DE69619530T2

DE69619530T2 - Zyklische somatostatinanaloge mit wachstumhormon inhibierender aktivität

Info

Publication number: DE69619530T2
Application number: DE69619530T
Authority: DE
Inventors: Romano Deghenghi
Original assignee: Individual
Current assignee: Ardana Bioscience Ltd
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2016-07-18
Also published as: ITMI951670A0; CA2227980A1; WO1997005167A1; ATE213742T1; KR19990035961A; EP0842193A1; US5962409A; AU6700996A; DE69619530D1; IT1277391B1; ITMI951670A1; BR9609801A; ES2171704T3; DK0842193T3; HK1008225A1; JPH11510147A; PT842193E; KR100321448B1; EP0842193B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft cyclische Peptide, die zu Somatostatin homolog sind und eine inhibitorische Aktivität auf das Wachstumshormon zeigen.

Hintergrund der Erfindung

Somatostatin, oder der Somatotropin-Freisetzungs-Inhibierungsfaktor ist ein Neuropeptid, das die Freisetzung des Wachstumshormons (Somatotropin) inhibiert.
Eine Anzahl von synthetischen Somatostatin-Analoga sind bekannt, die in der Human- und Tiertherapie verwendet werden.
Insbesondere war Octreotid seit einiger Zeit bekannt, welches ein synthetisches Somatostatin-Analogon ist, das bei der Therapie zur Behandlung von Syndromen verwendet wird, die auf gastroenteral-pankreatischen endokrinen Tumoren und Akromegalie beruhen, genauso wie bei der post-chirurgischen Behandlung von Pankreas-Eingriffen. Octreotid ist auch indiziert als Mittel zur Inhibierung der Magen-Sekretion. Diese Verbindung ist in US 4,395,403 (im Namen von Sandoz) beschrieben und hat die Formel:
Das oben beschriebene Octapeptid liegt innerhalb der allgemeinen Formel von monocyclischen Polypeptiden, umfassend einen Hexapeptidrest, der einen Phenylalaninrest enthält, gegebenenfalls substituiert an der 1-Position des aromatischen Rings, ein Cysteinrest an der 2-Position, einen D-Trypthophanrest, gegebenenfalls substituiert an der 4-Position des Indolrings, einen Lysinrest an der 5-Position, gegebenenfalls N-alkyliert an der Position &epsi;, einen Aminosäurerest an der 6-Position und einen Cysteinrest an der 7-Position, wobei die beiden Schwefelatome der 2- und 7-Cysteinreste miteinander und mit einem Aminosäurerest an der 8-Position gebunden sind.
Ein weiteres synthetisches Somatostatin-Analogon, unter dem Namen Lanreotid bekannt, wird seit kurzem in der Therapie verwendet. Diese Verbindung hat die Formel:
EP 0 203 031, Proc. Natl. Acad. sci. (1987), Seiten 2502 bis 2506 und EP 0 214 872 beschreiben Octapeptide, die Somatostatin-Analoga sind und Lysin enthalten. Die Octapeptide sind wirksame GH-Inhibitoren, es gibt jedoch keinen Hinweis auf eine Selektivität bei den verschiedenen GH-Rezeptoren.
EP 0 505 680 beschreibt Octapeptide mit starker Somatostatin-artiger Aktivität, die einen stark hydrophoben Substituenten in Position 1 tragen.
WO 91118016 beschreibt die Substitution von D-Trp durch D-2-Alkyl-Trp in biologisch aktiven Peptiden, um ihre Beständigkeit gegen oxidativen Abbau zu erhöhen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, dass Verbindungen der Formel (I)
wobei
A D-2-AlkTrp, D-βNal, D-Phe ist;
B Tyr, Phe ist;
C Val, Thr ist;
R ThrNH&sub2;, 2-AlkTrpNH&sub2; ist;
wobei mindestens einer von A oder R D-2-AlkTrp bzw. 2-AlkTrp ist, und wobei die Alkylgruppe von 2-AlkTrp 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfasst; und die pharmazeutisch verträglichen Salze dieser Peptide eine Aktivität aufweisen, die die Freisetzung des Wachstumshormons inhibiert, und daher einsetzbar sind als aktive Prinzipien in der Human- und Tiermedizin.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem höchst überraschenden Befund, dass die Änderung einiger strukturellen Eigenschaften, die in US 4,395,403 als wesentlich definiert wurden, nicht nur die Somatostatin-artige Aktivität beibehält, sondern auch weitere Vorteile im Hinblick auf Spezifizität (siehe beispielsweise die Expression von Rezeptor-sub-Typen in Hypophyse-Adenomen (G. M. Miller et al. J. C. E. M. 80, 1386, 1995) und in carcinoiden Bronchialtumoren zeigen (H. Lefabre et al. J. C. E. M. 80, 1423, 1995).

Detaillierte Offenbarung der Erfindung

Die hier verwendeten Abkürzungen für die Reste von Aminosäuren sind in Übereinstimmung mit der Standard-Nomenklatur für Peptide, daher bedeuten in der oben angegebenen Formel (I):
Cys = Cystein;
D-Trp = D-Trypthophan;
Lys = L-Lysin;
D-2-AlkTrp = D-2-Alkyltryptophan;
D-β-Nal = D-β-Naphthylalanin;
D-Phe = D-Phenylalanin
Tyr = L-Tyrosin;
Phe = L-Phenylalanin;
Val = L-Valin;
Thr = L-Threonin;
ThrNH&sub2; = L-Threoninamid;
2-Alk-TrpNH&sub2; = L-2-Alkyltryptophanamid.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist mit Alkyl in Position 2- des Tryptophanrests Niederalkyl gemeint, umfassend 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Beispiele für Niederalkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl. Von diesen ist die Methylgruppe am meisten bevorzugt, und die Abkürzung MeTrp wird zur Bezeichnung von 2-Methyltryptophan verwendet.
Alle drei Buchstaben-Abkürzungen der Aminosäuren, denen ein "D" vorhergeht, bedeuten die D-Konfiguration des Aminosäurerestes.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind:
wobei MeTrp 2-Methyltryptophan ist.
wobei MeTrp 2-Methyltryptophan ist, ist am meisten bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptid-Verbindungen können entsprechend den üblichen Methoden der Peptidchemie hergestellt werden, sowohl als feste Phase als auch in Lösung, oder mit Hilfe der klassischen im Stand der Technik bekannten Methoden. Die Festphasen-Synthese geht vom C-terminalen Ende des Peptids aus. Ein geeignetes Ausgangsmaterial kann beispielsweise hergestellt werden, in dem die erforderliche geschützte α-Aminosäure an ein chlormethyliertes Harz, ein hydroxymethyliertes Harz, ein Benzhydrylamin-Harz (BHA) oder ein para- Methylbenzhydrylamin-Harz (p-Me-BHA) gebunden wird. Als Beispiel wird ein chlormethyliertes Harz unter dem Handelsnamen BIOBEADS® SX 1 von BioRad Laboratories, Richmond, California, verkauft. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist beschrieben von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 15997, (1966). Das BHA-Harz wird beschrieben von Pietta und Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) und ist kommerziell erhältlich von Peninsula Laboratories Inc., Belmont Californien.
Nach der Anfangsbindung kann die Schutzgruppe der α-Aminosäure mit Hilfe von verschiedenen sauren Reagentien, umfassend Trifluoressigsäure (TFA) oder Salzsäure (HCl), gelöst in organischem Lösungsmittel bei Raumtemperatur entfernt werden. Nach der Entfernung der Schutzgruppe der α-Aminosäure können die verbleibenden geschützten Aminosäuren Schritt für Schritt in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt werden. Jede geschützte Aminosäure kann allgemein in einem Überschuss von etwa dreimal unter Verwendung einer geeigneten Carboxyl-aktivierenden Gruppe wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIC), die beispielsweise in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder Dimethylformamid (DMF) und ihren Gemischen gelöst ist, umgesetzt werden. Nach Vervollständigung der gewünschten Aminosäuresequenz kann das gewünschte Peptid vom Trägerharz durch Behandlung mit einem Reagens wie Fluorwasserstoff (HF) abgespalten werden, das nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch die üblicheren Schutzgruppen der Seitenketten. Wenn ein chlormethyliertes Harz oder hydroxymethyliertes Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit HF zur Bildung des sauren Peptids in freier Form. Wenn ein BHA- oder p-Me-BHA-Harz verwendet wird, führt die Behandlung mit HF direkt zur Bildung des Amid-Peptids in freier Form.
Die oben diskutierte Festphasen-Prozedur ist im Stand der Technik bekannt und wurde beschrieben von Atherfon und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1989).
Einige Methoden in Lösung, die zur Synthese der Peptideinheiten der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im Detail angegeben in Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2. Auflage, John Wiley & Sons, New York, N. Y. 1976 und in Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford, 1994).
Diese Verbindungen können Tieren und Menschen in einer wirksamen Dosis gegeben werden, die leicht vom Experten auf diesem Gebiet bestimmt werden kann und die in Abhängigkeit von der Spezies, dem Alter, dem Geschlecht und dem Gewicht des behandelten Subjektes variieren kann. Beispielsweise fällt bei Menschen bei intravenöser Gabe die bevorzugte Dosis in den Bereich von 0,1 ug bis 10 ug Gesamtpeptid pro kg Körpergewicht. Bei oraler Gabe sind typischerweise höhere Mengen notwendig. Beispielsweise ist bei Menschen für die orale Gabe das Dosierungsniveau typischerweise von etwa 30 ug bis etwa 1000 ug Polypeptid pro kg Körpergewicht. Der exakte Spiegel kann leicht empirisch basierend auf der obigen Offenbarung bestimmt werden.
Zusammensetzungen, umfassend als aktiven Bestandteil die organischen und anorganischen Additionssalze der oben beschriebenen Polypeptide und ihre Kombinationen, gegebenenfalls im Gemisch mit einem Vehikel, einem Verdünner, einer Matrix oder einer Beschichtung zur verzögerten Freisetzung sind ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. Die pharmazeutischen Formeln zur verzögerten Freisetzung, umfassend bioerodierbare Matrizes die geeignet sind für subkutane Implantate, sind besonders interessant. Beispiele für diese Matrizes sind beschrieben in WO 9222600 und WO 9512629.
Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide wurde in vitro und in vivo untersucht.
Die Studie der Bindung der Peptide an Somatostatin-Rezeptoren wurde durch eine Verdrängungsmethode durchgeführt, welche in einer Verdrängung des Radioliganden (11-Tyr radioiodiertes Somatostatin 14-) von den Rezeptoren vor elektrophoretischer Analyse auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel durchgeführt (Prevost et al., European J. Cancer, 11, 1589 bis 1592, 1993).
Die biologische Aktivität wurde bei Ratten- und Human-Zelllinien getestet, nämlich einer GH 3-Ratten-Zellinie, die hergestellt wurde ausgehend von einem Hypophyse- Tumor mit zwei 70 und 57 kDa-Rezeptoren; MCF7-Human-Zellinie, ausgehend von einer Pleural-Effusion eines Brustkarzinoms mit zwei hauptsächlichen 57 und 42 kDa-Rezeptoren und einer Human-Zellinie, die hergestellt wurde ausgehend von einem kleinzelligen Lungenkarzinom mit einem 57 kDa-Rezeptor.
Der Test wurde mit den folgenden unten aufgelisteten erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführt:
wobei MeTrp 2-Methyltryptophan ist, jeweils bezeichnet mit den Buchstaben b, c, d.
Als Vergleich wurden die bekannten Peptide Lanreotid (W. A. Murphy et al. Life Sci. 40, 2515, 1987), Antarelix (R. Deghenghi et al., Biomed. & Pharmacother. 47, 107, 1993) und Somatostatin-14 verwendet.
Die pharmakologische Untersuchung der Verdrängung der Bindung zwischen radiomarkiertem Somatostatin und dem Rezeptor durch die getesteten Peptide zeigte, dass der 70 kDa-Komplex den 1 oder 4 sub-Typ-Rezeptoren entspricht, der 57 kDa-Kompfex dem sub-Typ 2 entspricht und der 42 kDa-Komplex dem sub-Typ 3 oder 5 entspricht.
Die getesteten Peptide wurden in 0,1%iger Essigsäure in einer Endkonzentration von 10 mM suspendiert und bei 4ºC gelagert.
Die Tests wurden mit einer 10&supmin;&sup6; M Konzentration durchgeführt.
Autoradiographien bei der Elektrolyse haben gezeigt, dass der 70 kDa-Komplex nur durch Somatostatin-14 unterdrückt wird, während der 57 kDa-Komplex durch die erfindungsgemäßen Peptide, durch Lanreotid aber nicht durch Antarelix verdrängt wird. Der 42 kDa-Komplex wird durch die Peptide c, d gemäß der Erfindung unterdrückt, welche daher eine Wirkungsspezifizität bewiesen haben.
Tests mit abnehmenden Konzentrationen 10&supmin;&sup6;, 10&supmin;&sup7;, 10&supmin;&sup8; M haben gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen besonders aktiv sind, verglichen mit den bekannten Verbindungen und Somatostatin.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine inhibitorische Aktivität auf die Freisetzung des Wachstumshormons, und sind daher einsetzbar als aktive Prinzipien zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung der Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht des Wachstumshormons charakterisiert sind. Insbesondere sind sie einsetzbar für die Behandlung von endokrinen Tumoren, Akromegalie und bei Zuständen, bei denen die bekannten Somatostatin-Analoga eingesetzt werden.
Entsprechend einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung cyclische Peptide der oben gezeigten Formel (I) als Träger für radioaktive Marker bereit, beispielsweise ¹²&sup5;Iod oder ¹¹¹Indium oder 99mTechnetium, die nützlich sind als diagnostische Mittel für Tumore, die durch die Anwesenheit von Somatostatin- Rezeptoren charakterisiert sind.

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:

(i) Anmelder:
(A) Name: DEGHENGHI Romano
(B) Straße: Cheseaux Dessous B1
(C) Stadt: St. Cergue
(E) Land: Schweiz
(F) Postleitzahl: 1264
(ii) Titel der Erfindung: Somatostatin-analoge cyclische Peptide mit inhibitorischer Aktivität auf Wachstumshormon
(iii) Anzahl der Sequenzen: 3
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn # 1.0, Version # 1.30 (EPO)
(vi) Prioritätsanmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: IT M195A001670
(B) Anmeldedatum: 28. Juli 1995

(2) Information für SEQ ID Nr. 1:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit:
(D) Topologie: zirkulär
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Disulfid-Bindung
(B) Ort: 2.. 7
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 1
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist D-2-Methyl-Trp"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 4
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist D-Trp"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Ort: 8
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Thr ist Thr-NH&sub2;" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:

(2) Information für SEQ ID Nr. 2:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(0) Strängigkeit:
(D) Topologie: zirkulär
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Disulfid-Bindung
(B) Ort: 2 .. 7
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 1
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Ala ist D-betaNal"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 4
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist D-Trp"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 8
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist 2-Methyl-Trp-NH&sub2;" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2:

(2) Information für SEQ ID Nr. 3:

(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strängigkeit:
(D) Topologie: zirkulär
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Disulfid-Bindung
(B) Ort: 2 .. 7
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 1
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist D-2-Methyl-Trp"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 4
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist D-Trp"
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: modifizierte Stelle
(B) Ort: 8
(D) Weitere Information: /Produkt = "andere"
Anmerkung = "Trp ist 2-Methyl-Trp-NH&sub2;" (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:

Claims

1. Verbindungen der Formel (I)

wobei

A D-2-AlkTrp, D-β-Nal, D-Phe ist;

B Tyr, Phe ist;

C Val, Thr ist;

R ThrNH&sub2;, 2-AlkTrpNH&sub2; ist;

wobei mindestens einer von A oder R D-2-AlkTrp oder 2-AlkTrp ist, und wobei die Alkylgruppe von 2-AlkTrp 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfaßt; und die pharmazeutisch verträglichen Salze dieser Verbindungen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:

wobei MeTrp 2-Methyltryptophan ist.

3. Verwendung der Verbindungen der Ansprüche 1-2 zur Herstellung eines Medikaments mit inhibitorischer Wirkung auf das Wachstumshormon.

4. Verwendung der Verbindungen der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung eines Medikaments mit inhibitorischer Antitumor-Aktivität.

5. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Ansprüche 1-2 als aktive Bestandteile im Gemisch mit Trägern und/oder pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.

6. Verbindungen der Ansprüche 1-2 als Liganden für einen radioaktiven Marker.

7. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 6 zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zum Nachweis von Tumoren.