SE446451B - Tyrosylerade proinsulin c-peptidderivat, medel for bestemning av proinsulin c-peptidnivan i serum med immunologiska metoder samt anvendning av det tyrosylerade proinsulin c-peptidderivatet - Google Patents

Tyrosylerade proinsulin c-peptidderivat, medel for bestemning av proinsulin c-peptidnivan i serum med immunologiska metoder samt anvendning av det tyrosylerade proinsulin c-peptidderivatet

Info

Publication number
SE446451B
SE446451B SE7909653A SE7909653A SE446451B SE 446451 B SE446451 B SE 446451B SE 7909653 A SE7909653 A SE 7909653A SE 7909653 A SE7909653 A SE 7909653A SE 446451 B SE446451 B SE 446451B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
peptide
proinsulin
tyr
positions
gly
Prior art date
Application number
SE7909653A
Other languages
English (en)
Other versions
SE7909653L (sv
Inventor
K Inouye
M Kono
N Yoshida
M Nakamura
T Okabayashi
K Igano
Original Assignee
Shionogi & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi & Co filed Critical Shionogi & Co
Publication of SE7909653L publication Critical patent/SE7909653L/sv
Publication of SE446451B publication Critical patent/SE446451B/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

lö 20 25' 50"' 446 4517 -2~ samman för att utgöra proinsulin-molekylen och som samtidigt skall frigöras tillsammans med en ekvimolär mängd insulin i enlighet med sönderdelningen av proínsulin i enlighet med sönderdelningen av proinsulin till pankreatiska B-celler.
C-peptiden, som häri hänföres till, är en peptid sammansatt av 31 aminosyrarester, vilket motsvarar ställningar 35 - 65 hos human proinsulin, men den har inte någon tyrosinrest. Därför kan C-peptiden som den står, inte märkas med radioaktivt jod för att utföra radioimmunoassay.
Steiner och andra har därför föreslagit användningen av en N-tyrolyserad C-peptid, vars tyrosínrest kan märkas med radioak- tivt jod (Steiner, D.F. et al: Proc. Natl. Acad. Sci._US., ål, H75 -(l9b7fi- Steiners tyrosylerade C-peptid betraktas såsom varande fram- stålld enligt metoden, som beskrives av Melani et al., (Melani, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. §1, lü8 (l970D.
Enligt denna metod kan C-peptiden tyrosyleras vid pH 7,6 med N-karboxianhydriden av tyrosín, d v s :H2C6HuOH IH- H-YO oào I denna metod är man emellertid ur stånd att stoppa reaktionen vid ett förutbestämt steg och därför är den åtföljande bildningen av C-peptidderivat med mer än en tyrosin oundviklig.
D v s sålunda erhållen produkt är inte en enda substans utan den blandning av C-peptidderivat, i vilken en eller flera tyrosin- rester införes. Förhållandena av komponenterna kan variera från en del till en annan och deras separation skulle vara praktiskt taget omöjlig.
Fastän Steiner hävdar, att den biologiska verkan såsom anti- kroppspecificitet knappast kan påverkas av poly-tyrosyleringen, är det svårt att bekräfta hans påstående i wmtenda avseende.
I allmänhet kan införandet av tyrosín-resten i en viss peptid -utföras med en av de följande föreningarna såsom acyleringsmedel: i) Z -f Tyr(Z)--X ii) Z - Tyr(But)"X iii) Z Tyr X 10 15 20 25 JÛ 35 HO 446 451 vari Z betecknar en bensyloxikarbonylgrupp, X betecknar en aktiv tríklorofvnoxí rller en azídfirupp _3.. ;;ru;n>, såsom oxisuvcinimidyloxi, och Bun betecknar den tertiära butylgruppen och vari Z kan ersät- tas av Boo (tertiär butoxikarbonylgrupp) och But kan ersättas av Boo (tertiär butoxikarbonylgrupp) Och But kan ersättas av Bzl (bensylgrupp) i vilket som helst av fallen. Följande stycken kom- mer att beskriva användningen av dessa föreningar för tyrosyle- ring av C-peptid.
En metod, som använder medlet i), är beskriven i beskrivning- en i den japanska patentpublikationen 25 767/77 och en metod som utnyttjar medlet ii) rapporteras Naithani och andra (Naithani, V.K., et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., QÉQ, 1305 (1975). I des- sa fall måste emellertid den skyddande gruppen på hydroxylgruppen i sidokedjan hos tyrosín borttagas före märkningen.
Sålunda underkastas acyleringsprodukten katalytisk hydrogenolys eller acidolys med vätefluorid och liknande i det förra fallet och acidolys med trifluoroättiksyra (TFA) för (bflfttaïande aV But) eller vätefluorid (för borttagande av både But och Z) i det senare fallet.
Den katalytiska hydrogenolysen kan tillämpas på en kortked- jig peptid men knappast tillämpas på en långkedjig peptid, på grund av dess låga reaktionshastighet. (Se: t ex V.K. Naithani et al. ibid).
Om det acidolytiska borttagandet användes, tenderar erhållen tyrosinrest att undergå modifiering genom den möjliga inverkan av frigiven karboniumkatjon. Dessutom kan man inte utesluta möjlig- heten att den andra delen av C-peptidmolekylen_skulle undergå modi- fiering samtidigt vid syrabehandling.
I sådana fall såsom de som nämndes ovan skulle reningen av produkten med hjälp av fraktionering eller liknande medföra åt- skilliga svårigheter.
Genom att använda medlet iii) kan ovan nämnda nackdel undvi- kas, men acyleringen av C-peptid måste göras med en överskotte- mängd av reagenset för att fullborda reaktionen. Såsom ett resul- tat kan möjlig överacylering vid sidokedjan i tyrosin inte undvi- kas.
Det enda fallet i vilket överacyleríng inte uppträder, är när X = NB i iii). Emellertid har tyrosinaziden vanligen tendens att bilda en inaktiv amid i närvaro av vatten under framställningsför- loppet. 10 W 20 25 35 U0 ._»....,.. ._, 446 451 Under sådana omständigheter har beskrivningarna i japanska patentpublikationen 1087?/Y? föreslagit utnyttjandet av en ny de- finierad "C-peptíd", som är unik i den meningen att den är ett de- rivat av C-peptiden definierad av Steiner (en peptid med en sekvens av 31 aminosyrarester motsvarande ställningar 35-65 i human-proinsulin och omfattar extra sekvenser Arg-Arg (argínyl-argínin) och Lys(For)- Arg-OH (Ng-formyllysyl-arghün)vid N- respektive C-ändställningar -qi 'En Tv i C-peptiden.
Denna hexatriakontapeptid innehåller aminosyrarester motsva- _ rande ställningar 31-65 av human proinsulin och har en tyrosinrest vid N-terminalen. Hydroxifenylgruppen hos tyrosin kan märkas med 1251. D Man använde denna hexatriakontapeptid såsom :antigen i stäl- let för C-peptiden sj älv, emedan den senare endast har rapporterats vara svagt antígenisk även i form av ett albuminbundet konjugat.
Emellertid har den föreslagna metoden en nackdel i syntesen av antigen, då den behöver förfarande för koppling av 35 aminosyra- rester jämfört med 51 hos normal human C-peptid. Utvídgandet av C-peptidsekvensen genom de fyra återstående resterna dåmæs inte' vara nödvändiga för införandet av tyrosinresten. I ' Det är därför en primär avsikt med föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett nytt tyrosylerat proinsulin C-peptidderi- vat, som övervinner de förut nämnda nackdelarna och förebygger besväret, som tillhör tidigare teknik.
Det är en am¶n1avsfld;næd föreliggande uppfinning att tillhan- dahålla ett sådant tyrosylerat C-peptidderivat med enklare struk- tur. Det är vidare en avsikt med föreliggande uppfinning att till- handahålla ett derivat, som kan framställas lättare än tidigare derivat.
Det är ytterligare en annan avsikt med föreliggande uppfin- ning att tillhandahålla ett derivat av förbättrad stabilitet vid användning och lagring. 7 " Det är ytterligare en annan avsikt med föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett medel för bestämning av C-peptidnivân i hu- manserum med hjälp av radioimmunoassay. I Enligt föreliggande uppfinning tillhandahållas ett tyrosyle- rat proinsulin C-peptidderivat med formeln: _ _ Y - Tyr - Gly - R vari Y betecknar en väteatom eller en aminoskyddande grupp, Tyr be- * 10 l5 20 |\) LT! 50 U0 s 446 451 tecknar en tyrosinåterstod vari minst en av väteatomerna på fe- nylringen kan vara substituerad med radioaktivt jod, Gly beteck- nar en glycínrest och R betecknar en peptidrest, 50m motsvarar en uminosyrasekvens, som omfattar minst ställningarna 7 till Zl i human C-peptíd.
Den hela aminosyrasekvensen hos det anförda der1vatet_kan illustreras med nummer, som representerar ställningarna i Cfpep- tidmolekylerna såsom 1 2 3 U 5 “6 7 8 Y-Tyr-Gly-(Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln)-Val-Gly- 9 io 11 12 13 114 15 16 17 18 19 Gin-vai-Giu-Leu-Giy-siy-aiy-Pr-e-aiy-Aia-aiy- 20 21 22 25 2ü 25 26 27 28 29 30 Ser-Leu-(Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu- jl Gln)-OH vari Y och Tyr har samma betydelse som nämndes tidigare och amino~ syraresterna i parenteserna eventuellt kan utelämnas och i så fall fullständigt eller partiellt. Ett skäl för insättandet av en gly- cinrest mellan tyrosinresten och resten av aminosyrasekvensen är att övervinna den tidigare angivna svårigheten förbunden med an- vändningen av tyrosinazid eller åtminstone för att reducera oläg- ligheten förbunden därtill.
Glycin dömes att vara mera lämpligt för ovanstående ändamål än andra aminosyror, på grund av att den förra inte har någon si- dokedja, så att den möjliga faran av racemering fullständigt eli- mineras.
Vilka aminoskyddande grupper som helst kan användas såsom Y, men den tertiära butoxikarbonylgruppen är speciellt lämplig. Skä- let För detta är att det selektiva borttagandet av den skyddande 'gruppen i sidokedjan i tyrosinresten måste göras i syntesen av I Z-Tyr(But)-Gly-0Me eller Boo-Tyr(Bzl)-Gly-OMe, en mellanprodukt för Y-Tyr~Gly-NB och att N~Boc-0-Bzl-tyrosin är mera lätt tillgängligt såsom utgängsmaterial än N-Z~O-But-tyrosin. Förutom detta är Boc- gruppen mera hydrofil än Z-gruppen och är mindre benägen att min- ska lösligheten av Y-Tyr-Gly-C-peptid.
Fastän derivaten av C-peptid och dess kortkedjiga analoger, *som framställes i föreliggande uppfinning, är av enklare struktur, utgör vardera av dem en funktion jämförbar med det tyrosylerade C-peptidderivatet som allmänt användes, och har en överlägsen sta- bilitet på grund av närvaron av den aminoskyddande gruppen Y, så att den kan hållas intakt under hela undersökningsförfarandet. Det 10 15 zo, 30 35 H0 446 451 är onödigt att säja, att den tyrosylerade C-peptiden och kortked- jiga analoger av enklare struktur är fördelaktiga ur syntetisk synpunkt över föreningarna som allmänt användes.
De beskrivna derivaten kan erhållas genom att enkelt bringa e den tidigare framställda aziden (Boa-Tyr-Gly-N5) med en syntetisk peptid motsvarande en aminosyrasekvens omfattande minst ställning- arna 7 till 21 hos human C-peptid och förfarandet därför kommer att belysas mera i detalj under hänvisning till framställningen, som beskrives i följande stycken.
Framställning Förfarande l), Boc-Tyr(Bzl)-Gly-OMe 7 soc-Tyr(Bzl) -oH(2,79 g 7,5 mmol) och tri-n-butyl-amin (1,79 ml, 7,5 mmol) löses i metylenklorid (15 ml) och till detta sättes H~Gly-OMe - HCL (0,94 3, 7,5 mmol). Blandningen kyles i is och dicyklohexylkarbodiimid (l,55 g, 7,5 mmol) tillsättes med mety- lenklorid (5 ml) såsom lösningsmedel. Blandningen får stå över nat~ ten vid 4 OC, Efter det att de kristallina fällningarna av dicyklo- hexylkarbamid har avfiltrerats, indunstas lösningsmedlet i vakuum.
Erhållen återstod återupplöses i etylacetat och lösningen tvättas i följd med iskall lM saltsyra, vatten och lM natriumvätekarbonat. 1Efter att ha torkats över vattenfritt magnesiumsulfat, in- dunstas denna lösning till torrhet i vakuum. Omkristallisation av den kristallina återstoden från etylacetat-dietyleter ger titel~ föreningen (2,72 g, 82 %). f g amp 121-122 °c, [pjšå _+ 1,8 i 0,4 ° (C 1,0, Meon). A» Anal. ber. för C2uH30 N2O6: C, 65,lü; H, 6,83; N, 6,33 % Funnet: C, 65,16; H, 6,85; N, 6,39 %.
Förfarande 2). Boc-Tyr-Gly-NHNH2 Boc-Tyr(Bzl)-Gly-OMe (O,ÄOg), erhållen ovan i förfarande 1), i me- tanol (ca 10 ml), som innehåller ättiksyra (0,5 ml)hydrogenolyseraS över palladiumsvart i 6 timmar. En sirapsaktig återstod, som er- hållits efter borttagandet av katalysatorn genom filtrering och lösningsmedlet genom indunstning,.löses i etylacetat och lösningen .tvättas med vatten, torkas över vattenfritt magnesiumsulfat och indunstas i vakuum. Erhållen Boo-Tyr-Gly-OMe löses i metanol (5 ml), hydrazínhydrat (O,22) tillsättes och blandningen får stå över nat- ten vid 25 OC. Erhållen återstod vid indunstning av lösningsmedlet i vakuum löses i vatten och lösningen blir efter mättnäd med na- triumklorid extraherad med etylacetat. Extraktet torkas över vat- tenfritt magnesiumsulfat och indunstas till torrhet; Den kristallina n' \'\Z~ v » 10 20 25 50 35 7 446 451 återstoden omkristalliseras från etylacetat för att ge titelförening- en (O,29 g, 75 %). Denna förening förlorar sitt kristallísationslös- ningsmedel för att bli amorft vid 75-85 OC. ber. för C1ßH2uNuO5 - CH3C02C2H5: C, 50, 53; H, 7,32; N, 12,72 % Funnet: C, 50, H2; H, 7,53; N, 13,23 % Förfarande 5). B00-Tyr-Gly-N, Produkten erhållen i enlighet med förfarande 2) (26,H mg, 60 0 mol) löses i dimetylformamid (DMF 0,5 ml) och kyles ned till -l5-20 90.
Till denna lösning sättes i följ* U N väteklorid/dioxan (0,06 ml) och isoamylnitrit (8,7 ul, 6,6 umol) och blandningen omröres i 10 min, kyles ned till -30 -40 OC och neutraliseras sedan med diisopro- pyletylamino (DIEA, 59 ul, 300 umol) för att ge en.lösning av ti- telaziden.
FörfarandeÅ). Boc-Typ-Gly-human C-peptid Syntetisk human C-peptid (20,2 mg, ca 6 umol) och DIEA (5 pl, HO pmol) löses i en blandning av DMF (0,5 ml) och vatten (0,3 ml).
Till detta sättes azidlösningen, som erhållits i förfarande 5) o- van, och blandningen får stå vid U OC i 18 timmar. Detta påföres en kolonn (l,74 x 108 cm) av "Sephadex" G-25® (medium), som tidigare har bringats i jämvikt med'0,05 M ammoniumvätekarbonat och elue- ringen utföres med samma buffert. Fraktioner (5,75 ml/rör) uppsam- las och de motsvarande den första toppen (rör 20-H0) som observe- ras genom absorption vid 230 mm, kombineras och lyofiliseras_för att ge titelföreningen (2l,7 mg). Aminosyraförhållanden i syrahydro- lysat (teoretiska värden ges i paranteser): Asp, 1,00 (1), Ser, 2,03 (2), Glu, 7,96 (8), Pro, 2,10 (2), Gly, 7,89 (8), Ala, 2,66 (5), val, 2,01) (2), Leu, 6,00 (6), Tyr, 0,81 (1)*- Tyr-innehållet i intakt peptid är 1,00 mol/mol peptid, vilket mä- tes spektrofotometriskt vid 290 mm i 0,1 M natriumhydroxid.
Förfarande U-1), Boc-Tyr-Gly-human C-peptid - (7 - 31), - (7 - 20) Anal. och -(7-21). _ Syntetisk human C-peptid (7-31)-pentakosapeptid (10 mg, ca 3,6 umol) löses i 0,0 ml DMF. Till detta sättes azidlösningen er- hållen i förfarande 3) ovan från 36 umol av hydraziden och blandningen får stå vid H UC i ? dagar.
Detta överföres till en kolonn (1,7N x 108 cm) av "Sephadex" G-25 (medium) (dextrangcl), som tidigare har bringats i jämvikt med 0,05 M ammoniumvütukarbonat och elucríngon utföres med summa buffert.
Fraktioner (3,75 Irü/rör) uppsamlas och de som Inotsvarar den första top- 10 TS 20 25 ,35 40 446 451 8 pen (rör 22-26), vilket observerades genom absorption vid 250 nm, kombineras och lyofiliseras för att ge titelföreningen (ll mg).
. Väsentligen samma förfarande följes respektive med human C- peptid-(7-24)-oktadekapeptid och human C-peptid-(7-3l)-pentadeka- _ peptid för att erhålla motsvarande föreningar.
Föreningen, som härstammar från oktadekapeptid, framträdde i rör 25-41, och den från pentadekapeptiden framträdde i rör 26-H5 i kolonnkromatografin därav. Aminosyraförhållanden i syrahydroly- saten (teoretiska värden ges inom (pan¶wesaÜ.av peptiderna, erhåll- na ovan är: 2 l. Boc__Tyr-Gly ~human C-peptid - (7-31) ser. 1,91 (2), alu, 4,50 (5); Pro, 2,17 (2), Gly, 7,86 (8), Ala, 2,07 (2), Val. 1,64 (2); Leu. 5,00 (5); Tyr, 1,12 (1). Z 2. Boc-Tyr-Gly-human C-peptid-(7-2Ä) ser. 0,90 (l); Glu, 2,8H (3); Pro. 2,10 (2), Giy, 7,3H (7); Ala, 1,06 (1), vol, 1,91 (2), Lou, 3,00 (5); Tyr, 1,28 (1). 3. Boo-Tyr-Gly-human C-peptid - (7-21) Ser. 0,99 (1), Glu, 1,87 (2), Pro, l,l2 (1), Gly, 7,61 (7); Ala, 1,13 (1), val, 2,08 (2), Leu, 2,00 (2); Tyr, 1,43 (1) Var och en av de sålunda erhållna tyrosylerade C-peptiderna är i stånd att märkas genom vilken känd metod som helst på grund av att de innefattar en hydroxifenylgrupp i molekylen. Exempelvis användes för detta ändamål behandling med radioaktivt jod i närvaro av kloramin T följt av avslutning av reaktionen med natriummetabi- sulfit.
Förfarande 5). Boc-(125I)Tyr -Gly-human C-peptid Den tyrosylerade C-peptiden (2 ng), som erhållits i förfarande 4), löses i 0,5 M fosfatbuffert (pH 7,5; 20 ul) och joderas på van~ iigt sätt med Na 1251 (2 moi) ooh kioramin T (20 ng) och såsom ett oxidationsmedel vid rumstemperatur. Efter 30 sek tillsättes natrium- metabisulfit (120 ng) för att avsluta reaktionen.
Erhållen Boc-Tyr(l25I)-Gly-human C-peptid fraktioneras genom gelflltrering på en kolonn av "Sephadex" G-25 (1 x 25 cm) (dextran- gel) med 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,Ä) såsom elueringsmedel. Fraktio- ner (1 ml/rör) uppsamlas och deras radioaktivitet mätes. Rören mot- svarande en huvudtopp kombineras för att ge titelföreningen med en mig). specifik radioaktivitet av ca 150p ci/ng. 10 15 20 25 j0 35 NO 9 446 451 Liknande förfaranden följdes för att erhålla Boc-É125I)Tyr- Gly-human C-peptid-(7-31) (snecifik radioaktivitet 170 uCi/üg), Boc-(125I]Tyr - Gly - human C-peptid-(7-2N)(20O pCí/pg) och Boc- (125I)Tyr-Gly-human C-peptid-(7-2l)(22O uCi/På).
Exempel Mätningen av C-peptid i serumprov genom användning av det 1251-märkta derivatet, som erhållits i föreliggande uppfinning, utföres, fastän mätningen är ganska vanlig och beskrives såsom ett rent exempel på följande sätt: C-peptid-kreatursserum-albumin-konjugat, som innehåller human C-peptid (normal l-31; 1,25 mg) löses i steriliserad J.P. saltlös- ning (l,25 ml) och till denna lösning sättes Freunds kompletta adjuvans (l,25 ml) och blandningen emulgeras noggrant genom omrör-~ ning. Emulsionen injiceras sedan intradermikalt i fem (5) kaniner.
På samma sätt injiceras kaninerna med C-peptidkonjugatet fle- ra (5-6) gånger vid tre (3) på varandra följande veckor. Blodet uppsamlas tio (10) dagar efter den sista injektionen för erhållan- de av önskat antiserum.
Bortsett från föregående framställning av antiserum kombineras en standard C-peptidlösning (100 ul), det framställda antiserumet (100 pl, utspätt till l:25000) och en av de märkta peptiderna er- hållna i förfarande 5) (H0 000 cpm) kombineras för att stå vid rumstemperatur i ca 20-2ü timmar för att alstra ett antigen-anti- kroppkomplex. Till detta sättas en get-antikanin IgG-antikropp (en konjugat av antikropp med polyakrylamidgel, tillgänglig från Bio-Rad Laboratories, USA under namnet "IMMUNOBEAD") och bland- ningen får stå vid rumstemperatur i en timma.
Blandningen centrifugeras sedan för att borttaga dess Över- skiktade vätska genom aspiration. Radioaktivitet hos sedimenten räknas med scintillationsräknare.
Standardkurvor skildrade i vidhängande ritning är dos-repons- kurvor, som erhållits genom att mäta radioaktiviteterna hos sedi- menten i vilka respektive derivat framställda i förfarande 5) är införlivade. BO representerar den radioaktiva bindningen till anti- kropp i frånvaro av icke-märkt C-peptid, under det att B betecknar (den bundna radioaktiviteten i närvaro av icke märkt C-peptid.
Samma förfarande, som beskrevs i samband med framställningen av standardkurvorna, följes i aktuell mätning av C-peptid i serum- provet, som skall bestämmas och som i detta fall ersätter standard- C-peptídlösningen. Koncentrationen av C-peptiden i serumprovet av- 446 451 10 läses från standardkurvorna.
Alternativt kan serumprovet kombineras med antiserumet och en av de märkta C-peptiderna och sedan odlas vid UOC i H8 timmar.
Den odlade blandningen behandlas sedan med en konventionell dubbel- antikroppmetod och radioaktiviteten hos sedimenten räknas. :fp

Claims (5)

446 451 Patentkrav
1. Proinsulin C-peptidderívat, k ä n n e t e c k n a t, av formeln: Y-Tyr-Gly-R vari Y betecknar en väteatom eller en aminoskyddande grupp, Tyr betecknar en tyrosínrest, vari minst en av väteatomerna kan vara substítuerad med radioaktivt jod, Gly betecknar en glycinrest och R betecknar en amínosyrasekvens, som utväljes från en grupp bestående av human proinsulin C-peptid (ställningar 1 till 31), en peptid, som motsvarar ställningarna 7 till 31 av human pro- insulin C-peptid, en peptid som motsvarar ställningarna 7 till 24 av human proínsulin C-peptid, och en peptid som motsvarar ställningarna 7 till 21 av human proinsulin C-peptíd.
2. Proinsulin C-peptidderivat enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a t därav, att Y betecknar en tertiär butoxikarbonyl- EYUPP-
3. Proinsulín C-peptidderivat enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t därav, att minst en av väteatomerna i hydroxifenylkärnan av tyrosinresten är substituerad av jod 125 (1251).
4. Medel för att bestämma proinsulín C-peptidnívàn i serum med immunologiska metoder, k ä n n e t e c k n a t av ett proinsu- lin C-peptidderivat med formeln: Y-Tyr--Gly--R vari Y betecknar en väteatom eller en aminoskyddande grupp, Tyr be~ tecknar en tyrosinrest, vari minst en av väteatomerna kan vara subs- tituerad med radioaktivt jod, Gly betecknar en glycinrest och R be~ tecknar en amínosyrasekvens, som utväljes från en grupp bestående av human proinsulin C-peptid (ställningar 1 till 31), en peptíd, som motsvarar ställningarna 7 till 31 av human proínsulín C-peptid, en peptid som motsvarar ställningarna 7 till 24 av human proinsulin C-peptid, och en peptid som motsvarar ställningarna 7 till 21 av human proinsulin C-peptid.
5. Användning av ett proinsulin C-peptíddcrivut med formeln: Y-Tyr-Gly-R vari Y betecknar en väteatom eller enaminoskyddande grupp, Tyr be» 44e 451 Q tecknar en tyrosinrcst, vari minst en av väteutomerna kan vara sub- stituerad med radioaktivt jod, Gly betecknar en glycínrest och R betecknar en amínosyrasekvens, som utväljcs från en grupp bestående av human proinsulín C-peptid (ställningar 1 till 31), en peptid, som motsvarar ställningarna 7 till 31 av human proínsulín C-peptid, en peptid som motsvarar ställningarna 7 till 24 av human proínsulín C-peptíd, och en peptíd som motsvarar ställningarna 7 till 21 av human proinsulin_C-peptíd för att bestämma proinsulín C-peptídnivån i serum med immunologiska metoder. mr-
SE7909653A 1978-10-02 1979-11-22 Tyrosylerade proinsulin c-peptidderivat, medel for bestemning av proinsulin c-peptidnivan i serum med immunologiska metoder samt anvendning av det tyrosylerade proinsulin c-peptidderivatet SE446451B (sv)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12163478A JPS55105653A (en) 1978-10-02 1978-10-02 Tyrosyl c-peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE7909653L SE7909653L (sv) 1981-05-23
SE446451B true SE446451B (sv) 1986-09-15

Family

ID=14816112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE7909653A SE446451B (sv) 1978-10-02 1979-11-22 Tyrosylerade proinsulin c-peptidderivat, medel for bestemning av proinsulin c-peptidnivan i serum med immunologiska metoder samt anvendning av det tyrosylerade proinsulin c-peptidderivatet

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4327072A (sv)
JP (1) JPS55105653A (sv)
CA (1) CA1132135A (sv)
DE (1) DE2947268A1 (sv)
FR (1) FR2470113A1 (sv)
GB (1) GB2063883B (sv)
SE (1) SE446451B (sv)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62132172A (ja) * 1985-12-04 1987-06-15 Shionogi & Co Ltd 固相化抗体およびその製造方法
SE520392C2 (sv) * 1996-09-27 2003-07-01 Creative Peptides Sweden Ab C Specifika peptider för behandling av diabetes mellitus
CN102419373A (zh) * 2010-09-28 2012-04-18 广州市达瑞抗体工程技术有限公司 一种胰岛素和c肽双标记测定试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5210872B2 (sv) 1973-07-14 1977-03-26
DE2614259A1 (de) * 1976-04-02 1977-10-20 Hoechst Ag Radioaktiv markiertes jodiertes insulin und verfahren zu seiner herstellung

Also Published As

Publication number Publication date
SE7909653L (sv) 1981-05-23
FR2470113B1 (sv) 1984-08-31
DE2947268A1 (de) 1981-06-19
JPS5737586B2 (sv) 1982-08-10
GB2063883A (en) 1981-06-10
CA1132135A (en) 1982-09-21
FR2470113A1 (fr) 1981-05-29
DE2947268C2 (sv) 1989-08-31
JPS55105653A (en) 1980-08-13
US4327072A (en) 1982-04-27
GB2063883B (en) 1983-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sanke et al. An islet amyloid peptide is derived from an 89-amino acid precursor by proteolytic processing.
TREGEAR et al. Synthesis of substance P
Brady et al. Practical synthesis of cyclic peptides, with an example of dependence of cyclization yield upon linear sequence
PT90596B (pt) Processo para a preparacao de tetrapeptidos e de pentapeptidos com actividade auxiliar de celulas t
FR2503145A1 (fr) Peptides apparentes aux interferons humains, anticorps obtenus a partir de ces peptides et adsorbants obtenus a partir de ces anticorps
JPH03501738A (ja) ラットの顎下腺から導出したペプチド及びポリペプチド、対応するポリクローナル及びモノクローナル抗体、対応するハイブリドーマ並びに診断、検出及び治療目的でのこれらの生成物の使用
Strickler et al. Utility of the gas-phase sequencer for both liquid-and solid-phase degradation of proteins and peptides at low picomole levels
US4223016A (en) Peptides
US3953418A (en) Novel human proinsulin C-peptide derivatives
Gisin et al. Synthesis of the major component of alamethicin
US4518527A (en) Polypeptides related to the pre-acetylcholine receptor-α of the electric organ of Torpedo californica
SE446451B (sv) Tyrosylerade proinsulin c-peptidderivat, medel for bestemning av proinsulin c-peptidnivan i serum med immunologiska metoder samt anvendning av det tyrosylerade proinsulin c-peptidderivatet
Hofmann et al. Studies on Polypeptides. XV. Observations on the Relation between Structure and Melanocyte-expanding Activity of Synthetic Peptides1_3
JPH04500603A (ja) クローン化腎炎抗原
US3896105A (en) (n-propionyl) -gly-cys-lys-asn-phe-phe-trp-lys-thr-phe-thr-ser-cys-oh and intermediates
AU623687B2 (en) New pentapeptide and a process for the preparation thereof
Burke et al. Divergence of the in vitro biological activity and receptor binding affinity of a synthetic insulin analog.[21-Asparaginamide-A] insulin
EP0009147A2 (en) A method for enzyme immunoassay of pancreatic glucagon and a peptide-enzyme conjugate usable for the method
ABIKO et al. Synthesis of the nonatriacontapeptide corresponding to the entire amino acid sequence of calf thymosin β8 and its effect on the impaired T-cell subsets in patients with Lupus Nephritis
US4058512A (en) Synthetic peptides having growth promoting activity
Garg et al. Amino sugars. CI. Synthesis of substituted glycopeptides containing a 2-acetamido-2-deoxy-. beta.-D-glucopyranosyl residue and the amino acid sequence 18-22 of bovine pancreatic deoxyribonuclease A
JPH0768271B2 (ja) ヒトオステオカルシンの製造法
US5446129A (en) Peptide or its salt for autoimmune hyperthyroidism containing it
Diaz et al. A large-scale synthesis of somatostatin for clinical use by a novel alternating solution/solid-phase procedure
Rocchi et al. Synthesis of peptide analogs of the N-terminal eicosapeptide sequence of ribonuclease A. VIII. Synthesis of [Serine4, Ornithione10]-and [Serine5, Ornithine10] eicosapeptides

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 7909653-3

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 7909653-3

Format of ref document f/p: F