ブチルオキシカルボニル、tert―
アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカ
ルボニル、ｐ―メトキシベンジルオキシカルボニ
ル、２―クロル―ベンジルオキシカルボニル、ア
ダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセ
チル、フタリル、ホルミル、ｏ―ニトロフエニル
スルフエニル、ジフエニルホスフイノチオイルな
どが挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は、例えばアルキルエステル（例メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、tert―ブチルなどのアル
キルエステル）、ベンジルエステル、ｐ―ニトロ
ベンジルエステル、ｐ―メトキシベンジルエステ
ル、ｐ―クロルベンジルエステル、ベンズヒドリ
ルエステル、カルボベンゾキシヒドラジド、tert
―ブチルオキシカルボニルヒドラジド、トリチル
ヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。アルギニンのグアニジノ基保護基としては、例
えばニトロ、トシル、ｐ―メトキシベンゼンスル
ホニル、カルボベンゾキシ、イソボルニルオキシ
カルボニル、アダマンチルオキシカルボニル等が
挙げられる。また、そのグアニジノ基は適当な酸
例えばベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン
酸、塩酸、硫酸などの塩の形で保護してもよい。スレオニン及びセリンの水酸基は、例えばエス
テル化またはエーテル化によつて保護することが
できるが必ずしも保護する必要はない。このエス
テル化に適する基としては、例えばアセチル等の
低級アルカノイル、ベンゾイル等のアロイル、ベ
ンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボ
ニル等の炭酸から誘導される基等が挙げられる。
またエーテル化に適する基としては、例えばベン
ジル、テトラヒドロピラニル、tert―ブチル等で
ある。カルボキシル基の活性化されたものとしては、
例えば対応する酸クロライド、酸無水物又は混合
酸無水物、アジド、活性エステル（メチルアルコ
ール、エチルアルコール、ベンジルアルコール、
ペンタクロロフエノール、ｐ―ニトロフエノー
ル、Ｎ―ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ―ヒドロ
キシベンズトリアゾール、Ｎ―ヒドロキシ―５―
ノルボルネン―２，３―ジカルボキシイミド等と
のエステル）等が挙げられる。尚ペプチド結合形
成反応は、縮合剤例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、カルボジイミダゾール等のカルボジイ
ミド試薬やテトラエチルピロホスフイト等の存在
下に実施し得る場合もある。上記一般式(1)で表わされるペプチドは、Ｒで示
される基の種類に応じて、より具体的には以下に
示す〔〕〜〔〕の方法に従い製造される。〔〕Ｒが水素原子を示す場合

【表】｜
A−Glu−B (15)

【表】〔〕ＲがＨ―Thr―Asn―Leu―Gln基を示
す場合

【表】〔〕ＲがＨ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―
Leu―Gln基を示す場合

【表】

【表】〔〕ＲがＨ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―
Asn―Leu―Gln基を示す場合

【表】〔上記〔〕〜〔〕において、Ａはアミノ基
の保護基、Ｂは水酸基又はカルボキシル基の活性
基、Ｃはアルギニンのグアニジノ基の保護基、Ｄ
はリジンのε―アミノ基の保護基、Ｅはグルタミ
ン酸のγ―カルボキシル基の保護基及びＦはカル
ボキシル基の保護基を示す。〕上記においてＡの好ましいものとしては、
Boc、Ｚ、ｐ―メトキシベンジルオキシカルボニ
ル基等を、Ｂの好ましいものとしては、Ｎ―ヒド
ロキシサクシンイミド、ｐ―ニトロフエニルエス
テル等の活性エステル残基、イソブチルオキシカ
ルボニル基等の混合酸無水物残基、アジド等を、
Ｃの好ましいものとしては、ニトロ、トシル等
を、Ｄの好ましいものとしては、トシル等を、Ｅ
の好ましいものとしては、ベンジルオキシ等を、
またＦの好ましいものとしてはアルキルエステル
残基、tert―ブトキシカルボニルヒドラジド等を
夫々例示できる。上記方法〔〕においてアミノ酸２とアミノ酸
３との反応は、溶媒の存在下に行ない得る。溶媒
としては、ペプチド縮合反応に使用し得ることが
知られている各種のもの例えば無水または含水の
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロル
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ―
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を用い得る。アミノ
酸３とアミノ酸２との使用割合としては、特に限
定されないが、通常前者に対して後者を等量〜５
倍量、好ましくは等量〜1.5倍量使用するのがよ
い。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され
得ることが知られている範囲、通常約−40〜約60
℃、好ましくは約−20〜約40℃の範囲から適宜選
択される。反応時間は一般に数分〜30時間程度で
ある。方法〔〕におけるペプチド５とアミノ酸６と
の反応、ペプチド８とアミノ酸９との反応、ペプ
チド11とアミノ酸12との反応、ペプチド14とアミ
ノ酸15との反応及びアミノ酸６とアミノ酸45との
反応は、上記アミノ酸２とアミノ酸３との反応と
同様にして行ない得る。また方法〔〕における
アミノ酸18とアミノ酸19との反応、ペプチド21と
アミノ酸22との反応、ペプチド24とアミノ酸25と
の反応及びペプチド27とペプチド28との反応、方
法〔〕におけるアミノ酸19とアミノ酸31との反
応、ペプチド33とアミノ酸６との反応及びペプチ
ド35とペプチド36との反応、並びに方法〔〕に
おけるペプチド39とアミノ酸40との反応及びペプ
チド42とペプチド36との反応も亦上記と同様にし
て行ない得る。上記各反応により得られるペプチド４，７，
10，13，16，20，23，26，29，32，34，37及び43
の有する保護基Ａの離脱反応は、常法により行な
われる。該方法としては、例えば還元的方法（例
パラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素
添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還
元）、アシドリシス（例トリフルオロ酢酸、弗化
水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等の強酸に
よるアシドリシス）等が挙げられる。上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧１
気圧、０〜40℃にて行ない得る。触媒の使用量
は、通常100mg〜１ｇ程度でよく、一般に１〜48
時間程度で反応は終了する。また上記アシドリシ
スは、無溶媒下、通常０〜30℃程度好ましくは０
〜20℃にて約15分〜１時間程度を要して行ない得
る。酸の使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍
量程度とするのがよい。更に上記液体アンモニア
中金属ナトリウムによる還元は、反応溶媒がパー
マネントブルーに30秒〜10分間程度呈色している
ような量の金属ナトリウムを用い、通常−40〜−
70℃程度にて行ない得る。またペプチド10の保護基Ｃ及びペプチド16，
29，37及び45の保護基Ｄ、ペプチド４及び６の保
護基Ｅ並びにペプチド26，34，43及び46の保護基
Ｆは、夫々上記還元的方法によつて、同様に脱保
護することができる。上記方法（）乃至（）に利用されるアミノ
酸２，３，６，９，15，18，19，22，25，31，40
及び45は、公知の市販品でよく、またペプチド１
２，27，35及び42は公知の市販品又は混合酸無水
物法、アジド化法等により得られるものを利用で
きる。上記混合酸無水物法は、適当な溶媒中塩基性化
合物の存在下、アルキルハロカルボン酸、例えば
クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻
酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブ
チル等を用いて行なわれる。塩基性化合物として
は、例えばトリエチルアミン、トリメチルアミ
ン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ―メチルモ
ルホリン、１，５―ジアザビシクロ〔４，３，
０〕ノネン―５（DBN）、１，５―ジアザビシク
ロ〔５，４，０〕ウンデセン―５（DBU）、１，
４―ジアザビシクロ〔２，２，２〕オクタン
（DABCO）等の有機塩基や炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリ
ウム等の無機塩基を使用できる。また溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用の各種溶媒、具体的に
は塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン
等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエ
ステル類、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド等の非プロトン性極性溶媒などを使用できる。
反応は通常−20〜100℃好ましくは−20〜50℃に
おいて行なわれ、反応時間は一般に５分〜10時間
好ましくは５分〜２時間である。またアジド化法は、まず活性化されたカルボキ
シル基、例えばメチルアルコール、エチルアルコ
ール、ベンジルアルコール等のアルコールで活性
化されたカルボキシル基にヒドラジン水和物を適
当な溶媒中にて反応させることにより行なわれ
る。溶媒としては例えばジオキサン、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド又はこれらの
混合溶媒等を使用できる。ヒドラジン水和物の使
用量は、活性化されたカルボキシル基に対して通
常５〜20倍モル量好ましくは５〜10倍モル量とす
るのがよい。反応は通常50℃以下、好ましくは−
20〜30℃にて行なわれる。斯くして末端アミノ酸
のカルボキシル基部分がヒドラジンで置換された
化合物（ヒドラジン誘導体）を製造し得る。末端
アミノ酸のカルボキシル基部分がアジドで置換さ
れた化合物は、酸の存在下、適当な溶媒中、上記
で得られるヒドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反
応させることにより製造される。酸としては通常
塩酸が用いられる。溶媒としては例えばジオキサ
ン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド又はこれらの混合溶媒等を使用できる。また亜
硝酸化合物としては例えば亜硝酸ナトリウム、亜
硝酸イソアミル、塩化ニトロシル等を使用するこ
とができる。斯かる亜硝酸化合物は、ヒドラジン
誘導体に対して通常等モル〜２倍モル量好ましく
は等モル〜1.5倍モル量用いられる。反応は通常
−20〜０℃、好ましくは−20〜−10℃にて行なわ
れ、一般に５〜10分程度で反応は終了する。前記方法〔〕におけるペプチド28は、ペプチ
ド16の保護基Ａ及びＥを脱離することにより、ま
た前記方法〔〕におけるペプチド36は、ペプチ
ド29の保護基Ａを脱離することにより夫々収得で
きる。之等の脱保護基反応は、上述した方法に従
えばよい。上記のようにして製造された一般式(1)のペプチ
ドは反応混合物からペプチドの分離手段例えば抽
出、分配、カラムクロマトグラフイー等により単
離精製される。かくして一般式(1)で表わされる合成ペプチド即
ちヒトリンホブラストイドインターフエロンのＣ
末端ペプチド及びその誘導体を得る。かくして得られる合成ペプチドは、これに
I¹²⁵、I¹³¹等の放射性ヨードを導入することによ
り、ラジオイムノアツセイ法（RIA法）において
用いられる標識抗原の製造用原料である標識ペプ
チドとして利用できる。上記放射性ヨードの導入
は、通常のヨード化法、例えばクロラミンＴを用
いる酸化的ヨード化法〔W.M.Hunter and F.C.
Greenwood；Nature，194，P495（1962）、
Biochem.J.89，P114（1963）参照〕等により行な
われる。具体的には例えば適当な溶媒例えば
0.2Mリン酸緩衝液（PH＝7.4）等の溶媒中、クロ
ラミンＴの存在下室温付近にて10〜30秒程度で行
なわれる。ペプチド、放射性ヨード及びクロラミ
ンＴの使用割合は、例えばチロシン当り放射性ヨ
ード１個を導入する場合には、ペプチド中に含ま
れるチロシン分子１ナノモルに対して放射性ヨー
ドを１ミリキユーリー程度、クロラミンＴを10〜
100ナノモル程度用いるのがよく、またチロシン
当り放射性ヨード２個を導入する場合には、ペプ
チド中に含まれるチロシン分子１ナノモルに対し
て放射性ヨードを２ミリキユーリー程度、クロラ
ミンＴを10〜100ナノモル程度用いるのがよい。
斯くして製造される放射性ヨードにより標識化さ
れたペプチドは、通常の分離手段例えば抽出、分
配、カラムクロマトグラフイー、透析等により単
離精製される。このようにして得られるペプチド
は必要ならば凍結乾燥させて保存しておくことも
できる。以下上記一般式(1)で表わされる合成ペプチドを
ハプテンとして利用するヒトα型インターフエロ
ン抗原の製造方法につき詳述する。ヒトα型インターフエロン抗原は、上記ペプチ
ドの少なくとも１種をハプテンとし、これをハプ
テン―担体結合試薬の存在下に、適当な担体と反
応させることにより製造される。上記方法においてハプテンに結合される担体と
しては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子
の天然若しくは合成蛋白質を広く使用できる。該
担体としては、例えば馬血清アルブミン、牛血清
アルブミン、ウサギ血清アルブミン、人血清アル
ブミン、ヒツジ血清アルブミン等の動物の血清ア
ルブミン類、馬血清グロブリン、牛血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、人血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン
類、馬チログロブリン、牛チログロブリン、ウサ
ギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチ
ログロブリン等の動物のチログロブリン類、馬ヘ
モグロブリン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグ
ロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブ
リン等の動物のヘモグロブリン類、動物のヘモシ
アニン類、回虫より抽出された蛋白質（アスカー
リス抽出物、特開昭56―16414号公報、J.
Immun.，111，260〜268（1973）、J.Immun.，
122，302〜308（1979）、J.Immun.，98，893〜900
（1967）及びAm.J.Physiol.，199，575〜578
（1960）に記載されたものまたはこれらを更に精
製したもの）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、
リジン―グルタミン酸共重合体、リジン又はオル
ニチンを含む共重合体等を挙げることができる。ハプテン―担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはアミノ基とアミノ基とを架橋結合
させる。例えばグリオキサール、マロンジアルデ
ヒド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類、チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばＮ，N′―ｏ―フエニレンジマレイミ
ド、Ｎ，N′―ｍ―フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル―Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドエステル、４
―（マレイミドメチル）―シクロヘキサン―１―
カルボキシル―N′―ヒドロキシスクシンイミド
エステル等のマレイミドカルボキシル―Ｎ―ヒド
ロキシスクシンイミドエステル化合物、アミノ基
とカルボキシル基とをアミド結合させる通常のペ
プチド結合形成反応に用いられる試薬、例えば
Ｎ，Ｎ―ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ―
エチル―N′―ジメチルアミノカルボジイミド、
１―エチル―３―ジイソプロピルアミノカルボジ
イミド、１―シクロヘキシル―３―（２―モルホ
リニル―４―エチル）カルボシイミド等のカルボ
ジイミド類等の脱水縮合剤を挙げることができ
る。また上記ハプテン―担体結合試薬としては、
ｐ―ジアゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウム
アリールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成
反応試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組み合わせ
たものも使用可能である。上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中好ましくはPH８〜９の
緩衝液中で、０〜40℃好ましくは室温付近で行な
われる。該反応は通常約１〜24時間好ましくは３
〜５時間で完結する。上記において用いられる代
表的緩衝液としては、次のものを例示できる。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム―0.2Mホウ酸―0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム―0.2Mホウ酸―
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム―0.05M四ホウ酸
ナトリウム緩衝液上記においてハプテン、ハプテン―担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を２〜６倍重量好まし
くは３〜５倍重量、及びハプテン―担体結合試薬
を５〜10倍モル程度用いるのがよい。上記反応に
よりハプテン―担体結合試薬を仲介させて担体と
ハプテンとが結合したペプチド―担体複合体から
成るヒトα型インターフエロン抗原が収得され
る。反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈殿法等により容易に
単離精製できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法
により保存できる。かくしてヒトα型インターフエロンのＣ末端ペ
プチドの少なくとも１種と、担体との複合体から
成る所望のヒトα型インターフエロン抗原を得
る。該抗原は、通常蛋白質１モルに対しペプチド
が平均５〜20モル結合したものであり、いずれも
引き続き再現性よく、ヒトα型インターフエロン
に対する特異性の高い抗体の作成を可能とするも
のである。特に上記蛋白質に対するペプチドの結
合モル比が１：８〜15のものは、特異性が一層高
く高力価、高感度の抗体を作成し得るものであり
好ましい。上記で得られる抗原による抗体の作成は、以下
の如くして行なわれる。即ち上記抗原を哺乳動物
に投与し、生体内に産生されを抗体を採取するこ
とにより行なわれる。抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常兎やモルモツトを用いるの
が望ましい。抗体の産生に当つては、上記により
得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃度に
希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Adjuvant）と混合して懸濁液を調整
し、之を哺乳動物体に投与すればよい。例えば兎
に上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として0.5〜
５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月好まし
くは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよい。抗
体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量
産出される時期、通常上記最終投与１〜２週間経
過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心分
離後血清を分離採取することにより行なわれる。
上記によれば、用いる抗原の特殊性に基づいて、
ヒトα型インターフエロンに対して優れた特異性
を有し、高力価、高感度の抗体を収得できる。かくして得られるヒトα型インターフエロン抗
体は、例えばこれをRIA法に利用してヒトα型イ
ンターフエロンの定量を高精度をもつて可能とす
る。また該抗体は、これを酵素または螢光物質で
標識することによつてエンザイムイムノアツセイ
（EIA）法、フローレツセンスイムノアツセイ
（FIA）法等に使用できる。さらに該抗体は公知
の不溶化させる物質と反応させて不溶化抗体とす
ることもできる。以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)のペプチド、これを利用した抗原及び該抗原か
らの抗体の製造例を挙げるか、本発明はこれに限
定されるものではない。尚各製造例におけるRf値はシリカゲル上の薄
層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用いて
測定したものである。 Rf〓…１―ブタノール―酢酸―水（４：１：
５） Rf〓…１―ブタノール―ピリジン―酢酸―水
（15：10：３：12）＜ペプチドの合成＞製造例１１Ｚ―Lys（Tos）―Glu（OBsl）―OBzlの製造Ｈ―Glu（OBzl）―OBzl・Tos4.18ｇをジメチ
ルホルムアミド（DMF）30mlに溶解し、トリエ
チルアミン（TEA）1.21mlを加え、撹拌下冷却
する。一方Ｚ―Lys（Tos）―OH 4.35ｇをテトラ
ヒドロフラン（THF）30mlに溶解し、Ｎ―メチ
ルモルホリン0.98mlを加え−15℃に冷却し、撹拌
下クロロ蟻酸イソブチル1.27mlを滴下する。滴下
30秒後該液に上記で調製した冷DMF溶液を加え、
この混合液を０℃下に５分間、次いで40℃の水浴
中で１分間、更に15℃下に30分間撹拌する。反応
液よりTHF及びDMFを減圧留去し、残渣を酢酸
エチルで抽出する。抽出液を1Nクエン酸、飽和
食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和
食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、酢酸エチルを留去する。得られた油状残渣に
エチルエーテルを加えて固化させ、これを酢酸エ
チル―エーテルより再沈殿させて目的物5.37ｇを
得る。 Rf〓＝0.96 Rf〓＝0.90 元素分析値（C₄₀H₄₅N₃O₉Sとして）計算値（％） C64.59 H6.10 N5.65 実測値（％） C64.13 H5.95 N5.63 ２(a) Ｈ―Lys（Tos）―Glu―OHの製造Ｚ―Lys（Tos）―Glu（OBzl）―OBzl 5.21ｇ
をメタノール80mlと10％酢酸20mlとの混液に溶解
し、パラジウムブラツク少量を加えH₂ガス導入
下１夜撹拌する。反応終了後触媒を吸引過によ
り去し、液を減圧蒸留し、残渣を水に注ぎ凍
結乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.29 Rf〓＝0.52 ２(b) Ｚ―Ser―Lys（Tos）―Glu―OHの製造Ｚ―Ser―NHNH₂ 2.13ｇをDMF20mlに溶解
し、6N塩酸／ジオキサン4.20mlを加え、−15℃に
冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル1.13mlをえる。
反応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA3.53mlの冷DMF1.20ml溶液を少量宛滴下し
中和させる。このアジドを含む溶液を、上記(a)で
得たＨ―Lys（Tos）―Glu―OH及びTEA1.96ml
の冷DMF溶液に加え、混合液を−10〜−15℃下
２時間、次いで４℃下20時間撹拌する。DMFを
減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エ
チル層を1Nクエン酸及び飽和食塩水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧
留去する。得られる残渣にエチルエーテルを加え
て固化させ、酢酸エチル―エーテルより再沈殿さ
せて、目的物4.14ｇを得る。 Rf〓＝0.64 Rf〓＝0.65 元素分析値（C₂₉H₃₈N₄O₁₁S・1/2H₂Oとして）計算値（％） C52.80 H5.96 N8.49 実測値（％） C52.87 H5.69 N8.46 ３(a) Ｈ―Ser―Lys（Tos）―Glu―OHの製造Ｚ―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH 4.03ｇをメ
タノール60mlと10％酢酸40mlとの混液に溶解し、
パラジウムブラツク少量を加えH₂ガス導入下１
夜撹拌する。反応終了後触媒を吸引過により
去し、液を減圧蒸留し、残渣を水に注ぎ凍結乾
燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.23 Rf〓＝0.48 ３(b) Ｚ―Arg（NO₂）―Ser―Lys（Tos）―Glu
―OHの製造上記(a)で得たＨ―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH
をDMF20mlに溶解し、TEA1.74mlを加え、撹拌
下冷却する。一方Ｚ―Arg（NO₂）―OH2.41ｇを
THF20mlに溶解し、Ｎ―メチルモルホリン0.70
mlを加え−15℃に冷却し、撹拌下クロロ蟻酸イソ
ブチル0.86mlを滴下する。滴下30秒後該液に上記
で調製した冷DMF溶液を加え、この混合液を０
℃下に５分間、次いで40℃の水浴中で１分間、更
に15℃下に30分間撹拌する。反応液よりTHF及
びDMFを減圧留去し、残渣を２％酢酸飽和ブタ
ノールで抽出する。抽出液をｎ―ブタノール飽和
の２％酢酸で５回洗浄し、減圧蒸留し、水に置き
換えて酢酸を留去し、更にメタノールに置き変え
て水を留去する。得られる油状残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、これを酢酸エチル―メタ
ノールより再沈殿させて目的物4.09ｇを得る。 Rf〓＝0.42 Rf〓＝0.65 元素分析値（C₃₅H₄₉N₉O₁₄S・1/2H₂Oとして）計算値（％） C48.83 H5.85 N14.64 実測値（％） C49.22 H6.05 N14.11 ４Ｚ―Ser―Leu―NHNH₂の製造Ｚ―Ser―NHNH₂2.54ｇをDMF20mlに溶解
し、6N塩酸／ジオキサン5.00mlを加え、−15℃に
冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル1.34mlを加え
る。反応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA4.20mlの冷DME1.40ml溶液を少量宛滴下し
中和させる。このアジドを含む溶液を、Ｈ―Leu
―OC₂H₅・HCl 1.96ｇ及びTEA1.40mlの冷DMF
溶液15mlに加え、混合液を−10〜−15℃下２時
間、次いで４℃下20時間撹拌する。DMFを減圧
留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル
層を1Nクエン酸、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナ
トリウム水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留
去する。得られる残渣に石油エーテルを加えデカ
ンテーシヨンにより洗浄する。油状物質をデシケ
ーター内で減圧乾燥し、乾燥物をメタノール50ml
に溶かし、氷冷下100％ヒドラジン１水和物2.50
mlを加え、室温下20時間放置し、メタノールを減
圧留去する。残渣にエチルエーテルを加えて固化
させ、これをデシケーター内で乾燥後、水洗過
して過剰のヒドラジン１水和物を除去し、メタノ
ール―酢酸エチルから再沈殿させて、目的物2.68
ｇを得る。 Rf〓＝0.73 Rf〓＝0.76 元素分析値（C₁₇H₂₆N₄O₅として）計算値（％） C55.73 H7.15 N15.29 実測値（％） C55.72 H7.01 N15.42 ５(a) Ｈ―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―OHの
製造Ｚ―Arg（NO₂）―Ser―Lys（Tos）―Glu―
OH2.00ｇをメタノール30mlと50％酢酸30mlとの
混液に懸濁し、パラジウムブラツク少量を加え
H₂ガス導入下36時間撹拌する。反応終了後触媒
を吸引過により去し、液を減圧蒸留し、残
渣を水に注ぎ凍結乾燥し、18時間後再度水に溶か
して凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.05 Rf〓＝0.41 ５(b) Ｚ―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―
Glu―OHの製造Ｚ―Ser―Leu―NHNH₂1.03ｇをDMF15mlに
溶解し、6N塩酸／ジオキサン1.41mlを加え、−15
℃に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル0.38mlを加
える。反応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA1.18mlの冷DMF0.40ml溶液を少量宛滴下し
中和させる。このアジドを含む溶液を、上記(a)で
得たＨ―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH及び
TEA0.66mlの冷DMF溶液10mlに加え、混合液を
−10〜−15℃下２時間、次いで４℃下20時間撹拌
する。DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のｎ―
ブタノールで抽出し、ブタノール層をｎ―ブタノ
ール飽和水で５回洗浄し、減圧留去する。得られ
る残渣にエチルエーテルを加えて固化させ、メタ
ノール―酢酸エチルより再沈殿させて、目的物
1.92ｇを得る。 Rf〓＝0.33 Rf〓＝0.69 元素分析値（C₄₄H₆₆N₁₀O₁₅S・2H₂Oとして）計算値（％） C50.66 H6.76 N13.43 実測値（％） C50.57 H6.51 N13.34 ６(a) Ｈ―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―
Glu―OHの製造Ｚ―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu
―OH1.84ｇをメタノール30mlと10％酢酸30mlと
の混液に懸濁し、パラジウムブラツク少量を加え
H₂ガス導入下13時間撹拌する。反応終了後触媒
を吸引過により去し、液を減圧蒸留し、残
渣を水に注ぎ凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.09 Rf〓＝0.53 ６(b) Boc―Glu（OBzl）―Ser―Leu―Arg―Ser
―Lys（Tos）―Glu―OHの製造上記(a)で得たＨ―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys
（Tos）―Glu―OHをDMF20mlに溶解し、
TEA0.51mlを氷冷下に加え、更にBoc―Glu
（OBzl）―ONHS0.95ｇを加え、混合液を室温下
24時間撹拌する。DMFを減圧留去し、残渣を水
飽和のｎ―ブタノールで抽出し、ブタノール層を
ｎ―ブタノール飽和の水で５回洗浄する。ブタノ
ール層を減圧留去し、得られる残渣にエチルエー
テルを加えて固化させ、メタノール―酢酸エチル
より再沈殿させて、目的物1.70ｇを得る。 Rf〓＝0.42 Rf〓＝0.60 元素分析値（C₅₃H₈₁N₁₁O₁₈S・2H₂Oとして）計算値（％） C51.82 H6.97 N12.55 実測値（％） C51.27 H6.58 N12.47 ７(a) Boc―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys
（Tos）―Glu―OHの製造 Boc―Glu（OBsl）―Ser―Leu―Arg―Ser―
Lys（Tos）―Glu―OH150mgをメタノール30mlと
10％酢酸30mlとの混液に溶解し、パラジウムブラ
ツク少量を加えH₂ガス導入下18時間撹拌する。
反応終了後触媒を吸引過により去し、液を
減圧蒸留し、残渣に水を注ぎ凍結乾燥して目的物
を得る。７(b) Ｈ―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys
（Tos）―Glu―OHの製造上記(a)で得たBoc―Glu―Ser―Leu―Arg―
Ser―Lys（Tos）―Glu―OHをTHFに溶解し、
室温で15分間放置する。無水エーテル約30mlを加
え、析出物を過し、無水エーテルで洗浄後、水
酸化カリウム―五酸化リンを入れたデシケーター
内で減圧乾燥して、目的物を得る。７(c) Ｈ―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys―
Glu―OHの製造上記(b)で得たＨ―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser
―Lys（Tos）―Glu―OHを、予め金属ナトリウ
ムで乾燥した液体アンモニアに溶解し、撹拌下に
金属ナトリウムの小片を溶液が青色を30秒〜１分
間保つまで加える。更に結晶NH₄Clを加え、過
剰のナトリウムを中和し、室温でアンモニアを完
全に蒸発留去後、溶出液に50％酢酸を用いたセフ
アデツクスＧ―25ゲルによりゲル過して、目的
物58mgを得る。以下これを「ペプチドＡ」と呼
ぶ。 Rf〓＝0.04 Rf〓＝0.34 元素分析値（C₃₄H₆₁N₁₁O₁₄・C₂H₄O₂・3H₂Oと
して）計算値（％） C44.95 H7.44 N16.02 実測値（％） C45.05 H7.11 N15.84 ８(a) Ｈ―Gln―NHNHBocの製造Ｚ―Gln―NHNHBoc16.00ｇをメタノール100
mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量を加えH₂
ガス導入下18時間撹拌する。反応終了後触媒を吸
引過により去し、液を減圧蒸留し、残渣を
デシケーター内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.37 Rf〓＝0.58 ８(b) Ｚ―Leu―Gln―NHNHBocの製造上記(a)で得たＨ―Gln―NHNHBocをTHF50
mlに溶解し、氷冷下Ｚ―Leu―ONHS5.51ｇを加
え、室温下18時間撹拌する。THFを減圧留去し、
残渣を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を1N
クエン酸、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム
水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥後、酢酸酸エチルを留去する。得
られる油状残渣にエチルエーテルを加えて固化さ
せ、これをメタノール―エチルエーテルより再沈
殿させて目的物6.04ｇを得る。 Rf〓＝0.81 Rf〓＝0.86 元素分析値（C₂₄H₃₇N₅O₇として）計算値（％） C56.79 H7.35 N13.80 実測値（％） C56.67 H7.15 N13.75 ９(a) Ｈ―Leu―Gln―NHNHBocの製造Ｚ―Leu―Gln―NHNHBoc2.79ｇをメタノー
ル80mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量を加え
H₂ガス導入下32時間撹拌する。反応終了後触媒
を吸引過により去し、液を減圧留去し、残
渣をデシケーター内で減圧乾燥して、目的物を得
る。 Rf〓＝0.33 Rf〓＝0.66 ９(b) Ｚ―Asn―Leu―Gln―NHNHBocの製造上記(a)で得たＨ―Leu―Gln―NHNHBocを
DMF30mlに溶解し、撹拌下冷却する。一方Ｚ―
Asn―OH1.61ｇをTHF30mlに溶解し、Ｎ―メチ
ルモルホリン0.62mlを加え−15℃に冷却し、撹拌
下クロロ蟻酸イソブチル0.80mlを滴下する。滴下
30秒後該液に上記で調製した冷DMF溶液を加え、
この混合液を０℃下に５分間、次いで40℃の水浴
中で１分間、更に15℃下に30分間撹拌する。反応
液よりTHF及びDMFを減圧留去し、残渣を酢酸
エチルで抽出する。抽出液を1Nクエン酸、飽和
食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和
食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、酢酸エチルを留去する。得られる油状残渣に
エチルエーテルを加えて固化させ、メタノール―
酢酸エチルで再沈殿させて目的物2.55ｇを得る。 Rf〓＝0.63 Rf〓＝0.77 元素分析値（C₂₈H₄₃N₇O₉として）計算値（％） C53.10 H6.97 N15.77 実測値（％） C53.67 H6.63 N15.68 10(a) Ｚ―Thr―ONHSの製造Ｚ―Thr―OH1.28ｇをTHF30mlに溶解し、こ
れにNHS0.58ｇを加え、氷冷し、次いでＮ，Ｎ
―ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）1.05
ｇを加える。この混合液を４℃で24時間撹拌し、
析出物を去し、液を減圧留去し、残渣にエチ
ルエーテルを加え、デカンテーシヨン洗浄する。
得られる油状物質をデシケーター内にて減圧乾燥
して目的物を得る。 10(b) Ｈ―Asn―Leu―Gln―NHNHBocの製造Ｚ―Asn―Leu―Gln―NHNHBoc2.43ｇをメ
タノール80mlに懸濁し、パラジウムブラツク少量
を加え、H₂ガス導入下18時間撹拌する。反応終
了後触媒を吸引過により去し、液を減圧留
去し、デシケーター内で減圧乾燥して目的物を得
る。 Rf〓＝0.31 Rf〓＝0.64 10(c) Ｚ―Thr―Asn―Leu―Gln―NHNHBoc
の製造上記(b)で得たＨ―Asn―Leu―Gln―
NHNHBocをDMF30mlに溶解し、この溶液に上
記(a)で得たＺ―Thr―ONHSのDMF20ml溶液を
氷冷下に加え、混合液を室温下18時間撹拌する。
DMFを減圧留去して得られた残渣に1Nクエン酸
を加えて固化し、メタノール―酢酸エチルより再
沈殿させて、目的物2.12ｇを得る。 Rf〓＝0.82 Rf〓＝0.79 元素分析値（C₃₂H₅₀N₈O₁₁として）計算値（％） C53.18 H6.97 N15.50 実測値（％） C52.85 H6.95 N15.28 11(a) Ｚ―Thr―Asn―Leu―Gln―NHNH₂の製
造Ｚ―Thr―Asn―Leu―Gln―NHNHBoc0.91
ｇをTFA8mlに溶解し、室温下15分間放置する。
無水エーテル80mlを加えて析出物をすばやく過
し、無水エーテルで洗浄後、水酸化カリウム―五
酸化リンを入れたデシケーター内で減圧乾燥して
目的物を得る。 Rf〓＝0.34 11(b) Ｈ―Glu（OBsl）―Ser―Leu―Arg―Ser
―Lys（Tos）―Glu―OHの製造 Boc―Glu（OBsl）―Ser―Leu―Arg―Ser―
Lys（Tos）―Glu―OH1.00ｇをTFA8mlに溶解
し、室温下15分間放置する。無水エーテル80mlを
加えて析出物をすばやく過し、無水エーテルで
洗浄後、水酸化カリウム―五酸化リンを入れたデ
シケーター内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.24 Rf〓＝0.44 11(c) Ｚ―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu（OBzl）
―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―
OHの製造上記(a)で得たＺ―Thr―Asn―Leu―Gln―
NHNH₂をDMF10mlに溶解し、6N塩酸／ジオキ
サン0.63mlを加え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝
酸イソアミル0.17mlを加える。反応液がヒドラジ
ドテスト陰性になつた後TEA0.53mlの冷
DMF0.40ml溶液を少量宛滴下し中和させる。こ
のアジドを含む溶液を、上記(b)で得たＨ―Glu―
（OBzl）―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―
Glu―OH及びTEA0.24mlの冷DMF溶液10mlに加
え、混合液を−10〜−15℃下２時間、次いで４℃
下18時間撹拌反応させる。さらに上記(a)と同様に
してＺ―Thr―Asn―Leu―Gln―
NHNHBoc1.16ｇをTFAで処理して得た反応物
を上記反応混合物に加え24時間同温度下に撹拌反
応させる。DMFを減圧留去し、残渣を水飽和の
ｎ―ブタノールで抽出し、ｎ―ブタノール飽和の
水で５回洗浄し、減圧蒸留する。残渣にエチルエ
ーテルを加えて固化させ、メタノール―酢酸エチ
ルより再沈殿させ更に熱メタノールで洗浄して、
目的物を得る。 11(d) Ｈ―Thr―Asn―Len―Gln―Glu―Ser―
Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―OHの製
造上記(c)で得たＺ―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu
（OBzl）―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―
Gln―OHをメタノール50ml及び30％酢酸50mlと
の混液に懸濁させ、パラジウムブラツク少量を加
え、H₂ガス導入下18時間撹拌する。反応終了後
触媒を吸引過により去し、液を減圧濃縮
し、メタノールを完全に留去後、得られる濃縮液
を、50％酢酸を溶出液とするセフアヂツクスＧ―
25によりゲル過して、目的とするフラクシヨン
を集め凍結乾燥して目的物740mgを得る。 Rf〓＝0.17 Rf〓＝0.35 元素分析値（C₆₆H₉₉N₁₇O₂₃・C₂H₄O₂・2H₂Oと
して）計算値（％） C48.91 H7.08 N15.64 実測値（％） C48.82 H6.63 N15.74 12 Ｈ―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu
―Arg―Ser―Lys―Glu―OHの製造Ｈ―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu―
Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH51.0mgを、予
め金属ナトリウムで乾燥した液体アンモニアに溶
解し、撹拌下に金属ナトリウムの小片を溶液が青
色を30秒〜１分間保つまで加える。更に結晶
NH₄Clを加え、過剰のナトリウムを中和し、室
温でアンモニアを完全に蒸発留去後、溶出液に50
％酢酸を用いたセフアデツクスＧ―25ゲルにより
ゲル過して、目的とするフラクシヨンを集め、
これを濃縮後水を加えて凍結乾燥して、目的物32
mgを得る。以下これを「ペプチドＢ」と呼ぶ。 Rf〓＝0.01 Rf〓＝0.37 元素分析値（C₅₃H₉₃N₁₇O₂₁・C₂H₄O・3H₂Oとし
て）計算値（％） C46.57 H7.32 N16.79 実測値（％） C46.10 H6.98 N16.82 13 Ｚ―Leu―Ser―OCH₃の製造Ｈ―Ser―OCH₃・HCl1.81ｇのDMF25mlに溶
解し、TEA1.62mlを加え−10℃に氷冷する。攪
拌下Ｚ―Leu―ONHS4.21ｇを加え、室温で18時
間撹拌を続ける。DMFを減圧留去し、残渣を酢
酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水洗し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去
する。得られる残渣にエチルエーテルを加えて固
化させ、酢酸エチル―エーテルより再沈殿させ
て、目的物2.68ｇを得る。 Rf〓＝0.81 Rf〓＝0.82 元素分析値（C₁₈H₂₆N₂O₆として）計算値（％） C59.00 H7.15 N7.65 実測値（％） C58.62 H7.03 N7.65 14(a) Ｈ―Leu―Ser―OCH₃・HClの製造Ｚ―Leu―Ser―OCH₃4.20ｇをメタノール40ml
と1N塩酸11.46mlとの混液に懸濁させ、パラジウ
ムブラツク少量を加え、H₂ガス導入下18時間撹
拌する。反応終了後触媒を吸引過により去
し、液を減圧蒸留し、更に水を加え減圧蒸留す
る操作を３回繰返す。残渣を五酸化リンを入れた
デシケーター内で減圧乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.38 14(b) Ｚ―Ser―Leu―Ser―OCH₃の製造Ｚ―Ser―NHNH₂3.19ｇをDMF25mlに溶解
し、6N HCl／ジオキサン6.30mlを加え、−15℃
に冷却し、撹拌下亜硝酸イソアミル1.69mlを加え
る。反応液がヒドラジドテスト陰性になつた後
TEA5.29mlの冷DMF1.76ml溶液を少量宛滴下し
中和させる。このアジドを含む溶液を、上記(a)で
得たＨ―Leu―Ser―OCH₃・HCl及びTEA1.60ml
の冷DMF溶液20mlに加え、混合液を−10〜−15
℃下２時間、次いで４℃下18時間撹拌する。
DMFを減圧留去し、残渣に水を加えて固化させ、
メタノール―酢酸エチルより再沈殿させて、目的
物4.11ｇを得る。 Rf〓＝0.76 Rf〓＝0.79 元素分析値（C₂₂H₃₁N₃O₈として）計算値（％） C55.62 H6.89 N9.27 実測値（％） C55.48 H6.92 N9.18 15 Ｚ―Ser―Leu―Ser―NHNH₂の製造Ｚ―Ser―Leu―Ser―OCH₃2.00ｇをメタノー
ル40mlに溶解し、氷冷下100％NH₂NH₂・
H₂O1.10mlを加え、室温で18時間放置する。反応
終了後、溶媒を減圧留去し、エーテルを加えて固
化させ、過剰のNH₂NH₂・H₂Oを水を加えて除
去し、メタノール―酢酸エチルより再沈殿させて
目的物1.91ｇを得る。 Rf〓＝0.43 Rf〓＝0.73 元素分析値（C₂₀H₃₁N₅O₇として）計算値（％） C52.97 H6.89 N15.44 実測値（％） C52.85 H6.70 N15.44 16(a) Ｚ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu―
Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）
―Glu―OHの製造Ｚ―Ser―Leu―Ser―NHNH₂70.42mgをDMF5
mlに溶解し、6N塩酸／ジオキサンのDMF10倍希
釈液0.78mlを加え、−15℃に冷却し、撹拌下亜硝
酸イソアミルのDMF10倍希釈液0.20mlを加え、
反応液がヒドラジドテスト陰性になつた後、
TEAのDMF10倍希釈液0.65mlを少量宛滴下し中
和させる。このアジドを含む溶液を、上記11(d)で
得たＨ―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu
―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH151mgと
TEAのDMF10倍希釈液0.29mlの冷DMF5ml溶液
に加え、混合液を−10〜−15℃下２時間、次いで
４℃下18時間撹拌する。更にＺ―Ser―Leu―Ser
―NHNH₂117.36mgを加え、24時間反応させる。 DMFを減圧留去し、残渣を水飽和のｎ―ブタ
ノールで抽出し、ｎ―ブタノール飽和の水で10
回、更にｎ―ブタノール飽和の２％酢酸で５回洗
浄し、減圧濃縮し、水を加えて更に減圧濃縮し、
完全にｎ―ブタノールを留去後、凍結乾燥する。
これを酢酸エチル―エーテルで再沈殿させて目的
物を得る。 16(b) Ｈ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu―
Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys―Glu
―OHの製造Ｚ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu―Gln―
Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys（Tos）―Glu―
OH150mgを予め金属ナトリウムで乾燥した液体
アンモニアに溶解し、撹拌下金属ナトリウムの小
片を溶液が青色を30秒〜１分間保つまで加える。
更に結晶NH₄Clを加え、過剰のナトリウムを中
和し、室温でアンモニアを完全に蒸発後、溶出液
に50％酢酸を用いたセフアデツクスＧ―25ゲルに
よりゲル過して、フラクシヨンを集めこれを濃
縮後水を加えて凍結乾燥して、目的物94mgを得
る。以下これを「ペプチドＣ」と呼ぶ。 Rf〓＝0.02 Rf〓＝0.39 元素分析値（C₆₅H₁₂₀N₂₀O₂₆・C₂H₄O₂・H₂Oと
して）計算値（％） C48.19 H7.24 N16.78 実測値（％） C47.93 H6.93 N16.49 17(a) Ｚ―Tyr―OSuの製造Ｚ―Tyr―OH1.04ｇをTHF30mlに溶解し、Ｎ
―ヒドロキシサクシンイミド0.38ｇを加え、氷冷
後更にDCC0.68ｇを氷冷下に加え、混合物を４℃
で18時間撹拌する。析出物を吸引過により除
き、液を減圧濃縮し、残渣にエチルエーテルと
石油エーテルとを加えてデカンテーシヨン、乾燥
して目的物を得る。 17(b) Ｈ―Ser―Leu―Ser―OCH₃の製造参考例14(b)で得たＺ―Ser―Leu―Ser―
OCH₃1.00ｇをメタノール20mlと10％酢酸20mlに
懸濁し、パラジウムブラツク少量を加え、H₂ガ
ス導入下14時間撹拌する。反応終了後触媒を吸引
過により去し、液を減圧濃縮後水を加えて
凍結乾燥して目的物を得る。 Rf〓＝0.35 Rf〓＝0.65 17(c) Ｚ―Tyr―Ser―Leu―Ser―OCH₃の製造上記(b)で得たＨ―Ser―Leu―Ser―OCH₃を
DMF10mlに溶解し、TEA0.31mlを氷冷下に加
え、この溶液に上記(a)で得たＺ―Tyr―OSuの冷
DMF溶液を撹拌下に加える。混合液を室温下18
時間撹拌し、DMFを減圧留去し、残渣に水を加
えて固化させ、メタノール―エーテル次いでメタ
ノール―酢酸エチルから再沈殿させて目的物1.08
ｇを得る。 Rf〓＝0.78 Rf〓＝0.82 元素分析値（C₃₀H₄₀N₄O₁₀として）計算値（％） C58.43 H6.54 N9.09 実測値（％） C58.14 H6.58 N9.16 17(d) Ｚ―Tyr―Ser―Leu―Ser―NHNH₂の製
造Ｚ―Tyr―Ser―Leu―Ser―OCH₃1.00ｇをメ
タノールに溶解し、氷冷下100％NH₂NH₂・
H₂O0.82mlを加え、室温で18時間放置する。メタ
ノールを減圧留去し、残渣にエチルエーテルを加
えて固化させ、水洗により過剰のNH₂NH₂・
H₂Oを除去し、メタノール―エーテルで再沈殿
後熱メタノールで洗浄して目的物0.81ｇを得る。 Rf〓＝0.45 Rf〓＝0.76 元素分析値（C₂₉H₄₀N₆O₉として）計算値（％） C56.48 H6.54 N13.63 実測値（％） C56.12 H6.57 N13.58 18(a) Ｚ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―
Leu―Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys
（Tos）―Glu―OHの製造Ｚ―Tyr―Ser―Leu―Ser―NHNH₂42.3mgを
DMF4mlに溶解し、6N塩酸／ジオキサンの
DMF10倍希釈液0.34mlを加え、−15℃に冷却し、
撹拌下亜硝酸イソアミルのDMF10倍希釈液0.09
mlを加え、反応液がヒドラジンデスト陰性になつ
た後、TEAのDMF10倍希釈液0.29mlを少量ずつ
滴下し中和させる。このアジドを含む溶液を、Ｈ
―Thr―Asn―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu―Arg
―Ser―Lys（Tos）―Glu―OH50.0mgとTEAの
DMF10倍希釈液0.10の冷DMF4ml溶液に加え、
混合液を−10〜−15℃下２時間、次いで４℃下18
時間撹拌する。更にＺ―Tyr―Ser―Leu―Ser―
NHNH₂42.3mgを加え24時間反応させる。DMF
を減圧留去し、残渣を水飽和のｎ―ブタノール30
mlで抽出し、抽出液をｎ―ブタノール飽和水で10
回、次いでｎ―ブタノール飽和の２％酢酸で５回
洗浄する。有機層を集め減圧濃縮し、ｎ―ブタノ
ールを留去後、凍結乾燥し、酢酸エチル―エーテ
ルで再沈殿させて目的物を得る。 18(b) Ｈ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn
―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―
Lys―Glu―OHの製造上記(a)で得たＺ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr
―Asn―Leu―Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser
―Lys（Tos）―Glu―OHを予め金属ナトリウム
で乾燥した液体アンモニアに溶解し、撹拌下金属
ナトリウムの小片を溶液が青色を30秒〜１分間保
つまで加える。更に結晶NH₄Clを加え、過剰の
ナトリウムを中和し、室温でアンモニアを完全に
蒸発後、溶出液に50％酢酸を用いたセフアデツク
スＧ―25ゲルによりゲル過して、フラクシヨン
を集め目的物33mgを得る。以下これを「ペプチド
Ｄ」と呼ぶ。 Rf〓＝0.02 Rf〓＝0.35 元素分析値（C₇₄H₁₂₃N₂₁O₂₈・C₂H₄O₂・4H₂Oと
して）計算値（％） C47.71 H7.30 N15.79 実測値（％） C47.32 H7.24 N15.82 ＜抗原の製造＞製造例１ペプチドの合成製造例７(c)で得たペプチドＡの
５mg及び牛血清アルブミン（以下「BSA」と略
記する）の15mgを酢酸アンモニウム緩衝液（0.1
モル、PH7.0）２mlにとかす。この溶液に0.1モル
のグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、室温
で５時間撹拌する。その後反応混合物を48時間、
４℃で水１で透析する。透析中５回水を交換す
る。その後、ペプチド―蛋白質複合体を含有する
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原（以下「抗原」と呼ぶ）15mgを得る。この抗原は、BSA1モルに対してペプチドＡ
が平均10モル結合したものである。尚このペプチ
ドＡとBSAとの結合率は、得られる抗原を更
にセフアデツクスＧ―50（溶出液：生理食塩水、
検出：OD280nm、流出速度：３ml／時間、分取
量：１mlずつ）でゲル過した際、未反応BSA
及びペプチドＡの存在は認められないことより、
該ゲル過によつてBSAに結合したペプチドＡ
のフラクシヨンと他の生成体（ペプチドＡの２量
体）のフラクシヨンとを分離し、ペプチド２量体
の標準濃度の検量線を作成して、上記２量体の量
を求め、これを出発原料として用いたペプチドＡ
の量から差し引いた値がすべてBSAに結合して
いるとして求めたものである。以下の抗原製造例
により得られる各抗原についても同様である。製造例２ペプチド合成製造例12で得たペプチドＢの５mg
及びBSAの５mgを酢酸アンモニウム緩衝液（0.1
モル、PH7.0）２mlにとかす。この溶液に0.1モル
のグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、室温
で５時間撹拌する。その後反応混合物を48時間、
４℃で水１で透析する。透析中５回水を交換す
る。その後、ペプチド―蛋白質複合体を含む溶液
を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗原
（以下「抗原」と呼ぶ）９mgを得る。得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドＢが平均９モル結合したものである。製造例３ペプチド合成製造例16(b)で得たペプチドＣの５
mg及びBSA25mgを水４mlに溶解する。この溶液
にジシクロヘキシルカーボジイミド（DCC）200
mgを加え、室温で５時間撹拌する。次に反応混合
物を水２を用い４℃にて48時間要して透析す
る。透析中５回水を交換する。その後ペプチド―
蛋白質複合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトα型
インターフエロン抗原（以下「抗原」と呼ぶ）
28mgを得る。得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドＣが平均12モル結合したものである。製造例４ペプチド合成製造例18(b)で得たペプチドＤの４
mg及びBSAの20mgを酢酸アンモニウム緩衝液
（0.1モル、PH7.0）２mlに溶かす。この溶液に0.1
モルのグルタールアルデヒド溶液0.11mlを加え、
室温で５時間撹拌する。その後反応混合物を48時
間、４℃で水１で透析する。透析中５回水を交
換する。その後、ペプチド―蛋白質複合体を含む
溶液を凍結乾燥してヒトα型インターフエロン抗
原（以下「抗原」と呼ぶ）22mgを得る。得られた抗原は、BSA1モルに対してペプチ
ドＤが平均９モル結合したものである。＜抗体の製造＞製造例１抗原の製造例３で得た抗原の100μgを1.5mlの
生理食塩水に溶解後、之にフロインドの補助液
1.5mlを加えて調製した懸濁液を、７羽の兎（2.5
〜3.0Kg）に皮下投与し、２週間毎に６回同量投
与する。更にその後１カ月毎に３回、最初投与し
た量と同量を投与する。最終投与後７日経過して
のち試験動物から採血し、遠心分離して抗血清を
採取して、ヒトα型インターフエロン抗体（以下
「抗体」と呼ぶ）を得る。製造例２〜４抗原の製造例１、２及び４で得た抗原、及
びを用い、上記製造例１と夫々同様にしてヒト
α型インターフエロン抗体（抗体、及び）
を夫々得る。 Γ 標識ペプチドの製造Ｈ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu
―Gln―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys―Glu
―OH即ちペプチドＤをクロラミンＴを用いる方
法で以下の通り標識化する。即ち上記ペプチド5μgの0.5モルのリン酸塩緩衝
液（PH7.0）20μlにNa〔¹²⁵〕（carrier free N.E.
N.）１ミリキユーリーの0.5モルリン酸塩緩衝液
を加え、次にクロラミンT70mg／mlの0.5モルリ
ン酸塩緩衝液20μlを加える。室温で30秒間撹拌し
て60mg／mlのメタ重亜硫酸ナトリウム
（Na₂S₂O₅）の0.5Mリン酸塩緩衝液50μlを加える
ことで反応を終わらせる。次いで反応液に１％の
冷沃化ナトリウム水溶液100μlを加え、反応混合
物をセフアデツクスＧ―25のカラム（1.0×30cm）
にかけ（溶出液0.25％BSA、10mMEDTA及び
0.02％NaN₃を含む0.05モルリン酸塩緩衝液、PH
7.4）、¹²⁵で標識されたペプチドＤを得る。 Γ 力価の測定上記で得られる抗体の力価を次の通り測定す
る。即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10、10²、
10³、10⁴、10⁵……倍に希釈（イニシヤル）し、
これらの夫々100μlに、¹²⁵標識ペプチド（上記
で得られる標識ペプチドを約9500cpmになるよう
に希釈したもの）0.1ml及び0.05モルリン酸塩緩
衝液（PH＝7.4）〔0.25％BSA、10mM EDTA及
び0.02％NaN₃を含む〕0.2mlを加え、４℃で24時
間インキユベートし、生成した抗体と¹²⁵標識
抗原との結合体を、デキストラン―活性炭法及び
遠心分離法（４℃、30分間、3000rpm）により未
反応（結合しない）¹²⁵標識ペプチドから分離
し、その放射線をカウントし、各希釈濃度におけ
る抗体の¹²⁵標識ペプチドとの結合率（％）を
測定する。縦軸に抗体の¹²⁵標識ペプチドとの
結合率（％）及び横軸に抗体の希釈倍率（イニシ
ヤル濃度）をとり、各々の濃度において結合率を
プロツトする。結合率が50％となる抗体の希釈倍
率即ち抗体の力価を求める。その結果抗体の力
価は、50000であつた。 Γ 抗体のヒトα型インターフエロン特異性試験供試試料として各種濃度のヒトβ型インターフ
エロン（東京都総合臨床研究所製、比活性３×
10⁶U／mgプロテイン）、ペプチドの合成製造例16
(b)で得たペプチドＣ即ちヒトα型インターフエロ
ンのペプチド鎖及びヒトα型インターフエロン
〔林原研究所製、リムホブラストイドインターフ
エロン〕を使用する。また標準希釈剤として0.25
％BSA、5mM、EDTA及び0.02％のNaN₃を含
む0.05モルリン酸塩緩衝液（PH7.4）を使用する。各々の試験管に、標準希釈剤0.2ml、供試試料
0.1ml、抗体の製造例３で得た抗体の0.1ml及び
¹²⁵標識ペプチド（上記で得られる標識ペプチ
ドを約2800cpmになるように希釈したもの）0.1
mlを入れ、４℃で72時間インキユベートした後、
ノーマルブタ血清（normal porcine serum）を
0.1ml加え、次いでデキストラン被膜した活性炭
の懸濁液0.5mlを加え４℃で30分間放置し、次に
４℃、3000rpmの条件下に30分間遠心分離を行な
い、抗体と¹²⁵標識ペプチドとの結合体及び未
反応（結合しない）¹²⁵標識ペプチドを分離し、
その放射線をカウントし、用いた抗体の力価に相
当する結合率（Bo）を100％として、供試試料の
濃度及び希釈率における抗体と¹²⁵標識ペプチ
ドとの結合体(B)の百分率を求める。得られる結果
より抗体は、ヒトα型インターフエロンに対す
る反応性とヒトβ型インターフエロンに対する反
応性において明確に区別され、このことよりβ型
インターフエロンに低交叉性の、特異性の高い抗
体であることが判る。また抗体、及びについても同様の試験を
行なつた結果抗体と略々同様にヒトα型インタ
ーフエロンに対し特異性の高い抗体であることが
確認された。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式Ｒ―Glu―Ser―Leu―Arg―Ser―Lys―Glu―
OH ［式中Ｒは水素原子、Ｈ―Thr―Asn―Leu―
Gln基、Ｈ―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn―Leu―
Gln基又はＨ―Tyr―Ser―Leu―Ser―Thr―Asn
―Leu―Gln基を示す］で表わされるヒトリムホブラストイドインターフ
エロンのＣ末端ペプチドからなる群から選ばれた
化合物をハプテンとし、これをハプテン―担体結
合試薬の存在下に担体と反応させることを特徴と
するヒトα型インターフエロン抗原の製造法。