JPH0551398A

JPH0551398A - ポリペプチドおよびその用途

Info

Publication number: JPH0551398A
Application number: JP3208334A
Authority: JP
Inventors: Chieko Kitada; 千恵子北田
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-08-20
Filing date: 1991-08-20
Publication date: 1993-03-02

Abstract

(57)【要約】【目的】ｃ−ＡＭＰ産生活性を有する新規なポリペプチ
ドの創製。【構成】式Ｘ-Gly-Ile-Leu-Asn-Glu-Ala-Tyr-Arg-Lys-
Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-His-Leu-Gln-Se
r-Leu-Val-Ala-Ｙ［式中、ＸはAsp-Val-Ala-HisのＣ末
端側から数えて１ないし４個のアミノ酸もしくはペプチ
ドを、ＹはArg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-
Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-Leu-SerのＮ末端側から
数えて１ないし１９個のアミノ酸もしくはペプチドを示
す］で表されるポリペプチドまたはそのアミド、エステ
ルもしくは塩。【効果】顕著なｃ−ＡＭＰ産生活性を有し、たとえば各
種の神経障害の治療剤または損傷神経の修復剤などの医
薬として有用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はｃ−ＡＭＰ産生活性を有
する、新規なポリペプチドまたはそのアミド、エステル
もしくは塩、ならびにその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】脳の視床下部、精巣等に由来する新しい
生理活性ペプチドとして、３８個のアミノ酸からなるポ
リペプチド−ＰＡＣＡＰ３８−がヒト、ヒツジ、ラット
等において発見されている。ヒト、ヒツジ、ラット由
来のＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配列は同一で、His-Ser-
Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Ly
s-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-
Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys（配列
番号：１）［I］で表される。ＰＡＣＡＰ３８は脳下
垂体細胞の細胞内ｃ−ＡＭＰの産生を高める活性や、ア
ストログリア細胞のｃ−ＡＭＰ産生を高めて神経細胞の
生存を延長させる作用がある。また、ＰＡＣＡＰ３８
のＮ末端側２７個のアミノ酸からなるポリペプチド−Ｐ
ＡＣＡＰ２７(His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-T
yr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr
-Leu-Ala-Ala-Val-Leu（配列番号：２）［II］)−にも
ＰＡＣＡＰ３８と同じ作用のあることが見いだされてい
る［ヨーロッパ公開特許第404,652号］。

【０００３】脳内の神経伝達物質または神経賦活物質と
してはＰＡＣＡＰ３８やＰＡＣＡＰ２７よりも前にヴァ
ソアクティヴ・インテスティナル・ペプチド（Vasoacti
ve Intestinal Peptide、ＶＩＰ）が知られていて、Ｐ
ＡＣＡＰ２７とＶＩＰの相同性は６８％であるが、ｃ−
ＡＭＰ産生活性においてはＰＡＣＡＰ３８やＰＡＣＡＰ
２７の方がＶＩＰよりも強いと報告されている［上記の
ヨーロッパ公開特許］。

【０００４】一方、ＰＡＣＡＰ３８のｃＤＮＡの塩基配
列やＰＡＣＡＰ３８前駆体蛋白質のアミノ酸配列がヒ
ト、ヒツジ、ラットにおいて明らかにされている。たと
えばヒトＰＡＣＡＰ前駆体蛋白質のひとつとして、 ¹Me
t-Thr-Met-Cys-Ser-Gly-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Leu-Val-
Tyr-Gly-Ile-Ile-Met-His-Ser-Ser-Val-Tyr-Ser-Ser-Pr
o-Ala-Ala-Ala-Gly-Leu-Arg-Phe-Pro-Gly-Ile-Arg-Pro-
Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Glu-Asp-Gly-Asn-Pro-Leu-Pr
o-Asp-Phe-Gly-Gly-Ser-Glu-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-
Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Arg-Ala-Ala-Ala-Ala-Trp-Tyr-Ar
g-Pro-Ala-Gly-Arg-Arg-⁸²Asp-Val-Ala-His-Gly-Ile-Le
u-Asn-Glu-Ala-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Ser-
Ala-Gly-Lys-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Val-¹¹⁰Ala-Arg-Gly
-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-A
la-Glu-Pro-Leu-Ser-Lys-Arg-¹³²His-Ser-Asp-Gly-Ile-
Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Al
a-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-
Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-¹⁶⁹Lys-Gly-Arg-Arg-Ile
-Ala-Tyr-¹⁷⁶Leu（配列番号：３）［III］というアミノ
酸配列の前駆体蛋白質が知られている。式［III］に
おいて¹³²His・・・・・¹⁶⁹LysがＰＡＣＡＰ３８に相当す
る。大儀らはＰＡＣＡＰ３８の上流部分である⁸²Asp・
・・・・¹¹⁰AlaをＰＲＰ（PACAP Related Peptide）と名付
け、このＰＲＰが何らかの重要な役割を果たしていると
予想している［バイオケミカルアンドバイオフィジカ
ルリサーチコミュニケーションズ（Biochemical and
Biophysical Research Communications）、173巻、1271
-1279(1990年)］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のＰＲＰの役割は
未だ解明されておらず、ＰＲＰまたはその一部分を含有
するポリペプチドを合成してその作用を定性的かつ定量
的に確かめることができれば、ＰＲＰの役割の手掛かり
がつかめると期待できる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、式［II
I］において⁸⁵His・・・・・¹²⁹Serからなるポリペプチドを
合成してその作用を調べたところ、意外にも本体のＰＡ
ＣＡＰ３８・ＰＡＣＡＰ２７やＶＩＰと同じｃ−ＡＭＰ
産生活性があることが分かり、さらに検討を加えて本発
明を完成した。

【０００７】すなわち本発明は、（１）式Ｘ-Gly-Ile
-Leu-Asn-Glu-Ala-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-S
er-Ala-Gly-Lys-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Val-Ala-Ｙ［I
V］［式中、ＸはAsp-Val-Ala-HisのＣ末端側から数えて
１ないし４個のアミノ酸もしくはペプチドを、ＹはArg-
Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-As
p-Ala-Glu-Pro-Leu-SerのＮ末端側から数えて１ないし
１９個のアミノ酸もしくはペプチドを示す］で表される
ポリペプチドまたはそのアミド、エステルもしくは塩、
および、（２）式［IV］で表されるポリペプチドまた
はそのアミド、エステルもしくは薬理学的に許容される
塩を含有する医薬組成物に関する。

【０００８】なお、本明細書におけるペプチドは、ペプ
チド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、
右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。

【０００９】式［IV］においてＸはAsp-Val-Ala-Hisの
Ｃ末端側から数えて１ないし４個のアミノ酸もしくはペ
プチドを示すが、言い換えると、ＸはHis, Ala-His, Va
l-Ala-HisおよびAsp-Val-Ala-Hisのいずれかであること
を示す。一方、ＹはArg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gl
y-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-Leu-SerのＮ
末端側から数えて１ないし１９個のアミノ酸もしくはペ
プチドを示すが、言い換えると、ＹはArg、 Arg-Gly、Ar
g-Gly-Val、Arg-Gly-Val-Gly、 Arg-Gly-Val-Gly-Gly、A
rg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Le
u、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly、Arg-Gly-Val-Gl
y-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu
-Gly-Gly-Gly、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-
Gly-Ala、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-A
la-Gly、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Al
a-Gly-Asp、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly
-Ala-Gly-Asp-Asp、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-
Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-S
er-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu、Arg-Gl
y-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-
Ala-Glu-Pro、Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-G
ly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-LeuおよびArg-Gly-Va
l-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-
Glu-Pro-Leu-Serのいずれかであることを示す。

【００１０】式［IV］はＣ末端が通常カルボキシル基
（-COOH）またはカルボキシレート（-COO^-）であるが、
Ｃ末端がアミド（-CONH₂）またはエステル（-COOR）で
あってもよい。ここでエステルとしては、低級アルキ
ルエステル（たとえばR＝メチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_1-6アルキルエ
ステル）、シクロアルキルエステル（たとえばR＝シク
ロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8シクロアルキ
ルエステル）、アリールエステル（たとえばR＝フェニ
ル、α-ナフチルなどのＣ_6-12アリールエステル）、ア
ラルキルエステル（たとえばR＝ベンジル、フェネチル
などのＣ_7-14アラルキルエステル）のほか、経口用エス
テルとして繁用されるピバロイルオキシメチルエステル
などがあげられる。

【００１１】本発明のポリペプチド［IV］の薬理学的に
許容される塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、塩酸塩、硫酸
塩、リン酸塩などの無機酸付加塩、酢酸塩、プロピオン
酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、蓚酸塩など
の有機酸塩などがあげられる。

【００１２】本明細書において、アミノ酸およびペプチ
ドなどを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ Com
mission on Biochemical Nomenclature による略号ある
いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を下記する。

【００１３】Gly ：グリシン Ala ：アラニン Val ：バリン Ile ：イソロイシン Leu ：ロイシン Pro ：プロリン Arg ：アルギニン Lys ：リジン His ：ヒスチジン Asp ：アスパラギン酸 Asn ：アスパラギン Glu ：グルタミン酸 Gln ：グルタミン Ser ：セリン Thr ：スレオニン Phe ：フェニルアラニン Tyr ：チロシンまた本明細書中で常用される保護基および試薬を下記の
略号で表記する。

【００１４】 Boc ：ターシャリーブトキシカルボニル Bzl ：ベンジル BrZ ：２-ブロムベンジルオキシカルボニル ClZ ：２-クロルベンジルオキシカルボニル Tos ：パラトルエンスルホニル Bom ：ベンジルオキシメチル Fmoc ：９-フルオレニルメチルオキシカルボニル PAM ：フェニルアセトアミドメチル DEAE ：ジエチルアミノエチル OBzl ：ベンジルエステル OcHex ：シクロヘキシルエステル DCC ：Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド HOBt ：１-ヒドロキシベンゾトリアゾール HOOBt ：３-ヒドロキシ-４-オキソ-3,4-ジヒドロベン
ゾトリアジン HONB ：Ｎ-ヒドロキシ-５-ノルボルネン-2,3-ジカル
ボキシイミド DMF ：Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド本発明のポリペプチド［IV］はペプチド合成の常套手段
で製造しうる。そのようなペプチド合成の手段は、任意
の公知の方法に従えばよく、たとえば、M. Bodansky お
よび M. A. Ondetti 著、ペプチドシンセシス(Peptide
Synthesis)、インターサイエンス、ニューヨーク、196
6年；F. M. Finn および K. Hofmann著、ザプロテイン
ズ(The Proteins)、第２巻、H. Nenrath、R. L. Hill
編集、アカデミックプレスインク、ニューヨーク、19
76年；泉屋信夫他著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善
(株) 1985年；矢島治明、榊原俊平他著、生化学実験講
座１、日本生化学会編、東京化学同人 1977年；木村俊
他著、続生化学実験講座２、日本生化学会編、東京化学
同人 1987年；J. M. Stewart およびJ. D. Young 著、
ソリッドフェイズペプチドシンセシス(Solid Phase
Peptide Synthesis)、ピアスケミカルカンパニー、イ
リノイ、1984年などに記載された方法、たとえばアジド
法、クロリド法、酸無水物法、混酸無水物法、DCC法、
活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カ
ルボニルイミダゾール法、酸化還元法、DCC/HONB法、BO
P試薬を用いる方法などがあげられる。

【００１５】本発明のポリペプチド［IV］の合成は液相
合成法、固相合成法のいずれによってもよいが、本発明
においては固相合成法がより好ましい。固相合成法の
場合には当該技術分野で知られた不溶性樹脂を用いる。
そのような不溶性樹脂としてはたとえば、クロロメチ
ル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン
樹脂、アミノメチル樹脂、４-ベンジルオキシベンジル
アルコール樹脂、４-メチルベンズヒドリルアミン樹
脂、PAM樹脂、４-ヒドロキシメチルフェニルアセトアミ
ドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４-（2',4'-
ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹
脂、４-（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmoc・アミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などがあげられる。これらの樹脂
を用い、ポリペプチド［IV］のＣ末端側からアミノ酸配
列通り順に保護アミノ酸を常法に従って順次縮合し、次
いで後記する保護基除去処理を施して全保護基を除去す
ることにより目的とするポリペプチド［IV］を合成する
ことができる。保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチ
ド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ
るが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミ
ド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミ
ド、N-エチル-N'-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド、などがあげられる。これらによる活性化に
はラセミ化抑制添加剤（たとえば、HOBt、 HOOBt）とと
もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対
称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステル
としてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行ったのちに
樹脂に添加することができる。保護アミノ酸の活性化
や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮
合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選
択されうる。たとえばDMF、ジメチルスルホキシド、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタ
ン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチ
ル、Ｎ-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の混合
物などがあげられる。反応温度は、ペプチド結合形成
反応に使用されうることが知られている範囲から適宜選
択され、通常約−20℃〜30℃の範囲から適宜選択され
る。活性化されたアミノ酸誘導体は通常、1.5~４倍過
剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの
結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこと
なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うこ
とができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られ
ないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを
用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。

【００１６】原料のアミノ基の保護基としては、たとえ
ばベンジルオキシカルボニル、Boc、ターシャリーアミ
ルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、
４-メトキシベンジルオキシカルボニル、ClZ、 BrZ、ア
ダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、
フタリル、ホルミル、２-ニトロフェニルスルフェニ
ル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげら
れる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばア
ルキルエステル(たとえば、メチル、エチル、プロピ
ル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シ
クロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２-
アダマンチルなどのエステル基)、ベンジルエステル、
４-ニトロベンジルエステル、４-メトキシベンジルエス
テル、４-クロルベンジルエステル、ベンズヒドリルエ
ステル、フェナシルエステル、ベンジルオキシカルボニ
ルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラ
ジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。

【００１７】セリンの水酸基は、たとえばエステル化ま
たはエーテル化によって保護することができる。この
エステル化に適する基としてはたとえばアセチル基など
の低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル
基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル
基などの炭酸から誘導される基などがあげられる。ま
たエーテル化に適する基としては、たとえばベンジル
基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基な
どである。

【００１８】チロシンのフェノール性水酸基の保護基と
しては、たとえば、Bzl、2,6-ジクロロベンジル、２-ニ
トロベンジル、BrZ、ターシャリーブチルなどがあげら
れるが、必ずしも保護する必要はない。ヒスチジン
のイミダゾールの保護基としては、Tos、４-メトキシ-
2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、2,4-ジニトロフ
ェニル、ベンジルオキシメチル、ターシャリーブトキシ
メチル、Boc、トリチル、Fmocなどがあげられる。

【００１９】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル［アルコール(たとえば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、 2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、Ｎ-ヒドロキシスクシミド、Ｎ-ヒドロキシフ
タルイミド、HOBt)とのエステル］などがあげられる。
原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえ
ば対応するリン酸アミドがあげられる。

【００２０】保護基の除去（脱離）方法としては、たと
えばＰd黒あるいはＰd-炭素などの触媒の存在下での水
素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタ
ンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフ
ルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理
や、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども
あげられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に−
20℃〜40℃の温度でおこなわれるが、酸処理において
は、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタク
レゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-
ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールのようなカチ
オン補足剤の添加が有効である。また、ヒスチジンの
イミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェ
ニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプト
ファンのインドール保護基として用いられるホルミル基
は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオール
などの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナ
トリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっ
ても除去される。

【００２１】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などもまた公知の基あるいは公知
の手段から適宜選択しうる。

【００２２】このようにして製造されたポリペプチド[I
V]は反応終了後、通常のペプチドの分離精製手段、たと
えば、抽出、分配、再沈殿、再結晶、カラムクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどによって採
取される。

【００２３】本発明のポリペプチド［IV］は自体公知の
方法により金属塩（たとえばナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩など）、塩基または
塩基性化合物との塩（たとえばアンモニウム塩、アルギ
ニン塩など）、酸付加塩、とりわけ薬理学的に許容され
る酸付加塩としても得ることができ、たとえば、無機酸
(たとえば、塩酸、硫酸、リン酸)あるいは有機酸(たと
えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ
酸、蓚酸、メタンスルホン酸)などの塩があげられる。

【００２４】ｃ−ＡＭＰ産生活性の測定はラット副腎髄
質由来の継代培養細胞PC12hを用い、細胞外へ分泌され
るｃ−ＡＭＰ量をｃ−ＡＭＰ測定用キットを用いて行っ
た。その結果、図１に示すように本発明のポリペプチド
［IV］にはＶＩＰと同等の活性が認められた。一方、
式［III］において¹¹²Gly・・・・・¹²⁹Serからなるポリペプ
チド［V］には全く活性が認められなかった。

【００２５】

【作用・効果】本発明の新規なポリペプチド［IV］（そ
のアミド、エステルもしくは塩も含む）はｃ−ＡＭＰの
産生を高める。そのため本発明の新規なポリペプチド
［IV］はたとえば神経賦活剤として用いることができ
る。具体的には各種の神経障害の治療剤または損傷神経
の修復剤として使用することができる。

【００２６】本発明のポリペプチド［IV］を上記した神
経障害治療剤や損傷神経修復剤として用いる場合、その
ままあるいは薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈
剤と混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、注射剤、
座剤、軟膏剤、徐放型製剤などの剤型で経口的または非
経口的に安全に投与することができる。本発明のポリ
ペプチド［IV］は主として非経口的に投与(たとえば、
静脈あるいは皮下注射、脳室内あるいは脊髄内投剤、経
鼻投与、直腸投与)されるが、場合によっては経口投与
されることもある。

【００２７】本発明のポリペプチド［IV］は物質として
安定であるため生理食塩水の溶液として保存できるが、
マンニトール、ソルビトールを添加して凍結乾燥アンプ
ルとし、使用時に溶解することもできる。本発明のポ
リペプチド［IV］は、遊離体としてあるいはその塩基塩
または酸付加塩として投与され得る。その投与量は、
ペプチドの遊離体、塩基塩、酸付加塩ともに、遊離体の
量として、一般に体重１kg当り0.1ナノモル〜１マイク
ロモルの範囲が適量である。さらに詳述すれば、投与
量は対象疾患、症状、投与対象、投与方法などによって
も異なるが、たとえば成人の患者に対して注射で投与す
る場合、通常薬効成分(ペプチド［IV］)１回量として0.
1ナノモル/kg〜１マイクロモル/kg体重程度、より好ま
しくは１ナノモル/kg〜0.1マイクロモル/kg体重程度を
１日１回〜３回程度投与するのが好都合である。ま
た、点滴でも効果があり、点滴の場合の全投与量は注射
の場合と同じである。

【００２８】このポリペプチドを治療剤として用いる場
合には、注意深く精製を行ない細菌や発熱物質が存在し
ないように注意しなければならない。

【００２９】

【実施例】以下に実施例、参考例、試験例をあげて本発
明をさらに具体的に説明する。なお、実施例、参考例中
のアミノ酸はすべてL体である。

【００３０】

【実施例１】 H-Asp-Val-Ala-His-Gly-Ile-Leu-Asn-Gl
u-Ala-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Ser-Ala-Gly-
Lys-His-Leu-Gln-Ser-Leu-Val-Ala-Arg-Gly-Val-Gly-Gl
y-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-
Leu-Ser-OH（配列番号：４）［IVa、式［III］において
⁸²Asp・・・・・¹²⁹Serからなるポリペプチド］の合成市販のBoc-Ser(Bzl)-OCH₂-PAM樹脂（アプライドバイ
オシステムズ社製；0.68g, 0.5mmole）を用い、ペプチ
ド合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

【００３１】樹脂上のBoc基を50%トリフルオロ酢酸／ジ
クロロメタンで処理してアミノ基を遊離させ、このアミ
ノ基に Boc-Val、 Boc-Leu、Boc-Pro、 Boc-Ser(Bzl)、 Bo
c-Gln、 Boc-His(Bom)、 Boc-Lys(ClZ)、 Boc-Gly、 Boc-Al
a、 Boc-Asp(OcHex)、 Boc-Arg(Tos)、 Boc-Tyr(BrZ)、 Boc
-Glu(OcHex)、 Boc-Asn、 Boc-Ile を［IVa］のアミノ酸
配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDC
CまたはHOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再
度縮合し、保護［IVa］樹脂(2.30g)を得た。

【００３２】この保護［IVa］樹脂(0.42g)をパラクレゾ
ール(0.85g)共存下に無水フッ化水素(8ml)で０℃、60分
間処理したのち、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチ
ルエーテル(5ml)で２回洗浄したのち、残渣を50%-酢酸
水(5ml)で抽出した。不溶物をろ去、凍結乾燥し、粉末
(187mg)を得た。これを0.1%トリフルオロ酢酸水(100m
l)に溶解し、LiChroprep RP-18樹脂カラム(2.6×9.4cm)
に付け、0.1%トリフルオロ酢酸水と50%アセトニトリル
(0.1%トリフルオロ酢酸含有)の間での直線型濃度勾配で
溶出した。主要分画を集め凍結乾燥した。これを0.
05M-酢酸アンモニア水(20ml)に溶解し、DEAE-セルロフ
ァインの樹脂カラム(2.6×9.4cm)に付け、0.05Mから0.2
M-酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主
要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末(16.7mg)を得た。
これをN-酢酸(1ml)に溶解し、セファデックスG-25(2.
0×85cm)のゲルクロマトグラフィーに付し、主要画分を
集めて凍結乾燥し白色粉末(12.7mg)を得た。

【００３３】アミノ酸分析値: Asp 4.98(5), Ser 3.50
(4), Glu 4.30(4), Pro 0.97(1), Gly8.90(9), Ala 5.9
6(6), Val 3.92(4), Ile 0.95(1), Leu 7.00(7), Tyr
0.86(1), Lys 1.99(2), His 1.99(2), Arg 2.01(2) 質量分析による(M+H)⁺ 4797.7020 ＨＰＬＣ溶出時間 22.7分カラム条件カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ(AM-301, S-5 120A) (4.6×100
cm) 溶離液：Ａ液(0.1%-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液(0.1%-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速：1.0ml/分

【００３４】

【実施例２】 H-His-Gly-Ile-Leu-Asn-Glu-Ala-Tyr-Ar
g-Lys-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-His-Leu-
Gln-Ser-Leu-Val-Ala-Arg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gl
y-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-Leu-Ser-OH
（配列番号：５）［IVb、式［III］において⁸⁵His・・・・・
¹²⁹Serからなるポリペプチド］の合成市販のBoc-Ser(Bzl)-OCH₂-PAM樹脂（アプライドバイ
オシステムズ社製；0.68g, 0.5mmole）を用い、ペプチ
ド合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

【００３５】樹脂上のBoc基を50%トリフルオロ酢酸／ジ
クロロメタンで処理してアミノ基を遊離させ、このアミ
ノ基に Boc-Val、 Boc-Leu、Boc-Pro、 Boc-Ser(Bzl)、 Bo
c-Gln、 Boc-His(Bom)、 Boc-Lys(ClZ)、 Boc-Gly、 Boc-Al
a、 Boc-Asp(OcHex)、 Boc-Arg(Tos)、 Boc-Tyr(BrZ)、 Boc
-Glu(OcHex)、 Boc-Asn、 Boc-Ile を［IVb］のアミノ酸
配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合した。さらにDC
CまたはHOBt/DCCで活性化した同じアミノ酸誘導体で再
度縮合し、保護［IVb］樹脂(2.60g)を得た。

【００３６】この保護［IVb］樹脂(0.43g)をパラクレゾ
ール(0.46g)共存下に無水フッ化水素(5ml)で０℃、60分
間処理したのち、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチ
ルエーテル(5ml)で２回洗浄したのち、残渣を50%-酢酸
水(5ml)で抽出した。不溶物をろ去、凍結乾燥し、粉末
(243mg)を得た。これを0.1%トリフルオロ酢酸水(100m
l)に溶解し、LiChroprep RP-18樹脂カラム(4.1×7.5cm)
に付け、20%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含
有)と50%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸含有)の
間での直線型濃度勾配で溶出した。主要分画を集め凍
結乾燥した。これを0.05M-酢酸アンモニア水(20ml)に溶
解し、ＣＭ−セルロファインの樹脂カラム(2.6×9.4cm)
に付け、0.05Mから0.3M-酢酸アンモニア水の直線型濃度
勾配で溶出した。主要画分を合して凍結乾燥し、白色
粉末(8.9mg)を得た。これをN-酢酸(1ml)に溶解し、セ
ファデックスG-25(2.0×85cm)のゲルクロマトグラフィ
ーに付し、主要画分を集めて凍結乾燥し白色粉末(5.0m
g)を得た。

【００３７】アミノ酸分析値: Asp 3.98(4), Ser 3.18
(4), Glu 4.07(4), Pro 1.28(1), Gly8.82(9), Ala 5.0
6(5), Val 2.95(3), Ile 0.97(1), Leu 7.00(7), Tyr
0.83(1), Lys 1.97(2), His 1.91(2), Arg 1.90(2) 質量分析による(M+H)⁺ 4512.6330 ＨＰＬＣ溶出時間 19.1分カラム条件カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ(AM-301, S-5 120A) (4.6×100
cm) 溶離液：Ａ液(0.1%-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液(0.1%-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速：1.0ml/分

【００３８】

【参考例】 H-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Gly-
Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-Leu-Ser-OH（配列番号：
６）［V、式［III］において¹¹²Gly・・・・・¹²⁹Serからな
るポリペプチド］の合成市販のBoc-Ser(Bzl)-OCH₂-PAM樹脂（アプライドバイ
オシステムズ社製；0.68g, 0.5mmole）を用い、ペプチ
ド合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル43
0A）を使用し、合成した。

【００３９】樹脂上のBoc基を50%トリフルオロ酢酸／ジ
クロロメタンで処理してアミノ基を遊離させ、このアミ
ノ基に Boc-Val、 Boc-Leu、Boc-Pro、 Boc-Ser(Bzl)、 Bo
c-Gly、 Boc-Ala、 Boc-Asp(OcHex)、 Boc-Glu(OcHex) を
［V］のアミノ酸配列通り順にHOBt/DCCで活性化し縮合
した。さらにDCCまたはHOBt/DCCで活性化した同じア
ミノ酸誘導体で再度縮合し、保護［V］樹脂(1.55g)を得
た。

【００４０】この保護［V］樹脂(0.42g)をパラクレゾー
ル(0.43g)共存下に無水フッ化水素(5ml)で０℃、60分間
処理したのち、フッ化水素を減圧留去し、残渣をエチル
エーテル(5ml)で２回洗浄したのち、残渣を50%-酢酸水
(5ml)で抽出した。不溶物をろ去、凍結乾燥し、粉末
(183mg)を得た。これを0.1%トリフルオロ酢酸水(100m
l)に溶解し、LiChroprep RP-18樹脂カラム(2.6×9.4cm)
に付け、0.1%トリフルオロ酢酸水と30%アセトニトリル
(0.1%トリフルオロ酢酸含有)の間での直線型濃度勾配で
溶出した。主要分画を集め凍結乾燥した。これを0.
05M-酢酸アンモニア水(20ml)に溶解し、DEAE-セルロフ
ァインの樹脂カラム(2.6×9.4cm)に付け、0.05Mから0.5
M-酢酸アンモニア水の直線型濃度勾配で溶出した。主
要画分を合して凍結乾燥し、白色粉末(43.7mg)を得た。
これをN-酢酸(1ml)に溶解し、セファデックスG-25(2.
0×85cm)のゲルクロマトグラフィーに付し、主要画分を
集めて凍結乾燥し白色粉末(42.4mg)を得た。

【００４１】アミノ酸分析値: Asp 1.84(2), Ser 1.63
(2), Glu 1.00(1), Pro 0.88(1), Gly6.41(7), Ala 2.0
6(2), Val 0.96(1), Leu 2.00(2) 質量分析による(M+H)⁺ 1515.6785 ＨＰＬＣ溶出時間 14.6分カラム条件カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ(AM-301, S-5 120A) (4.6×100
cm) 溶離液：Ａ液(0.1%-トリフルオロ酢酸水) Ｂ液(0.1%-トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル) を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出(50分) 流速：1.0ml/分

【００４２】

【試験例】副腎髄質由来の株化細胞PC12hを準牛胎児血
清10％を含むダルベッコ変法イーグル培地中37℃で培養
し、コラーゲン処理した48穴プレートに１穴あたり５×
10⁴個の細胞をまき、７〜10日間培養した。その後、
培地を500μlのハンクス平衡塩類溶液にかえ37℃で30分
間置き、ここへ、同じ溶液に溶解した被検体を加え、37
℃で２時間培養した。次にこの培養液中のc-AMPの量
をアマシャム社製c-AMP測定用キットを用いて測定し
た。

【００４３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：２配列の長さ：２７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：３配列の長さ：１７６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：４配列の長さ：４８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：５配列の長さ：４５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列番号：６配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の化合物［IVa］，［IVb］、ＶＩ
Ｐ、および参考例の化合物［V］のｃ−ＡＭＰ産生活性
を比較して示したグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ｘ-Gly-Ile-Leu-Asn-Glu-Ala-Tyr-Arg-
Lys-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Ser-Ala-Gly-Lys-His-Leu-Gl
n-Ser-Leu-Val-Ala-Ｙ［式中、ＸはAsp-Val-Ala-Hisの
Ｃ末端側から数えて１ないし４個のアミノ酸もしくはペ
プチドを、ＹはArg-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-
Gly-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Glu-Pro-Leu-SerのＮ末端側
から数えて１ないし１９個のアミノ酸もしくはペプチド
を示す］で表されるポリペプチドまたはそのアミド、エ
ステルもしくは塩。
【請求項２】請求項１記載のポリペプチドまたはそのア
ミド、エステルもしくは薬理学的に許容される塩を含有
する医薬組成物。
【請求項３】神経賦活剤である請求項２記載の医薬組成
物。