ES2268713T3 - Ensayos de receptores de secretagogos de la hormona de crecimiento. - Google Patents
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Abstract
EN LA PRESENTE INVENCION SE DESCRIBE UN ENSAYO PARA LA DETECCION DE RECEPTORES DE SECRETAGOGO DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO Y OTROS RECEPTORES RELACIONADOS. YA QUE DICHOS RECEPTORES SON MIEMBROS DE LOS RECEPTORES ACOPLADOS A LA PROTEINA G, UNA SUBUNIDAD DE DICHA PROTEINA DEBE ESTAR PRESENTE PARA DETECTAR LA EXPRESION. SE DESCRIBE UN ENSAYO SIMILAR EN EL QUE SE DETECTA LA PRESENCIA DE SECRETAGOGOS DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO.
Description
Ensayos de receptores de secretagogos de la
hormona de crecimiento.
Esta invención se refiere a un ensayo que
implica la identificación de receptores de la membrana celular,
específicamente receptores de secretagogos de la hormona de
crecimiento (GHSR). Variando el protocolo pueden identificarse
ligandos de los receptores o puede identificarse la presencia de un
GHSR.
La hormona de crecimiento (GH) es una hormona
anabólica capaz de promover un crecimiento lineal, una ganancia de
peso y una retención corporal completa de nitrógeno. Clásicamente,
se cree que la GH es liberada principalmente a partir de células
somatotrofas de la pituitaria anterior bajo la regulación coordinada
de dos hormonas hipotalámicas, el factor liberador de la hormona de
crecimiento (GHRF o GRF) y la somatostatina. Tanto la estimulación
por el GHRF como la inhibición por la somatostatina de la
liberación de la GH se produce mediante la implicación específica
de receptores en la membrana celular del somatotrofo.
Recientemente se han incrementado las pruebas
que sugieren que la liberación de GH también es estimulada por un
grupo de péptidos cortos denominados péptidos liberadores de hormona
del crecimiento (GHRP; GHRP-6,
GHRP-2 [hexarelina]). Estos péptidos se describen,
por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 4.411.890, en la publicación
de patente PCT nº WO 89/07110, en la publicación de patente PCT nº
WO 89/07111, en la publicación de patente PCT nº WO 93/04081, y en
J. Endocrinol. Invest., 15 (Supl. 4), 45 (1992). Estos
péptidos funcionan uniéndose selectivamente a distintos receptores
de la membrana celular del somatotrofo, el receptor secretagogo de
la hormona de crecimiento (GHSR). Un enfoque medicoquímico ha dado
como resultado el diseño de varias clases de compuestos no
peptídicos de bajo peso molecular activos por vía oral que se unen
específicamente a este receptor y dan como resultado la liberación
pulsátil de GH. Dichos compuestos que poseen una actividad
secretagoga de la hormona del crecimiento se describen en, por
ejemplo, los siguientes documentos: patente de EE.UU. nº 3.239.345;
Patente de EE.UU. nº 4.036.979; Patente de EE.UU. nº 4.411.890;
Patente de EE.UU. nº 5.206.235; Patente de EE.UU. nº 5.283.241;
Patente de EE.UU. nº 5.284.841; Patente de EE.UU. nº 5.310.737;
Patente de EE.UU. nº 5.317.017; Patente de EE.UU. nº 5.374.721;
Patente de EE.UU. nº 5.430.144; Patente de EE.UU. nº 5.434.261;
Patente de EE.UU. nº 5.438.136; Patente de EE.UU. nº 5.494.919;
Patente de EE.UU. nº 5.494.920; Patente de EE.UU. nº 5.492.916;
Publicación de patente EPO nº 0.144.230; Publicación de patente EPO
nº 0.513.974; Publicación de patente PCT nº WO 94/07486;
Publicación de patente PCT nº WO 94/08583; Publicación de patente
PCT nº WO 94/11012; Publicación de patente PCT nº WO 94/13696;
Publicación de patente PCT nº WO 94/19367; Publicación de patente
PCT nº WO 95/03289; Publicación de patente PCT nº WO 95/03290;
Publicación de patente PCT nº WO 95/09633; Publicación de patente
PCT nº WO 95/11029; Publicación de patente PCT n º WO 95/12598;
Publicación de patente PCT nº WO 95/13069; Publicación de patente
PCT nº WO 95/14666; Publicación de patente PCT nº WO 95/16675;
Publicación de patente PCT nº WO 95/16692; Publicación de patente
PCT nº WO 95/17422; Publicación de patente PCT nº WO 95/17423;
Publicación de patente PCT nº WO 95/34311; Publicación de patente
PCT nº WO 96/02530; Science, 260, 1640-1643
(11 de junio de 1993); Ann. Rep. Med. Chem., 28,
177-186 (1993); Bioorg. Med. Chem. Ltrs., 4
(22), 2709-2714 (1994); y Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 92, 7001-7005 (julio de 1995).
El uso de dichos agentes activos por vía oral
que estimulan la liberación pulsátil de GH sería un avance
significativo en el tratamiento de la deficiencia de hormona del
crecimiento en niños y adultos, y también proporcionaría un
beneficio sustancial en aquellas circunstancias en las que los
efectos anabólicos de la GH podrían ser explotados clínicamente
(por ejemplo, rehabilitación tras una fractura de cadera, en
ancianos débiles y en pacientes en recuperación
postoperatoria).
Los receptores de la membrana celular que son
poco abundantes en las células pueden ser difíciles de aislar,
clonar y caracterizar. En el pasado, los ensayos para identificar un
receptor en una célula de mamífero o en un ovocito de rana han
dependido generalmente de: 1) detectar directamente una interacción
receptor-ligando, tal como mediante la unión de un
ligando radiomarcado; o 2) detectar indirectamente la unión
receptor-ligando detectando bien un suceso
intracelular (tal como la movilización de calcio o la identificación
de, por ejemplo, una corriente activada por calcio) o un suceso
extracelular (tal como una secreción hormonal), que es la
consecuencia de la unión del ligando a su receptor. La mayoría de
los receptores clonados, que han sido aislados usando un ensayo de
expresión funcional, se han basado en líneas celulares
inmortalizadas o en tejidos derivados de tumores que están
enriquecidos en el receptor de
interés.
interés.
Existen numerosos receptores que no pueden ser
identificados fácilmente usando estos tipos de ensayo, debido a: 1)
una escasez de información bioquímica sobre la proteína; 2) la poca
abundancia de receptores presentes en la célula; y/o 3) la carencia
de una línea celular o de un material tumoral que exprese el
receptor. Sería deseable desarrollar un ensayo que pueda usarse
para identificar y caracterizar receptores celulares no susceptibles
de estudio por medios convencionales.
Esta invención se refiere a un procedimiento de
ensayo para determinar la presencia de un ácido nucleico que
codifica un receptor de un secretagogo de la hormona de crecimiento
(GHSR) que comprende:
a) introducir un ácido nucleico
sospechoso de codificar un GHSR en una célula que no expresa de
forma natural el receptor en su membrana celular;
b) introducir una molécula detectora o
un ácido nucleico que codifica una molécula detectora en la célula,
en la que la molécula detectora responde directa o indirectamente a
un suceso bioquímico activado por proteínas G;
c) poner en contacto la célula con un
secretagogo de la hormona de crecimiento; y
d) determinar si el ácido nucleico
codifica un GHSR monitorizando la molécula detectora.
Una forma de realización adicional de esta
invención es un ensayo para determinar la presencia de un
secretagogo de la hormona de crecimiento. Por lo tanto, esta
invención también comprende un procedimiento para determinar la
presencia de un secretagogo de la hormona de crecimiento que
comprende:
a) introducir un ácido nucleico que
codifica un GHSR en una célula que no expresa de forma natural el
receptor en su membrana celular en unas condiciones tales que se
exprese un GHSR;
b) introducir una molécula detectora o
un ácido nucleico que codifica una molécula detectora en la célula,
en la que la molécula detectora responde directa o indirectamente a
un suceso bioquímico activado por proteínas G;
c) poner en contacto la célula con un
compuesto sospechoso de ser un secretagogo de la hormona de
crecimiento; y
d) determinar si el compuesto es un
secretagogo de la hormona de crecimiento monitorizando la molécula
detectora.
La Figura 1 es el ADN del GHSR
porcino (Tipo I) contenido en el Clon 7-3.
La Figura 2 es la secuencia de
aminoácidos del GHSR porcino codificado por el ADN de la Figura
1.
La Figura 3 es el marco
abierto de lectura completo del clon de Tipo 1, de la Figura 1.
La Figura 4 es el ADN del GHSR
porcino (Tipo II) contenido en el Clon 1375.
La Figura 5 es la secuencia de
aminoácidos del GHSR porcino (Tipo II) codificado por el ADN de la
Figura 4.
La Figura 6 es el ADN del GHSR
humano (Tipo I) contenido en el Clon 1146.
La Figura 7 es la secuencia de
aminoácidos del GHSR humano (Tipo I) codificado por el ADN de la
Figura 6.
La Figura 8 es el marco abierto de
lectura completo del GHSR de Tipo 1, codificado por la secuencia
ADN de la Figura 6.
La Figura 9 es el ADN del GHSR
humano (Tipo II) contenido en el Clon 1141.
La Figura 10 es la
secuencia de aminoácidos del GHSR humano (Tipo II) codificada por
el Clon 1141.
La Figura 11 es el ADN del
GHSR humano (Tipo I) contenido en el Clon 1143.
La Figura 12 es la
secuencia de aminoácidos del GHSR humano (Tipo I) codificada por el
Clon 1143.
La Figura 13 compara el
ORF porcino de Tipo I (sin el iniciador MET del GHSR completo y sin
12 aminoácidos adicionales) con el dominio homólogo de los
receptores porcinos de Tipo II.
La Figura 14 compara el
dominio homólogo de los receptores humanos de Tipo I y Tipo II (la
secuencia amino terminal carece del iniciador MET y de cuatro
aminoácidos adicionales).
La Figura 15 compara los
ORF de los receptores porcino de Tipo I y humano de Tipo I (la
secuencia amino terminal carece del iniciador MET y de 12
aminoácidos adicionales).
La Figura 16 compara los
receptores completos porcino de Tipo II y humano de Tipo II.
La Figura 17 es un
diagrama esquemático que representa el mapa físico de los clones de
ADNc del receptor de secretagogos de la hormona de crecimiento
porcino y humano.
La Figura 18 es un gráfico
que muestra la farmacología de los receptores expresados de
secretagogos de la hormona de crecimiento porcinos y humanos en
ovocitos de Xenopus usando el ensayo de bioluminiscencia con
aequorina.
La Figura 19 es una tabla
que muestra la farmacología de los receptores expresados de
secretagogos de la hormona de crecimiento porcinos y humanos en
ovocitos de Xenopus usando el ensayo de bioluminiscencia con
aequorina y varios secretagogos.
La Figura 20 es un gráfico
que representa la farmacología del receptor porcino puro de
secretagogos de la hormona de crecimiento expresado en células
COS-7 usando el ensayo de unión del Compuesto A
marcado con ^{35}S.
La Figura 21 es una tabla
que representa el análisis de competición con el receptor porcino
de secretagogos de la hormona de crecimiento puro expresado en
células COS-7 usando el ensayo de unión del
Compuesto A marcado con ^{35}S y diversos secretagogos y otros
ligandos de receptores acoplados a proteínas G (receptores GPC) en
un ensayo de competición.
La Figura 22 es la
secuencia de aminoácidos del GHSR humano completo (Tipo I)
codificado por el clon 11304.
Las Figuras 23A y 23B son gráficos de la
medida de la unión del [^{35}S]-Compuesto A a
membranas de pituitaria anterior porcina.
23A muestra los resultados de los experimentos
de saturación usando una cantidad fija de membrana. 23B muestra las
isotermas de saturación analizadas mediante un análisis de
Scatchard.
La Figura 24 muestra la
inhibición de la unión del [^{35}S]-Compuesto A a
membranas de pituitaria anterior porcina mediante diversos
compuestos.
La Figura 25 muestra el
efecto del GHRP-6 sobre la unión específica del
[^{35}S]-Compuesto A a membranas de pituitaria
anterior porcina en el equilibrio.
La Figura 26 muestra los
efectos de GTP-\gamma-S y de
nucleótido sobre la unión específica del
[^{35}S]-Compuesto A a membranas de pituitaria
anterior porcina.
La Figura 27 es la
secuencia de ADN del GHSR de rata desde el codón de inicio Met hasta
el codón de terminación. Esta secuencia incluye un intrón.
La Figura 28 es el marco
abierto de lectura sólo del GHSR de rata de la Figura 27.
La Figura 29 es la
secuencia de aminoácidos deducida del ORF de la Figura 28.
La Figura 30 muestra la
expresión del GHSR funcional de rata en células
HEK-293 transfectadas.
Según se usa a lo largo de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones, se aplican las siguientes
definiciones:
"Ligandos" son cualquier molécula que se
une a un GHSR de esta invención. Los ligandos pueden tener una
actividad agonista, agonista parcial, antagonista parcial o
antagonista.
"Secretagogo de la hormona de crecimiento"
o "GHS" es cualquier compuesto o agente que estimula o aumenta
directa o indirectamente la liberación de la hormona del crecimiento
en un animal.
"Compuesto A" es
(N-[1(R)-[1,2-dihidro-1-metansulfonlilespiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-il)carbonil]-2-(fenil-
metiloxi)-etil]-2-amino-2-metil-propanamida, descrito en Patchett y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7001-7005.
metiloxi)-etil]-2-amino-2-metil-propanamida, descrito en Patchett y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7001-7005.
"Compuesto B" es
(3-amino-3-metil-N-(2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-1{2'-(1H-tetrazol-5-il)(1,1'-bifenil)-4-il]metil}-
1H-1-benzacepin-3(R)il-butanamida, descrito en Patchett y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92; 7001-7005.
1H-1-benzacepin-3(R)il-butanamida, descrito en Patchett y col., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92; 7001-7005.
Esta invención se refiere a ensayos de
receptores de secretagogos de la hormona de crecimiento.
Se descubrió que las proteínas de esa invención
tenían unas características estructurales que eran típicas del
dominio 7-transmembrana (TM) que contiene receptores
de la superfamilia de receptores unidos a proteínas G
(GPC-R o receptores 7-TM). Por lo
tanto, los receptores de secretagogos de la hormona de crecimiento
forman nuevos miembros de la familia de receptores
GPC-R. Se encontró que los receptores intactos de
esta invención tenían las características generales de los
GPC-R, incluyendo siete regiones transmembrana, tres
bucles intra y extracelulares y la secuencia distintiva de la
proteína GPC-R. Los dominios transmembrana y la
secuencia distintiva del receptor GPC están marcados en las
secuencias proteicas del receptor de GHS de Tipo l en las Figuras 3
y 8. No todas las regiones son necesarias para su
funcionamiento.
Los GHSR comparten cierta homología de secuencia
con receptores GPC clonados previamente, incluyendo el receptor de
neurotensina de rata y humano (aproximadamente un 32% de identidad)
y el receptor de TRH de rata y humano (aproximadamente un 30% de
identidad).
Los GHSR se aislaron y caracterizaron usando
técnicas de clonación y expresión en ovocitos de Xenopus. La
clonación fue difícil debido a tres factores. En primer lugar, antes
de esta invención había muy poca información disponible sobre las
características bioquímicas y las vías intracelulares efectoras/de
señalización de las proteínas. Por lo tanto, las metodologías de
clonación que dependen del uso de información sobre la secuencia
proteica para el diseño de oligonucleótidos degenerados para cribar
bibliotecas de ADNc o que utilizan la PCR no pudieron utilizarse de
forma eficaz. Por lo tanto, se necesitaba determinar la bioactividad
del receptor.
En segundo lugar, el receptor de secretagogos de
la hormona de crecimiento no aparece abundantemente - está presente
en la membrana celular en una concentración aproximadamente 10 veces
menor que la mayoría de los demás receptores de membrana. Con
objeto de clonar satisfactoriamente los receptores, se han tomado
unas minuciosas precauciones para asegurar que el GHSR estaba
representado en una biblioteca de ADNc que se iba a cribar. Esto
requería: I) el aislamiento de ARNm poli(A)+ intacto, no
degradado y puro; 2) la optimización de la síntesis de ADNc para
maximizar la producción de moléculas completas; y 3) era necesario
cribar una biblioteca de un tamaño mayor al normal (aproximadamente
de 0,5 a 1 x 10^{7} clones) para aumentar la probabilidad de
poder obtener un clon funcional de ADNc.
En tercer lugar, no se conoce ninguna línea
celular permanente que exprese estos receptores. Por lo tanto, tuvo
que usarse tejido primario de pituitaria como fuente de ARNm o de
proteínas. Esto es una dificultad añadida porque la mayoría de los
tejidos primarios expresan unas cantidades menores de un receptor
dado que una línea celular inmortalizada o tejidos tumorales.
Además, la extracción quirúrgica de una pituitaria porcina y la
extracción de ARNm biológicamente activo intacto para la
construcción de una biblioteca de expresión de ADNc es
considerablemente más difícil que la extracción del ARNm a partir de
una línea celular de cultivo tisular. Junto con la necesidad de
obtener continuamente tejido nuevo, están los problemas relacionados
con la variabilidad intrínseca entre animales y entre
preparaciones.
Un aspecto de esta invención está dirigido al
desarrollo de un ensayo de cribado extremadamente sensible,
consistente, fiable y de alto rendimiento, que podría ser usado para
identificar porciones de una biblioteca de ADNc que codifica el
receptor.
La capacidad para identificar ADNc que codifican
receptores de secretagogos de la hormona de crecimiento dependía de
dos descubrimientos realizados según ésta invención: 1) que los
sucesos de unión receptor de secretagogo de la hormona de
crecimiento-ligando son transducidos a través de
proteínas G; y 2) que una subunidad de una proteína G en
particular, tal como G\alpha11, debe estar presente en las células
con objeto de detectar la actividad del receptor. Sólo cuando se
realizaron estos dos descubrimientos pudo diseñarse un ensayo para
detectar la presencia de las secuencias de ADN que codifican el
GHSR.
Se desarrolló un ensayo con un radiorreceptor
usando Compuesto A de alta actividad específica
(700-1.100 Ci/mmol) marcado con [^{35}S] (un GHS
conocido) como ligando. Se detectó una unión saturable de alta
afinidad en las membranas de pituitaria anterior porcina (Figura
23A). El análisis de Scatchard (Figura 23B) indicó la presencia de
una única clase de sitios de alta afinidad con una constante de
disociación aparente (K_{D}) de 161 \pm 11 pM y una
concentración (B_{máx}) de 6,3 \pm 0,6 fmol/mg de proteína (n =
4). Se detectó una unión de alta afinidad específica similar en
membranas de pituitaria de rata, indicando un valor de K_{D} de
180 \pm 9 pM y una B_{máx} de 2,3 \pm 1,1 fmol/mg de proteína
(n = 3).
La unión de alta afinidad al GHSR forma otro
aspecto más de esta invención. Esta invención también está dirigida
a un procedimiento para identificar nuevas proteínas del GHSR que
comprende marcar un ligando conocido, exponerlo a una supuesta
proteína de GHSR y determinar si se produce la unión.
La especificidad de la unión del
[^{35}S]-Compuesto A se estableció determinando la
capacidad de los secretagogos de la GH de competir con el
radioligando por los sitios de unión (Figura 24). El Compuesto A no
marcado desplazó completamente al
[^{35}S]-Compuesto A de los sitios de unión
específicos con una constante de inhibición, K_{i}, de 240 pM,
que es similar al valor de K_{D} determinado mediante un análisis
de Scatchard. Otros GHS, el GHRP-6 (K_{i} 6,3
nM), y el Compuesto B antagonista de péptidos (K_{i} 63 nM)
tuvieron unas afinidades del 3,8, el 0,6 y el 0,4%,
respectivamente, respecto a las del Compuesto A. El Compuesto C, el
estereoisómero biológicamente inactivo del Compuesto B, compitió
débilmente con la unión del [^{35}S]-Compuesto A.
La isoterma de saturación para la unión del
[^{35}S]-Compuesto A analizada mediante una
representación gráfica recíproca doble demostró que la inhibición
del GHRP-6 fue superada por una concentración
creciente del [^{35}S]-Compuesto A (Figura 25).
Este resultado muestra que el GHRP-6 interactúa
competitivamente con el Compuesto A en el mismo sitio de unión. De
forma similar, se demostró que el Compuesto B era un competidor de
la unión del [^{35}S]-Compuesto A. Los agonistas
más potentes tuvieron las afinidades más altas por los sitios
receptores de la pituitaria. Los compuestos que no compitieron con
el [^{35}S]-Compuesto A a 1 \muM incluían GHRH,
somatostatina, met-encefalina, sustancia P,
galanina, hormona liberadora de gonadotropinas, hormona liberadora
de tirotropina, péptido liberador de gastrina,
PHM-27, hormona estimulante de los melanocitos,
polipéptido-38 activador de la adenilato ciclasa de
pituitaria, fenoxibenzamina, dopamina, bromocriptina, metoxamina,
benoxatián, isoproterenol, propanolol y clonidina.
Para estudiar si el sitio de unión específico
del [^{35}S]-Compuesto A estaba unido a proteínas
G, se estudiaron los efectos de los análogos estables de GTP
GTP-\gamma-S y
GMP-PNP sobre la unión del
[^{35}S]-Compuesto A. Se encontró que
GTP-\gamma-S y
GMP-PNP eran potentes inhibidores de la unión del
[^{35}S]-Compuesto A, con unos valores de
IC_{50} de 30 y 110 nM, respectivamente (Figura 26).
ATP-\gamma-S era ineficaz.
Además, en ausencia de Mg^{2+}, sólo se detectó una unión
específica del 15-25% del
[^{35}S]-Compuesto A en comparación con el
control (Mg^{2+} 10 mM), lo que sugiere que la unión específica
del [^{35}S]-Compuesto A requería la presencia de
Mg^{2+} regula la liberación de GH in vivo) no se une al
sitio del Compuesto A. A partir de estos datos se puede concluir
que el receptor está unido a proteínas G.
Cuando el GHSR está unido a un ligando (un
secretagogo de la hormona de crecimiento), las proteínas G presentes
en la célula activan la fosfolipasa C específica de
fosfatidilinositol (PI-PLC), una enzima que libera
moléculas de señalización intracelular (diacilglicerol y trifosfato
de inositol), que a su vez inician una cascada de sucesos
bioquímicos que promueven la movilización de calcio. Según esta
invención, la detección de esta cascada bioquímica puede usarse
como base para un ensayo.
En el ensayo de esta invención puede usarse
prácticamente cualquier célula eucariota conveniente. Éstas
incluirían ovocitos (los preferidos son los de Xenopus sp.),
pero también pueden usarse líneas celulares, algunos Ejemplos de
las líneas celulares preferidas son líneas celulares de mamíferos,
incluyendo COS, HEK-293, CHO, HeLa, NS/0,
CV-1, GC, GH3 y VERO.
Un componente importante del ensayo es una
molécula detectora. Preferiblemente, la molécula detectora responde
a un suceso intracelular que es parte de la cascada bioquímica
iniciada por la unión GHS-GHSR. Una clase de
moléculas detectoras preferidas puede responder a cambios en las
concentraciones de calcio. Una molécula detectora preferida que
responde a concentraciones de calcio es la aequorina (una
fotoproteína de medusa) que actúa sobre el sustrato coelenteracina.
Otras moléculas detectoras incluyen quelantes de calcio con
capacidad fluorescente, tales como FURA-2 e
indo-1.
En la célula puede introducirse la propia
molécula detectora o los nucleótidos que codifican la molécula
detectora, en unas condiciones que permitan la expresión de la
molécula detectora. Generalmente se prefiere introducir en la
célula nucleótidos, tales como ADN que codifique la molécula
detectora, en unas condiciones en las que la célula expresará la
molécula detectora.
Las proteínas G heterotriméricas, formadas por
las subunidades \alpha, \beta y \gamma, sirven para transmitir
información desde los receptores de la superficie celular hasta los
efectores intracelulares, tales como la fosfolipasa C y la
adenilato ciclasa. La subunidad \alpha de la proteína G es un
componente esencial de la vía de transducción intracelular de
señales, activado por la interacción
receptor-ligando. En el proceso de la activación
del GPCR inducida por ligando, la subunidad G\alpha de un complejo
trimérico G\alpha\beta\gamma intercambiará su GDP unido por
GTP, y se disociará del heterodímero \beta\gamma. La proteína
G\alpha disociada sirve como transductor activo de señales, a
menudo conjuntamente con el complejo \beta\gamma, iniciando así
la activación de la vía de transducción intracelular de señales. Las
subunidades G-\alpha se clasifican en subfamilias
según la identidad de la secuencia y el principal tipo de efectores
a los que se acoplan: G_{s-} activa la adenilato ciclasa,
G_{i}/_{o}/_{t} inhibe la adenilato ciclasa, G_{q}/_{11}
activa la PI-PLC, y G_{12/13} es un efector
desconocido.
Se ha demostrado que la expresión de varios
receptores en células heterólogas aumenta mediante la coexpresión
de ciertas subunidades G\alpha. Esta observación fue la base de la
razón para usar las subunidades G\alpha de varias subfamilias
junto con una fuente de GHSR (ARNm poliA^{+} porcino) para probar
si podía medirse una respuesta funcional inducida por GHS en el
sistema de ovocitos de Xenopus. Las respuestas inducidas por
GHS se detectaron, y se encontró que eran estrictamente dependientes
de la coexpresión de G\alpha11, un descubrimiento sin precedentes
que esboza la especificidad de la interacción. El descubrimiento de
que la expresión del GPCR podría ser completamente dependiente de
la adición de una única subunidad de proteína G era inesperado,
dado que en todos los trabajos publicados previamente la adición de
una subunidad de una proteína G modulaba una actividad ya
existente. Aquí se restableció completamente una señal previamente
ausente. Este descubrimiento indicó que la ausencia de una señal en
huevos de Xenopus era completamente dependiente de una
subunidad de una proteína G como factor limitante.
Para realizar el ensayo puede añadirse la propia
subunidad o un ácido nucleico que codifique las subunidad, o ambos,
y no es necesario que los sucesos de adición se produzcan
conjuntamente.
A continuación se introduce en la célula un
ácido nucleico o un conjunto de ácidos nucleicos, en el que al
menos un ácido nucleico es sospechoso de codificar un GHSR. Cuando
se está intentando identificar un posible gen de GHSR a partir de
una biblioteca grande, a menudo es más eficaz usar un conjunto de
ácidos nucleicos, siendo cada ácido nucleico diferente de los demás
ácidos nucleicos del conjunto.
Después de que el ácido o ácidos nucleicos
sospechosos de codificar un GHSR han sido introducidos en la célula,
la célula se expone a un secretagogo conocido de la hormona del
crecimiento, tal como el Compuesto A (L-163.191).
También puede usarse cualquier otro secretagogo de la hormona del
crecimiento. Algunos preferidos incluyen:
N-[1(R)-[(1,2-dihidro-l-metansulfonilespiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-il)carbonil]-2-(fenilmetiloxi)etil]-2-amino-2-metilpropanamida,
o
3-amino-3-metil-N-(2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-1-{[2'-1H-tetrazol-5-il)(1,1'-bifenil)-4-il]metil}-1H-1-benzacepin-3(R)-il-butanamida,
o un compuesto descrito en, por ejemplo, los siguientes documentos:
patente de EE.UU. Nº 3.239.345; Patente de EE.UU. Nº 4.036.979;
Patente de EE.UU. Nº 4.411.890; Patente de EE.UU. Nº 5.206.235;
Patente de EE.UU. Nº 5.283.241; Patente de EE.UU. Nº 5.284.841;
Patente de EE.UU. Nº 5.310.737; Patente de EE.UU. Nº 5.317.017;
Patente de EE.UU. Nº 5.374.721; Patente de EE.UU. Nº 5.430.144;
Patente de EE.UU. Nº 5.434.261; Patente de EE.UU. Nº 5.438.136;
Patente de EE.UU. Nº 5.494.919; Patente de EE.UU. Nº 5.494.920;
Patente de EE.UU. Nº 5.492.916; Publicación de Patente EPO Nº
0.144.230; Publicación de Patente EPO Nº 0.513.974; Publicación de
Patente PCT Nº WO 94/07486; Publicación de Patente PCT Nº WO
94/08583; Publicación de Patente PCT Nº WO 94/11012; Publicación de
Patente PCT Nº WO 94/13696: Publicación de Patente PCT Nº WO
94/19367; Publicación de Patente PCT Nº WO 95/03289; Publicación de
Patente PCT Nº WO 95/03290; Publicación de Patente PCT Nº WO
95/09633; Publicación de Patente PCT Nº WO 95/11029; Publicación de
Patente PCT Nº WO 95/12598; Publicación de Patente PCT Nº WO
95/13069; Publicación de Patente PCT Nº WO 95/14666; Publicación de
Patente PCT Nº WO 95/16675; Publicación de Patente PCT Nº WO
95/16692; Publicación de Patente PCT Nº WO 95/17422; Publicación de
Patente PCT Nº WO 95/17423; Publicación de Patente PCT Nº WO
95/34311; Publicación de Patente PCT Nº WO 96/02530; Science,
260, 1640-1643 (11 de junio de 1993); Ann.
Rep. Med. Chem., 28, 177-186 (1993); Bioorg.
Med. Chem. Ltrs. 4 (22), 2709-2714 (1994); y
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92, 7001-7005
(julio de 1995), o cualquier otro secretagogo de la hormona del
crecimiento.
Si uno o más de los ácidos nucleicos codifica un
GHSR, entonces el ligando secretagogo se unirá al receptor, la
proteína G se activará, el nivel de calcio fluctuará y la molécula
detectora cambiará de forma que pueda ser un monitorizada. Para el
sistema que usa aequorina y coelenteracina, la unión
receptor-GHS producirá una bioluminiscencia
medible.
Si el procedimiento usó un conjunto complejo de
ácidos nucleicos, uno o más de los cuales podría codificar el
receptor, entonces será necesario un cribado adicional para
determinar qué ácido nucleico es responsable de codificar el GHSR.
Una vez que se encuentra un resultado positivo, el procedimiento
puede repetirse con una subdivisión del conjunto de ácidos
nucleicos (por ejemplo, comenzando con aproximadamente 10.000 ácidos
nucleicos, y usando después aproximadamente 1.000, después
aproximadamente 500, después aproximadamente 50, y después puro).
En este procedimiento se prefieren los conjuntos de ARN.
Usando este protocolo general en ovocitos de
Xenopus con una biblioteca de expresión de ADNc porcino, se
identificó que el Clon 7-3 contenía un ácido
nucleico que codificaba para un receptor de un secretagogo de la
hormona del crecimiento porcino. El clon tiene un tamaño de
aproximadamente 1,5 kb, y en dirección 3’ del supuesto iniciador
metionina (MET), contiene un marco abierto de lectura (ORF) que
codifica 302 aminoácidos (M_{r} = 34.516). El ADN y la secuencia
deducida de aminoácidos se proporcionan en las Figuras 1 y 2. Cuando
se realiza un análisis de hidropatía (por ejemplo,
Kyte-Doolittle; Eisenberg, Schwartz, Komaron y Wall)
sobre la secuencia proteica del clon 7-3, sólo hay
presentes 6 dominios transmembrana predichos en dirección 3’ del
supuesto iniciador MET. Sin embargo, la traducción del ORF más
largo codificado en el clon 7-3 codifica una
proteína de 353 aminoácidos (M_{r} = 39.787), pero está
desprovisto de un aparente iniciador MET (Figura 3). Siete
segmentos transmembrana están codificados en la proteína de 353
aminoácidos más larga, en la que está ausente un codón MET de
inicio de la traducción localizado en dirección 5’ de TMI (Figura
3). Por lo tanto, el clon 7-3 aparece truncado en
su amino terminal, pero es completamente funcional, lo que demuestra
que el clon 7-3 es un equivalente funcional de un
GHSR natural.
El clon de ADNc resultante (o porciones más
cortas de, por ejemplo, sólo 15 nucleótidos de longitud) puede
usarse para sondear bibliotecas en condiciones de hibridación para
encontrar otros receptores que sean lo suficientemente similares
como para que los ácidos nucleicos puedan hibridar, y es
particularmente útil para el cribado de bibliotecas de otras
especies. Usando este procedimiento se han clonado ADNc de GHSR
adicionales humano, porcino y de rata, y se ha clonado su secuencia
de nucleótidos. En esta etapa, el experto habitual en la materia
apreciará que las condiciones de hibridación pueden variar desde muy
rigurosas hasta relajadas. La temperatura apropiada, las
concentraciones salinas y los tampones son bien conocidos. Según se
usa en este documento, condiciones de "lavado
post-hibridacional convencional" significa 6 x
SSC a 55°C. Condiciones de "lavado
post-hibridacional relajadas" significa 6 x SSC a
30°C.
Se hibridaron una biblioteca de pituitaria
porcina, una biblioteca de pituitaria humana y una biblioteca de
pituitaria de rata con un ADNc radiomarcado derivado del marco
abierto de lectura del clon 7-3 de GHSR porcino. Se
aislaron veintiún clones de ADNc de GHSR humano positivos, y cinco
conjuntos de bibliotecas porcinas dieron una fuerte señal de
hibridación, y contenían clones con insertos mayores que el clon
7-3, a juzgar por el tamaño de su inserto en las
inmunotransferencias Southern. También se aisló un único clon de
ADNc de rata.
El análisis de la secuencia de nucleótidos
reveló dos tipos de ADNc para los ADNc del GHSR tanto humano como
porcino. El primero (Tipo I) codifica una proteína representada por
el clon 7-3, que codifica 7 dominios TM (la
secuencia de aminoácidos de un clon humano completo 11304 se muestra
en la Figura 22). El marco abierto de lectura completo se extiende
13 aminoácidos más allá del mayor marco abierto de lectura predicho
del clon 7-3, (353 aminoácidos).
\newpage
El segundo (tipo II) diverge en su secuencia de
nucleótidos del ADNc de tipo I en su extremo 3', en el segundo
aminoácido predicho del TM-6. En los ADNc de tipo
II, el TM-6 está truncado y fusionado con un corto
marco de lectura contiguo de sólo 24 aminoácidos, seguido por el
codón de terminación de la traducción. El clon porcino 1375 es un
ejemplo de un ADNc de Tipo II (Figuras 4 y 5). Estos 24 aminoácidos
más allá del TM-6 están altamente conservados
cuando se compara el ADNc humano y porcino. El ADN y las secuencias
de aminoácidos del GHSR humanos de Tipo I y II se proporcionan en
las Figuras 6-12 y 22. Se aísla un ADNc predicho
completo que codifica el receptor humano de Tipo I, es decir, una
molécula que codifica 7 dominios TM con un iniciador MET en un
contexto favorable, precedida por un codón de terminación en marco,
y se denomina clon 11304. El ORF predicho del clon 11304 para el
GHSR completo de Tipo I mide 366 aminoácidos (M_{r} = 41.198;
Figura 22). Un ADNc completo humano de Tipo II codifica un
polipéptido de 289 aminoácidos (M_{r} = 32.156; Figuras 9 y 10).
Las alineaciones de las secuencias realizadas tanto a nivel de
ácidos nucleicos como de proteínas muestran que los GHSR de Tipo I
y II están altamente relacionados entre sí y a través de las
especies (Figuras 13-16). Las secuencias del GHSR
humano y porcino son idénticas en un 93%, y similares en un 98% a
nivel de aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos que codifica la
extensión amino terminal ausente del clon 7-3
porcino de Tipo I procede del clon humano completo de Tipo I, así
como del ADNc humano y porcino de Tipo II. El marco de lectura de
los clones completos se extendía 13 aminoácidos más allá de la
secuencia amino terminal del clon 7-3, y esta
secuencia estaba conservada en 12/13 residuos de aminoácidos cuando
se comparaba entre la humana y la porcina. La extensión amino
terminal incluye un iniciador de la traducción metionina en un
contexto favorable según la regla de Kosak, estando interrumpido el
marco de lectura algo más hacia 5’ por un codón de terminación. En
la Figura 17 se proporciona un mapa físico esquemático de los
clones de ADNc de Tipo I y II humanos y porcinos.
El clon de rata también se investigó
adicionalmente. El análisis de la secuencia reveló la presencia de
una secuencia intrónica no codificante en el nt 790 correspondiente
a un sitio de corte y empalme (véanse las Figuras 27, 28 y 29.) El
sitio de corte y empalme G/GT aparece dos aminoácidos después de que
termine el dominio transmembrana 5 predicho (leucina 263),
dividiendo así el GHSR de rata en un segmento amino terminal (que
contiene el dominio extracelular, TM-1 hasta
TM-5, y los dos primeros bucles intra y
extracelulares) y un segmento carboxi terminal (que contiene
TM-6, TM-7, los terceros bucles
intra y extracelulares, y el dominio intracelular). El punto de
inserción y las secuencias de ADN flanqueantes están altamente
conservados, y también están presentes en ambos ADNc humano y
porcino de Tipo I y II.
Una comparación del marco abierto de lectura
completo que codifica la proteína del GHSR de rata entre homólogos
humanos y porcinos revela un alto grado de identidad en la secuencia
(de rata frente a humano, 95,1%; de rata frente a porcino,
93,4%).
Los ARNc humano y porcino de Tipo I expresados
en ovocitos eran funcionales y respondían a concentraciones del
Compuesto A que variaban desde 1 \muM hasta tan bajas como 0,1 nM
en el ensayo de bioluminiscencia con aequorina. Los ARNc humano o
porcino derivados del Tipo II que están truncados en el
TM-6 no dieron una respuesta cuando fueron
inyectados en ovocitos, y éstos representan un subtipo de receptor
que puede unirse al GHS, pero que no puede activar de forma eficaz
la vía de transducción de señales intracelular. Además, el receptor
de Tipo II puede interactuar con otras proteínas, y por lo tanto
reconstituir un GHSR funcional. Unas proteínas tales como éstas,
que pueden tener una actividad de unión de ligando pero que no son
activas en la transducción de señales, son particularmente útiles
en los ensayos de unión de ligando. En estos casos también se puede
sobre expresar una proteína mutante en la membrana celular y probar
la capacidad de unión de los supuestos ligandos marcados. Usando un
mutante no señalizador que está constitutivamente en un estado de
alta afinidad puede medirse la unión, pero no daría como resultado
consecuencias metabólicas adversas. Por lo tanto, el uso de
mutantes no señalizadores es un aspecto importante de esta
invención.
La caracterización farmacológica de los
receptores humano de Tipo I, porcino de Tipo I y de rata en el
ensayo de bioluminiscencia con aequorina en ovocitos se resume en
las Figuras 18, 19 y 30. Los GHS bioactivos peptidilo y no
peptidilo eran activos en un rango de orden de potencia similar al
observado para el receptor de pituitaria natural. Una prueba
confirmatoria independiente de que el GHSR de Tipo I (mostrado para
el clon porcino 7-3) codifica un GHSR completamente
funcional es aportada por el descubrimiento de que cuando el clon
7-3 es expresado temporalmente en células
COS-7 de mamífero, se observa una unión de alta
afinidad (KD \sim 0,2 nM), saturable (B_{máx} \sim 80 fmol/mg
de proteína) y específica (> 90% desplazado por Compuesto A no
marcado 50 nM) para el ^{35}S-Compuesto A
(Figuras 20-21).
Variando los parámetros de los ensayos
anteriores se pueden buscar otras incógnitas. Por ejemplo, en el
ensayo que detecta si hay presente un ácido nucleico que codifica
un GHSR, se puede modificar el ensayo de forma que detecte si hay
presente un GHS. En esta forma de realización se introduce en la
célula un ácido nucleico que codifica un GHSR, así como un ácido
nucleico que codifica una molécula detectora, y una subunidad de una
proteína G. La célula se pone en contacto con al menos un compuesto
que es un supuesto GHS. Si el compuesto es un GHS, entonces el GHS
se unirá al GHSR, y los sucesos intracelulares resultantes pueden
ser detectados monitorizando la molécula detectora. Si el compuesto
no es un GHS, entonces no se detectará dicha actividad. Este ensayo
de GHS forma otro aspecto más de esta invención.
Se ha demostrado que la expresión de varios
receptores en células heterólogas está aumentada por la coexpresión
de ciertas subunidades G\alpha. Esta observación formó la base de
la razón de usar las subunidades G\alpha de varias subfamilias
junto con una fuente de GHSR (ARNm poliA+ porcino) para probar si
podía medirse una respuesta funcional inducida por GHS en el
sistema de ovocitos de Xenopus. Las respuestas inducidas por
GHS se detectaron, y se descubrió que eran estrictamente
dependientes de la coexpresión de G\alpha11, un descubrimiento
sin precedentes que esboza la especificidad de la interacción. Por
lo tanto, otro aspecto de esta invención es un procedimiento para
detectar una respuesta ante GHS que comprende coexpresar una
subunidad de una proteína G\alpha11 en una célula que también
expresa un GHSR, exponer la célula a un GHS, y detectar la
respuesta.
La presencia de G\alpha11 era esencial al usar
ARN poliA+ o conjuntos de ARNc complejos (es decir, 10.000 ARNc).
Sin embargo, una vez que se obtuvo un clon puro, ya no era esencial
el requisito de la adición de la proteína G. Esto indica que la
necesidad de la adición de la proteína G dependía de la pureza del
ácido nucleico, requiriendo el ensayo más sensible la adición de la
subunidad G\alpha.
Los ligandos detectados usando los ensayos
descritos en este documento pueden usarse en el tratamiento de
dolencias que aparecen cuando hay una escasez de hormona de
crecimiento, tales como los observados en niños deficientes en
hormona de crecimiento, pacientes ancianos con un deterioro
musculoesquelético y en recuperación tras una fractura de cadera,
pacientes con enfermedades neurodegenerativas y pacientes en
recuperación de una cirugía de derivación coronaria, y en la
osteoporosis.
Puede usarse diagnósticamente un receptor de
GHS, preferiblemente inmovilizado sobre un soporte sólido, para la
determinación de la concentración de secretagogos de la hormona de
crecimiento, o metabolitos de los mismos, en fluidos fisiológicos,
por ejemplo, fluidos corporales, incluyendo suero y extractos
tisulares, como por ejemplo en pacientes que están en tratamiento
con un secretagogo de la hormona de crecimiento.
La administración de un receptor de GHS aún
paciente también puede emplearse con el propósito de: amplificar el
efecto neto de un secretagogo de la hormona de crecimiento
proporcionando una señal retrógada aumentada tras la administración
del secretagogo de la hormona de crecimiento, disminuyendo así la
dosis requerida del secretagogo de la hormona de crecimiento; o
disminuyendo el efecto de una sobredosis de un secretagogo de la
hormona de crecimiento durante el tratamiento.
Los siguientes Ejemplos no limitantes se
presentan para ilustrar mejor la invención.
Se preparó [^{35}S]-Compuesto
A a partir de un precursor apropiado,
N-[1(R)-[(1,2-dihidroespiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-il)-carbonil]-2-(fenil-metiloxi)etil]-2-amino-t-butoxicarbonil-2-metilpropanamida,
usando cloruro de metan[^{35}S]sulfonilo, según
describen Dean DC, y col., 1995, en: Allen J, Voges R (eds)
Synthesis and Applications of Isotopically Labelled
Compounds, John Wiley & Sons, Nueva York, págs.
795-801. La purificación mediante HPLC
semipreparativa (columna Zorbax SB-fenilo, MeOH/agua
al 68%, TFA al 0,1%, 5 ml/min) fue seguida por una escisión con
N-t-BOC usando ácido
trifluoroacético al 15% en diclorometano (25°C, 3 h) para dar
[metilsulfonil-^{35}S]Compuesto A con un
rendimiento prácticamente cuantitativo. La purificación mediante
HPLC (columna Hamilton PRP-1 de 4,6 x 250 mm,
gradiente lineal del 50-75% de
metanol-agua con HCl 1 mM durante 30 min, 1,3
ml/min) proporcionó el ligando con una pureza radioquímica >99%.
La estructura se estableció mediante coelución en HPLC con
Compuesto A sin marcar y mediante un análisis espectral de masas.
El último procedimiento también indicó una actividad específica de
\sim 1.000 Ci/mmol.
Se homogeneizaron glándulas pituitarias
anteriores congeladas de cerdos macho (50-80 kg) o
de ratas Wistar macho (150-200 g) en un
homogenizador de tejidos, en tampón enfriado con hielo (tampón de
Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 2,5
mM, albúmina de suero bovino al 0,1% y 30 \mug/ml de bacitracina).
Los homogeneizados se centrifugaron durante 5 min a 1.400 x g, y
los sobrenadantes resultantes se centrifugaron entonces a 34.000 x
g durante 20 min. Los sedimentos se resuspendieron en el mismo
tampón hasta 1.500 \mug de proteína/ml y se almacenaron a -80°C.
Las proteínas se determinaron mediante un método
Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA).
La disolución de unión convencional contenía:
400 m de tampón de Tris-HCl 25 mM, pH 7,4,
MgCl_{2} 10 mM, EDTA 2,5 mM y
[^{35}S]-Compuesto A 100 pM. Se añadieron las
membranas de pituitaria (100 \mul, 150 \mug de proteína) para
iniciar la reacción de unión. Las alícuotas se incubaron a 20°C
durante 60 min, y el radioligando unido se separó del libre
mediante filtración a través de filtros GF/C previamente tratados
con un 0,5% de polietilenoimina en un cosechador celular Brandel.
Los filtros se lavaron tres veces con 3 ml de tampón enfriado con
hielo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM,
EDTA 2,5 mM y 0,015% de Triton X-100) y la
radioactividad de los filtros se contó en Aquasol 2. La unión
específica se definió como la diferencia entre la unión total y la
unión no específica ensayadas en Compuesto A 500 nM no marcado. Las
uniones específicas fueron del 65-85 y del
45-60% de la unión total en membranas porcina y de
rata, respectivamente. Los ensayos se llevaron a cabo por
triplicado y los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Se aislaron ovocitos de Xenopus laevis y
se inyectaron usando procedimientos convencionales previamente
descritos en Arena, y col., 1991, Mol. Pharmacol. 40,
368-374, que se incorpora al presente documento como
referencia. Se anestesiaron ranas Xenopus laevis adultas
hembras (adquiridas en Xenopus One, Ann Arbor, MI) con
metanosulfonato de tricaína al 0,17%, y se extirparon
quirúrgicamente los ovarios y se colocaron en una placa de cultivo
de 60 mm (Falcon) que contenía medio OR-2 sin
calcio (NaCl 82,5 mM, KCl 2 mM, piruvato sódico 2,5 mM, MgCl_{2}
1 mM, 100 \mu/ml de penicilina, 1 mg/ml de estreptomicina, HEPES 5
mM, pH = 7,5; ND-96 de Specialty Media, NJ). Los
lóbulos ováricos se abrieron, se lavaron varias veces, y los
ovocitos fueron liberados de sus sacos mediante digestión con
colagenasa A (Boehringer-Mannheim; al 0,2% durante
2-3 horas a 8°C) en OR-2 sin calcio.
Cuando se había eliminado aproximadamente el 50% de las capas
foliculares, se seleccionaron ovocitos en las Etapas V y VI y se
colocaron en ND-86 con calcio (NaCl 86 mM, KCl 2 mM,
MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, piruvato sódico 2,5 mM,
teofilina 0,5 mM, gentamicina 0,1 mM, HEPES 5 mM [pH = 7,5]). Para
cada ronda de inyecciones, típicamente se probó previamente la
capacidad de 3-5 ranas de expresar un receptor de
control unido a proteínas G (receptor de la hormona liberadora de
gonadotropina humana) y mostraron una consistente vía de
señalización intracelular mediante fosfolipasa C (incubación con
suero de pollo al 1%, que promueve la movilización de calcio
mediante una activación de la fosfolipasa C). Basándonos en estos
resultados se eligieron 1-2 ranas para la inyección
del conjunto de bibliotecas (50 nI de ARNc a una concentración de 25
ng (conjuntos complejos) a 0,5 ng (clon puro) por ovocito,
habitualmente de 24 a 48 horas tras el aislamiento de los
ovocitos.
Se preparó ARN total de pituitarias
(criogenizado en nitrógeno líquido a los 1-2 minutos
del sacrificio del animal) porcinas (50-80 kg, raza
Yorkshire) mediante un procedimiento modificado de tiocianato de
fenol:guanidinio (Chomczynski, y col, 1987 Anal. Biochem.
162, 156-159, que se incorpora al presente documento
como referencia), usando el reactivo TRI-Reagent LS
según las instrucciones del fabricante (Molecular Research Center,
Cincinnati, OH). Típicamente se obtuvieron 5 mg de ARN total a
partir de 3,5 g de peso en húmedo de tejido de pituitaria. El ARN
poli (A)+ se aisló a partir del ARN total mediante una cromatografía
en columna (dos pases) en oligo (dT) celulosa (Pharmacia,
Piscataway, NJ). El rendimiento del ARNm poli (A)+ a partir del ARN
total fue habitualmente del 0,5%. El ARN de otros tejidos se aisló
de forma similar.
Se sintetizó ADNc de primera hebra a partir de
ARNm poli (A)+ usando una transcriptasa inversa ARNasa (-)
M-MLV (Superscript, GIBCOBRL, Gaithersberg, MD)
según las instrucciones del fabricante con un
cebador-adaptador oligo (dT)/Not I. Tras la
síntesis del ADNc de segunda hebra, el ADNc de doble hebra se
sometió a las siguientes etapas: 1) ligado a adaptadores EcoR I, 2)
digestión con Not I, y 3) enriquecimiento para ADNc grandes y
eliminación del exceso de adaptadores mediante una cromatografía de
filtración en gel en una columna Sephacryl S-500
(Pharmacia). Las fracciones correspondientes a los ADNc de alto
peso molecular se ligaron a pSV-7 digerido con EcoR
I/Not I, un vector de expresión eucariota capaz de expresar ADNc
clonado en células de mamífero mediante transfección (conducida por
el promotor SV-40) y en ovocitos usando transcritos
in vitro (iniciada a partir del promotor de la ARN
polimerasa T7). El pSV-7 se construyó remplazando el
sitio de clonación múltiple de pSG-5 (Stratagene,
La Jolla, CA; Green, S. y col., 1988 Nucleic Acids Res.
16:369, que se incorpora al presente documento como referencia),
por un sitio de clonación múltiple expandido. El ligado vector:ADNc
se transformó en la cepa de E. coli DH10B
(GIBCO-BRL) mediante electroporación con una
eficacia de transformación de 1 x 10^{6} ufp/10 ng de ADNc de
doble hebra. La biblioteca contenía aproximadamente 3 x 10^{6}
clones independientes, de los que más del 95% tenían insertos con
un tamaño medio que se aproximaba a 1,65 kb (intervalo, de
0,8-2,8 kb).
Las reservas de biblioteca sin amplificar se
congelaron en glicerol a -70°C hasta que se necesitaron. Las
alícuotas de la biblioteca se amplificaron una vez antes del cribado
mediante una modificación de un procedimiento en estado sólido
(Kriegler, M. en Gene Transfer and Expression: A Laboratory
Manual Stockton Press, NY 1990). Las reservas de biblioteca se
valoraron en placas LB, y después se añadió el equivalente a
500-1.000 colonias a 13 ml de 2 x medio YT que
contenía agarosa al 0,3% y 100 \mug/ml de carbenicilina en un tubo
de polipropileno de 14 ml de fondo redondo (Falcon). La suspensión
bacteriana se enfrió en un baño de hielo húmedo durante 1 hora para
solidificar la suspensión, y después se hizo crecer en vertical a
37°C durante 24 horas. Las colonias bacterianas resultantes se
recogieron mediante centrifugación a 2000 x g a RT durante 10 min,
se resuspendieron en 3 ml de 2X YT/carbenicilina. Se tomaron
alícuotas para las reservas congeladas (5%) y la preparación de ADN
de plásmido.
El ADN de plásmido se purificó a partir de
sedimentos de bacterias cultivadas en estado sólido (1.000 conjuntos
de 500 clones independientes cada uno) usando el kit Wizard
Miniprep según las instrucciones del fabricante (Promega Biotech,
Madison, WI). El rendimiento del ADN de plásmido a partir de una
amplificación en estado sólido de 14 ml fue de 5-10
\mug. En la preparación de la síntesis del ARNc, se digirieron 4
\mug de ADN con Not I, y el subsiguiente ADN linealizado se
libera de proteína de ARNasa mediante un tratamiento con proteinasa
K (10 \mug durante 1 hora a 37°C), seguido de dos extracciones con
fenol, dos con cloroformo/isoamilo y dos precipitaciones con
etanol. El ADN se resuspendió en aproximadamente 15 \mul de agua
exenta de ARNasa y se almacenó a -70°C hasta que se necesitaron. El
ARNc se sintetizó usando un kit de Promega Biotech con
modificaciones. Cada 50 \mul de reacción contenían: 5 \mul de
plásmido linealizado (aproximadamente 1 \mug),
Tris-HCl 40 mM (pH = 7,5), MgCl_{2} 6 mM,
espermidina 2 mM, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, 0,05 mg/ml de albúmina de
suero bovino, 2 unidades/ml de ARNasin, 800 \muM de cada uno de
ATP, CTP y UTP, GTP 200 \muM, m7G(5')ppp(5')G 800
\muM, 80 unidades de polimerasa T7 de ARN, y aproximadamente
20.000 cpm de ^{32}P-CTP como marca para la
cuantificación del ARN sintetizado mediante precipitación con TCA.
La reacción se incubó durante 3 horas a 30°C; se añadieron 20
unidades de ADNasa exenta de ARNasa, y se dejó continuar la
incubación durante 15 min adicionales a 37°C. El ARNc se purificó
mediante dos extracciones con fenol, dos con cloroformo/isoamilo,
dos precipitaciones con etanol, y se resuspendió a una
concentración de 500 ng/ml en agua exenta de ARNasa inmediatamente
antes de su uso.
El ABA requiere la inyección de ARNc del
conjunto de bibliotecas (25 ng/huevo para tamaños de conjunto de
500 a 10.000) con ARNc de aequorina (2 ng/huevo) suplementado con la
subunidad G\alpha11 de una proteína G (2 ng/huevo). Para
facilitar la estabilización de los transcritos sintéticos de los
plásmidos de aequorina y G\alpha11, se modificó el vector de
expresión pCDNA-3 (denominado
pcDNA-3v2) mediante la inserción (en el sitio de la
enzima de restricción Apa I del policonector) de un casete para
adjuntar un tramo de poli (A) en todos los ARNc que parten del
promotor de la polimerasa T7 de ARN. Este casete incluye (de 5' a
3'): un sitio Bgl Il, pA (20) y un sitio Sfi I que puede usarse
para la linealizacion del plásmido. Se utilizó la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para generar un fragmento de ADN
correspondiente al marco abierto de lectura (ORF) del ADNc de
aequorina con una secuencia de iniciación de la traducción Kosak
optimizada (Inouye, S. y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 82: 3154-3158). Este ADN se ligó en
pCDNA-3v2 linealizado con EcoR I y Kpn I en el
sitio EcoR I/Kpn I de pCDNA-3v2. El ADNc de Gal se
escindió como un fragmento Cla I/Not I del vector
pCMV-5 (Woon, C. y col., 1989 J. Biol. Chem.
264: 5687-93), se hizo romo con una polimerasa de
ADN Klenow y se insertó en el sitio EcoR V de
pCDNA-3v2. El ARNc se inyectó en los ovocitos usando
el inyector motorizado "Nanoject" (Drummond Sci. Co.,
Broomall, PA) en un volumen de 50 nl. Las agujas de inyección se
agruparon en una única etapa usando un agrupador de micropipetas
Flaming/Brown, Modelo P-87 (Sutter Instrument Co) y
las puntas se rompieron usando un aumento de 53X, de forma que se
generó un ángulo agudo, siendo el diámetro externo de la aguja
<3 \mum. Tras la inyección, los ovocitos se incubaron en medio
ND-96, con una suave agitación orbital a 18°C en la
oscuridad. Los ovocitos se incubaron durante 24 a 48 horas
(dependiendo del experimento y del tiempo requerido para la
expresión del ARN heterólogo) antes de "cargar" la aequorina
expresada con el cromóforo esencial coelenterazina. Los ovocitos se
"cargaron" con coelenterazina transfiriéndolos a placas de 35
mm que contenían 3 ml de medio de carga e incubando durante
2-3 horas con una suave agitación orbital en la
oscuridad a 18°C. El medio de carga contenía coelenterazina 10
\muM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.) y glutatión reducido
30 pM en medio OR-2 (sin calcio). Entonces los
ovocitos fueron devueltos a medio ND-86 con el
medio de calcio descrito anteriormente, y la incubación continuó en
la oscuridad con una agitación orbital hasta que se iniciaron las
medidas de bioluminiscencia. La medida de la expresión del GHSR en
los ovocitos se realizó usando un luminómetro Berthold LB953
(Wallac Inc., Gaithersburg, MD) conectado a un PC con el programa
informático Autolumat-PC Control (Wallac Inc.,
Gaithersburg, MD). Los ovocitos (individualmente o por parejas)
fueron transferidos a tubos de plástico (75 x 12 mm, Sarstedt) que
contenían 2,9 ml de medio OR-2 exento de Ca^{+2}.
Cada conjunto de ARNc se probó usando un mínimo de 3 tubos que
contenían ovocitos. Las medidas de bioluminiscencia se
desencadenaron mediante la inyección de 0,1 ml de Compuesto A 30
\muM (concentración final de 1 \muM) y se siguieron los
registros durante 2 min para observar las respuestas cinéticas
coherentes con una respuesta mediada por
IP3.
IP3.
El conjunto S10-20 se preparó a
partir de la biblioteca de ADNc no fraccionada de pituitaria porcina
y estaba formado por 10 conjuntos, cada uno de 1.000 clones. El
S10-20 dio una señal positiva en los instrumentos
luminométricos, y entonces se aprobó individualmente la actividad
de los conjuntos de componentes. A partir de los 10 conjuntos de
1.000 clones, sólo el conjunto S271 dio una respuesta positiva. Este
conjunto se formó a partir de dos conjuntos de 500 clones
denominados P541 y P542. De nuevo, sólo uno de los conjuntos, P541,
dio una señal bioluminiscente positiva en presencia de Compuesto A
1 \muM. En este punto se determinó el título bacteriano en las
reservas en glicerol de P541, de forma que las diluciones pudieron
colocarse en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml
carbenicilina, para rendir aproximadamente 50 colonias por placa. Se
recogieron un total de 1527 colonias y se replicaron a partir de 34
placas. Entonces las colonias de la placa original se lavaron, se
aislaron los plásmidos, se sintetizó el ARNc y se inyectó en los
ovocitos. El ARNc preparado a partir de 8 de las 34 placas dio
señales positivas en los ovocitos. Se eligieron dos placas y se
hicieron crecer las colonias individuales de estas placas, se
aislaron los plásmidos, se preparó el ARNc y se inyectó en los
ovocitos. Una única cepa clínica clonal de cada placa (denominadas
clones 7-3 y 28-18) dio una
respuesta bioluminiscente positiva al Compuesto A 1 \muM. El clon
7-3 se caracterizó adicionalmente.
La secuenciación del ADN se realizó sobre ambas
hebras usando un instrumento automatizado Applied Biosystems (ABI
modelo 373) y manualmente mediante el método didesoxi de terminación
de la cadena usando Sequenase II (US Biochemical, Cleveland, OH).
Las búsquedas en bases de datos (Genbank 88, EMBL 42,
Swiss-Prot 31, PIR 40, dEST, Prosite, dbGPCR), las
alineaciones de las secuencias y el análisis de las secuencias de
nucleótidos y proteínas del GHSR se llevaron a cabo usando el GCG
Sequence Analysis Software Package (Madison, WI; acumulación,
estructura de péptidos y programas de motivos), y los programas de
búsqueda FASTA y BLAST, y el conjunto de programas informáticos
PC/Gene de Intelligenetics (San Francisco, CA; programas de análisis
de proteínas). Se realizó un análisis por inmunotransferencia
Northern usando ARNm total (20 \mug/carril) o poli (A)+
(5-10 \mug/carril) preparado según se describió
anteriormente. El ARN se fraccionó en un gel de agarosa al 1% que
contenía formaldehído 2,2 M y se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa. Los transfectos se hibridaron con una sonda generada
mediante PCR que engloba a la mayoría del ORF predicho por el clon
7-3 (nt 291 a 1132). La sonda se radiomarcó
mediante cebado aleatorio con
[\alpha]^{32}P-dCTP hasta una actividad
específica de más de 10^{9} dpm/\mug. Los transfectos se
hibridaron previamente a 42°C durante 4 horas en 5 X de SSC, 5 X de
disolución de Denhardt, 250 \mug/ml de ARNt, glicina al 1%, SDS al
0,075%, NaPO_{4} 50 mM (pH 6) y formamida al 50%. Las
hibridaciones se llevaron a cabo a 42°C durante 20 horas en 5 X de
SSC, 1 X de disolución de Denhardt, SDS al 0,1%, NaPO_{4} 50 mM y
formamida al 50%. Los transfectos de ARN se lavaron con 2 X de SSC,
SDS al 0,2% a 42°C y a -70°C. Los marcadores de tamaño del ARN
fueron ARNr 28S y 18S y marcadores de ARN transcritos in
vitro (Novagen). Se hibridaron membranas de nailon que contenían
ADN genómico de varias especies digerido con EcoR I y Hind III
(Clontech; 10 mg/carril) durante 24 horas a 30°C en 6 X de SSPE, 10
X de Denhardt, SDS al 1% y formamida al 50%. Los transfectos
genómicos se lavaron dos veces con 6 X de SSPE a temperatura
ambiente, dos veces con 6 X de SSPE a 55°C y dos veces con 4 X de
SSPE a 55°C. Se identificaron clones adicionales de GHSR porcinos a
partir de la biblioteca de ADNc porcino (descrita anteriormente)
mediante hibridación con ADN de plásmido (en conjuntos de 500
clones cada uno) inmovilizados en membranas de nailon en un aparato
slot-blot (Scheicher and Schuell). Las cepas
clínicas clonales puras se identificaron subsiguientemente mediante
hibridación de las colonias. Los clones de GHSR porcinos que se
extendían adicionalmente en una dirección 5' se identificaron
usando procedimientos 5' RACE (Frohman, M. A., 1993 Methods Enzymol.
218: 340-358, que se incorpora como referencia)
usando ARNm poli (A)+ de pituitaria porcina como plantilla.
Se obtuvieron homólogos de pituitaria humana del
GHSR porcino cribando una biblioteca de ADNc disponible
comercialmente construida en el vector lambda ZAP II (Stratagene)
según las instrucciones del fabricante. Inicialmente se colocaron
en placas aproximadamente 1,86 x 10^{6} fagos y se cribaron usando
una porción marcada mediante cebado aleatorio del clon porcino
7-3 (descrito anteriormente) como sonda de
hibridación. Se purificaron en placa veintiún clones positivos. Los
insertos de estos clones se escindieron del bacteriófago hacia el
fagómido pBluescript II SK- mediante coinfección con fago ayudante,
según describe el fabricante (Stratagene). Los clones humanos se
caracterizaron según se describió anteriormente para el clon
porcino.
Una hibridación cruzada con una rigurosidad
reducida fue la estrategia utilizada para aislar el GHSR de rata de
tipo Ia. Se colocaron en placas aproximadamente 10^{6} placas de
fagos de una biblioteca de ADNc de pituitaria de rata amplificado
una vez en \lambdagt11 (RL1051b; Clontech, Palo Alto, CA) en la
cepa de E. coli Y1090r-. Las placas se transfirieron a
Nytran de máxima resistencia (Schleicher & Schuell, Keene, NH)
desnatualizado, se neutralizaron y se cribaron con un fragmento de
1,6 kb de EcoRI/Notl que contenía las regiones codificantes y no
traducidas completas del GHSR porcino, el clon 7-3.
Las membranas se incubaron a 30°C en disolución de hibridación
previa (formamida al 50%, 2 X de Denhardt, 5 X de SSPE, SDS al 0,1%,
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) durante 3 horas, seguida
de una incubación hasta el día siguiente en disolución de
hibridación (formamida al 50%, 2 X de Denhardt, 5 X de SSPE, SDS al
0,1%, sulfato de dextrano al 10%, 100 \mug/ml de ADN de esperma
de salmón) con 1 x 10^{6} cpm/ml de sonda marcada con [^{32}P].
La sonda se marcó con [^{32}P]dCTP usando un kit de cebado
aleatorio (Gibco BRL, Gaithersburg, ND). Después de la hibridación,
los transfectos se lavaron dos veces, cada uno con 2 X de SSC, SDS
al 0,1% (a 24°C, después a 37°C y finalmente a 55°C). Se aisló un
único clon positivo después de las tres rondas de purificación en
placa. El fago que contenía el GHSR se eluyó desde las placas con 1
x de tampón lambda (NaCl 0,1 M, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,01M,
Tris-HCl 35 mM, pH 7,5) siguiendo el crecimiento
hasta el día siguiente de aproximadamente 200 ufp/150 mm de placa.
Después de una centrifugación de diez minutos a 10.000 x/g para
eliminar los desechos, la disolución de fago se trató con 1
\mug/ml de ARNasa A y ADNasa I durante treinta minutos a 24°C,
seguida de una precipitación con PEG (8000) al 20%/NaCl 2 M durante
dos horas en hielo, y su recogida mediante centrifugación a 10.000
x/g durante veinte minutos. El ADN del fago se aisló mediante
incubación en SDS al 0,1%, EDTA 30 mM, 50 \mug/ml de proteinasa K
durante una hora a 68°C, con la subsiguiente extracción con fenol
(tres veces) y cloroformo (dos veces) antes de la precipitación con
isopropanol hasta el día siguiente. El inserto de ADN de GHSR
(\sim6,4 kb) se subclonó a partir de lamda gtl l en el vector de
plásmidos Litmus 28 (New England Biolabs, Beverly, MA). Se
calentaron 2 \mug de ADN de fago a 65°C durante diez minutos,
después se digirieron con 100 unidades de 100 BsiWI (New England
Biolab, Bevely, MA) a 37°C hasta el día siguiente. Se purificó en
gel un fragmento de 6,5 kb, se electroeluyó y se extrajo con
fenol/cloroformo antes de la ligado al vector Litmus 28 digerido
con BsiWI.
Se secuenciaron ambas hebras del ADN de doble
hebra en un secuenciador automático ABI usando el kit de reacción
listo para el ciclo de secuenciación por coloración de la
terminación AB1 PRISM (Perkin Elmer; Foster City, CA).
Para las comparaciones de las secuencias y los
estudios de expresión funcionales se generó un fragmento de ADN
contiguo que codificaba para el ORF completo (desprovisto de la
secuencia intermedia) para el GHSR de rata de tipo Ia. Se utilizó
la PCR para sintetizar un fragmento amino terminal desde la
Met-1 hasta la Val-260 con sitios
de restricción añadidos EcoRI (5') y HpaI (3'), mientras que se
generó un fragmento carboxilo terminal desde la
Lys-261 hasta la Thr-364 con sitios
de restricción añadidos Dra I (5') y Not I (3'). El constructo ORF
se ensambló en el vector de expresión de mamífero pSV7 mediante un
ligado de tres vías con pSV7 digerido con EcoRI/Not I, fragmento
NH_{2}-terminal digerido con EcoRI/Hpa I y
fragmento C-terminal digerido con Dra I/Not I.
La actividad funcional del constructo ORF se
evaluó transfectando (usando lipofectamina; GIBCO/BRL) 5 \mug de
ADN de plásmido en la línea celular indicadora que expresa la
aequorina (293-AEQI7) cultivada en placas de 60 mm.
Después de aproximadamente 40 horas de expresión, la aequorina de
las células se cargó durante 2 horas con coelenterazina, las
células se recogieron, se lavaron y se sedimentaron mediante una
centrifugación a baja velocidad en tubos de luminómetro. La
actividad funcional se determinó midiendo la movilización de calcio
intracelular dependiente del Compuesto A y la concomitante
bioluminiscencia de aequorina inducida por el calcio. En la Fig. 26
se muestran tres muestras replicadas que presentan las respuestas
luminescentes inducidas por el Compuesto A.
Se transfectaron células de mamífero
(COS-7) con plásmidos de expresión del GHSR usando
Lipofectamina (GIBCO-BRL;
Hawley-Nelson, 1993, Focus 15: 73). Las
transfecciones se realizaron en placas de 60 mm en células
confluyentes al 80% (aproximadamente 4 x 10^{5} células) con 8
\mug de Lipofectamina y 32 \mug de ADN de plásmido de GHSR.
Se realizó la unión del
[^{35}S]-Compuesto A a membranas pituitarias
porcinas y a membranas en bruto preparadas a partir de células
COS-7 transfectadas con plásmidos de expresión de
GHSR. Se prepararon membranas celulares en bruto, en hielo, a
partir de transfectantes COS-7, 48 horas después de
la transfección. Cada placa de 60 mm se lavó dos veces con 3 ml de
PBS, una vez con 1 ml de tampón de homogeneización
(Tris-HCl 50 mM [pH 7,4], MgCl_{2} 5 mM, EDTA 2,5
mM, 30 \mug/ml de bacitracina). Se añadieron 0,5 ml de tampón de
homogeneización a cada placa, las células se eliminaron por raspado
y después se homogeneizaron usando un dispositivo Polytron
(Brinkmann, Syosset, NY; 3 estallidos de 10 s en la posición 4).
Entonces el homogeneizado se centrifugó durante 20 min a 11.000 x g
a 0°C, y el sedimento de membranas en bruto (que contiene
principalmente membranas y núcleos celulares) se resuspendió en
tampón de homogeneización suplementado con BSA al 0,06% (0,1
ml/placa de 60 mm) y se mantuvo en hielo. Las reacciones de unión
se realizaron a 20°C durante 1 h en un volumen total de 0,5 ml que
contiene: 0,1 ml de suspensión de membranas, 10 \mul de
[^{35}S]-Compuesto A (de 0,05 a 1 nM; actividad
específica de aproximadamente 900 Ci/mmol), 10 \mul de fármaco
competidor y 380-390 \mul de tampón de
homogeneización. El radioligando unido se separó mediante una
rápida filtración a vacío (cosechador celular Brandel de 48
pocillos) a través de filtros GF/C previamente tratados durante 1 h
con polietilenoimina al 0,5%. Tras la aplicación de la suspensión
de membranas al filtro, los filtros se lavaron 3 veces con 3 ml cada
uno de Tris-HCl 50 mM [pH 7,4], MgCl_{2} 10 mM,
EDTA 2,5 mM y Triton X-100 al 0,015% enfriado en
hielo, y la radioactividad unida en los filtros se cuantificó
mediante un recuento de centelleo. La unión específica (> 90% del
total) se define como la diferencia entre la unión total y la unión
no específica producida en presencia de Compuesto A 50 nM no
marcado.
Claims (11)
1. Un procedimiento para determinar la
presencia de un ácido nucleico que codifica un receptor de un
secretagogo de la hormona de crecimiento (GHSR) que comprende:
- a)
- introducir un ácido nucleico sospechoso de codificar un GHSR en una célula que no expresa de forma natural el receptor en su membrana celular;
- b)
- introducir una molécula detectora o un ácido nucleico que codifica una molécula detectora en la célula, en la que la molécula detectora responde directa o indirectamente a un suceso bioquímico activado por proteína G;
- c)
- poner en contacto la célula con un secretagogo de la hormona de crecimiento; y
- d)
- determinar si el ácido nucleico codifica un GHSR monitorizando la molécula detectora.
2. Un procedimiento para determinar la
presencia de un secretagogo de la hormona de crecimiento que
comprende:
- a)
- introducir un ácido nucleico que codifica un GHSR en una célula que no expresa de forma natural el receptor en su membrana celular en unas condiciones tales que se exprese un GHSR;
- b)
- introducir una molécula detectora o un ácido nucleico que codifica una molécula detectora en la célula, en la que la molécula detectora responde directa o indirectamente a un suceso bioquímico activado por proteína G;
- c)
- poner en contacto la célula con un compuesto sospechoso de ser un secretagogo de la hormona de crecimiento; y
- d)
- determinar si el compuesto es un secretagogo de la hormona de crecimiento monitorizando la molécula detectora.
3. Un procedimiento según la
reivindicación 1 que comprende adicionalmente la etapa de introducir
una subunidad de proteína G en la célula.
4. Un procedimiento según la
reivindicación 2 que comprende adicionalmente la etapa de introducir
una subunidad de proteína G en la célula.
5. Un procedimiento según la
Reivindicación 3 o la Reivindicación 4 en el que la subunidad de
proteína G es una subunidad de proteína G-alfa.
6. Un procedimiento según la
Reivindicación 5 en el que la subunidad de proteína G es la
subunidad de proteína G-\alpha_{11}.
7. Un procedimiento según la
Reivindicación 3 en el que se introduce en la célula en la etapa a)
un conjunto que comprende al menos 500 moléculas de ácidos nucleicos
diferentes.
8. Un procedimiento según la
Reivindicación 7 en el que el conjunto comprende moléculas de
ARN.
9. Un procedimiento según la
Reivindicación 7 en el que tras determinar que el conjunto de
moléculas de ácidos nucleicos diferentes comprende un ácido
nucleico que codifica un GHSR, se repiten todas las etapas salvo
que el conjunto comprende un número menor de moléculas de ácidos
nucleicos diferentes.
10. Un procedimiento según la
Reivindicación 4 en el que el resultado de la etapa d) se compara
con el obtenido usando un secretagogo conocido de la hormona del
crecimiento.
11. Un procedimiento según cualquier
Reivindicación previa en el que la molécula detectora es
aequorina.
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Families Citing this family (17)
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|---|---|---|---|---|
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| US6682908B1 (en) | 1998-07-10 | 2004-01-27 | Merck & Co., Inc. | Mouse growth hormone secretagogue receptor |
| EP1097169A1 (en) * | 1998-07-10 | 2001-05-09 | Merck & Co., Inc. | Mouse growth hormone secretagogue receptor |
| CA2333857A1 (en) | 1998-07-13 | 2000-01-20 | Merck & Co., Inc. | Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids |
| EP1112282A4 (en) * | 1998-08-10 | 2002-10-31 | Merck & Co Inc | RECEPTOR OF THE GROWTH HORMONE SECRETION PROMOTER FROM THE DOG |
| ES2333097T3 (es) | 2000-05-31 | 2010-02-17 | Raqualia Pharma Inc | Uso de secretagogos de la hormona de crecimiento para estimular la motilidad gastrointestinal. |
| US20030171377A1 (en) * | 2001-08-29 | 2003-09-11 | Bigge Christopher Franklin | Antidiabetic agents |
| US20040121407A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-06-24 | Elixir Pharmaceuticals, Inc. | Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis |
| JP4533655B2 (ja) * | 2003-04-23 | 2010-09-01 | 武田薬品工業株式会社 | 新規スクリーニング方法 |
| DE602004023493D1 (de) * | 2003-04-23 | 2009-11-19 | Takeda Pharmaceutical | Neues screening-verfahren |
| US7476653B2 (en) | 2003-06-18 | 2009-01-13 | Tranzyme Pharma, Inc. | Macrocyclic modulators of the ghrelin receptor |
| WO2005027913A1 (en) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Pfizer Products Inc. | Pharmaceutical compositions and methods comprising combinations of 2-alkylidene-19-nor-vitamin d derivatives and a growth hormone secretagogue |
| US20090275648A1 (en) * | 2005-06-13 | 2009-11-05 | Fraser Graeme L | Macrocyclic ghrelin receptor antagonists and inverse agonists and methods of using the same |
| CU23558A1 (es) | 2006-02-28 | 2010-07-20 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Compuestos análogos a los secretagogos peptidicos de la hormona de crecimiento |
| BRPI0807046A2 (pt) | 2007-02-09 | 2015-05-26 | Tranzyme Pharma Inc | Composto, composição farmacêutica, métodos de tratar um distúrbio, uma doença cardiovascular e um paciente que sofre de motilidade gastrointestinal reduzida ou disfuncional e, kit. |
| AU2010313282A1 (en) | 2009-10-30 | 2012-05-24 | Ocera Therapeutics, Inc. | Macrocyclic ghrelin receptor antagonists and inverse agonists and methods of using the same |
| CN109371011A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-02-22 | 天津科技大学 | 一种新的提取噬菌体基因组dna的方法 |
Family Cites Families (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3239345A (en) | 1965-02-15 | 1966-03-08 | Estrogenic compounds and animal growth promoters | |
| US4411890A (en) | 1981-04-14 | 1983-10-25 | Beckman Instruments, Inc. | Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity |
| US4036979A (en) | 1974-01-25 | 1977-07-19 | American Cyanamid Company | Compositions containing 4,5,6,7-tetrahydrobenz[b]thien-4-yl-ureas or derivatives and methods of enhancing growth rate |
| US4410513A (en) | 1981-12-28 | 1983-10-18 | Beckman Instruments, Inc. | Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity |
| GB8332704D0 (en) | 1983-12-07 | 1984-01-11 | Pfizer Ltd | Growth promotants for animals |
| US5057417A (en) | 1987-06-12 | 1991-10-15 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the synthesis of growth hormone receptor and growth hormone binding protein |
| NL8702588A (nl) | 1987-10-30 | 1989-05-16 | S B Systems B V | Dubbel-roterende electriese motor/generator. |
| DE68922602T2 (de) | 1988-01-28 | 1995-12-07 | Polygen Holding Corp | Polypeptide mit hormonwachstumsbefreiender wirkung. |
| JPH03502326A (ja) | 1988-01-28 | 1991-05-30 | ポリゲン ホールディング コーポレイション | 成長ホルモン放出活性を有するポリペプチド化合物類 |
| US5206235A (en) | 1991-03-20 | 1993-04-27 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams that promote the release of growth hormone |
| US5591641A (en) | 1992-06-23 | 1997-01-07 | American Cyanamid Company | Nucleic acid encoding the growth hormone releasing hormone receptor |
| US5583010A (en) | 1992-06-23 | 1996-12-10 | American Cyanamid Company | Nucleic acid molecule encoding the porcine growth hormone receptor |
| US5283241A (en) | 1992-08-28 | 1994-02-01 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5583130A (en) | 1992-09-25 | 1996-12-10 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5317017A (en) | 1992-09-30 | 1994-05-31 | Merck & Co., Inc. | N-biphenyl-3-amido substituted benzolactams stimulate growth hormone release |
| US5374721A (en) | 1992-10-14 | 1994-12-20 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| WO1994011012A1 (en) | 1992-11-06 | 1994-05-26 | Merck & Co., Inc. | Substituted dipeptide analogs promote release of growth hormone |
| CZ151495A3 (en) | 1992-12-11 | 1995-12-13 | Merck & Co Inc | Spiropiperidine derivatives, process of their preparation and a pharmaceutical composition containing thereof |
| US5536716A (en) | 1992-12-11 | 1996-07-16 | Merck & Co., Inc. | Spiro piperidines and homologs which promote release of growth hormone |
| US5284841A (en) | 1993-02-04 | 1994-02-08 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5430144A (en) | 1993-07-26 | 1995-07-04 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5434261A (en) | 1993-07-26 | 1995-07-18 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5545735A (en) | 1993-10-04 | 1996-08-13 | Merck & Co., Inc. | Benzo-Fused Lactams promote release of growth hormone |
| BR9407869A (pt) | 1993-10-19 | 1996-10-29 | Merck & Co Inc | Combinaçao composiçao farmacêutica e processo para o tratamento de osteoporose |
| US5438136A (en) | 1993-11-02 | 1995-08-01 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused macrocycles promote release of growth hormone |
| US5492916A (en) | 1993-12-23 | 1996-02-20 | Merck & Co., Inc. | Di- and tri-substituted piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone |
| US5494919A (en) | 1993-11-09 | 1996-02-27 | Merck & Co., Inc. | 2-substituted piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines promote release of growth hormone |
| AU1172995A (en) | 1993-11-09 | 1995-05-29 | Merck & Co., Inc. | Piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1h-azepines promote release of growth hormone |
| AU684878B2 (en) | 1993-11-24 | 1998-01-08 | Merck & Co., Inc. | Compounds and the use thereof to promote the release of growth hormone(s) |
| WO1995016675A1 (en) | 1993-12-13 | 1995-06-22 | Merck & Co., Inc. | Benzo-fused lactams promote release of growth hormone |
| US5606054A (en) | 1993-12-14 | 1997-02-25 | Merck & Co., Inc. | Heterocyclic-fused lactams promote release of growth hormone |
| UA42747C2 (uk) | 1993-12-23 | 2001-11-15 | Ново Нордіск А/С | Похідні пептиду,фармацевтична композиція та спосіб стимулювання секреції гормону росту |
| HU221092B1 (en) | 1993-12-23 | 2002-08-28 | Novo Nordisk As | Compounds with growth hormone releasing properties |
| WO1995034311A1 (en) | 1994-06-13 | 1995-12-21 | Merck & Co., Inc. | Piperazine compounds promote release of growth hormone |
| US5783582A (en) | 1994-07-20 | 1998-07-21 | Merck & Co., Inc. | Piperidines and hexahydro-1H-azepines spiro substituted at the 4-position promote release of growth hormone |
| US5494920A (en) | 1994-08-22 | 1996-02-27 | Eli Lilly And Company | Methods of inhibiting viral replication |
| WO1997022367A1 (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-26 | Merck & Co., Inc. | Radiolabeled growth hormone secretagogue |
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