ES2229289T3 - Familia de receptores de secretagogo de la hormona del crecimiento. - Google Patents
Familia de receptores de secretagogo de la hormona del crecimiento.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE AL AISLAMIENTO, CLONACION Y SECUENCIACION DE RECEPTORES DE SUSTANCIAS ESTIMULADORAS DE LA SECRECION DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO DE RATA, PORCINA Y HUMANA. DICHOS RECEPTORES SON NUEVOS MIEMBROS DE LA FAMILIA DE LA PROTEINA G DE RECEPTORES Y PUEDEN UTILIZARSE PARA SELECCIONAR E IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE SE UNEN AL RECEPTOR DE LA SUSTANCIA ESTIMULADORA DE LA SECRECION DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO. DICHOS COMPUESTOS SE PUEDEN UTILIZAR PARA EL TRATAMIENTO DE ALTERACIONES QUE TIENEN LUGAR CUANDO SE PRODUCE UN DEFICIT DE HORMONA DE CRECIMIENTO, COMO SE OBSERVA EN NIÑOS DEFICITARIOS EN HORMONA DE CRECIMIENTO, PACIENTES ANCIANOS CON TRASTORNOS MUSCULOESQUELETICOS, RECUPERACION DE LA FRACTURA DE CADERA Y OSTEOPOROSIS.
Description
Familia de receptores de secretagogo de la
hormona del crecimiento.
Esta invención se refiere a una nueva familia de
receptores que incluye los receptores de secretagogo de la hormona
del crecimiento (GHSR) y receptores relacionados con el secretagogo
de la hormona del crecimiento (GHSRR), los ácidos nucleicos que
codifican estos receptores, y el uso de un GHSR para identificar
los secretagogos de la hormona del crecimiento y compuestos que
modulan la función de los GHSR.
La hormona del crecimiento (GH) es una hormona
anabólica capaz de facilitar el crecimiento lineal, la ganancia de
peso y la retención de nitrógeno corporal total. Clásicamente se
piensa que la GH se libera principalmente en las células
somatotrofas de la hipófisis anterior bajo la regulación coordinada
de dos hormonas hipotalámicas, el factor liberador de hormona del
crecimiento (GHRF o GRF) y la somatostatina. Tanto la estimulación
por el GHRF como la inhibición por la somatostatina de la
liberación de la GH se produce por la ocupación específica de
receptores de la membrana celular de los somatotrofos.
Se dispone de datos recientes que indican que la
liberación de la GH también está estimulada por un grupo de
péptidos cortos, los péptidos liberadores de hormona del
crecimiento (GHR; GHRP-6, GHRP-2
[hexarelina]) que se describen, por ejemplo, en la Patente de
EE.UU. Nº 4.411.890, Patente PCT Nº Pub. WO 89/07110, Patente PCT
Nº Pub. WO 89/07111, Patente PCT Nº Pub. WO 93/04081, y J.
Endocrinol. Invest. 15 (Suppl. 4), 45 (1992). Estos péptidos
actúan uniéndose de manera selectiva a receptores diferenciados de
la membrana celular de los somatotrofos, los receptores de
secretagogo de la hormona del crecimiento (GHSR). Un abordaje
químico medicinal ha dado lugar al diseño de varias clases de
compuestos no peptídicos de bajo peso molecular y activos por vía
oral que se unen específicamente a este receptor y que dan lugar a
liberación pulsátil de GH. Estos compuestos que tienen actividad
secretagoga de la hormona del crecimiento se describen, por
ejemplo, en los siguientes documentos: Patente de EE.UU. Nº
3.239.345; Patente de EE.UU. Nº 4.036.979; Patente de EE.UU. Nº
4.411.890; Patente de EE.UU. Nº 5.206.235; Patente de EE.UU. Nº
5.283.241; Patente de EE.UU. Nº 5.284.841; Patente de EE.UU. Nº
5.310.737; Patente de EE.UU. Nº 7.317.017; Patente de EE.UU. Nº
5.374.721; Patente de EE.UU. Nº 5.430.144; Patente de EE.UU. Nº
5.434.261; Patente de EE.UU. Nº 5.438.136; Patente de EE.UU. Nº
5.494.919: Patente de EE.UU. Nº 5.494.920; Patente de EE.UU. Nº
5.492,916; Patente EPO Nº pub. 0.144.230; EPO Patent Nº pub.
0.513,974; PCT Patent Nº pub. WO 94/07486; PCT Patent Nº pub. WO
94/08583; PCT Patent Nº pub. WO 94/11012; PCT Patent Nº pub. WO
94/13696; PCT Patent Nº pub. WO 94/19367; PCT Patent Nº pub. WO
95/03289; PCT Patent Nº pub. WO 95/03290; PCT Patent Nº pub. WO
95/09633; PCT Patent Nº pub. WO 95/11029; PCT Patent Nº pub. WO
95/12598: PCT Patent Nº pub. WO 95/13069; PCT Patent Nº pub. WO
95/14666; PCT Patent Nº pub. WO 95/16675; PCT Patent Nº pub. WO
95/16692; PCT Patent Nº pub. WO 95/17422; PCT Patent Nº pub. WO
95/17423; PCT Patent Nº pub. WO 95/34311; PCT Patent Nº pub. WO
96/02530; Science 260, 1640-1643 (11 de
junio de 1993); Ann. Rep. Med. Chem. 28,
177-186 (1993): Bioorg. Med. Chem. Ltrs.
4(22), 2709-2714 (1994); y Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92, 7001-7005 (julio de
1995).
El uso de fármacos activos por vía oral que
estimularan la liberación pulsátil de GH sería un avance
significativo en el tratamiento del déficit de hormona del
crecimiento en niños y adultos, y proporcionaría un efecto
beneficioso sustancial en circunstancias en las que se podrían
aprovechar clínicamente los efectos anabólicos de la GH (por
ejemplo, rehabilitación después de una fractura de cadera, ancianos
debilitados y pacientes en el periodo de recuperación
postoperatoria).
También sería deseable conocer la estructura
molecular de los receptores de secretagogo de la hormona del
crecimiento para analizar esta nueva familia de receptores y
comprender su importancia fisiológica normal de manera concertada
con las acciones del GHRF y de la somatostatina. Esto podría dar
lugar a una mejor comprensión de los procesos in vivo que se
producen después de la unión ligando-receptor.
Además, sería deseable usar receptores de secretagogo de la hormona
del crecimiento clonados como componentes esenciales de un sistema
de ensayo que pueda identificar nuevos secretagogos de la hormona
del crecimiento.
Esta invención se refiere a una nueva familia de
receptores que incluye los receptores de secretagogo de la hormona
del crecimiento (GHSR) y receptores relacionados con secretagogos
de la hormona del crecimiento (GHSRR).
Un primer aspecto de esta invención son los
receptores de secretagogo de la hormona del crecimiento, que están
libres de proteínas asociadas al receptor. Los GHSR pueden proceder
de cualquier especie, y en otras formas de realización pueden estar
aislados o purificados. Una forma de realización de esta invención
es el receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento humano
(hGHSR), libre de proteínas asociadas al receptor. Otro aspecto de
esta invención es el hGHSR que está aislado o purificado.
\newpage
Otro aspecto de esta invención es el receptor de
secretagogo de la hormona del crecimiento porcino (sGHSR), libre de
proteínas asociadas al receptor. Otro aspecto de esta invención es
el sGHSR que está aislado o purificado.
Otro aspecto de esta invención es el receptor de
secretagogo de la hormona del crecimiento de rata (rGHSR), libre de
proteínas asociadas al receptor. Otro aspecto de esta invención es
el rGHSR que está aislado o purificado.
Así, la presente invención proporciona un
receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento aislado que
comprende una secuencia de aminoácidos que se presenta en la Figura
3, 7, 12, 22 ó 25.
La presente invención también proporciona un
receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento libre de
proteínas asociadas al receptor, que comprende una secuencia de
aminoácidos que se presenta en la Figura 3, 7, 12, 22 ó 25.
También se proporciona un ácido nucleico de un
receptor de la hormona del crecimiento aislado que codifica una
secuencia de aminoácidos como la que se presenta en la Figura 3, 7,
12, 22 ó 25. Se proporciona una secuencia porcina en la Figura 1,
las secuencias humanas en las Figuras 6 y 11 y las secuencias de
rata en las Figuras 23 y 24.
Los receptores de secretagogo de la hormona del
crecimiento son proteínas que contienen varios dominios
funcionales, incluyendo uno o más dominios que anclan el receptor a
la membrana celular, y al menos un dominio de unión a ligandos.
Como ocurre con muchas proteínas receptoras, es posible modificar
muchos de los aminoácidos, particularmente los que no se encuentran
en el dominio de unión al ligando, y que la proteína conserve al
menos un porcentaje de la actividad biológica del receptor
original. Según esta invención, se ha mostrado que las porciones
N-terminales del GHSR no son esenciales para su
activación por los secretagogos de la hormona del crecimiento
(GHS).
Otro aspecto de esta invención son los ácidos
nucleicos que codifican un receptor de secretagogo de la hormona
del crecimiento procedente del cerdo, del ser humano o de la rata.
Estos ácidos nucleicos pueden estar libres de ácidos nucleicos
asociados, o pueden estar aislados o purificados. Para la mayor
parte de los fines de clonación, el ADNc es un ácido nucleico
preferido, pero esta invención incluye específicamente otras formas
de ADN, así como los ARN que codifican un GHSR o un equivalente
funcional del mismo.
Otro aspecto más de esta invención se refiere a
vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican un GHSR.
Estos vectores pueden estar formados por ADN o ARN; para la mayor
parte de los fines de clonación se prefieren vectores de ADN. Los
vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados,
bacteriófagos y cósmidos, cromosomas artificiales de levadura y
otras formas de ADN episómico o integrado que pueden codificar un
GHSR. Está dentro del conocimiento de un técnico con conocimientos
normales determinar un vector adecuado para una transferencia
génica particular o para otro uso.
Otro aspecto de esta invención son células
huésped que son transformadas con un gen que codifica un receptor
de secretagogo de la hormona del crecimiento. La célula huésped
puede expresar o no de manera natural un GHSR en la membrana
celular. Preferentemente, una vez que se han transformado, las
células huésped son capaces de expresar el receptor de secretagogo
de la hormona del crecimiento en la membrana celular. Dependiendo
de la célula huésped, puede ser deseable adaptar el ADN de modo que
se usan codones particulares a fin de optimizar la expresión. Esas
adaptaciones son conocidas en la técnica, y esos ácidos nucleicos
también se incluyen en el ámbito de esta invención. Generalmente
son células huésped preferidas líneas celulares de mamíferos, como
células COS, HEK-293, CHO, HeLa, NS/0,
CV-1, GC, GH3 o VERO, pero también se pueden usar
otras células y líneas celulares tales como ovocitos de
Xenopus o células de insecto.
La Figura 1 es el ADN del GHSR porcino (tipo I)
contenido en el Clon 7-3.
La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR porcino codificado por el ARN de la Figura 1.
La Figura 3 es el marco de lectura abierto
completo del clon de tipo I de la Figura 1.
La Figura 4 es el ADN del GHSR porcino (tipo II)
contenido en el Clon 1375.
La Figura 5 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR porcino (tipo II) codificado por el ADN de la Figura 4.
La Figura 6 es el ADN del GHSR humano (tipo I)
contenido en el Clon 1146.
La Figura 7 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR humano (tipo I) codificado por el ADN de la Figura 6.
La Figura 8 es el marco de lectura abierto
completo del GHSR codificado por la secuencia de ADN de la Figura
6.
La Figura 9 es el ADN del GHSR humano (tipo II)
contenido en el Clon 1141.
La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR humano (tipo II) codificado por el clon 1141.
La Figura 11 es el ADN del GHSR humano (tipo I)
contenido en el Clon 1143.
La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR humano codificado por el Clon 1143.
La Figura 13 compara el ORF del receptor porcino
de Tipo I (que carece del iniciador MET del GHSR de secuencia
completa y que carece de otros 12 aminoácidos) con el dominio
homólogo de los receptores porcinos de Tipo II.
La Figura 14 compara el dominio homólogo de los
receptores humanos de Tipo I y de Tipo II (la secuencia
aminoterminal carece del iniciador MET y de otros cuatro
aminoácidos).
La Figura 15 compara los ORF de los receptores
porcino de Tipo I y humano de Tipo I (la secuencia aminoterminal
carece del iniciador MET y de otros 12 aminoácidos).
La Figura 16 compara la longitud completa de los
receptores porcino de Tipo II y humano de Tipo II.
La Figura 17 es un diagrama esquemático que
representa el mapa físico de los clones de ADNc del receptor de
secretagogo de la hormona del crecimiento porcino y humano.
La Figura 18 es un gráfico que demuestra la
farmacología de los receptores de secretagogo de la hormona del
crecimiento porcino y humano expresados en ovocitos de
Xenopus usando el ensayo de bioluminiscencia de
aecuorina.
La Figura 19 es una tabla que demuestra la
farmacología de los receptores de secretagogo de la hormona del
crecimiento porcino y humano expresados en ovocitos de
Xenopus usando el ensayo de bioluminiscencia de aecuorina y
varios secretagogos.
La Figura 20 es un gráfico que demuestra la
farmacología del receptor de secretagogo de la hormona del
crecimiento porcino puro expresado en células COS-7
usando el ensayo de unión al Compuesto A marcado con ^{35}S.
La Figura 21 es una tabla que representa el
análisis de competición con el receptor de secretagogo de la
hormona del crecimiento porcino puro expresado en células
COS-7 usando el ensayo de unión al Compuesto A
marcado con ^{35}S y varios secretagogos y otros ligandos de
receptores acoplados a la proteína G (receptores GPC) en un ensayo
de competición.
La Figura 22 es la secuencia de aminoácidos del
GHSR humano de longitud completa (de Tipo I) codificado por el clon
11.304.
La Figura 23 es la secuencia del ADN del GHSR de
la rata desde el codón de iniciación Met hasta el codón de
terminación. Esta secuencia incluye un intrón.
La Figura 24 es sólo el marco de lectura abierto
del GHSR de la rata de la Figura 23.
La Figura 25 es la secuencia de aminoácidos
deducida del ORF de la Figura 24.
La Figura 26 muestra la expresión del GHSR
funcional de rata en células HEK-293
transfectadas.
Para su uso en toda la solicitud y en las
reivindicaciones, se aplicarán las siguientes definiciones:
Secretagogo de la hormona del crecimiento:
cualquier compuesto o agente que estimula o aumenta directa o
indirectamente la liberación de la hormona del crecimiento en un
animal.
Ligando: cualquier molécula que se une al GHSR de
esta invención. Los ligandos pueden tener actividad agonista,
agonista parcial, antagonista parcial o antagonista.
Libre de proteínas asociadas al receptor: la
proteína del receptor no está en una mezcla o solución con otras
proteínas del receptor de membrana.
Libre de ácidos nucleicos asociados: el ácido
nucleico no está unido covalentemente al ADN al que está unido
covalentemente de manera natural en el cromosoma del organismo.
Receptor aislado: la proteína no está en una
mezcla o solución con ninguna otra proteína.
Ácido nucleico aislado: el ácido nucleico no está
en una mezcla o solución con ningún otro ácido nucleico.
Receptor purificado: el receptor tiene una pureza
de al menos aproximadamente el 95%.
Ácido nucleico purificado: el ácido nucleico
tiene una pureza de al menos aproximadamente el 95%.
Compuesto A:
(N-[1(R)-[1,2-dihidro-1-metano-sulfonilespiro[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-il)carbonil]-2-(fenil-
metiloxi)etil]-2-amino-2-metil propanamida, descrito en Patchett, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7001-7005.
metiloxi)etil]-2-amino-2-metil propanamida, descrito en Patchett, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7001-7005.
Compuesto B:
3-amino-3-metil-N-(2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-{[2'-1H-tetrazol-5-il)(1,1'-bifenil)-4-il]metil}-1H-
benzazepina-3(R)il-butanamida, descrito en Patchett, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7001-7005.
benzazepina-3(R)il-butanamida, descrito en Patchett, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7001-7005.
Compuesto C:
3-amino-3-metil-N-(2,3,4,5-tetra-hidro-2-oxo-{[2'-1H-tetrazol-5-il)(1,1'-bifenil)-4-il]metil}-1H-benzazepina-3(S)il-butanamida,
descrito en la patente de EE.UU. 5.206.235.
Condiciones de lavado posthibridación estándar o
rígidas: 6 x SCC a 55ºC.
Condiciones de lavado posthibridación moderadas:
6 x SCC a 45ºC.
Condiciones de lavado posthibridación relajadas:
6 x SCC a 30ºC.
Se encontró que las proteínas de esta invención
tienen características estructurales que son típicas de la
superfamilia de los receptores ligados a la proteína G que
contienen 7 dominios transmembrana (TM) (GPC-R o
receptores 7-TM). De esta manera la familia de
receptores de secretagogo de la hormona del crecimiento supone
nuevos miembros de la familia GPR-C de receptores.
Se encontró que los GHSR intactos de esta invención tienen las
características generales de los GPC-R, incluyendo
7 regiones transmembrana, tres bucles intra y extracelulares, y la
secuencia de firma de la proteína GPC-R. Los
dominios TM y la secuencia de firma de la proteína
GPC-R se observan en las secuencias proteicas del
receptor GHS de tipo I en las Figuras 3 y 8. No son necesarias
todas las regiones para su funcionamiento, y por lo tanto esta
invención también comprende receptores funcionales que carecen de
uno o más dominios no esenciales.
Los GHSR de esta invención comparten algunas
homologías de secuencia con receptores GPC clonados previamente,
incluyendo el receptor de neurotensina de rata y humano (identidad
de aproximadamente 32%) y el receptor de TRH de rata y humano
(identidad de aproximadamente 30%).
Los GHSR de esta invención se aislaron y
caracterizaron usando técnicas de clonación de la expresión en
ovocitos de Xenopus. La clonación estuvo dificultado por
tres factores. Primero, antes de esta invención se disponía de muy
poca información sobre las características bioquímicas y las rutas
intracelulares de señalización/efectores de las proteínas. De esta
manera, no se podían utilizar de manera eficaz los procedimientos de
clonación que dependían del uso de información de la secuencia
proteica para el diseño de oligonucleótidos degenerados para hacer
cribado de bibliotecas de ADNc o que utilizaban PCR. Por lo tanto,
según esta invención, se tenía que determinar la bioactividad del
receptor.
En segundo lugar, el receptor de secretagogo de
la hormona del crecimiento no aparece de manera abundante; está
presente en la membrana celular en una concentración
aproximadamente 10 veces menor que la de la mayoría de los demás
receptores de membrana. Para clonar con éxito los receptores de esta
invención se tuvieron que tomar precauciones exhaustivas para
asegurarse de que el GHSR estaba representado en una biblioteca de
ADNc que se iba a cribar. Esto precisaba el aislamiento de ARNm
poli (A)^{+} intacto, no degradado y puro, y la
optimización de la síntesis de ADNc para maximizar la producción de
moléculas completas. Además, se tuvo que hacer cribado en una
biblioteca de un tamaño mayor de lo normal (aproximadamente 0,5 a 1
x 10^{7} clones) para aumentar la probabilidad de obtener un clon
de ADNc funcional.
En tercer lugar, no se conoce ninguna línea
celular permanente que exprese este receptor. Por lo tanto, se tuvo
que obtener tejido hipofisario primario como fuente de ARNm o de
proteína. Esto planteo un obstáculo adicional porque la mayor parte
de los tejidos primarios expresa cantidades menores de un receptor
dado que una línea celular inmortalizada que se puede mantener en un
cultivo tisular o que algunos materiales tumorales. Además, la
resección quirúrgica de la hipófisis de cerdo y la extracción de
ARNm intacto y biológicamente activo para la construcción de una
biblioteca de expresión de ADNc es considerablemente más difícil
que la extracción de ARNm a partir de una línea celular cultivo
tisular. Junto con la necesidad de obtener continuamente un tejido
reciente, hay problemas asociados a la variabilidad intrínseca
interanimal e interpreparación. Por lo tanto, el desarrollo de
líneas celulares que expresan el receptor de esta invención es un
aspecto significativo de esta invención.
También se describe el desarrollo de un ensayo de
cribado extremadamente sensible, robusto, fiable y de alto
rendimiento que se podría usar para identificar porciones de una
biblioteca de ADNc que contiene el receptor. Este ensayo se describe
y se reivindica en las solicitudes de patente pendientes de
tramitación con Nº de Serie 60/008.584, presentada el 13 de
diciembre de 1995, e informe de agente N1 19590V2 que se presenta
con esta solicitud.
Brevemente, la capacidad de identificar ADNc que
codifica los receptores de secretagogo de la hormona del
crecimiento dependía de dos descubrimientos que se hicieron con
esta invención: 1) que los acontecimientos de unión entre el
receptor de secretagogo de la hormona del crecimiento y el ligando
son transducidos mediante las proteínas G, y 2) que una subunidad
particular de la proteína G, G_{a11}, debe estar presente en las
células para detectar la actividad del receptor. Sólo cuando se
hicieron estos dos descubrimientos se pudo diseñar un ensayo para
detectar la presencia de secuencias de ADN que codifican el
GHSR.
Cuando un ligando (un secretagogo de la hormona
del crecimiento) se une al GHSR, las proteínas G presentes en la
célula activan la fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol
(PI-PLC), un enzima que libera moléculas de
señalización intracelular (diacilglicerol y trifosfato de
inositol), que a su vez inician una cascada de acontecimientos
bioquímicos que promueven la movilización del calcio. Esto se puede
usar como base de un ensayo. Se introduce una molécula detectora
que puede responder a los cambios de la concentración del calcio,
como la aecuorina, una fotoproteína de medusa, en el interior de
una célula, junto con una mezcla compleja de hasta 10.000 ARN
individuales de una biblioteca de expresión de ADNc, al menos uno
de los cuales puede codificar un GHSR. De esta manera se expone a la
célula a un secretagogo conocido de la hormona del crecimiento,
como el Compuesto A o el Compuesto B. Si uno o más ARN codifica un
GHSR, entonces el ligando secretagogo se unirá al receptor, se
activará la proteína G, la concentración del calcio fluctuará, y la
aecuorina dará lugar a una bioluminiscencia medible. Una vez que se
ha encontrado un resultado positivo, se puede repetir el
procedimiento con una subdivisión de la mezcla de ARN (por ejemplo,
aproximadamente 1000, posteriormente aproximadamente 500,
posteriormente aproximadamente 50, y posteriormente clones puros)
hasta que se identifica un solo clon a partir del cual se puede
generar un ARN que codifica un GHSR.
Usando este protocolo general en ovocitos de
Xenopus con una biblioteca de expresión de ADNc porcino, se
identificó que el Clon 7-3 contenía un ácido
nucleico que codificaba un GHSR porcino. El inserto del clon de ADNc
tiene un tamaño de aproximadamente 1,5 kb, y corriente abajo de la
supuesta metionina (MET) iniciadora, contiene un marco de lectura
abierto (ORF) que codifica 302 aminoácidos (M_{r} = 34.516). El
ADN y la secuencia de aminoácidos deducida se dan en las Figuras 1
y 2. Cuando se realiza análisis de hidropatía (por ejemplo,
Kyte-Doolittle; Eisenberg, Schwartz, Komaron y Wall)
en la secuencia proteica del clon 7-3, sólo hay
seis dominios transmembrana predichos corriente abajo del supuesto
iniciador MET. La traducción del mayor ORF que está codificado en
el clon 7-3 codifica una proteína de 353 aminoácidos
(M_{r} = 39.787); sin embargo no se puede identificar un
iniciador MET aparente para este marco de lectura más largo (Figura
3). Este marco de lectura más largo es significativo porque en la
proteína de 353 aminoácidos en la que no hay un codón iniciador de
la traducción MET corriente arriba de TM1 se codifican siete
segmentos transmembrana. Además, el dominio TM1 predicho de esta
proteína más larga también comparte homología con receptores
acoplados a la proteína G conocidos (Figura 3 y secciones
siguientes). De esta manera, el clon 7-3, aunque
está truncado en su extremo aminoterminal, es completamente
funcional, lo que demuestra que el clon 7-3 no es
sino una forma de realización de un equivalente funcional de un
GHSR natural.
El clon de ADNc resultante (o porciones más
cortas del mismo, por ejemplo de sólo 15 nucleótidos de longitud)
se puede usar para estudiar bibliotecas en condiciones de
hibridación para encontrar otros receptores que sean lo
suficientemente similares como para que los ácidos nucleicos se
puedan hibridar, y es particularmente útil para cribar bibliotecas
de otras especies. Usando este procedimiento se han clonado otros
ADNc de GHSR humanos, porcinos y de rata, y se han determinado sus
secuencias de nucleótidos. Además, la hibridación de un ADNc con un
ADN genómico demostró que el receptor de Tipo I (véase más adelante)
está codificado por un solo gen que está muy conservado. El ADN
humano, del mono, de rata, de ratón, de perro, de vaca, de pollo y
de invertebrado dio en todos los casos una sola especie de
hibridación en condiciones posthibridación rígidas. Por lo tanto,
esta invención no está limitada a ninguna especie particular.
Se hibridó una biblioteca de hipófisis porcina,
una biblioteca de hipófisis humana y una biblioteca de hipófisis de
rata con un ADNc radiomarcado derivado del marco de lectura abierto
del clon 7-3 del GHSR porcino. Se aislaron 21
clones positivos de ADNc de GHSR humano y 5 mezclas de biblioteca
porcina dieron lugar a una señal de hibridación intensa y contenían
clones con insertos mayores que el clon 7-3, como
se determinó por el tamaño del inserto en estudios de transferencia
Southern. También se aisló un solo clon de ADNc de rata.
El análisis de la secuencia de nucleótidos mostró
dos tipos de ADNc para el ADNc de GHSR humano y porcino. El primero
(Tipo I) codifica una proteína representada por el clon
7-3, que codifica 7 dominios transmembrana. El marco
de lectura abierto de longitud completa parece extenderse 13
aminoácidos más allá del mayor marco de lectura abierto predicho
del clon 7-3 (353 aminoácidos). El segundo (Tipo
II) diverge en su secuencia de nucleótidos del ADNc de tipo I en su
extremo 3', inmediatamente después del segundo aminoácido predicho
del sexto dominio transmembrana (TM-6).
En los ADNc de tipo II el TM-6
está truncado y fusionado con un marco de lectura contiguo corto de
sólo 24 aminoácidos, seguido de un codón de terminación de la
traducción. El clon porcino 1375 es un ejemplo de un ADNc de Tipo II
(Figuras 4 y 5). Estos 24 aminoácidos más allá de
TM-6 están muy conservados cuando se compara entre
los ADNc humano y porcino. Las secuencias del ADN y de los
aminoácidos de los GHSR humanos de Tipo I y II se dan en las
Figuras 6-12. Se aísla un ADNc de longitud completa
que codifica el receptor de Tipo I humano, es decir, una molécula
que codifica 7 dominios TM con una MET iniciadora en un contexto
favorable precedida de un codón de terminación en el interior del
marco, y se denomina clon 11.304. El ORF predicho del clon 11.304
para el GHSR de Tipo I de longitud completa mide 366 aminoácidos
(M_{r} = 41.198; Figura 22). El ADNc humano de Tipo II de longitud
completa codifica un polipéptido de 289 aminoácidos (M_{r} =
32.156; Figuras 9 y 10).
Las alineaciones de secuencia que se realizan a
nivel del ácido nucleico y de la proteína muestran que los GHSR de
Tipo I y II están relacionados entre sí y en diferentes especies
(Figuras 13-16). Las secuencias del GHSR humano y
porcino tienen una identidad de 93% y una similitud de 98% a nivel
de aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos que codifica la
extensión aminoterminal que falta en el clon 7-3 de
Tipo I porcino deriva del clon de Tipo I humano de longitud
completa predicho y del ADNc de Tipo II humano y porcino. El marco
de lectura de los clones de longitud completa se extendió 13
aminoácidos más allá de la secuencia aminoterminal del clon
7-3, y esta secuencia se conservó en 12/13 residuos
de aminoácidos cuando se comparaba el ADNc humano con el porcino. La
extensión aminoterminal incluye una metionina iniciadora de la
traducción en un contexto favorable según la regla de Kosak, de modo
que el marco de lectura que está más corriente arriba está
interrumpido por un codón de terminación. En la Figura 17 se
presenta un mapa físico esquemático de los clones de ADNc porcino y
humano de Tipo I y II.
También se investigó más el clon de rata. El
análisis de la secuencia mostró la presencia de una secuencia
intrónica no codificadora en el nt 790 que correspondía a un punto
donante de ayuste (véanse las Figuras 23, 24 y 25). El punto
donante de ayuste G/GT está dos aminoácidos después de la
finalización del dominio transmembrana 5 predicho (leucina 263),
dividiendo de esta manera el rGHSR en un segmento aminoterminal
(que contiene el dominio extracelular, TM-1 A
TM-5 y los dos primeros bucles intra y
extracelulares) y un segmento carboxiterminal (que contiene
TM-6, TM-7, el tercer bucle intra y
extracelular, y el dominio intracelular). El punto de inserción y la
secuencia de ADNc adyacente están muy conservados, y también están
presentes en los ADNc de Tipo I y II humano y porcino.
La comparación del marco de lectura abierto
completo que codifica la proteína GHSR de rata con los homólogos
humano y porcino muestra un alto grado de identidad de la secuencia
(de rata frente a humano, 95,1%; de rata frente a porcino,
93,4%).
El GHSR humano se puede asignar mediante análisis
de hibridación fluorescente in situ [FISH, como se describe
en Cytogenet. Cell Genet. 69:196 (1995)] a la banda
citogenética 3Q26.2. El gen del ratón está localizado en 3A3.
Los ARNc de Tipo I humano y porcino expresados en
ovocitos fueron funcionales y respondieron a concentraciones del
Compuesto A que variaban desde 1 mM a concentraciones tan bajas
como 0,1 nM en el ensayo de bioluminiscencia con aecuorina. Los
ARNc derivados de Tipo II humanos o porcinos que están truncados en
TM-6 no dieron lugar a ninguna respuesta cuando se
inyectaron en los ovocitos, y representan un subtipo de receptores
que se puede unir al GHS pero que no activa de manera eficaz la
ruta intracelular de transducción de señales. Además, el receptor
de tipo II puede interactuar con otras proteínas y de esta manera
reconstituir un GHSR funcional. Proteínas como éstas, que pueden
tener actividad de unión a ligandos pero que no son activas en la
transducción de señales, son particularmente útiles para ensayos de
unión a ligandos. En estos casos también se puede sobreexpresar una
proteína mutante en la membrana celular y estudiar la capacidad de
unión de los posibles ligandos marcados. Usando una mutante no
señalizadora que está en un estado de elevada afinidad de manera
constitutiva se puede medir la unión, pero no se producirían
consecuencias metabólicas adversas. De esta manera, las mutantes no
señalizadoras son un aspecto importante de esta invención.
La caracterización farmacológica de los
receptores humano de Tipo I, porcino de Tipo I y de rata en el
ensayo de bioluminiscencia con aecuorina en ovocitos se resume en
las Figuras 18, 19 y 26. Los GHS peptidílicos y no peptidílicos
bioactivos fueron activos en un rango de potencia similar al que se
observó para el receptor de la hipófisis natural. Datos
independientes que confirman que el GHSR de Tipo I (se muestra para
el clon porcino 7-3) codifica un GHSR totalmente
funcional proceden del hallazgo de que cuando el clon
7-3 se expresa de manera transitoria en células
COS-7 de mamíferos, se observa una unión de elevada
afinidad (K_{D} \sim0,2 nM), saturable (B_{max} \sim80
fmol/mg de proteína) y específica (> 90% desplazado por Compuesto
A no marcado 50 nM) para el ^{35}S Compuesto A (Figuras 20 y
21).
Los receptores del GHSR de esta invención se
pueden identificar mediante hibridación del ADNc del GHSR con el
ADN genómico en condiciones de lavado post hibridación relajadas o
moderadas. Este análisis da lugar a un número discreto de bandas de
hibridación. Una biblioteca genómica humana adecuada que se puede
usar en este procedimiento es PAC (según se describe en Nature
Genetics 6: 84 (1994)) y una biblioteca genómica de ratón
adecuada es BAC (según se describe en Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:8.794 (1992)).
Debido al elevado grado de homología con los
GHSR, se piensa que los GHSR de esta invención funcionan de manera
similar a los GHSR y que tienen una actividad biológica similar.
Son útiles para comprender las rutas biológicas y fisiológicas que
participan en el crecimiento de un organismo. También se pueden
usar para buscar agonistas y antagonistas de secretagogo de la
hormona del crecimiento, como en particular para estudiar la
especificidad de los ligandos identificados.
Las proteínas G heterotriméricas formadas por
subunidades a, b y g, actúan transmitiendo la información desde los
receptores de la superficie celular a los receptores intracelulares,
como la fosfolipasa C y la adenilato ciclasa. La subunidad alfa de
la proteína G es un componente esencial de la ruta de transducción
de señales intracelulares activada por la interacción
receptor-ligando. En el proceso de la activación del
GPCR inducida por ligando, la subunidad Ga de una Gabg trimérica
intercambia su GDP unido por GTP y se disocia el heterodímero bg.
La subunidad disociada actúa como transductor activo de señales, a
menudo de manera concertada con el complejo bg, iniciando de esta
manera la activación de la ruta de transducción de señales
intracelulares. Por definición, los receptores de la superficie
celular que se acoplan intracelularmente mediante interacciones con
la proteína G se denominan GPC-R. Esta interacción
se ha caracterizado principalmente en lo relativo al tipo de
subunidad G-alfa (G_{a}) que participa
principalmente en el proceso de transducción de señales. Las
subunidades G_{a} se clasifican en subfamilias según la identidad
de secuencia, y se ha caracterizado el tipo principal receptores a
los que se acoplan: G_{s} activa la adenilato ciclasa;
G_{i/o/t} inhibe la adenilato ciclasa; G_{q/11} activa la
PI-PLC; y G_{12/13} tiene un efector
desconocido.
Se ha mostrado que la expresión de varios
receptores en células heterólogas está aumentada por la coexpresión
de ciertas subunidades G_{a}. Esta observación formó la base del
fundamento del uso de subunidades G_{a} de varias subfamilias
junto a una fuente de GHSR (ARNm poli [A^{+}] porcino) para
verificar si se podría medir una respuesta funcional inducida por
GHS en el sistema de ovocito de Xenopus. Se detectaron
respuestas inducidas por GHS y se encontró que eran estrictamente
dependientes de la coexpresión de G_{a11} en este sistema, un
hallazgo sin precedentes que pone de relieve la especificidad de la
interacción. Así, otro aspecto de esta invención es un
procedimiento para detectar una respuesta a GHS que comprende la
coexpresión de una subunidad proteica G_{a11} en una célula que
también expresa un GHSR, la exposición de la célula a un GHS y la
detección de la respuesta.
Los ligandos que se detectan usando los ensayos
que se describen en esta solicitud se pueden usar en el tratamiento
de enfermedades que se producen cuando hay disminución de la
hormona del crecimiento, como las que se observan en los niños con
déficit de la hormona del crecimiento, pacientes ancianos con
alteraciones musculoesqueléticas y que se recuperan de una fractura
de cadera, y osteoporosis.
El GHSR y sus fragmentos son inmunógenos. Así,
otro aspecto de esta invención son anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos que se pueden unir al GHSR o a un fragmento del GHSR.
Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales y se pueden
producir usando tecnología de hibridomas o procedimientos
recombinantes. Se pueden usar como parte de sistemas de ensayo o
para reducir la función de un GHSR presente en una membrana
celular.
También se describen nucleótidos y
oligonucleótidos no codificadores que se pueden unir a nucleótidos
del GHSR y modular la función o la expresión del receptor.
Además se describe un procedimiento para aumentar
la cantidad de GHSR en una membrana celular que comprende
introducir en la célula un ácido nucleico que codifica un GHSR y
permitir la expresión del GHSR.
Se puede usar un receptor de GHS, preferentemente
inmovilizado en un soporte sólido, con fines diagnósticos para la
determinación de la concentración de secretagogos de la hormona del
crecimiento, o metabolitos de los mismos, en líquidos fisiológicos,
por ejemplo, líquidos corporales, incluyendo suero y extractos
tisulares, como por ejemplo en pacientes a los que se trata con un
secretagogo de la hormona del crecimiento.
La administración de un receptor de GHS a un
paciente también se puede emplear con los fines de: amplificar el
efecto neto de un secretagogo de la hormona del crecimiento
proporcionando un aumento de la señal corriente abajo después de la
administración de secretagogo de la hormona del crecimiento,
disminuyendo de esa manera la dosis necesaria de secretagogo de
hormona del crecimiento; o disminuir el efecto de una sobredosis de
secretagogo de la hormona del crecimiento durante el
tratamiento.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar mejor la invención.
Los ovocitos de Xenopus laevis se aislaron
y se inyectaron usando los procedimientos estándar descritos
previamente por Arena y col., 1991, Mol. Pharmacol. 40,
368-374, que se incorpora a esta solicitud como
bibliografía. Se anestesió a ranas Xenopus laevis hembras
adultas (compradas a Xenopus One, Ann Arbor, MI) con
metanosulfonato de tricaína al 0,17% y se resecaron quirúrgicamente
los ovarios y se colocaron en una cubeta de cultivo de 60 mm
(Falcon) que contenía medio OR-2 sin calcio (NaCl
82,5 mM, KCl 2 mM, piruvato sódico 2,5 mM, MgCl_{2} 1 mM,
penicilina 100 mg/ml, estreptomicina 1 mg/ml, HEPES 5 mM, pH = 7,5;
ND-96 de Specialty Media, NJ). Se abrieron los
lóbulos ováricos, se lavaron varias veces y se liberaron los
ovocitos de sus sacos mediante digestión con colagenasa A
(Boehringer-Mannheim; 0,2% durante
2-3 horas a 18ºC) en medio OR-2 sin
calcio. Cuando se había eliminado aproximadamente el 50% de las
capas foliculares, se seleccionaron ovocitos en etapas V y VI y se
colocaron en medio ND-86 con calcio (NaCl 86 mM, KCl
2 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, piruvato sódico 2,5 mM,
teofilina 0,5 mM, gentamicina 0,1 mM, HEPES 5 mM [pH = 7,5]). Para
cada ciclo de inyecciones se estudió previamente de manera típica a
3-5 ranas para detectar su capacidad de expresar un
receptor control unido a una proteína G (receptor de la hormona
liberadora de gonadotropina humana) y para mostrar una ruta de
señalización intracelular de fosfolipasa C robusta (incubación con
suero de pollo al 1%, que promueve la movilización de calcio
mediante la activación de la fosfolipasa C). De acuerdo con estos
resultados, se eligió a 1-2 ranas para la inyección
de una mezcla de bibliotecas (50 nl de ARNc a una concentración de
25 ng [mezclas complejas] a 0,5 ng [clon puro] por ovocito)
habitualmente 24 a 48 horas después del aislamiento del
ovocito.
Se preparó ARN total de hipófisis (congelada
rápidamente en nitrógeno líquido en un plazo de 1-2
minutos después del sacrificio del animal) porcina
(50-80 kilogramos, raza Yorkshire) mediante un
procedimiento modificado de fenol:tiocianato de guanidinio
(Chomczynski y col., 1987, Anal. Biochem.
162:156-159), usando el reactivo
TRI-Reagent LS según las instrucciones del
fabricante (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). Típicamente
se obtuvieron 5 mg de ARN total de 3,5 g de peso húmedo de tejido
hipofisario. Se aisló el ARN poli (A)^{+} a partir del ARN
total mediante cromatografía en columna (dos pases) en celulosa
oligo(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ). El rendimiento del
ARNm poli (A)^{+} a partir del ARN total fue habitualmente
de 0,5%. El ARN de otros tejidos se aisló de manera similar.
Se sintetizó la primera hebra de ADNc a partir
del ARNm poli (A)^{+} usando transcriptasa inversa
M-MLV ARNasa (-) (Superscript,
GIBCO-BRL, Gaithersberg, MD) según las
instrucciones del fabricante con un
cebador-adaptador oligo (dT)/Not I. Después de la
síntesis de la segunda hebra de ADNc, el ADNc bicatenario se
sometió a las siguientes etapas: 1) ligación a los adaptadores EcoR
I, 2) digestión por Not I, y 3) enriquecimiento en ADNc de gran
tamaño y eliminación del exceso de adaptadores mediante
cromatografía de filtración en gel en una columna Sephacryl S500
(Pharmacia). Las fracciones correspondientes a ADNc de elevado peso
molecular se ligaron al pSV-7 digerido con EcoR
I/Not I, un vector de expresión eucariótico capaz de expresar ADNc
clonado en células de mamíferos mediante transfección (dirigida por
el promotor SV-40) y en ovocitos usando transcritos
in vitro (iniciados desde el promotor de la ARN polimerasa
T7). PSV-7 se construyó remplazando el punto de
clonación múltiple pSG-5 (Stratagene, La Jolla, CA;
Green S. y col., 1988, Nucleic Acid Res. 16:369) por un
punto de clonación múltiple expandido. El complejo ligado
vector:ADNc se transformó en el interior de la cepa de E.
coli DH10B (GIBCO-BRL) mediante electroporación
con una eficiencia de la transformación de 1 x 10^{6} ufp/10 ng
de ADNc bicatenario. La biblioteca contenía aproximadamente 3 x
10^{6} clones independientes, de los que más del 95% tenía
insertos con un tamaño medio de aproximadamente 1,65 kb (intervalo
0,8-2,8 kb). Las reservas de librería no
amplificadas se congelaron en glicerol a -70ºC hasta que fueran
necesarias. Se amplificaron alícuotas de la biblioteca una vez antes
de cribado mediante una modificación de un procedimiento de estado
estable (Kriegler M., en Gene Transfer and Expression: A
Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990). Las reservas de
biblioteca se titularon en placas LB y posteriormente se añadió el
equivalente a 500-100 colonias a 13 ml de medio 2X
YT que contenía agarosa al 0,3% y carbenicilina 100 mg/ml en un tubo
de polipropileno de fondo redondeado de 14 ml (Falcon). La
suspensión bacteriana se enfrió en un baño de hielo húmedo durante 1
hora para solidificar la suspensión, y posteriormente se cultivó en
posición vertical a 37ºC durante 24 horas. Las colonias bacterianas
resultantes se recogieron mediante centrifugación a 2000 x g a TA
durante 10 minutos y se volvieron a suspender en 3 ml de medio 2X
YT/carbenicilina. Se tomaron alícuotas para guardar reservas
congeladas (5%) y para la preparación del ADN plasmídico.
El ADN plasmídico se purificó a partir de
sedimentos de bacterias cultivadas en estado sólido (1000 mezclas
de 500 clones independientes cada una) usando el kit Wizard
Miniprep según las instrucciones del fabricante (Promega Biotech,
Madison, WI). El rendimiento del ADN plasmídico por la amplificación
de 14 ml de mezcla en estado sólido fue de 5-10 mg.
En preparación para la síntesis del ARNc, se digirieron 4 mg de ADN
con Not I, y el ADN linealizado que se obtuvo posteriormente se
purificó de proteínas y de ARNasa mediante tratamiento con
proteinasa K (10 mg durante 1 hora a 37ºC), seguido de dos
extracciones con fenol y dos con cloroformo/alcohol isoamílico y
dos precipitaciones con etanol. El ADN se volvió a suspender en
aproximadamente 15 ml de agua sin ARNasa y se almacenó a -70ºC
hasta que fuera necesario. El ARNc se sintetizó usando un kit de
Promega Biotech con modificaciones. Cada 50 ml de reacción
contenían: 5 ml de plásmido linealizado (aproximadamente 1 mg),
Tris-HCl 40 mM (pH = 7,5), MgCl_{2} 6 mM,
espermidina 2 mM, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, albúmina sérica bovina
0,05 mg/ml, ARNasina 2 unidades/ml, ATP, CTP y UTP 800 mM cada uno
de ellos, GTP 200 mM, m7G(5')ppp(5')G 800 mM, 80
unidades de ARN polimerasa T7 y aproximadamente 20.000 cpm de
^{32}P-CTP como marcador para cuantificar el ARN
sintetizado mediante precipitación con TCA. La reacción se incubó
durante 3 horas a 30ºC; se añadieron 20 unidades de ADNasa libre de
ARNasa, y se permitió que continuara la incubación otros 15 min a
37ºC. El ARNc se purificó mediante dos extracciones con fenol y con
cloroformo/alcohol isoamílico y dos precipitaciones en etanol, y se
volvió suspender a una concentración de 500 ng/ml en agua libre de
ARNasa inmediatamente antes de su uso.
El EBA precisa la inyección de ARNc de la mezcla
de la biblioteca (25 ng/huevo para tamaños de mezcla de 500 a
10.000) con ARNc de aecuorina (2 ng/huevo) suplementado con la
subunidad alfa de la proteína G, G_{a11} (2 ng/huevo). Para
facilitar la estabilización de los transcritos sintéticos de los
plásmidos de aecuorina y G_{a11}, se modificó el vector de
expresión pCDNA-3 (denominado
pCDNA-3v2) mediante inserción (en el punto del
enzima de restricción Apa I del policonector) de una casete para
añadir un tracto poli (A) a todos los ARNc que se inician desde el
promotor de la ARN polimerasa T7. Esta casete incluye (5' a 3'): un
punto Bgl II, pA (20) y un punto Sfi I que se puede usar para
linealizar el plásmido. Se usó la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para generar un fragmento de ADN correspondiente al
marco de lectura abierto (ORF) del ADNc de la aecuorina con una
secuencia optimizada de iniciación de la traducción Kosak (Inouye,
S., y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:3154-3158). Este ADN se ligó en el vector
pCDNA-3v2 linealizado con EcoR I y Kpn I en el
punto EcoR I/Kpn I de pCDNA-3v2. Se eliminó el ADNc
de G_{a11} del vector pCMV-5 en forma de
fragmento Cla I/Not I (Woon, C., y col., 1989, J. Biol.
Chem. 264:5687-5693), se hizo plano con ADN
polimerasa Klenow y se insertó en el punto EcoR V del
pCDNA-3v2. Se inyectó el ARNc en los ovocitos
utilizando el inyector motorizado "Nanoject" (Drummond Sci.
Co., Broomall, PA) en un volumen de 50 nl. Se extrajeron las agujas
de inyección en una sola etapa usando un extractor de micropipetas
Flaming/Brown modelo P-87 (Sutter Instrument Co.) y
se rompieron las puntas utilizando magnificación de 53 aumentos, de
modo que se generaba un ángulo agudo y el diámetro externo de la
aguja era < 3 mm. Después de la inyección se incubaron los
ovocitos en medio ND-96, con agitación orbital suave
a 18ºC a oscuras. Se incubaron los ovocitos durante 24 a 48 horas
(dependiendo del experimento y del tiempo necesario para la
expresión del ARN heterólogo) antes de "cargar" la aecuorina
expresada con el cromóforo esencial celenterazina. Se
"cargaron" los ovocitos con celenterazina transfiriéndolos a
cubetas de 75 mm que contenían 3 ml de medio de carga e incubándolos
durante 2-3 horas con agitación orbital suave a
oscuras a 18ºC. El medio de carga contenía celenterazina 10 mM
(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y glutatión reducido 30 mM en
medio OR-2 (sin calcio). Posteriormente se volvió
incubar a los ovocitos en el medio ND-86 con medio
cálcico que se ha descrito más arriba, y continuó la incubación a
oscuras con agitación orbital hasta que se iniciaron las mediciones
de bioluminiscencia. La medición de la expresión de GHSR en los
ovocitos se realizó usando un luminómetro Berthold Luminometer
LB953 (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) conectado a un PC en el que se
ejecutaba el programa informático Autolumat-PC
Control (Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Los ovocitos (de uno en
uno o por parejas) se transfirieron a tubos de plástico (75 x 12mm,
Sarstedt) que contenían 2,9 ml de medio OR-2 sin
Ca^{2+}. Cada mezcla de ARNc se estudió usando un mínimo de tres
tubos que contenían ovocitos. Las mediciones de bioluminiscencia se
desencadenaron mediante la inyección de 0,1 ml de
MK-677 30 mM (concentración final 1 mM) y se siguió
haciendo el registro durante 2 minutos para observar respuestas
cinéticas compatibles con una respuesta mediada por IP_{3}.
La mezcla S10-20 se preparó a
partir de la biblioteca de ADNc de hipófisis porcina no fraccionada
y estaba compuesta por 10 mezclas de 1000 clones cada una.
S10-20 dio una señal positiva en dos instrumentos de
luminometría y posteriormente se estudió de manera individual la
actividad de las mezclas que lo componen. De las 10 mezclas de 1000
clones, sólo la mezcla S271 dio una respuesta positiva. Esta mezcla
estaba formada por dos mezclas de 500 clones denominadas P541 y
P542. Una vez más, sólo una de esas mezclas, P541, dio una señal
bioluminiscente positiva en presencia del Compuesto A 1 mM. En este
punto se determinó el título bacteriano en la reserva en glicerol
de P541, de modo que las diluciones se podían cultivar en placas de
agar LB que contenían carbenicilina 100 mg/ml para obtener
aproximadamente 50 colonias por placa. Se tomó un total de 1527
colonias y se replicaron a partir de 34 placas. Posteriormente se
separaron mediante lavado las colonias de las placas originales, se
aislaron los plásmidos, se sintetizó el ARNc y se inyectó en los
ovocitos. El ARNc que se preparó a partir de ocho de las 34 placas
dio señales positivas en los ovocitos. Se seleccionaron dos placas
y se cultivaron las colonias individuales de estas placas, se
aislaron los plásmidos, se preparó el ARNc y se inyectó en los
ovocitos. Un solo aislado clonal de cada placa (denominados clones
7-3 y 28-18) dio una respuesta de
bioluminiscencia positiva al Compuesto A 1 mM. Se caracterizó más
el clon 7-3.
El secuenciado del ADN se realizó en las dos
hebras usando un instrumento automatizado Applied Biosystems (ABI
modelo 373) y manualmente mediante el procedimiento de la
terminación de la cadena didesoxi usando el kit Sequenase II (US
Biochemical, Cleveland, OH). Se realizaron búsquedas en bases de
datos (Genbank 88, EMBL-42,
Swiss-Prot 31, PIR 40, dEST, Prosite, dbGPCR),
alineaciones de secuencias y análisis de la secuencia de nucleótidos
y de proteínas de GHSR usando el programa informático GCG Sequence
Analysis Software Package (Madison, WI; programas de alineamiento
múltiple, estructura peptídica y patrones), los programas de
búsqueda FASTA y BLAST, y el programa informático PC/Gene de
Intelligenetics (San Francisco, CA; programas de análisis de
proteínas). Se realizó el análisis mediante transferencia Northern
usando ARNm total (20 mg/calle) o ARNm poli (A)+
(5-10 mg/calle) preparado como se ha descrito más
arriba. El ARN se fraccionó en un gel con agarosa al 1% que
contenía formaldehído 2,2 M y se transfirió a una membrana de
nitrocelulosa. Las transferencias obtenidas mediante transferencia
Southern se hibridaron con una sonda generada mediante PCR que
incluía la mayoría de los ORF predichos por el clon
7-3 (nt 291 a 1132). La sonda se radiomarcó mediante
cebado aleatorio con [a]^{32}P-dCTP hasta
una actividad específica mayor de 10^{9} dpm/mg. Las
transferencias obtenidas mediante transferencia Southern se
prehibridaron a 42ºC durante 4 horas en 5 x SSC, 5 x solución de
Denhardt, ARNt 250 mg/ml, glicina al 1%, SDS al 0,075%, NaPO_{4}
50 mM (pH 6) y formamida al 50%. Las hibridaciones se realizaron a
42ºC durante 20 horas en 5 x SSC, 1 x solución de Denhardt, SDS al
0,1%, NaPO_{4} 50 mM y formamida al 50%. Las transferencias de ARN
se lavaron en 2 x SSC y SDS al 0,2% a 42ºC y a -70ºC. Los
marcadores del tamaño del ARN fueron ARNr 28S y 18S, y marcadores
de ARN transcritos in vitro (Novagen). Se hibridaron
membranas de nylon que contenían ADN genómico digerido con EcoR I y
Hind III de varias especies (Clontech; 10 mg/calle) durante 24
horas a 30ºC en 6 x SSPE, 10 x solución de Denhardt, SDS al 1% y
formamida al 50%. Las transferencias genómicas se lavaron dos veces
con 6 x SSPE a temperatura ambiente, dos veces con 6 x SSPE a 55ºC
y dos veces con 4 x SSPE a 55ºC. Se identificaron otros clones de
GHSR porcino de la biblioteca de ADNc porcino (que se ha descrito
más arriba) mediante hibridación con ADN plasmídico (en mezclas de
500 clones cada una) inmovilizado en membranas de nylon en un
aparato de transferencia lineal (Scheicher y Schuell).
Posteriormente se identificaron aislados clonales puros mediante
hibridación de colonias. Se identificaron los clones de GHSR
porcino que se extienden más en dirección 5' usando procedimientos
5' RACE (Frohman, M.A., 1993, Methods Enzymol.
218:340-358, que se incorpora como bibliografía)
usando como molde ARNm poli (A)^{+} de hipófisis
porcina.
Se obtuvieron homólogos de la hipófisis humana
del GHSR porcino haciendo cribado de una biblioteca de ADNc
disponible comercialmente construida en el vector lambda ZAP II
(Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Inicialmente se
sembraron en placa aproximadamente 1,86 x 10^{6} fagos y se hizo
cribado usando una porción marcada con un cebador aleatorio del clon
porcino 7-3 (que se le ha descrito más arriba) como
sonda de hibridación. Se purificaron en placa 21 clones positivos.
Los insertos de estos clones se eliminaron del bacteriófago y se
insertaron en el fagémido pBluescript II SK mediante coinfección
con un fago cooperador según la descripción del fabricante
(Stratagene). Los clones humanos se caracterizaron como se ha
descrito más arriba para el clon porcino.
Se transfectaron células de mamífero
(COS-7) con plásmidos de expresión de GHSR usando
Lipofectamine (GIBCO-BRL;
Hawley-Nelson, P., 1993, Focus 15:73). Las
transfecciones se realizaron en cubetas de 60 mm en células con una
confluencia de 80% (aproximadamente 4 x 0^{5} células) con 8 mg de
Lipofectamine y 32 mg de ADN plasmídico de GHSR.
Se llevó a cabo la unión del
^{35}S-Compuesto A con membranas y membranas
crudas de hipófisis porcina preparadas a partir de células
COS-7 transfectadas con plásmidos de expresión de
GHSR. Las membranas celulares crudas de transfectantes
COS-7 se prepararon sobre hielo 48 horas después de
la transfección. Cada cubeta de 60 mm se lavó dos veces con 3 ml de
PBS y una vez con 1 ml de tampón de homogenización
(Tris-HCl 50 mM [pH 7,4], MgCl_{2} 5 mM, EDTA 2,5
mM, bacitracina 30 mg/ml). Se añadió 0,5 ml de tampón de
homogenización a cada cubeta, se retiraron las células mediante
raspado y posteriormente se homogenizaron usando un dispositivo
Polytron (Brinkmann, Syosset, NY; 3 ciclos de 10 s con el ajuste
4). Posteriormente se centrifugó el homogenado durante 20 min a
11.000 x g a 0ºC y la pastilla resultante de membranas crudas
(formada principalmente por membranas celulares y núcleos) se
volvió a suspender en tampón de homogenización suplementado con BSA
al 0,06% (0,1 ml/cubeta de 60 mm) y se mantuvo sobre hielo. Las
reacciones de unión se realizaron a 20ºC durante 1 hora en un
volumen total de 0,5 ml que contenía: 0,1 ml de suspensión de
membranas, 10 ml de ^{35}S-Compuesto A (0,05 a 1
nM; actividad específica aproximadamente 900 Ci/mmol), 10 ml de
fármaco competitivo y 380-390 ml de tampón de
homogenización. El radioligando unido se separó mediante filtración
rápida al vacío (recuperador de células de 48 pocillos Brandel) a
través de filtros GF/C pretratados durante 1 hora con
polietilenimina al 0,5%. Después de la aplicación de la suspensión
de membranas al filtro, los filtros se lavaron tres veces con 3 ml
de Tris-HCl 50 mM glacial [pH 7,4], 3 ml de
MgCl_{2} 10 mM, 3 ml de EDTA 2,5 mM y 3 ml de Triton
x-100 al 0,015%, y se cuantificó la radiactividad
unida a los filtros mediante contaje de centelleo. Se define la
unión específica (>90% del total) como la diferencia entre la
unión total y la unión inespecífica que se produce en presencia del
Compuesto A 50 nM no marcado.
El [^{35}S]-Compuesto A se
preparó a partir de un precursor adecuado,
N-[1(R)[(1,2-dihidroespirol[3H-indol-3,4'-piperidin]-1'-il)-carbonil]-2-(fenil-metiloxi)etil]-2-amino-t-butoxicarbonil-2-metilpropanamida,
usando [^{35}S]sulfonil cloruro de metano como se describe
en Dean DC. Y col., 1995, en: Allen J, Voges R (eds.): Synthesis
and Applications of Isotopically Labelled Compounds, John Wiley
& Sons, Nueva York, pág. 795-801. La
purificación mediante HPLC semipreparativa (columna Zorbax de
SB-fenilo, MeOH/agua al 68%, TFA al 0,1%, 5 ml/min)
se siguió con escisión N-t-BOC
usando ácido trifluoroacético al 15% en diclorometano (25ºC, 3
horas) para dar
[metilsulfonil-^{35}S]Compuesto A en un
rendimiento casi cuantitativo. La purificación mediante HPLC
(columna Hamilton PRP-1 4,6x250 mm, gradiente lineal
de 50-75% de metanol-agua con HCl 1
mM durante 30 min, a 1,3 ml/min) proporcionó el ligando con una
pureza radioquímica >99%. La estructura se estableció mediante
coelución mediante HPLC con Compuesto A no marcado y mediante
análisis espectral de masas. Este último procedimiento también
indicó una actividad específica de \sim1000 Ci/mmol.
La hibridación cruzada en condiciones relajadas
fue la estrategia que se utilizó para aislar el GHSR de rata de
tipo Ia. Se sembraron en placa aproximadamente 10^{6} fagos de
una biblioteca de ADNc de hipófisis de rata amplificada una vez en
el fago lambda gtl 1 (RL1051b; Clontech, Palo Alto, CA) en la cepa
de E. coli Y1090r^{-}. Las placas se transfirieron a Nytran
de máxima concentración (Schleicher & Schuell, Keene, NH), se
desnaturalizaron, se neutralizaron y se hizo cribado con un
fragmento EcoRI/NotI de 1,6 kb que contenía todas las regiones
codificadoras y no traducidas del GHSR porcino, clon
7-3. Las membranas se incubaron a 30ºC en solución
de prehibridación (formamida al 50%, 2 x Denhardts, 5 x SSPE, SDS al
0,1%, ADN de espermatozoides de salmón 100 mg/ml) durante 3 horas,
seguido de incubación durante una noche en solución de hibridación
(formamida al 50%, 2 x Denhardts, 5 x SSPE, SDS al 0,1%, sulfato de
dextrano al 10%, ADN de espermatozoides de salmón 100 mg/ml) con
sonda marcada con [^{32}P] 1 x 10^{6} cpm/ml. La sonda se marcó
con [^{32}P]dCTP usando un kit de cebado aleatorio (Gibco
BRL, Gaithersburg, ND). Después de la hibridación las transferencias
se lavaron dos veces con 2 x SCC y con SDS al 0,1% (a 24ºC,
posteriormente a 37ºC y finalmente a 55ºC). Se aisló un solo clon
positivo después de tres ciclos de purificación en placa. El fago
que contenía el GHSR se eluyó de las placas con 1 x tampón lambda
(NaCl al 0,1%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,01 M,
Tris-HCl 35 mM, pH 7,5) después del cultivo durante
una noche de aproximadamente 200 ufp/cubeta de 150 mm. Después de la
centrifugación durante 10 min a 10.000 x g para eliminar los
detritus, la solución de fagos se trató con ARNasa A 1 mg/ml y
ADNasa I 1 mg/ml durante 30 minutos a 24ºC, seguido de precipitación
con PEG al 20% (8000)/NaCl 2 M durante 2 horas sobre hielo, y la
recogida mediante centrifugación a 10.000 x g durante 20 minutos.
El ADN de los fagos se aisló mediante incubación en SDS al 0,1%,
EDTA 30 mM y proteinasa K 50 mg/ml durante una hora a 68ºC, con una
posterior extracción con fenol (tres veces) y cloroformo (dos
veces) antes de la precipitación en isopropanol durante una noche.
El inserto de ADN del GHSR (\sim6,4 kb) se subclonó a partir del
fago lambda gtl 1 en el vector plasmídico Litmus 28 (New England
Biolabs, Beverly, MA). Se calentaron 2 mg de ADN de fago hasta 65ºC
durante 10 minutos, posteriormente se digirieron con 100 unidades de
BsiWI (New England Biolabs, Beverly, MA) a 37ºC durante una noche.
Se purificó en gel un fragmento de 6,5 kb, se electroeluyó y se
extrajo con fenol/cloroformo antes de su ligación al vector Litmus
28 digerido con BsiWI.
Se secuenciaron las dos hebras del ADN
bicatenario en un secuenciador automatizado ABI 373 usando el kit
de reacción rápida de secuenciado mediante tinción del ciclo de
terminación (Perkin Elmer; Foster City, CA).
La comparación del ORF completo que codifica la
secuencia proteica del GHSR de rata de tipo I con los GHSR
homólogos humano y porcino revela un alto grado de identidad de
secuencia (rata frente a ser humano, 95,1%; rata frente a porcino,
93,4%).
Para las comparaciones de las secuencias y los
estudios de expresión funcional se generó un fragmento de ADN
contiguo que codificaba todo el ORF (desprovisto de una secuencia
interpuesta) para el GHSR de tipo I de rata. Se utilizó PCR para
sintetizar un fragmento aminoterminal desde Met-1 a
Val-260 con puntos de restricción añadidos EcoR I
(5') y Hpa I (3'), mientras que se generó un fragmento
carboxiterminal desde Lys-261 hasta
Thr-364 con puntos de restricción añadidos Dra I
(5') y Not I (3'). El constructo del ORF se ensambló en el vector
de expresión en mamíferos pSV7 mediante ligación de tres vías con
pSV7 digerido con EcoR I/Not I, con el fragmento
NH_{2}-terminal digerido con EcoR I/Hpa I, y con
el fragmento C-terminal digerido con Dra I/Not
I.
Se evaluó la actividad funcional del constructo
del ORF mediante la transfección (usando Lipofectamine;
GIBCO/BRL) de 5 mg de ADN plasmídico en la línea de células indicadoras que expresan aecuorina (293-AEQ17) cultivadas en cubetas de 60 mm. Después de aproximadamente 40 horas de expresión se cargó la aecuorina de las células con celenterazina durante 2 horas, se recuperaron las células, se lavaron y se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad en tubos de luminómetro. Se determinó la actividad funcional midiendo la movilización de calcio celular dependiente del Compuesto A y la bioluminiscencia de la aecuorina simultánea inducida por calcio. En la Figura 26 se muestran tres muestras repetidas que muestran respuestas luminiscentes inducidas por el Compuesto A.
GIBCO/BRL) de 5 mg de ADN plasmídico en la línea de células indicadoras que expresan aecuorina (293-AEQ17) cultivadas en cubetas de 60 mm. Después de aproximadamente 40 horas de expresión se cargó la aecuorina de las células con celenterazina durante 2 horas, se recuperaron las células, se lavaron y se sedimentaron mediante centrifugación a baja velocidad en tubos de luminómetro. Se determinó la actividad funcional midiendo la movilización de calcio celular dependiente del Compuesto A y la bioluminiscencia de la aecuorina simultánea inducida por calcio. En la Figura 26 se muestran tres muestras repetidas que muestran respuestas luminiscentes inducidas por el Compuesto A.
Claims (12)
1. Un receptor aislado de secretagogo de la
hormona del crecimiento que comprende una secuencia de aminoácidos
como la que se presenta en la Figura 3, 7, 12, 22 ó 25.
2. Un receptor de secretagogo de la hormona del
crecimiento, libre de proteínas asociadas al receptor, que
comprende una secuencia de aminoácidos como la que se presenta en la
Figura 3, 7, 12, 22 ó 25.
3. Un receptor según la reivindicación 1 ó 2 que
es porcino y que comprende la secuencia que se presenta en la
Figura 3.
4. Un receptor según la reivindicación 1 ó 2 que
es humano y que comprende la secuencia que se presenta en la
Figuras 7, 12 ó 22.
5. Un receptor según la reivindicación 1 ó 2 que
es de rata y que comprende la secuencia que se presenta en la
Figura 25.
6. Un ácido nucleico aislado del receptor de la
hormona del crecimiento que codifica una secuencia de aminoácidos
como la que se presenta en la Figura 3, 7, 12, 22 ó 25.
7. Un ácido nucleico porcino según la
reivindicación 6 que comprende la secuencia de nucleótidos que se
presenta en la Figura 1.
8. Un ácido nucleico humano según la
reivindicación 6 que comprende una secuencia de nucleótidos que se
presenta en la Figura 6 u 11.
9. Un ácido nucleico de rata según la
reivindicación 6 que comprende una secuencia de nucleótidos que se
presenta en la Figura 23 ó 24
10. Un vector que comprende un ácido nucleico
como el que se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a
9.
11. Un vector según la reivindicación 10 que es
un plásmido, un virus modificado, un cromosoma artificial de
levadura, un bacteriófago, un cósmido o un elemento
transponible.
12. Una célula huésped que comprende un vector
como el que se define en la reivindicación 10 u 11.
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