CZ291382B6

CZ291382B6 - Peptidické deriváty ovlivňující uvolňování růstového hormonu, farmaceutický přípravek je obsahující a jejich použití

Info

Publication number: CZ291382B6
Application number: CZ19961833A
Authority: CZ
Inventors: Nils Langeland Johansen; Jesper Lau; Kjeld Madsen; Behrend Friedrich Lundt; Henning Thogersen; Birgit Sehested Hansen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1993-12-23
Filing date: 1994-12-22
Publication date: 2003-02-12
Also published as: RU2167881C2; WO1995017422A1; NO315611B1; HU9601740D0; US5854211A; HUT74820A; EP0736038B1; CZ183396A3; AU683121B2; PL315114A1; FI962591A; JPH09506873A; DE69427650T2; CN1138334A; DE69427650D1; CN1052730C; AU1310695A; FI962591A0; EP0736038A1; JP3759748B2

Abstract

Peptidické deriváty obecného vzorce I, kde p je 0 nebo 1, a A, B, C, D, E a F znamenají aminokyselinové zbytky, mající zvýšenou rezistenci vůči enzymatické proteolytické degradaci, která je způsobena substitucí amidické vazby (-CONH-) aminomethylenem (-CH.sub.2.n.NH-) nebo zavedením N-benzylglycinu do molekuly peptidu. Farmaceutické přípravky stimulující uvolňování růstového hormonu z hypofýzy tyto deriváty obsahující a použití těchto derivátů pro přípravu léčiv.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových peptidických derivátů, farmaceutických přípravků, které obsahují, a jejich použití pro přípravu léčiva pro léčení zdravotních poruch vyplývajících z nedostatku růstového hormonu.

Dosavadní stav techniky

Růstový hormon je hormon stimulující růst všech tkání schopných růstu. Růstový hormon má řadu účinků na metabolické procesy, např. stimuluje proteosyntézu a mobilizaci mastných kyselin a přepíná energetický metabolismus mezi metabolismy uhlovodíků a tuků. Nedostatek růstového hormonu může způsobovat řadu těžkých zdravotních poruch, např. trpaslictví.

Růstový hormon je uvolňován hypofyzou. Jeho uvolňování podléhá příslušnému řízení hormony a neutrotransmitery, přímou i nepřímou cestou. Uvolňování růstového hormonu je stimulováno faktorem stimulujícím uvolňování růstového hormonu (growth hormone releasing hormone GHRH) a inhibováno somatostatinem. Oba tyto faktory jsou vylučovány hypotalamem, jejich účinek je primárně zprostředkováván specifickými receptory hypofyzy. Byly popsány i další sloučeniny stimulující uvolňování růstového hormonu z hypofyzy. Například arginin, L-3,4-dihydrofenylalanin (L-Dopa), glukagon, vesopresin, PACAP (peptid aktivující hypofyzámí adenylyl cyklázu), antagonisté muskarinového receptoru a syntetický hexapeptid GHRP (peptid stimulující uvolňování růstového hormonu), který působí na uvolňování endogenního růstového hormonu buď přímým působením na hypofyzu, nebo působením na uvolňování GHRH a/nebo somatostatinu z hypotalamu.

Při poruchách nebo zdravotních stavech, které vyžadují zvýšené hladiny růstového hormonu, proteinová podstata růstového hormonu vylučuje jakékoli jiné podávání než parenterální. Ani jiné přímo působící přirozené sekrety, např. GHRH a PACAP nelze jako delší polypeptidy podávat perorálně.

Již dříve bylo navrženo použití kratších peptidu, které by u savců zvyšovaly hladiny růstového hormonu, např. EP 18 072, EP 83 864, WO 89/07 110, WO 89/01 711, WO 89/10 933, WO 88/9 780, WO 83/02 272, WO 91/18 016, WO 92/01 711 a WO 93/04 081.

Složení peptidů stimulujících uvolňování růstového hormonu nebo jejich derivátů je důležité z hlediska jejich schopnosti uvolňovat růstový hormon i z hlediska jejich biologické dostupnosti. Předmětem předkládaného vynálezu jsou proto peptidy, které stimulují uvolňování růstového hormonu a které mají výhodnější vlastnosti, než dosud známé peptidy tohoto typu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká peptidických derivátů obecného vzorce I

Á-B-C-D-E(-F)p (I) kde p je 0 nebo 1;

-1 CZ 291382 B6

A je aminokyselinový zbytek imidazolyl-C|_6 alkanové kyseliny, imidazolyl-Ci^ alkenové kyseliny, amino-C^₆ alkanové kyseliny, amino-C|.₆ alkenové kyseliny nebo L- nebo D- aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující H-His, Η-Ala, H-D-Ala, H-(p-alanin), H-Aib. sarkosin a Gly;

B je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující D-Trp, D-2Nal nebo D-Phe;

C je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující Ala, Ser nebo Gly;

D je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující Trp, Phe, P-(2-thienyl}-alanin nebo N-fenylglycin;

E, pokud p je 1, je aminokyselinový zbytek D-Phe, nebo pokud je p 0, pak E je

-NH-CH(CH₂-R³>-CO-R⁴ nebo -NH-CH(CH2-R³)-CH2-R⁴, kde

R³ je fenyl a

R⁴ je piperazino, morfolino, piperidino, -OH nebo -N(R⁵)R⁶, kde R⁵ a R⁶ jsou nezávisle na 20 sobě vodík nebo C]_6 alkyl;

F, pokud p je 1, je aminokyselinový zbytek -NH-CH(R^I0)-(CH₂)v-R⁷)-, kde v je 0 nebo celé číslo z intervalu 1 až 8, a

R⁷ je imidazolyl, piperazino, morfolino, piperidino nebo -N(R⁸)-R⁹, kde R⁸ a R⁹ jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci_6 alkyl, a

R¹⁰ je -H, -COOH, -CO-R¹¹, CHr-OH, přičemž R¹¹ je piperazino, morfolino, piperidino, nebo 30 -N(R¹²)R¹³, kde R¹² a R¹³ jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci_6 alkyl;

pod podmínkou, že nejméně jedna amidická vazba mezi AaB, BaC, CaD, DaE nebo, pokud p je 1, mezi E a F, je substituována aminomethylenem; nebo že pokud p je 0, představuje E potom -NH-(CH(CH₂-R³)-CH2-R⁴, nebo pokudp je 1, potom R¹⁰ je CH2-Rⁿ.

Dále se předkládaný vynález týká farmaceuticky přijatelných solí výše uvedených sloučenin.

Peptidické deriváty obecného vzorce I vykazují zvýšenou rezistenci vůči proteolytické degradaci gastrointestinálními enzymy nebo enzymy v plazmě díky substituci amidické vazby (-CONH-) 40 aminomethylenem (-CH₂NH-) nebo díky zavedení N-aralkylglycinu do molekuly peptidů. Lze očekávat, že zvýšená rezistence peptidických derivátů předkládaného vynálezu vůči proteolytické degradaci zlepší jejich biologickou dostupnost ve srovnání s peptidy navrhovanými v dosavadním stavu techniky.

V kontextu předkládaného popisu znamená výraz „C]_6 alkyl“ alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, zejména methyl, ethyl, propyl, izo-propyl, butyl, pentyl nebo hexyl.

Podle výhodného provedení vynálezu je ve sloučenině obecného vzorce I p rovno 1. Podle jiného výhodného provedení vynálezu představuje v peptidickém derivátu obecného vzorce I symbol A 50 aminokyselinový zbytek His, D-Ala nebo imidazolyl-propionové kyseliny, B je výhodně aminokyselinový zbytek D-Trp, nebo D-2Nal, C je výhodně aminokyselinový zbytek Ala. D je aminokyselinový zbytek N-benzylglycinu, D je výhodně Trp, E je výhodně D-Phe. V rámci definice F je v výhodně 3 až 6 a R⁷ je výhodně -NH2, R¹⁰ je výhodně -CONH2, -CH₂-OH.

-2CZ 291382 B6

Příklady konkrétních peptidických derivátů předkládaného vynálezu:

H-HisT(CH₂NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

H-His-D-TrpT(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

H-His-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂

H-His-D-Trp-Ala-TrpT(CH₂NH)D-Phe-Lys-NH₂

H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂

H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂

H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Phe'l^/(CH2NH)Lys-OH (3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-Phe^vP(CH2NH)Lys-NH2 (3-(4-Imidazolyl)akryloyl)-D-2Nal-A]a-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂

H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂ (2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamin (2SMH-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH₂

4-(H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)butylamin (2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamin ((2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamino)hexylamin (2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-fenylpropylamin (2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-fenylpropylamin

H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂(2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)T(CH₂NH)D-Phe-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-PheT(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp'P(CH₂NH)D-Phe-NH}-6-aminohexanol (2S)-(2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamino)-6-aminohexanol

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)NH)-6-aminohexanol (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol 3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)propy lamin H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂

H-AiMD-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH₂NH₂)

Zkratky:

D-2Nal:

N-Bzl-Gly:

H-Aib:

D-2-naftylalanin

N-benzylglycin

H-amino-izomáselná kyselina

Sloučeniny obecného vzorce I lze připravit běžnými postupy syntézy peptidů v roztoku i na pevné fázi. Syntézu na pevné fázi lze například provést podle Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. Ed, Rockford, Illionois, USA, 1976. Syntézu v roztoku lze například provést podle Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2nd. Ed., New York, New York, USA, 1976.

Aminomethylenovou substituci amidické vazby lze provést podle Y. Sasaki and D. H. Coy, Peptides 8(1), 1987, pp. 119-121. Peptidické deriváty obsahující aminoskupinu derivatizovanou mono- nebo di-hexapyranózou lze připravit Amadoriho přesmykem podle R. Albert et al., Life Sciences 53, 1993, pp 517-525. Vhodnými mono- nebo di-hexapyranózami jsou např. glukóza, galaktóza, maltóza, laktóza nebo celobióza. Deriváty používané jako výchozí látky pro syntézu jsou komerčně dostupné a pokud je to žádoucí, lze do nich zavést vhodné chránící skupiny.

-3CZ 291382 B6

Farmaceuticky přijatelné adiční soli kyselin se sloučeninami obecného vzorce I jsou látky připravené reakcí peptidů s anorganickými nebo organickými kyselinami, jako jsou např. kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, octová, fosforečná, mléčná, maleinová. fialová, citrónová, glutarová, glukonová, methansulfonová, salicylová, jantarová, tertarová. toluensulfonová, trifluoroctová, amidosulfonová a fumarová.

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje farmaceutické přípravky obsahující jako aktivní složku sloučeninu obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Farmaceutické přípravky obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu lze připravit běžnými postupy jako je např. uvedeno v práci Remington 's Pharmaceutical Sciences, 1985. Přípravky jsou připravovány v obvyklých lékových formách, tj. jako kapsle, tablety , aerosoly, roztoky, suspenze nebo jako přípravky pro povrchovou aplikaci.

Jako farmaceutický nosič nebo ředidlo lze použít běžný pevný nebo kapalný nosič. Příkladem pevných nosičů jsou laktóza, terra alba, sacharóza, cyklodextrin, talek, želatina, agar, pektin, arabská guma, magnézium stearát, kys. stearová nebo nižší alkylethery celulózy. Příkladem kapalných nosičů jsou sirup, arašídový olej, olivový olej, fosfolipidy, mastné kyseliny, aminy mastných kyselin, polyoxyethylen a voda.

Podobně nosič nebo ředidlo mohou zahrnovat libovolné látky vedoucí k protrahovanému uvolňování léčiva, známé v příslušné oblasti techniky. Jde o látky jako glycerylmonostearát, nebo glyceraldistearát, které lze použít samotné nebo ve směsi s voskem.

Pokud je pro perorální podávání použit pevný nosič, lze přípravek tabletovat, uzavřít jako prášek nebo granule do tvrdých želatinových kapslí, nebo použít formu tablet (pilulek) nebo pastilek. Množství pevného nosiče je proměnlivé, ale nejčastěji se pohybuje v rozmezí 25 mg až 1 g.

Typická tableta připravená běžným tabletovacím postupem obsahuje:

Jádro:

Účinná složka (jako volná sloučenina nebo její sůl) 100 mg

Koloidní oxid křemičitý (Aerosil) 1,5 mg

Celulóza, mikrokryst. (Avicel) 70 mg

Modifikovaná celulózová pryskyřice (Ac-Di-Sol) 7,5 mg

Magnézium stearát

Potah:

HPMC průměrně 9 mg *Mywacett 9—40 T průměrně 0,9 mg *Acylovaný monoglycerid vhodný jako plastifikátor při potahování filmem.

Pokud je pro podávání léku použit kapalný nosič, lze přípravek připravit jako sirup, emulzi, měkké želatinové kapsle nebo jako sterilní injekční roztoky, tj. vodné nebo nevodné kapalné suspenze nebo roztoky.

Přípravek určený na aerosolovou aplikaci do nosu, obsahuje roztok nebo suspenzi sloučeniny obecného vzorce I v kapalném nosiči, nejčastěji ve vodném nosiči. Nosič dále případně obsahuje další přísady jako jsou solubilizační činidla, např. propylenglykol, povrchově aktivní látky, např. soli kyseliny žlučové, nebo ethery polyoxyethylenu s vyššími alkoholy, látky zvyšující absorpci, např. lecithin (fosfatidylcholin) nebo cyklodextrin, nebo konzervační činidla, např. parabeny.

-4CZ 291382 B6

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou obsaženy v jednotkové dávkové formě v množství 0,0001 až 100 mg účinné složky spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Vhodné dávkové množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu je 1 až 500 mg/den, např. léčivo podávané lidem obsahuje 100 mg účinné složky na dávku.

Bylo ukázáno, že sloučeniny obecného vzorce I stimulují uvolňování endogenního růstového hormonu in vivo. Tyto sloučeniny lze proto použít při léčbě stavů, které vyžadují vyšší hladinu hormonu v plazmě, jako např. u lidí trpících defíciencí růstového hormonu, u slabších pacientů nebo u hospodářských zvířat.

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků stimulujících uvolňování růstového hormonu z hypofyzy, přípravků, které jako aktivní složku obsahující sloučeninu obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu stimulace uvolňování růstového hormonu z hypofyzy, který spočívá v podávání účinného množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli pacientům.

Předkládaný vynález se dále týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva určeného na stimulaci uvolňování růstového hormonu z hypofyzy.

Odborníkům v oboru je dobře známo, že v současné době rozšířené podávání růstového hormonu lidem je velmi mnohostranné. Lze očekávat, že sloučenin}’ obecného vzorce I, podávány pro stimulaci uvolňování růstového hormonu z hypofyzy, budou vykazovat podobné účinky a mít podobné využití jako samotný růstový hormon. Použití růstového hormonu lze shrnout do následujících skupin: stimulace uvolňování růstového hormonu ve stáří; prevence vedlejších účinků katabolismu glukokortikoidů; léčba osteoporózy; stimulace imunního systému; urychlení hojení ran; urychlení reparace fraktur; léčba retardovaného růstu; léčba selhání ledvin nebo nedostatečnosti vyplývající z retardace růstu; léčba fyziologicky krátké postavy zahrnující léčbu dětí s defíciencí růstového hormonu a léčba krátké postavy související s chronickým onemocněním; léčba obezity a retardace růstu souvisejícího s obezitou; léčba retardace růstu souvisejícího a Prader-Williho syndromem a Trunerovým syndromem; urychlení uzdravování a zkrácení hospitalizace pacientů s popáleninami; léčba nitroděložní retardace růstu, kosterní dysplazie, hyperkostisolismu a Cushingova syndromu; indukce pulsatilního uvolňování růstového hormonu; náhrada růstového hormonu u pacientů trpících stresem; léčba osteochondrodysplazie, Noonanova syndromu, schizofrenie, depresí, Alzheimerovy choroby, pomalého hojení ran a psychosociální deprivace; léčba plicní nedostatečnosti a závislosti na ventilátoru; oslabení odpovědí katabolismu proteinů na velké chirurgické zákroky; snížení kachexie a ztráty proteinů v souvislosti s chronickým onemocněním jako je rakovina nebo AIDS; léčba hyperinsulinemie včetně nesidioblastózy, podpůrná léčba při indikaci ovulace; stimulace vývoje thymu a prevence snížení činnosti thymu závislé na věku; léčba imunosuprimovaných pacientů; posilování svalů, pohyblivosti; udržování pevnosti pokožky, metabolické homeostáze, ledvinné homeostáze u slabých starších pacientů; stimulace osteoblastů, přestavby kostí a růstu chrupavek; stimulace imunitního systému u zvířat žijících ve společenstvech a léčba poruch souvisejících se stárnutím u těchto zvířat; podporování růstu u hospodářských zvířat a stimulace růstu vlny u ovcí.

Doporučené dávky léčiva pro výše uvedená použití závisí na konkrétní použité sloučenině obecného vzorce I, cestě podání a požadované terapii. Obecně lze však pro účinné uvolňování endogenního růstového hormonu doporučit dávkové množství 0,0001 až 100 mg na 1 kg tělesné hmotnosti pacienta denně. Obvykle dávkové formy vhodné pro perorální nebo nosní podávání obsahují 0,0001 až 100 mg, výhodně 0,001 až 50 mg, sloučeniny obecného vzorce I ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

-5CZ 291382 B6

Sloučeniny obecného vzorce I lze podávat ve formě farmaceutiky přijatelné adiční soli s kyselinou, nebo je-li to žádoucí jako sůl alkalického kovu, kovu alkalické zeminy nebo nižší alkylamonnou sůl. Soli vykazují v průměru stejnou aktivitu jako volné báze.

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou vedle sloučeniny obecného vzorce 1 obsahovat ještě další sloučeninu nebo několik sloučenin s jinými účinky, např. antibiotika nebo jinak farmakologicky účinné látky. Těmito látkami mohou být jiné sekreci stimulující látky, jako GHRP (1 nebo 6), nebo GHRH nebo jeho analog, růstový hormon nebo jeho analog, nebo somatomedin jako je IGF-1 neboIGF-2.

Jako cestu podávání léčiva lze volit jakoukoliv cestu, která zajistí efektivní transport účinné látky do příslušného nebo požadovaného místa účinku, například podávání léčiva perorálně, do nosu nebo parenterálně, výhodné je podávání perorální.

Sloučeniny obecného vzorce I lze kromě farmaceutického použití použít jako nástroje pro výzkum regulace uvolňování růstového hormonu in vitro.

Sloučeniny obecného vzorce I lze rovněž použít in vivo při hodnocení schopnosti hypofýzy uvolňovat růstový hormon. Například lze sledovat množství růstového hormonu ve vzorcích séra odebraných před a po podání studovaných sloučenin pacientům. Porovnání množství růstového hormonu v jednotlivých vzorcích séra přímo udává schopnost pacientovy hypofýzy uvolňovat růstový hormon.

Sloučeniny obecného vzorce I lze podávat komerčně významným zvířatům pro zvyšování rychlosti a rozsahu vzrůstu, či pro zvyšování produkce mléka.

Farmakologické postupy

Sloučeniny obecného vzorce 1 lze testovat in vitro z hlediska účinnosti a rozsahu účinnosti na uvolňování růstového hormonu v primárních krysích somatotropech.

Primární krysí somatotropy byly připraveny dle Chen et al., Endocrinology 1991, 129, 3 337-3 342. Stručně, krysy byly usmrceny dekapitací. Hypofýzy byly rychle odstraněny a natráveny 0,2% kolagenázou a 0,2% hyalurinidázou ve vyváženém Hanksově fyziologickém roztoku. Buňky byly dále resuspendovány v Dulbeccově modifikaci Eagleova média obsahujícího 0,37 % NaHCO₃, 10 % koňského séra, 2,5 % fetálního telecího séra, 1 % neesenciálních aminokyselin, 1% glutaminu a 1% penicilinu/streptomycinu a adjustovaného na 1,5x10⁵buněk/ml. Takto připravená suspenze byla vnesena po 1 ml do všech jamek 24-ti jamkové destičky a ponechána 2-3 dny v klidu před prováděním testů uvolňování hormonu.

V prvém dnu experimentu byly buňky dvakrát promyty výše popsaným médiem, obsahujícím 25 mmol. Γ¹ HEPES, pH7,4. Uvolňování růstového hormonu bylo iniciováno přidáním média obsahujícího 25 mmol.r¹ HEPES a testovanou sloučeninu. Inkubace byly prováděny 15 min při 37 °C. Po inkubaci bylo množství růstového hormonu uvolněného do média stanoveno standardním postupem RIA.

Sloučeniny obecného vzorce I byly testovány in vivo z hlediska jejich účinnosti na uvolňování růstového hormonu na krysích samicích pod pentobarbitalovou narkózou, podle Bercu et al., Endocrinology 1991, 129, 2 592-2 598. Stručně, dospělí krysí samci Sprague-Davvley byli narkotizováni pentobarbitalem 50 mg/kg i.p. Zcela uspaným krysám byla do krční tepny ajugulámí žíly implantována tracheální kanyla a katétr. Po 15min rekonvalescenci byl odebrán vzorek krve v čase 0. Poté byly intravenózně podány hypofyzární sekreci stimulující látky a krevní vzorky odebrané z arterie byly na 15 min uloženy k ledu a poté centrifugovány 2 min při

-6CZ 291382 B6

000xg. Sérum bylo dekantováno a množství růstového hormonu stanoveno standardním postupem RIA.

Vynález je dále ilustrován několika příklady, které však v žádném směru neomezují jeho rozsah, 5 jakje nárokován.

Zkratky používané v popisu i příkladech představují následující struktury:

Zkratky pro nepřirozené aminokyselinové zbytky:

N-Bzl-Gly:

Nal:

Alb:

Zkratky pro substituované peptidické vazby:

ýíCHjNH)

^ÍCHjNHj)

Zkratky pro chránící skupiny:

BomAdOOFor

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

H-His-D-TrpT(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂

Nosič s peptidem, H-Ala-Trp-D-Phe-Lys-nosič, byl syntetizován Fmoc strategií na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems 431A v 0,25 mmol měřítku podle protokolu FastMoc UV dodaného výrobcem, který zahrnuje syntézu zprostředkovanou HBTU (2-(lH-Benzotriazol-lyl)-l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfát) vNMP (N-methylpyrrolidon) a UV monitorování deprotekce chránící skupiny Fmoc. Jako výchozí nosič pro syntézu byl použít 4-((2',4'dimethoxyfenyl)-(Fmoc-amino)methyl-fenoxy nosič (Novabiochem AG, Švýcarsko; katalogové číslo: 01-64-0013) o substituční kapacitě 0,53 mmol/g. Jako chráněné deriváty aminokyselin byly použity Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Phe-OH Fmoc-D-Trp-OH a Fmoc-Ala-OH.

Skupina -CH₂NH-, izotemí peptidická vazba, byla do peptidu zavedena dle Sasaki, K and Coy, D. H.,peptides 8(1) 119-121, 1987.

Fmoc-D-Trp-aldehyd byl připraven z 399 mg odpovídajícího Ν,Ο-dimethylhydroxamátu podle Fehrentz, J.-A. and Castro, B., Synthesis 676-678, 1983. Surový aldehyd byl rozpuštěn v 8 ml l%kys. octové vDMF (dimethylformamid) a rozdělen na dvě části. První část byla přidána k husté suspenzi 400 mg (0,2 mmol) H-Ala-Trp-D-Phe-Lys(Boc)-nosiče v 8 ml l%kys. octové v DMF při laboratorní teplotě. Poté bylo rozpuštěno 40 mgNaCNBH₃ (85%) v 1 ml DMF

-8CZ 291382 B6 a roztok během 60 min přidán k suspenzi, míchání pokračovalo dalších 60 min. Poté byl nosič odfiltrován a promyt na fritě l%kys. octové v DMF a byla přidána druhá část Fmoc-Alaaldehydu. Opět bylo rozpuštěno 40 mg NaCNBH₃ (85%) v 1 ml DMF, roztok během 60 min přidán k suspenzi a míchání pokračovalo při laboratorní teplotě dalších 18 h.

Po kroku redukční alkylace byl nosič s navázaným peptidem izolován a promyt 1% kys. octovou v DMF. Další prodloužení peptidového řetězce bylo provedeno na peptidovém syntetizátoru výše uvedeným postupem s použitím chráněné aminokyseliny Fmoc-His(Trt)-OH.

Peptid byl odštěpen z 240 mg nosiče směsí obsahující 3 ml TFA (kys. trifluoroctová), 225 mg fenolu, 75 μΐ ethandithiolu, 150 μΐ thioanisolu a 150 μΐ vody za stálého míchání, 240 min, při laboratorní teplotě. Směs po štěpení byla odfiltrována a filtrát zahuštěn v proudu dusíku. Z výsledného oleje byl surový peptid vysrážen diethyletherem (45 ml) a promyt diethyletherem (3 x 45 ml).

Surový' peptid byl purifikován semipreparativní HPLC na koloně 25 x 250 mm s náplní 7 pm C-18 silikagelu, po ekvilibraci 15% CH₃CN v 0,05 mol.Γ¹ (NH4)2SO4 adjustovaným na pH 2,5 4 mol.r* H2SO4. Po vysušení byl surový peptid rozpuštěn v 5 ml 70 % CH3CN/0,l % vodná TFA a zředěn vodou na 50 ml. 20 ml roztoku bylo zředěno na 90 ml a naneseno na chromatografickou kolonu. Separace byla provedena gradientem 21 až 31% CH3CN v 0,05 mol. Γ¹(NH4)₂SO₄, pH2,5, při rychlosti 10 ml/min, 47 min, při 40 °C. Frakce obsahující peptid byly spojeny, zředěny třemi objemy vody a naneseny na Sep-Pak^R C-18 kolonky (cartrige, Waters part, katalogové číslo: 51910) ekvilibrované 0,1 % TFA. Peptid byl z kolonky Sep-Pak^R eluován 70 % CH₃CN v 0,1 % TFA a z eluátu izolován po zředění vodou lyofilizací. Peptid byl připraven s výtěžkem 6,55 mg.

Výsledný produkt byl charakterizován aminokyselinovou analýzou (obsah peptidu a aminokyselinové složení) na analytickém RP-HPLC (retenční čas) a PDMS (plazmatickou desorpční hmotnostní spektrometrií) (molekulová hmotnost). Aminokyselinová analýza a PDMS byly v rámci experimentální chyby (PDMS: ± 0,9 amu, aminokyselinová analýza ± 10 %) v souladu s očekávanou strukturou.

RP-HPLC analýza byla prováděna UV detekcí při 214 nm na koloně Vydac 218TP54, 4,6x250 mm, s náplní 5 pm C-18 silikagelu (The Separation Group, Hesperia, USA), při rychlosti eluce 1 ml/min, při 42 °C. Byly použity dva rozdílné programy eluce:

Al: Kolona byla ekvilibrována 5 % CH₃CN v pufru 0,1 mol.r¹ (NH₄)₂SO₄ adjustovaným na pH 2,5 koncentrovanou H₂SO₄ a eluce provedena gradientem 5 až 60 % CH₃CN v uvedeném pufru, 50 min.

Bl: Kolona byla ekvilibrována 5 % CH3CN/0,l % TFA/H₂O a eluce provedena gradientem 5 % CH3CN/0,1 % TFA/H₂O až 60 % CH3CN/0,1 % TFA/H₂O, 50 min.

RP-HPLC analýzou velučních podmínkách Al a Bl byly zjištěny retenční časy 22,01 min, respektive 23,08 min.

Příklad 2

H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂

Syntéza H-Lys(2-Cl-Z)-nosiče vycházela z 660 mg 4-methyl-BHA nosiče (Bissendorf Biochemicals, Hannover, Německo, katalogové číslo: RMIS50) o substituční kapacitě 0,72 mmol/g, a Boc-Lys(CI-Z)-OH s využitím syntetické strategie Boc na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems 430A v 0,5 mmol měřítku podle protokolu dodaného výrobcem pro

-9CZ 291382 B6 jednotlivé syntetické stupně. Tento protokol zahrnuje syntetický postup z předem připravených symetrických anhydridů v DMF. Doba kondenzace byla stanovena na 60 min.

Skupina -CH₂NH-, izosterní peptidická vazba, byla do molekuly zavedena postupem popsaným 5 v příkladu 1. Reakce vycházela z 675 mg H-Lys(Cl-Z)-nosiče a Boc-ET-Phe-aldehydu připraveného z 616 mg odpovídajícího Ν,Ο-dimethyl hydroxamátu. Po kroku redukční alkylace byl nosič izolován a promyt 1% kys. octovou v DMF na fritě. Další prodloužení peptidového řetězce bylo provedeno na peptidovém syntetizátoru výše uvedeným postupem s použitím chráněných aminokyselin Boc-Trp(For)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-D-Trp(For)-OH 10 a Boc-His(Bom)-OH.

Peptid byl odštěpen z 391 mg nosiče směsí 5 ml HF a 500 μΐ m-kresolu, za stálého míchání, 75 min. Fluorovodík byl odpařen při 0 °C v proudu dusíku. Ze vzniklého oleje obsahujícího i nosič byl peptid vysrážen diethylesterem (50 ml), sraženina promyta diethyletherem (2 x 50 ml). 15 Ze sraženiny byl peptid extrahován TFA (2x2 ml), ze spojených extraktů opět vysrážen diethyletherem (50 ml) a promyt diethyletherem (2 x 50 ml).

Po vysušení byly odštěpeny formylové chránící skupiny z tryptofanu rozpuštěním peptidu v 64 ml 6 mol.r¹ guanidium hydrochloridu obsahujícího 4 ml ethanolaminu, za stálého míchání, 20 při 0 °C, 5 min. Poté byla reakční směs neutralizována 4 ml kys. octové a zředěna vodou na 140 ml.

Surový peptid byl purifikován semipreparativní HPLC přímým nanesením výsledné reakční směsi na kolonu ve stejných preparačních podmínkách jako v příkladu 1. Výtěžek 20,6 mg.

Výsledný produkt byl charakterizován jako v příkladu 1. RP-HPLC analýzou v elučních podmínkách Al a B1 byly zjištěny retenční časy 21,28 min, respektive 23,17 min.

Příklady 3 až 5

Př-	peptid	postup podle příkladu	RP-HPLC retenční časy
podm. Al (Př- O	podm. B1 (Př- 1)
3	H-HisT(CH₂NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	2	20,42	22,9
4	H-His-D-Trp-Ala-TrpT(CH₂NH)D-Phe-Lys-NH₂	1	18,97	21,3
5	H-His-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂	2	18,87	21,08

Příklad 6 (2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamin

Fmoc-D-Phe-aldehyd byl připraven z 385 mg odpovídajícího Ν,Ο-dimethylhydroxamátu podle Fehrentz, J.-A. and Castro, B., Synthesis 676-678, 1983. Surový aldehyd byl rozpuštěn v 20 ml 40 1% kys. octové v DMF a rozdělen na dvě části.

Z 580 mg 4-((2',4'-dimethoxyfenyl)-(Fmoc-amino)methyl-fenoxy nosiče (Novabiochem AG, Švýcarsko; katalogové číslo: 01-64-0013) o substituční kapacitě 0,43 mmol/g byla odštěpena chránící skupina 20% piperidinem v DMF, 20 min a nosič promyt DMF a l%kys. octovou 45 v DMF.

První část Fmoc-D-Phe-aldehydu a 58 mg NaCNBH₃ (85%) rozpouštěného v 1 ml DMF byla přidána k nechráněnému nosiči a hustá suspenze byla míchána při laboratorní teplotě 75 min.

-10CZ 291382 B6

Nosič s navázaným peptidem byl odfiltrován a promyt 1% kys. octovou v DMF. Poté byla druhá část Fmoc-D-Phe-aldehydu spolu s 58 mg NaCNBH₃ (85%) rozpuštěného v 1 ml DMF přidána k nosiči a směs míchána při laboratorní teplotě 18 h. Nosič s navázaným peptidem byl odfiltrován a promyt postupně 1% kys. octovou v DMF, DMF, směsí DCM/methanol 6:4 a DCM (dichlormethan).

Výsledný peptid byl odštěpen z 600 mg nosiče. Surový peptid byl rozpuštěn ve vodě (50 ml) a 25 ml roztoku bylo purifikována semipreparativní HPLC a charakterizováno jako v příkladu 1. Výtěžek 10,9 mg.

RP-HPLC analýzou v elučních podmínkách Al a Bl byly zjištěny retenční časy 27,98 min, respektive 29,45 min.

Příklady 7 až 12

př.	peptid	postup podle příkladu	RP-HPLC retenční časy
podm. Al (Př- O	podm. Bl (př- 1)
7	H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)- Lys-NH₂	1	26,00	27,02
8	H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)- Lys-NH₂	1	22,02	23,30
9	3-(4-imidazolyl)propionyl-D-2Nal-Ala-Trp-D- PheT(CH₂NH)Lys-NH₂	1	26,33	27,70
10	3-(4-imidazolyl)akryloyl-D-2Nal-Ala-Trp-D- Phe'P(CH₂NH)Lys-NH₂	1	26,93	28,15
11	(2S)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-Phe-NH)- 6-aminohexylamin	6	25,33	26,08
12	H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe- Lys-NH₂	1	23,62	25,07

Příklad 13 (2S)-((3-<4-Imidazolyl)propionyl-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH-6-aminohexanol

Nosič s peptidem, 3-(l-Adoc^l-imidazolyl)propionyl-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys(Boc)-Sasrinový nosič (Adoc je zkratka pro adamantyloxykabonyl), byl syntetizován v 1 mmol měřítku podle příkladu 1, stím rozdílem, že byl jako výchozí nosič použit Sasrinový nosič (1020 mg) (nosič funkcionalizovaný 2-methoxy-4-alkoxybenzylalkoholem) (Bachem, Bubendorf, Švýcarsko; katalogové číslo D-1295) o substituční kapacitě 0,87 mmol/g. Postup navázání první aminokyseliny k nosiči byl proveden podle protokolu dodaného výrobcem, a zahrnoval syntézu katalyzovanou 4-dimethylaminopyridinem vycházející z předem připraveného symetrického anhydridu, následovanou benzoylací zbylých volných -OH skupin nosiče anhydridem kys. benzoové.

Chráněný peptid (2 S)—((3—(l-Adoc-4-imidazolyl)propionyl-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-PheNH)-6-(Boc-amino)hexanol byl odštěpen z 1800 mg 3-(l-Adoc-4-imidazolyl)propionyl-DTrp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys(Boc)-Sasrinového nosiče mícháním suspenze nosiče s peptidem ve směsi 10,8 ml THF (tetrahydrofuran), 1,8 ml ethanolu, 211 mg LiBr a 92 mg NaBH₄, 24 h při laboratorní teplotě. Poté byly přikapány 2 ml vody a 2 ml kys. octové. Nosič po odštěpení peptidů byl odfiltrován a promyt 25 ml ethanolu. Filtrát byl zahuštěn ve vakuu, vzniklý

- 11 CZ 291382 B6 olej zředěn 50 ml vody a lyofilizován. Výsledný prášek byl štěpen TFA podle příkladu 1. 1/5 výsledné směsi byla purifikována podle příkladu 1. Výtěžek 28,54 mg.

Výsledný produkt byl charakterizován jako v příkladu 1. RP-HPLC analýzou v elučních podmínkách Al byl zjištěn retenční čas 20,4 min.

Příklad 14

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Ala^vP(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)propalamin

Nosič s peptidem, 3-(l-Adoc-4-imidazolyl)propionyl-Trp-Ala'P(CH2NH)Trp-D-Phe-Sasrinový nosič, byl syntetizován v lmmol měřítku podle příkladu 1, stím rozdílem, že byl jako výchozí nosič použit Sasrinový nosič (1000 mg) (nosič funkcionalizovaný 2-methoxy-4-alkoxybenzylalkoholem) (Bachem, Bubendorf, Švýcarsko; katalogové číslo D—1295) o substituční kapacitě 0,87 mmol/g. Postup navázání první aminokyseliny k nosiči byl proveden podle protokolu dodaného výrobcem, a zahrnoval syntézu katalyzovanou 4-dimethylaminopyridinem vycházející z předem připraveného symetrického anhydridu, následovanou benzoylací zbylých volných -OH skupin nosiče anhydridem kys. benzeoové.

Peptid 3-((3-(l-Adoc-4-imidazolyl)propionyl-D-Trp-AlaT(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin byl odštěpen z 1000 mg (3-(l-Adoc-4-imidazolyl)propionyl)-D-Trp-Ala'P(CH2NH)TrpD-Phe-Sasrinového nosiče mícháním v 10 ml 1,3-diaminopropanu, 20 h, při laboratorní teplotě. Nosič po štěpení byl odfiltrován a extrahován 5 ml DMF. Filtrát a extrakt byly spojeny a pomalu za stálého míchání přidány k 240 ml 1 mol.r¹ kys. chlorovodíkové. Dále byla směs zředěna na 500 ml vodou a přefiltrována. Surový peptid byl purifikován semipreparativní chromatografií v 9 cyklech, přímým nanesením 1/9 připraveného filtrátu na kolonu, v preparačních podmínkách podle příkladu 1. Výtěžek 73,53 mg.

Výsledný produkt byl charakterizován jako v příkladu 1. RP-HPLC analýzou v elučních podmínkách Al a B1 byly zjištěny retenční časy 21,5 min, respektive 22,7 min.

Příklady 15 až 18

př.	peptid	postup podle příkladu	RP-HPLC retenční časy
podm. Al (př- 1)	podm. B1 (Př- 1)
15	(2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-fenylpropylamin	6	29,6	31,2
16	(2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3fenylpropylamin	6	29,4	31,1
17	H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D- PheT(CH₂NH)Lys-NH₂	2	30,4	31,7
18	(2R)-(H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3fenylpropylamin	6	28,1	29,2

- 12CZ 291382 B6

Vzorové struktury sloučenin předkládaného vynálezu:

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl-D-Trp-AlaT(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin

(2S)-((2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-E)-Phe-Ala-Trp-NH)-3phenylpropylamino)-6aminohexanol

H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH₂NH2)

Příklad 19

Zkoumání účinků různých látek stimulujících sekreci růstového hormonu byl věnován test provedený in vitro na krysích hypofyzárních buňkách. Směsné hypofyzámí buněčné kultury byly 15 izolovány z předního laloku hypoíyzy krysích samců a kultivovány 3 dny. Po promytí byly

-13CZ 291382 B6 buňky stimulovány 15 min a v kultivačním médiu stanovováno množství uvolněného růstového hormonu.

Hypofyzární buňky byly izolovány modifikovaným postupem dle O. Sartor et al., Endocrinology 116, 1985, pp. 952-957. Samci krys o hmotnosti 250 g byli dekapitováni a byly odebrány hypofyzy, Neutrointermediámí laloky byly odstraněny a zbytek byl suspendován v Grayově médiu doplněném 0,25 % glukózy, dvěma neesenciálními aminokyselinami a 1 % BSA (izolační pufr). Žlázy byly nařezány na malé kousky a přeneseny do nádoby obsahující 3 ml izolačního pufru, 11 mg trypsinu a 1000 pg DNázy a směs byla inkubována při 37 °C, 35 min, 95 % O₂, 70 ot/min. Fragmenty byly 3x promyty sedimentací v izolačním pufru a buňky odsáty Pasterovou pipetou. Po dispergování byly buňky přefiltrovány přes nylonový filtr (160 pm) kvůli odstranění neztrávené tkáně. Buňky byly 3x promyty izolačním pufrem doplněným o trypsinový inhibitor ((0,75 mg/g) a resuspendovány v kultivačním médiu (DMEM doplněný 25 mmol HEPES, 4 mmol glutaminu, 0,75 % hydrogenuhličitanu sodného, 2,5 % FCS, 3 % koňského séra, 1 nmol T3 a 40 pg/1 dexamethasonu) při koncentraci 2 χ 10⁵ buněk/ml. Buňky byly vneseny do mikrotitračních destiček, 200 pl/jamku a kultivovány 3 dny při 37 °C a 8 % CO₂.

Po kultivaci byly buňky promyty 2 x stimulačním pufrem (HBSS doplněný 1 % BSA, 0,25 % D-glukózy a 25 mmol HEPES) a preinkubovány 1 h. Poté byl starý pufr odstraněn a přidán nový stimulační pufr obsahující peptid, destičky byly inkubovány 15 min při 37 °C a 5% CO₂.

V odebraném médiu bylo stanoveno množství krysího růstového hormonu scintilačním testem (scintillation proximity assay - SPA), jak je uvedeno dále (SPA, proveden podle US 4 568 649, Hart and Greenwalt, Mol. Immunol., 16, 1979, pp. 265-269, nebo Udenfriend et al., proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 1985, pp. 8 672-8 676).

Stanovení krysího růstového hormonu bylo provedeno na Optiplates (96-ti jamkové destičky) vhodné pro přímé počítání na Packards TopCount (β-scintilační počítadlo).

Provedení testu:

μΐ pufru μΐ vzorku (inkubovaného ve stimulačním pufru) μΐ ¹²⁵I-rGH (krysí růstový hormon) μΐ králičího anti-rGH μΐ SPA činidla (králičí anti-GH protilátka vázaná na fluomikrosféry)

Destičky byly uzavřeny a umístěny do třepačky na 30 min, po 10 h inkubace byly ponechány sedimentovat při 10 až 15 °C a proveden odečet.

V SPA, rGH navázaný na králičí anti-GH protilátku (primární protilátka) reaguje s další protilátkou navázanou na fluomikrosféry (SPA Typ II RIA, Amersham). Veškerý radioizotopicky značený rGH vázaný na primární protilátku se naváže na fluomikrosféry a svítí. Odečet na β-scintilačním počítadlem umožní stanovit množství radioizotopycky značeného rGH. Množství radioizotopicky značeného rGH navázaného na fluomikrosféry klesá se zvyšujícím se obsahem rGH ve vzorku.

Sloučenina	EC50 (nmol)	EC_max (% GHRP-6)
H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	2,0	100
H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	1,8	85
H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂	0,5	100
H-D-Ala-D-2Nal-Gly-Trp-D-Phe-Lys-NH₂	0,8	75
(2S)-((3-(4-imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-D- PheT(CH₂NH)-6-aminohexanol	5,0	80

-14CZ 291382 B6

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález přináší nové peptidické deriváty, které stimulují uvolňování růstového hormonu. Jsou využitelné při léčbě řady zdravotních poruch souvisejících s nedostatkem růstového hormonu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Peptidické deriváty obecného vzorce I

A-B-C-D-E(-F)_p (I), kde p je 0 nebo 1;

A je zbytek imidazolyl-C^ alkanové kyseliny, imidazolyl-C^ alkenové kyseliny, amino-Ci_6 alkanové kyseliny, amino-Ci_6 alkenové kyseliny nebo L- nebo D- aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující H-His, Η-Ala, H-D-Ala, H-(|3-alanin), H-Aib, sekosin a Gly;

C je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující Ala, Ser nebo Gly;

D je aminokyselinový zbytek volený ze skupiny zahrnující Trp, Phe, p-(2-thienyl)-alanin nebo N-fenylglycin;

E, pokud p je 1, je aminokyselinový zbytek D-Phe, nebo pokud je p 0, pak E je

-NH-CH(CH₂-R³)-CO-R⁴ nebo -NH-CH(CH2-R³)-CH2-R⁴, kde

R³ je fenyl a

R⁴ je piperazino, morfolino, piperidono, -OH nebo -N(R’)R⁶, kde R⁵ a R⁶ jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci_6 alkyl;

F, pokud p je 1, je aminokyselinový zbytek -NH-CH(R¹⁰)-(CH₂)v-R⁷, kde v je 0 nebo celé číslo z intervalu 1 až 8, a

R je imidazolyl, piperazino, morfolino, piperidino nebo -N(R )-R , kde R a R jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci_6 alkyl, a

R^!0 je -H, -COOH, -CO-R¹¹, -CH₂-OH, přičemž R¹¹ je piperazino, morfolino, piperidino, nebo -N(R'²)R¹³, kde R¹² a R¹³ jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci_6 alkyl;

pod podmínkou, že buď nejméně jedna amidická vazba A a B, BaC, C a D, D a E nebo, pokud pje 1, mezi E a F, je nahrazena aminomethylenem; nebo, pokud pje 0,

-15 CZ 291382 B6

E představuje -NH-CH(CH₂-R³)-CH2-R⁴, nebo pokud p je 1, R¹⁰ je -CH2-R'¹;

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

2. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I. kde p je 1.

3. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce 1, kde A je aminokyselinový zbytek His, D-Ala nebo imidazolylpropionové kyseliny.

4. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde B je aminokyselinový zbytek D-Trp nebo D-2Nal.

5. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde C je aminokyselinový zbytek Ala.

6. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde D je aminokyselinový zbytek N-benzylglycin nebo Trp.

7. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde E, je aminokyselinový zbytek D-Phe.

8. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde v je 6 a R⁷ je -NH₂.

9. Peptidické deriváty podle nároku 1 obecného vzorce I, kde R¹⁰ je -CONH₂, -CH₂-OH.

10. Peptidické deriváty podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 9, volené ze skupiny zahrnující:

H-HisT(CH₂NH)D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂, H-His-D-TrpT(CH₂NH)Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂, H-His-D-Trp-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-Lys-NH₂, H-His-D-Trp-Ala-TrpT(CH₂NH)D-Phe-Lys-NH₂, H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, H-I^AIa-^Nal-AlaT^C^NHjTrp-El-Phe-Lys-NH},

H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, (3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-A]a-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-OH, (3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, (3-(4-Imidazolyl)akiyloyl)-D-2Nal-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, (2R)-(H-D-Ala-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamin, (2SXH-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanoyl, H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH₂, 4-(H-D-Ala-D-2Nal-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)butylamin, (2R)-H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamin, ((2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamino)hexylamin, (2R)-(H-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-fenylpropylamin, (2R)-(H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-NH)-3-fenylpropylamin, H-Aib-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH₂NH)Lys-NH₂, (2SX(3-(4-Imidazolyl)propionyl)T(CH₂NH)D-Phe-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol, (2SX(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-PheT(CH₂NH)-Ala-Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol, (2SX(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-AlaT(CH₂NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol, (2SX(3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp'P(CH₂NH)D-Phe-NH)-6-aminohexanol, (2S)-(2R)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-NH)-3-fenylpropylamino)-6aminohexanol,

-16CZ 291382 B6

3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-E)-Trp-AlaT(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)propylamin, (2S)-((3~(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Phe-Ala-Trp-D-PheT(CH2NH)NH)-6-aminohexanol, (2S)-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-AlaT(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)-6-aminohexanol, 3-((3-(4-Imidazolyl)propionyl)-D-Trp-AlaT(CH2NH)Trp-D-Phe-NH)propylamino,

H-D-Ala-D-2Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT(CH2NH)Lys-NH₂, H-Aib-D-^Nal-Ala-N-Bzl-Gly-D-PheT^CFFNFF).

11. Farmaceutický přípravek, v y z n a č u j í c í s e t í m , že jako účinnou složku obsahuje peptidický derivát obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

12. Farmaceutický přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že v jednotkové dávkové formě obsahuje 10 až 200 mg peptidického derivátu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

13. Farmaceutický přípravek stimulující uvolňování růstového hormonu zhypofyzy, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje peptidický derivát obecného vzorce I podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

14. Peptidické deriváty podle nároků 1 až 10 obecného vzorce I pro použití jako léčiva pro léčení zdravotních poruch vyplývajících z nedostatku růstového hormonu.

15. Použití peptidických derivátů podle nároků 1 až 10 obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli pro přípravu léčiva na stimulaci uvolňování růstového hormonu z hypoíýzy.

Konec dokumentu