JP2002522058A - イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体 - Google Patents

イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体

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JP2002522058A
JP2002522058A JP2000564988A JP2000564988A JP2002522058A JP 2002522058 A JP2002522058 A JP 2002522058A JP 2000564988 A JP2000564988 A JP 2000564988A JP 2000564988 A JP2000564988 A JP 2000564988A JP 2002522058 A JP2002522058 A JP 2002522058A
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ホワード，アンドリュー，ディー．
パリハ，オクサマ，シー．
スミス，ロイ，ジー．
タン，カリーナ，ピー．
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メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体(GHSR)タンパク質をコードする、新規のイヌcDNA配列を提供する。また、新規cDNA配列によってコードされるイヌGHSRタンパク質も提供する。組換え系においてイヌGHSRタンパク質を発現する方法を提供する。さらに、イヌGHSRのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体をコードする新規のイヌDNA
配列、および該DNAによってコードされるタンパク質に関する。
【０００２】発明の背景 成長ホルモン(GH)とは、哺乳動物の正常な成長、体重増加および身体全体の窒
素保持を促進することが可能な同化ホルモンである。GHは、２つの視床下部ホル
モン、すなわち成長ホルモン放出因子（GHRFまたはGRF）およびソマトスタチン
との協調的な調節下で、主に下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞から放出される
と考えられる。成長ホルモン分泌細胞の細胞膜上で受容体が特異的に結合するこ
とによって、GH放出のGHRFによる刺激とソマトスタチンによる阻害とが起こる。
【０００３】 GHの放出は、成長ホルモン放出ペプチド(GHRP)または成長ホルモン分泌促進物
質として知られる一群の短ペプチド類によっても刺激される。GHRPの中では、GH
RP-2（ヘキサレリンhexarelin）およびGHRP-6について、例えば、米国特許第 4,
411,890号、PCT 特許公開第 WO89/07110号、PCT 特許公開第WO89/07111号、PCT
特許公開第 WO93/04081号およびJ. Endocrinol Invest., 15 (Suppl 4), 45 (19
92)に記載されている。GHRPは、特定の分泌細胞膜受容体、すなわち成長ホルモ
ン分泌促進物質受容体(GHSR)と選択的に結合することにより機能する。医化学的
研究の結果、ヒトGHSRと特異的に結合し、GHを拍動的に放出させる、経口活性で
低分子量の非ペプチド化合物が数種類提案された。成長ホルモン分泌促進活性を
有するこれらの化合物は、例えば以下のような文献において開示されている（米
国特許第3,239,345号、米国特許第 4,036,979号、米国特許第4,411,890号、米国
特許第 5,206,235号および米国特許第5,283,241号）。
【０００４】 GHSRと関連しGHの拍動性放出を刺激する経口活性剤の使用は、子供および成人
の成長ホルモン欠乏症の治療における重要な進歩であり、GHの同化作用が臨床的
に利用可能な環境においては実質的利益をもたらす（例えば、骨盤骨折後リハビ
リテーション、老人性虚弱、および術後回復期の患者など）。こうした経口活性
剤のその他の用途も、時に見出されている。例えば、Copinschiら, 1997, Neuro
endocrinol. 66:278-286では、非ペプチド成長ホルモン分泌促進物質MK-677を使
用した治療により、睡眠の質が向上することが示されている。
【０００５】 非ヒト種から得られるGHSRが供給されれば、前述のヒト疾患に類似した動物病
状に対する動物用医薬として使用できる、新規の薬剤を開発することが可能とな
る。
【０００６】発明の概要 本発明は、イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体(GHSR)をコードする、新規の
イヌDNAに関する。イヌGHSRをコードするこのDNAは、他の核酸を実質的に含まず
、配列番号１の塩基配列を有する。本発明はまた、新規DNA配列によってコード
されるイヌGHSRタンパク質を提供する。このイヌGHSRタンパク質は他のタンパク
質を実質的に含まず、配列番号２のアミノ酸配列を有する。さらに、組換え系で
イヌGHSRタンパク質を発現する方法、ならびにイヌGHSRのアゴニストおよびアン
タゴニストを同定する方法を提供する。
【０００７】発明の詳細な説明 本発明における定義として、 「他のタンパク質を実質的に含まない」とは、少なくとも90％、好ましくは95
％、さらに好ましくは99％、さらに一層好ましくは99.9％、他のタンパク質を含
まないことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含まないイヌGH
SRタンパク質調製物は、その全タンパク質に基づく割合で、10％以下、好ましく
は5％以下、さらに好ましくは1％以下、さらに一層好ましくは0.1％以下の非イ
ヌGHSRタンパク質を含む。所与のイヌGHSRタンパク質調製物が他のタンパク質を
実質的に含まないかどうかは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を、例えば銀染色法または免疫ブロット法などの適切
な検出方法と組み合わせて使用するなどの、タンパク質の純度を評価するための
定法に従って判定することが可能である。
【０００８】 「他の核酸を実質的に含まない」とは、少なくとも90％、好ましくは95％、さ
らに好ましくは99％、さらに一層好ましくは99.9％、他の核酸を含まないことを
意味する。したがって、他の核酸を実質的に含まないイヌGHSR DNA調製物は、そ
の全核酸に基づく割合で、10％以下、好ましくは5％以下、さらに好ましくは1％
以下、さらに一層好ましくは0.1％以下の非イヌGHSR核酸を含む。所与のイヌGHS
R DNA調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかは、例えばアガロースゲル
電気泳動を、臭化エチジウム染色法等の適切な染色方法と組み合わせて使用する
といった核酸の純度を評価するための定法に従うか、または配列決定によって判
定することが可能である。
【０００９】 ポリペプチドが、MK-677、GHRP-6、L-692,429等のイヌGHSRタンパク質のリガ
ンドに対してKdを有し、そのKdが配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌGHSRタ
ンパク質の同じリガンドに対するKdの５倍以下である場合には、そのポリペプチ
ドは、イヌGHSRタンパク質と「実質的に同じ生物学的活性」を有する。
【００１０】 「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した別の
アミノ酸残基によって置換されることを意味する。これらの保存的アミノ酸置換
の例としては、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン
）の別の疎水性残基による置換、極性残基の同じ電荷の別の極性残基による置換
（リジンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換等
）、芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）の別
の芳香族アミノ酸による置換などが挙げられる。
【００１１】 本発明は、イヌGHSRをコードするcDNAの同定およびクローニングに関する。本
発明は、配列番号１を含み、他の核酸を実質的に含まないDNA分子を包含する。
【００１２】 本発明のイヌGHSRをコードする新規DNA配列は、全体または一部において、他
のDNA配列、すなわち、イヌGHSRをコードするcDNAが自然状態では結合していな
いDNA配列と結合し、「組換えDNA分子」を形成することが可能である。これら他
のDNA配列としては、翻訳開始配列、RNAポリメラーゼIIプロモーター、転写もし
くは翻訳終結配列、エンハンサー配列、微生物の複製を調節する配列、抗生物質
耐性を付与する配列、またはポリヒスチジントラクトやmycエプトープ等のポリ
ペプチド「タグ」をコードする配列などの、転写や翻訳を調節するDNA配列を挙
げることができる。本発明の新規DNA配列は、プラスミド、コスミド、ウイルス
性ベクター、P1人工染色体、または酵母人工染色体等のベクターに挿入すること
が可能である。したがって本発明は、配列番号１を含む組換えDNA分子を包含す
る。
【００１３】 本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズするDNA
配列を包含する。例としては、高ストリンジェントな条件を利用する以下のよう
な方法を挙げることができるが、これに限るわけではない。：6× SSC、5×デン
ハルト溶液、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなるバッファー中、65℃で２
時間から一夜、DNAを含むフィルターの前ハイブリダイゼーション (prehybridiz
ation)を行なう。100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5-20×106cpmの32P標識プロ
ーブを含む前ハイブリダイゼーション混合液中で、フィルターを、65℃で12時間
から48時間ハイブリダイズする。2×SSC、0.1％SDSを含む溶液中、37℃で1時間
、フィルターを洗浄する。続いて0.1×SSC、0.1％SDS溶液中、50℃で45分間洗浄
し、次にオートラジオグラフィーを行なう。
【００１４】 高ストリンジェントな条件を利用するその他の方法としては、5×SSC、5×デ
ンハルト溶液、50％ホルムアミドからなるバッファー中、42℃で12時間から48時
間ハイブリダイゼーションを行なうか、または0.2×SSPE、0.2％SDSを含む溶液
中、65℃で30分から60分洗浄する方法等が挙げられる。
【００１５】 高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行なう前記方法で挙げた試薬
は、当業界で周知である。これら試薬の組成の詳細については、例えば、Sambro
ok, Fritschおよび Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。上記以外
の、使用可能なその他の高ストリンジェントな条件についても、当業界では周知
である。
【００１６】 遺伝暗号の縮重とは、２種類の例外アミノ酸を除き、特定のアミノ酸をコード
するコドンが複数あることを指す。これにより、合成DNAの塩基配列が配列番号
１の塩基配列と相当異なっていても、その合成DNAが配列番号１と同じイヌGHSR
タンパク質をコードする限り、イヌGHSRタンパク質をコードする合成DNAを構築
することが可能となる。それらの合成DNAもまた本発明の範囲に含まれる。
【００１７】 本発明に含まれるその他のDNA配列としては、最後の３つのヌクレオチド（停
止コドンTGA）が異なっている以外は配列番号１に同一のDNA配列が挙げられる。
特に配列番号１の停止コドンは、その他の停止コドン（TAAまたはTAG）に置き換
えることができる。
【００１８】 本発明の別の態様は、イヌGHSRタンパク質をコードするDNA配列を含む、およ
び／または発現するように操作された宿主細胞である。イヌGHSRタンパク質を作
製するために、この組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することが可能である
。組換え宿主細胞内でイヌGHSRタンパク質を発現させるために、イヌGHSRタンパ
ク質をコードするDNAを含む発現ベクターを使用することが可能である。組換え
宿主細胞としては、大腸菌等の細菌、酵母等の菌類細胞を含む原核生物または真
核生物、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯動物由来の細胞系を含む哺乳動物細
胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系を含む昆虫細胞を使用
してもよいが、これらに限定されるわけではない。イヌGHSRタンパク質の組換え
発現に適していて、商業上利用可能な哺乳動物種由来の細胞系としては、L細胞L
-M(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L-M (ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、Raji
(ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1
651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeL
a(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)およびMRC-5 (ATC
C CCL 171)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】 哺乳動物細胞内で組換えイヌGHSRを発現するためには、さまざまな哺乳動物発
現ベクターが使用できる。適切な商業上利用可能な哺乳動物発現ベクターには、
pMC1neo(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、pcDNAIおよびpcDNAIamp、pcDNA3、pc
DNA3.1、pCR3.1(Invitrogen)、EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1(8-2)(ATCC 3
7110)、pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(
ATCC 37198)ならびにpSV2-dhfr(ATCC 37146) などが非限定的に挙げられる。組
換え細胞内でイヌGHSRタンパク質が発現した後、定法に従ってこのタンパク質を
、他のタンパク質を実質的に含まないレベルにまで精製することが可能である。
【００２０】 本発明は、他のタンパク質を実質的に含まないイヌGHSRタンパク質を包含す
る。完全長イヌGHSRタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２として図２に示す
。よって本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有する、他のタンパク質を実質
的に含まないイヌGHSRタンパク質を包含する。
【００２１】 イヌGHSRタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）は、イヌGHSRタンパク質が
Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）に特徴的な性質を多く含んでいることを示し
ている。すなわち、 (a)７つの膜貫通ドメイン、 (b)３つの細胞内ループ、 (c)３つの細胞外ループ、および (d)GPCRトリプレットシグナル(triplet signature)配列 である。
【００２２】 多くのタンパク質と同様に、イヌGHSRタンパク質の場合も、元のタンパク質と
実質的に同一の生物学的活性を保持したまま、アミノ酸を幾つも改変することが
可能である。こうして本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有しながら
、なおイヌGHSRと実質的に同一の生物学的活性を保持する改変型イヌGHSRタンパ
ク質を包含する。アミノ酸を１つ置換しても、一般にタンパク質の生物学的活性
に変化は生じないとされている（Molecular Biology of the Gene, Watsonら, 1
987, 第四版, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., 226頁；Cunningh
am & Wells, 1989, Science 244: 1081-1085等を参照）。したがって本発明は、
配列番号２においてアミノ酸１つが置換されたポリペプチドであって、イヌGHSR
タンパク質と実質的に同じ生物学的活性をなお保持するポリペプチドを包含する
。さらに本発明は、配列番号２においてアミノ酸が２つ以上置換されたポリペプ
チドであって、イヌGHSRタンパク質と実質的に同じ生物学的活性をなお保持する
ポリペプチドを包含する。特に本発明は、ヒト、ラット、ブタおよびイヌの、４
つのGHSRすべてが同じアミノ酸（図３参照）を共有する位置には置換が生じず、
さらにタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌGHSRと実質的に同じ
生物学的活性を有する、２つ以上のアミノ酸置換を含むイヌGHSRポリペプチドを
包含する。特に本発明は、前記の置換が保存的置換である実施形態を包含する。
特に本発明は、前記の置換がリガンド結合ドメインでは生じない実施形態を包含
する。
【００２３】 本発明のイヌGHSRタンパク質は、共有結合される炭水化物、リン酸化チロシン
等の翻訳後修飾を含んでもよい。
【００２４】 また本発明は、キメライヌGHSRタンパク質を包含する。キメライヌGHSRタンパ
ク質は、非イヌGHSRタンパク質のポリペプチド配列に融合された、イヌGHSRタン
パク質の少なくとも一部の連続ポリペプチド配列からなる。例えば、Ｇタンパク
質と枠内でＣ末端融合された、イヌGHSRタンパク質のＮ末端ドメインおよび７つ
の膜貫通スパンニング(spanning)ドメインは、キメライヌGHSRタンパク質である
。
【００２５】 さらに本発明は、２量体等の多量体構造形態のイヌGHSRタンパク質を包含する
。かかるＧタンパク質結合受容体の多量体は、その他にも公知である（Hebertら
, 1996, J. Biol. Chem. 271, 16384-16392、Ngら, 1996, Biochem. Biophys. R
es. Comm. 227, 200-204、Romanoら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 28612-28616
）。
【００２６】 また本発明は、イヌGHSRタンパク質の単離形体を包含する。「単離されたイヌ
GHSRタンパク質」とは、天然源から単離されたイヌGHSRタンパク質を意味する。
「単離された」という用語を使用した場合は、イヌGHSRタンパク質が通常の細胞
環境から取り出されたものであることを意味する。したがって、単離されたイヌ
GHSRタンパク質は、無細胞溶液内に存在しても、また自然に発生した細胞環境と
は異なる細胞環境に置かれてもよい。単離されたという語は、単離されたイヌGH
SRタンパク質が、タンパク質だけからなることを意味するのではなく、このタン
パク質が少なくとも95％であって、イヌGHSRタンパク質と自然界で関連している
非アミノ酸物質（核酸、脂質、炭水化物等）を含まないことを意味する。したが
って、組換え発現するイヌGHSRタンパク質は、細菌において、または真核細胞内
においてさえ自然には（すなわち、ヒトが介在する場合を除いては）発現しない
「単離されたイヌGHSRタンパク質」であるということを意味する。
【００２７】 完全長イヌGHSRタンパク質をコードするcDNA断片は、ポリ(A)＋mRNA（視床下
部または下垂体由来）から構築されるイヌcDNAライブラリーから、適切なプライ
マー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して単離することが可能であ
る。これらのプライマー対は、配列番号１として図１に示したイヌGHSRのcDNA配
列に基づいて選択することが可能である。適切なプライマー対としては、例えば
、 ATGCGGAACGCGACGGCC（配列番号３）および TCATGTATTAATACTTAG（配列番号４）がある。 上記のプライマーによって、完全cDNAの増殖が可能となる。これらのプライマー
は一例にすぎない。その他の適切なプライマーも、当業者にとっては明らかであ
る。
【００２８】 PCR反応は、AmpliTaq、AmpliTaq GoldまたはVentポリメラーゼ等を非限定的に
含む、種々の熱安定酵素を使用して行なうことができる。AmpliTaqの場合、反応
は、10mM Tris-Cl(pH8.3)、2.0mM MgCl2、200μMの各dNTP、50mM KCl、0.2μMの
各プライマー、10ngのDNA鋳型、0.05単位/μlのAmpliTaq中で行なうことが可能
である。反応物を95℃で３分加熱した後、95℃で20秒、62℃で20秒、72℃で３分
の繰返し条件で、このサイクルを35回繰り返した。このような条件に加えて、PC
R Primer, A Laboratory Manual, C.W. DieffenbachおよびG.S.Dveksler編, 199
5, Cold Spring Harbor Laboratory Pressや、PCR Protocols: A Guide to Meth
ods and Applications, Michael ら編, 1990, Academic Pressには、適当なPCR
プロトコルが多種多様に記載されている。
【００２９】 当業界での定法を使用して、ベクターpcDNA-3.1 (Invitrogen, San Diego, C
A)等の適当なベクターにクローン化したイヌ視床下部ポリ(A)+mRNAから構築され
る適するcDNAライブラリーから、イヌGHSRをコードするクローンを単離すること
が可能である。こうしたライブラリーの１次クローンを、それぞれ約20,000のク
ローンを含むプールに副分割することが可能であり、各プールを個別に増殖する
ことが可能である。
【００３０】 これにより、アミノ酸349個（配列番号２）のオープンリーディングフレーム
をコードするcDNA断片を得ることが可能である。このcDNA断片は、適当なクロー
ニングベクターまたは発現ベクターにクローン化することが可能である。例えば
、この断片は、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA)に
クローン化することが可能である。次に、イヌGHSRまたはその一部をコードする
発現ベクターを適当な宿主細胞に移入し、適切な条件下で宿主細胞を増殖するこ
とによって、イヌGHSRタンパク質を作製できる。その後、イヌGHSRタンパク質を
定法によって単離する。
【００３１】 前記のPCR法に代わる方法として、イヌGHSRに特異なオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして使用し、当業界に周知のcDNAライブラリーを該オリゴヌクレオチド
プローブを使用してスクリーニングし、cDNAライブラリーからイヌGHSRタンパク
質をコードするcDNAを単離することが可能である。こうした方法については、例
えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Glover, D.M. 編, 19
85, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., I,
II巻などに記載されている。イヌGHSRに特異で、cDNAライブラリーのスクリー
ニングに使用可能なオリゴヌクレオチドは、配列番号１として図１に示すイヌGH
SRのcDNA配列に基づいて容易に設計でき、当業界に周知の方法で合成可能である
。
【００３２】 イヌGHSR遺伝子を含むゲノムクローンは、ストラタジーン社製イヌλゲノムDN
Aライブラリー(カタログ番号946802)等の、市販イヌゲノムライブラリーから入
手可能である。あるいは、特にP1人工染色体ベクター中にイヌゲノムライブラリ
ーを作製してもよく、それから、本明細書中で開示するイヌGHSR配列に基づくプ
ローブを使用して、イヌGHSRを含むゲノムクローンを単離することも可能である
。こうしたライブラリーを作製する方法は、当業界では公知である (Ioannouら,
1994, Nature Genet. 6:84-89)。
【００３３】 また本発明は、イヌGHSR遺伝子の単離、または他種からのGHSR遺伝子の単離に
使用することが可能な配列番号１に基づくオリゴヌクレオチドを提供する。特に
本発明は、配列番号１に記載の、少なくとも18個の連続するヌクレオチドを含む
DNAオリゴヌクレオチドを包含する。さらに本発明は、それらに対応するRNAオリ
ゴヌクレオチドを提供する。DNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチ
ドは、キット形式に包装することが可能である。
【００３４】 本発明は、さまざまなタイプの細胞におけるイヌGHSRタンパク質の組換え発現
を可能にする。かかる組換え発現は本タンパク質の研究を可能とし、それにより
本タンパク質の作用の生化学的機構や、生理学的役割が明らかにされた。したが
って本発明は、イヌGHSRタンパク質を発現する方法であって、 (a)イヌGHSRタンパク質をコードする発現ベクターで、宿主細胞をトランスフ
ェクトし、および (b)イヌGHSRタンパク質が発現する条件下で、ステップ(a)のトランスフェクト
した細胞を培養する ことを含んでなる該方法を包含する。
【００３５】 特定の実施形態として、該宿主細胞は真核細胞である。その他の実施形態とし
て、該宿主細胞は哺乳動物細胞である。さらにその他の実施形態として、該宿主
細胞はCOS細胞、その中でも特にCOS-7細胞(ATCC CRL 1651)、またはメラニン保
有細胞である。
【００３６】 また本発明は、イヌGHSRタンパク質のＣ末端切除形、特に該受容体の細胞外部
分は含むが、細胞内シグナリング部分を欠く、Ｃ末端切除形を包含する。このよ
うな切除型受容体は、本明細書中に開示した、結晶研究および構造活性相関の研
究に関する、種々の結合アッセイにおいて有用である。
【００３７】 受容体の機能を抑制するため、受容体タンパク質の膜スパンニング領域が使用
可能な場合のあることが知られている (Ngら, 1996, Biochem. Biophys. Res. C
omm. 227:200-204；Hebertら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 16384-16392; Lofts
ら, Oncogene 8:2813-2820)。よって本発明は、イヌGHSRタンパク質の７つの膜
スパンニング領域由来のペプチド、およびイヌGHSRの機能を抑制するための該ペ
プチドの使用を提供する。こうしたペプチドは受容体膜スパンニングドメインの
全体または一部を包含することが可能である。
【００３８】 本発明により、イヌGHSRタンパク質の生物学的活性を測定するアッセイを開発
することが可能である。組換え発現したイヌGHSRタンパク質を利用するこのアッ
セイは、特に興味深いものである。イヌGHSRタンパク質活性に関するアッセイは
、化合物のライブラリーまたはその他の化合物源をスクリーニングし、イヌGHSR
タンパク質活性の活性化剤又は阻害剤候補化合物を同定するために使用できる。
こうして同定された化合物は、イヌGHSRタンパク質の不適切な活性が関与した病
気に罹患した犬の治療に使用される、獣医用医薬の開発のためのいわば「糸口(l
eads)」として使用することが可能である。前記アッセイのタイプでは、イヌGHS
Rタンパク質変異体を使用し、そのイヌGHSRタンパク質変異体の有する活性の活
性化剤又は阻害剤を発見する。
【００３９】 一般的に、こうしたアッセイは、 (a)宿主細胞内で、イヌGHSRタンパク質またはイヌGHSRタンパク質変異体を組
換えて発現させ、および (b)イヌGHSRタンパク質またはイヌGHSRタンパク質変異体の活性化剤又は阻害
剤候補物質の存在下および不在下で、イヌGHSRタンパク質またはイヌGHSRタンパ
ク質変異体の生物学的活性を測定する ことを含み、 イヌGHSRタンパク質またはイヌGHSRタンパク質変異体の活性化剤又は阻害剤候
補物質の存在下での該タンパク質の生物学的活性と、該物質の不在下での該タン
パク質の生物学的活性とを比較したときの該生物学的活性の変化に基づき、該物
質が該タンパク質の活性化剤であるか、または阻害剤であるかを示すとすること
を含むものである。
【００４０】 イヌGHSRタンパク質の生物学的活性は、宿主細胞における種々の変化、すなわ
ち、細胞内カルシウムの増加、カリウムチャンネルの脱分極および阻害、イノシ
トール三リン酸濃度、またはプロテインキナーゼCの活性増加などを測定して評
価できる (Howardら, 1996, Science 273:974-977)。
【００４１】 本発明が提供したcDNA(配列番号１)および当業界周知の方法を使用することに
よって、イヌGHSRタンパク質をコードする相補的リボ核酸 (cRNA)を作製するこ
とが可能である。このcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、該卵母細胞
内でイヌGHSRタンパク質を発現させることが可能である。次にこの卵母細胞を、
イヌGHSRタンパク質のアゴニスト候補物質に曝露することが可能である。この物
質が実際にアゴニストである場合には、カルシウムによって活性化される塩化物
流の振動的増加が生じる。このような方法で、イヌGHSRのアゴニストを同定する
ことが可能である。本アッセイの感度を向上させるため、該卵母細胞にイヌGHSR
タンパク質をコードするcRNAの注入に加えて、生物発光性Ca2+感受性タンパク質
エクオリンをコードするcRNAおよびGαサブユニット（例えばGα11等）をコード
するcRNAを注入することも可能である。その他のGPCRのアゴニストに関するアッ
セイ方法も当業界では公知である（Howardら, 1996, Science 273:974-977等を
参照）。
【００４２】 イヌGHSRタンパク質へのアフィニティーを示す化合物の結合特異性は、クロー
ン化受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜への化合物のア
フィニティーを測定することによって評価できる。クローン化された受容体の発
現、ならびにイヌGHSRに結合する化合物およびイヌGHSRの公知の標識リガンドと
組換え細胞またはこれら細胞から作製された膜との結合を阻害する化合物のスク
リーニングは、イヌGHSRへの高いアフィニティーを有する化合物を迅速に選択す
る効果的な方法となる。こうした化合物を標識する必要は必ずしもなく、結合標
識化合物の代わりとして使用可能な、または機能性アッセイにおける活性化剤と
して使用可能な非標識化合物を使用することもまた可能である。前記方法で同定
された化合物は、イヌGHSRのアゴニストまたはアンタゴニストであると考えられ
、それらはペプチド、タンパク質、または非タンパク質有機分子であってもよい
。
【００４３】 したがって本発明は、イヌGHSRアゴニストおよびアンタゴニストを同定するア
ッセイを包含する。その他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定す
る類似した方法が当業界では周知であり、これら方法をイヌGHSRのアゴニストお
よびアンタゴニストを同定するために採用することが可能である。例えば、Casc
ieriら, 1992, Molec. Pharmacol. 41:1096-1099は、ラットニューロキニン受容
体に結合するアゴニストを阻害する物質、すなわちニューロキニン受容体の潜在
的なアゴニストまたはアンタゴニストになる物質の同定法について記載している
。この方法は、COS細胞をラットニューロキニン受容体を含有する発現ベクター
でトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞をニューロキニン受容体が発
現するのに十分な時間増殖させ、そのトランスフェクトした細胞を回収し、ニュ
ーロキニン受容体の公知の放射性標識アゴニストを含むアッセイバッファー中で
、該物質の存在下および不在下でその細胞を再懸濁し、その後、ニューロキニン
受容体の放射性標識した公知のアゴニストとニューロキニン受容体との結合を測
定することに関連している。該物質の存在下での公知のアゴニストの結合量が、
該物質の不在下での結合量よりも少ない場合は、該物質はニューロキニン受容体
の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００４４】 したがって本発明は、ある物質がイヌGHSRの潜在的なアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるか否かを判定する方法であって、 (a)細胞を、イヌGHSRをコードする発現ベクターでトランスフェクトし、 (b)トランスフェクトした細胞を、イヌGHSRが発現するのに十分な期間、増殖
させ、 (c)トランスフェクトした細胞を回収し、該物質の存在下および不在下で、イ
ヌGHSRの公知の放射性標識アゴニストの存在中に再懸濁し、および (d)該標識アゴニストとイヌGHSRとの結合を測定する ことを含み、 該物質の存在下における公知のアゴニストとイヌGHSRとの結合量が、該物質の不
在下よりも少ない場合に、該物質がイヌGHSRの潜在的なアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるとする該方法を包含する。
【００４５】 前記方法の１つの変法として、細胞をイヌGHSRを含む発現ベクターで安定的に
トランスフェクトするステップ(b)の変更がある。前記方法の別の変法として、
細胞を回収、再懸濁せず、むしろ細胞を組織培養プレートなどの基層(substratu
m)に付着させながら公知の放射性標識アゴニストと該物質を接触させるステップ
(c)の変更がある。
【００４６】 前記方法のステップ(c)を行なう条件は、タンパク質リガンド相互作用研究の
ため当業界で慣用される条件であり、たとえば、生理学的pH、PBS等の常用バッ
ファーに代表される緩衝液または組織培養培地における塩条件、約4〜約55℃の
温度などである。
【００４７】 また本発明は、ある物質がイヌGHSRに結合可能か否か、すなわちその物質がイ
ヌGHSRの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを判定する方法
を包含しており、この方法は、 (a)細胞を、その細胞内にイヌGHSRを発現させる発現ベクターでトランスフェ
クトすることによって、被検細胞を供給し、 (b)被検細胞を該物質へ曝露し、 (c)被検細胞における該物質とイヌGHSRとの結合量を測定し、および (d)被検細胞における該物質とイヌGHSRとの結合量を、イヌGHSRでトランスフ
ェクトしていない同一細胞と該物質との結合量と比較する ことを含む。
【００４８】 該物質と被検細胞との結合量が該物質と対照細胞との結合量を上回る場合に、
該物質はイヌGHSRに結合可能であるとし、イヌGHSRのアゴニストまたはアンタゴ
ニストである可能性があるとする。その物質が実際にアゴニストまたはアンタゴ
ニストであるか否かの判定は、前記およびHoward ら, 1996, Science 273:974-9
77に記載されているアフリカツメガエル卵母細胞アッセイ、または後に記載する
交雑Ｇタンパク質を使用するアッセイなどの、機能性アッセイを用いることで可
能である。
【００４９】 前記方法のステップ(b)を行なう条件は、タンパク質リガンド相互作用検討に
慣用される条件であり、すなわち、生理学的pH、PBS等の通常使用されるバッフ
ァーに代表される緩衝液や組織培養培地における塩条件、約4〜約55℃の温度な
どである。
【００５０】 前記方法の１つの変法として、本発明は、ある物質がイヌGHSRに結合可能か否
かを判定する方法を包含していて、この方法は、 (a)細胞中でのイヌGHSRの発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフ
ェクトすることによって、被検細胞を準備し、 (b)被検細胞内で公知のイヌGHSRリガンドとイヌGHSRを結合させる条件下で、
その被検細胞をそのイヌGHSRリガンドへ曝露し、 (c)ステップ(b)の後に、または同時に、被検細胞を、イヌGHSRに結合可能と疑
われる物質へ曝露し、 (d)該物質の存在下および不在下において、公知のイヌGHSRリガンドとイヌGHS
Rの結合量を測定し、および (e)該物質の存在下および不在下において、公知のイヌGHSRリガンドとイヌGHS
Rの結合量を比較し、該物質の存在下における公知のイヌGHSRリガンドとイヌGHS
Rの結合量の方が減少する場合に、該物質がイヌGHSRに結合可能であることを示
すとすることを含む。
【００５１】 前述したこれらのアッセイは、イヌGHSRで一時的にまたは安定的にトランスフ
ェクトした細胞を使用して行なうことが可能である。トランスフェクションとは
、イヌGHSRを被検細胞内に導入するための、当業界で公知のあらゆる方法を包含
する。例えば、トランスフェクションとしては、リン酸カルシウムまたは塩化カ
ルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、イヌGHSRを含むレトロ
ウイルス構築物の感染、および電気穿孔法などが挙げられる。
【００５２】 前記物質またはアゴニストとイヌGHSRとの結合を測定する場合、その結合は、
物質またはアゴニストを標識することによって測定可能である。標識物質または
アゴニストは、当業界で公知のあらゆる簡便な方法、すなわち放射能標識、蛍光
標識、酵素標識などで標識化することが可能である。同様に、公知のイヌGHSRリ
ガンドとイヌGHSRとの結合も、標識した公知のイヌGHSRリガンドを使用して測定
可能である。公知のイヌGHSRリガンドは、公知のヒト、ラット、ブタGHSRリガン
ドの群から選択できる。
【００５３】 前記方法の変法として、被検細胞を物質に曝露せずに、被検細胞から膜を調製
しその膜を物質に曝露することができる。細胞ではなく膜を利用するこのような
改良は、当業界では周知であり、Hessら, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm.
184:260-268などに記載されている。
【００５４】 前記方法の特定の実施形態として、イヌGHSRは配列番号２のアミノ酸配列を有
する。
【００５５】 前記方法の特定の実施形態として、発現ベクターは配列番号１を含む。
【００５６】 前記方法の特定の実施形態として、細胞は真核細胞である。別の実施形態とし
て、細胞は哺乳動物細胞である。その他の実施形態として、該細胞は、L細胞L-M
(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細胞 L-M (ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、Raji(
ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 16
51)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa
(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)またはMRC-5 (ATCC
CCL 171)である。
【００５７】 本発明は、イヌGHSRが媒介する機能性応答を刺激または阻害する能力によって
、イヌGHSRのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するアッセイを包含する。
イヌGHSRは、Ｇタンパク質共役型受容体（GPCR）として知られるタンパク質の種
類に属する。リガンド結合が起こると、GPCRは細胞膜を介してシグナルを伝達す
る。リガンド結合GPCRはヘテロ３量体Ｇタンパク質と相互作用し、Ｇタンパク質
のGαサブユニットをGβおよびGγサブユニットから解離させる。次にこのGαサ
ブユニット（および時としてGβおよびGγサブユニット）は、種々のセカンドメ
ッセンジャー系を活性化させることが可能である。
【００５８】 多くの種類のサブユニットを伴った多くの種類のＧタンパク質が存在する。一
般に、ある特定のGPCRは、ある特定の種類のＧタンパク質とのみ結合する。よっ
てGPCRからの機能性応答を観察するためには、GPCRを含む系の中に適当なＧタン
パク質が存在していることを確認することが、通常は必要である。しかしながら
、ある一定の「交雑する (promiscuous)」Ｇタンパク質が存在することが判明し
た。これらの交雑Ｇタンパク質は、実質的にいずれのGPCRとも結合し、その結果
あらゆるGPCRからの機能性応答を変換する。OffermannsおよびSimon, 1995, J.
Biol. Chem. 270:15175, 15180 (Offermanns)参照。Offermannsは、細胞を発現
ベクターでトランスフェクトし、その結果、多数のGPCRのうちの１つおよび交雑
Ｇタンパク質Gα15またはGα16のうちの１つを発現させる系について説明してい
る。GPCRのアゴニストをトランスフェクトした細胞に添加したところ、GPCRが活
性化し、Gα15またはGα16を介してホスホリパーゼCのβイソフォームを活性化
し、細胞内におけるイノシトールリン酸のレベルを増加させることが可能となっ
た。
【００５９】 エクオリンアッセイにおけるイヌGHSRの機能から、イヌGHSRはGαq11を介して
結合すると考えられる。したがって、配列番号１をコードする発現ベクターやG
αq11をコードする発現ベクターで、細胞をトランスフェクトすることにより、
イヌGHSRの機能性アッセイを行なうことができる。また別の方法として、Offerm
annsによる交雑Ｇタンパク質を使用すれば、インビボでイヌGHSRが結合するＧタ
ンパク質がわからなくても、イヌGHSRの機能性アッセイを行なうことが可能であ
る。１つの可能性として、交雑Ｇタンパク質と融合するイヌGHSRの細胞外および
膜スパンニング部分から構成される、融合またはキメラタンパク質を作製するこ
とができる。このような融合タンパク質は、イヌGHSR部分への該タンパク質のリ
ガンド結合後に、シグナル伝達すると考えられる。したがって本発明は、イヌGH
SRのアンタゴニストを同定する方法であって、 (a)Ｃ末端で交雑Ｇタンパク質と融合するキメライヌGHSRタンパク質を発現す
る細胞を提供し、 (b)細胞をイヌGHSRのアゴニストへ曝露し、 (c)ステップ(b)の後、または同時に、細胞をイヌGHSRのアンタゴニストである
と疑われる物質へ曝露し、および (d)細胞内におけるイノシトールリン酸のレベルを測定し、 該物質が存在する際のイノシトールリン酸のレベルが、該物質が存在しない際
のイノシトールリン酸のレベルよりも減少している場合に、該物質がイヌGHSRの
アンタゴニストであることを示すとすることを含む前記方法を提供する。
【００６０】 交雑Ｇタンパク質とイヌGHSRを組み合わせて利用する別の可能性として、イヌ
GHSRのアゴニストを同定する方法があり、該方法は、 (a)イヌGHSRと交雑Ｇタンパク質の両方を発現する細胞を提供し、 (b)細胞をイヌGHSRのアゴニストと疑われる物質へ曝露し、および (c)細胞内におけるイノシトールリン酸のレベルを測定し、 細胞内におけるアゴニストと疑われる物質の存在下におけるイノシトールリン
酸のレベルが、該物質の不在下におけるイノシトールリン酸のレベルよりも増加
する場合に、該物質がイヌGHSRのアゴニストであることを示すとするものである
。
【００６１】 また、交雑Ｇタンパク質とイヌGHSRを組み合わせて利用するさらに別の可能
性として、イヌGHSRのアゴニストを同定する方法があり、該方法は、 (a)イヌGHSRと交雑Ｇタンパク質の両方を発現する被検細胞を提供し、 (b)イヌGHSRを発現しないことを除きステップ(a)の細胞と同一の対照細胞を提
供し、 (c)被検細胞および対照細胞を、イヌGHSRのアゴニストであると疑われる物質
へ曝露し、および (d)被検細胞および対照細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定し、 被検細胞内のイノシトールリン酸のレベルが、対照細胞内のイノシトールリン
酸のレベルよりも増加する場合に、該物質がイヌGHSRのアゴニストであることを
示すとすることを含む。
【００６２】 イノシトールリン酸のレベルは、カルシウムの動員をモニタリングすることに
より測定可能である。細胞内カルシウム動員は、通常、蛍光染料を用いる顕微鏡
を使用した全細胞内のアッセイを行なうか、またはエクオリンアッセイを使用し
、ルミネセンスを介して細胞懸濁液内のアッセイを行なうことで測定される。
【００６３】 前記方法の特定の実施形態として、細胞は真核細胞である。別の実施形態とし
て、細胞は哺乳動物細胞である。その他の実施形態として、細胞は、L 細胞L-M(
TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L-M (ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、Raji(AT
CC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651
)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(A
TCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)およびMRC-5 (ATCC C
CL 171)である。
【００６４】 前記方法の特定の実施形態として、細胞内でイヌGHSRおよび交雑Ｇタンパク質
の発現を指令する発現ベクターで、細胞をトランスフェクトする。
【００６５】 細胞を物質に曝露する条件は、当業界において通常タンパク質リガンド相互作
用の研究に使用される条件であり、たとえばそれは、生理学的pH、PBS等の通常
使用されるバッファーに代表される緩衝液や組織培養培地における塩条件、約4
〜約55℃の温度などである。
【００６６】 前記方法の特定の実施形態として、交雑Ｇタンパク質はGα15またはGα16から
なる群から選択される。Gα15またはGα16を含む発現ベクターは当業界では公知
である。Offermanns; Buhlら, 1993, FEBS Lett. 323:132-134; Amatrudaら, 19
93, J. Biol. Chem. 268:10139-10144を参照のこと。
【００６７】 前記アッセイは、イヌGHSRのアンタゴニストを同定する方法を形成するために
、容易に改変することが可能である。こうした方法もまた、本発明の一部であり
、該方法は、 (a)イヌGHSRと交雑Ｇタンパク質の両方を発現する細胞を提供し、 (b)該細胞をイヌGHSRのアゴニストである物質へ曝露し、 (c)ステップ(b)の後に、または同時に、該細胞をイヌGHSRのアンタゴニストで
あると疑われる物質へ曝露し、および (d)細胞内におけるイノシトールリン酸のレベルを測定し、 アンタゴニストであると疑われる物質の存在下における細胞内のイノシトール
リン酸のレベルが、該物質の不在下におけるイノシトールリン酸のレベルよりも
減少する場合に、該物質がイヌGHSRのアンタゴニストであることを示すものとす
る。
【００６８】 前記方法の特定の実施形態として、細胞は真核細胞である。別の実施形態とし
て、細胞は哺乳動物細胞である。その他の実施形態として、細胞は、L 細胞L-M(
TK-)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L-M (ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、Raji(AT
CC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651
)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(A
TCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)およびMRC-5 (ATCC C
CL 171)である。
【００６９】 前記方法のステップ (b)および(c)を実施する条件は、当業界において通常タ
ンパク質リガンド相互作用の研究に使用される条件であり、すなわちそれは、生
理学的pH、PBS等の通常使用されるバッファーに代表される緩衝液や組織培養培
地における塩条件、約4〜約55℃の温度などである。
【００７０】 前記方法の特定の実施形態として、細胞内でイヌGHSRおよび交雑Ｇタンパク質
の発現を指令する発現ベクターで、細胞をトランスフェクトする。
【００７１】 前記方法の特定の実施形態として、交雑Ｇタンパク質は、Gα15またはGα16か
らなる群から選択される。
【００７２】 前記方法の特定の実施形態として、イヌGHSRは配列番号２のアミノ酸を有する
。
【００７３】 前記方法は、「ある物質がイヌGHSRの活性化剤または阻害剤である」ことを検
査することに直接関連するものであるが、その一方でこれら方法を、物質の収集
物、例えば組合せライブラリーなどを検査し、これら収集物のメンバーがイヌGH
SRの活性化剤または阻害剤であるか否かを決定することに適用可能であることは
、当業者にとって明らかである。したがって、前記方法の物質として集積した物
質の使用は、本発明の範囲内である。
【００７４】 ヒトGHSRの公知のアゴニストおよびアンタゴニストが広汎に利用されているこ
とから、本発明の方法で同定されるイヌGHSRアゴニストおよびアンタゴニストも
、ヒトGHSRアゴニストおよびアンタゴニストと同様の仕方で薬理学的に利用され
ることは、当然、当業者が考え得ることであろう。前記方法で同定されるイヌGH
SRアゴニストおよびアンタゴニストは、イヌに使用されることに加えて、理想的
な医薬的特質（経口生体利用率、作用持続時間等）を備えた化合物の選択を行な
うのに有用であり、ヒトまたは他の動物種（ブタ等）の成長促進目的に使用され
る。
【００７５】 化合物をスクリーニングし、標的受容体と特異的に相互作用する潜在的な医薬
を同定するためには、被同定化合物が標的受容体に可能な限り特異的である必要
がある。このためには、標的受容体に類似している、可能な限り多種多様な受容
体に対して化合物をスクリーニングする必要がある。したがって、受容体Ａと相
互作用する潜在的な医薬である化合物を見出すためには、化合物が受容体Ａ（「
プラス標的」）と相互作用し、受容体Ａを介して所望の薬理学的効果を生み出す
ことを確認するだけでなく、それらの化合物が受容体Ｂ、Ｃ、Ｄ等（「マイナス
標的」）と相互作用しないことまでも判定する必要がある。一般に、スクリーニ
ングプログラムの一部に、可能な限り多くのマイナス標的を加えることが重要で
ある（Hodgson, 1992, Bio/Technology 10:973-980, 980頁参照）。イヌGHSRタ
ンパク質およびイヌGHSRタンパク質をコードするDNAは、他のＧタンパク質共役
型受容体と特異的に相互作用する化合物を同定するためのスクリーニング計画に
おいて「マイナス標的」として使用できるという点で有用である。
【００７６】 本発明はまた、イヌGHSRタンパク質に対する抗体を包含する。こうした抗体は
、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。本発明の
抗体は、イヌGHSRタンパク質全体、または血清アルブミンやキーホールリンペッ
トヘモシニアン等の適当な担体に結合する該タンパク質の適当な抗原性断片に対
して、当業界に周知の方法で生成される。適当なタンパク質の抗原性断片を同定
する方法は、当業界で公知である。HoppおよびWoods, 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78:3824-3828；Jameson およびWolf, 1988, CABIOS (Computer Appli
cations in the Biosciences ) 4:181-186等を参照のこと。
【００７７】 ポリクローナル抗体を作製するには、イヌGHSRタンパク質または適当な担体に
結合したその抗原性断片を、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス等の適切な
非ヒト宿主動物に定期的に注射する。これら動物から定期的に採血し、得られた
血清に注射した抗原に対する抗体が存在するか否かについて検査する。こうした
注射は、筋肉内注射、 腹腔内注射、皮下注射などであり、アジュバントを共に
使用することが可能である。
【００７８】 モノクローナル抗体を作製するには、イヌGHSRタンパク質または適当な担体に
結合したその抗原性断片を、前述した適切な非ヒト宿主動物に注射する。モノク
ローナル抗体の場合は、通常使用される動物はマウスである。次に該宿主動物の
脾臓細胞を、KohlerおよびMilstein, 1975, Nature 256:495-497記載のように、
一般に骨髄腫細胞と融合させることなどによって不死化する。モノクローナル抗
体作製に関するさらに詳細な記述については、Antibodies: A Laboratory Manua
l, HarlowおよびLane編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988を参照の
こと。
【００７９】 以下に非限定的実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００８０】実施例１ イヌGHSRの完全長ゲノムクローンの単離 商業上利用可能なλダッシュベクター内のイヌ脾臓ゲノムライブラリー（スト
ラタジーン、La Jolla、CA）を、イヌGHSRタイプ1aのクローニングに使用した。
このライブラリーは、他のイヌGHSRファミリーメンバーからの単離にも利用可能
である。約1.8×106のクローンを平板培養し、次に製造業者の仕様書に従って、
プラークをナイトラン(Nytran)強化フィルター(SchleicherおよびSchuell, Keen
e, NH)上につり上げた。そのフィルターを、50％ホルムアミド、5×SSPE、2×デ
ンハルト溶液、0.1％SDS、100μg/mlサケ精子DNA中で、２時間30℃で前ハイブリ
ダイゼーションを行ない、その後、50％ホルムアミド、5×SSPE、2×デンハルト
溶液、0.1％SDS、10％硫酸デキストラン、100μg/mlサケ精子DNA中で、一夜、30
℃でハイブリダイズした。陽性クローンを同定するために、Strategene Prime I
t II kitを使用して、ヒトのタイプ1aGHSR（1.1kb）のオープンリーディングフ
レームをランダムプライムし、1×106cpm/mlのハイブリダイゼーション溶液を添
加した。後ハイブリダイゼーション(post-hybridization)として、フィルターを
中ストリンジェントな条件（1×SSC、0.1％SDS中、55℃、30分間）で洗浄し、Ｘ
線フィルムに露光した。３回のプラーク精製を行なうことで、５つの陽性クロー
ン（3、19、25、27および28）が判明した。Clontech labsが提供する手順に従っ
て、λファージ溶解液を調製した。そのDNAをSal Iで消化し、22kbおよび9kbのD
NA断片を生成した。クローン19に関しては、ヒトのタイプ1aプローブにハイブリ
ダイズした22kbの挿入物を、pGem 11 zf+ Sal I部位(Promega)にサブクローニン
グした。約1,000の形質転換体に対するコロニーハイブリダイゼーションによっ
て、単一ハイブリダイズサブクローンを見出し、ABI prism FS dye terminator
sequencing kit (Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用してそのサブク
ローンの配列決定を行なった。その他の４つのクローンについては、最近使用可
能となったABI prism FS bigdye terminator cycle sequencing kitを用いてλD
NAから直接配列決定した。
【００８１】実施例２ イヌGHSR cDNAのクローニング 製造業者の指示に従って、Poly (A) Pure mRNA isolation kit (Ambion Inc,
Austin, TX) を使用し、1gのイヌ視床下部からイヌ視床下部mRNAを調製した。Ch
oice Superscript cDNA kit (BRL、Bethesda、MD)を使用して、得られたmRNAか
らcDNAを調製した。カラムクロマトグラフィーを実施した後、 DNA Dipstick (Invitrogen、CA)を使用して、cDNAを定量した。PCR鋳型として10
ng cDNAを使用し、イヌに特異なプライマーであるPCR1S (GGG CCC GAA TTC GCC
GCC ATG CGG AAC GCG ACG GCC CGC（配列番号８）)およびPCR2AS (AGT TTA GCG
GCC GCT CAT GTA TTA ATA CTA GAC TCT GT（配列番号９）)を用いた。10mM Tris
(pH8.0)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、100μg/ml ゼラチン、250μMの各dNTPおよ
び10％DMSO中、20pモルの各プライマーおよび20ngの標的DNAを使って、PCR反応
を行なった。Taqポリメラーゼ (Pharmacia)を添加する前に、反応産物を100℃で
10分間加熱し、続いて72℃で浸漬した。0.25単位/mlの最終濃度にTaqポリメラー
ゼを添加した。繰返し条件は94℃で1分、50℃で1分、72℃で1分であり、全部で3
0サイクル繰り返した後に、72℃で10分間インキュベートした。反応産物を1×TA
Eバッファー中で1％Seakem GTGアガロースゲル電気泳動にかけ、長波長紫外線で
視覚化した。ORF（オープンリーディングフレーム）に関して予想されるサイズ
(1.2kb)の断片を電気溶出し、TAクローン化し (Invitrogen、CA)、dye terminat
or cycle sequencing ready reactions (Perkin Elmer、Foster City、CA)で配
列決定し、377 ABI Prism cycle sequencerで分析した。断片をpCDNA3ベクター
中にサブクローンし発現させた。全体的に見たところ、クローン化したイヌGHSR
のアミノ酸配列（図３）はラットGHSRに91％相同であり、ヒトGHSRに89％相同で
ある。イヌGHSRを他種由来のGHSRと比較した際に最も異なる性質は、Ｎ末端細胞
外ドメインにおける17個のアミノ酸の欠失である。
【００８２】実施例３ 放射性標識MK-677結合アッセイ イヌGHSR発現プラスミド（哺乳動物発現ベクターpcDNA-3内に位置する完全長
オープンリーディングフレーム）でトランスフェクトした細胞に関して[35S]-MK
-677結合アッセイを実施し、イヌGHSRの発現について調べた。リポフェクタミン
(GIBCO-BRL; Hawley-Nelson, 1993, Focus 15:73)を使用して、哺乳動物細胞 (
COS-7、HEK-293)をGHSR発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェ
クションは、60mmの皿中、80％コンフルエント細胞（約4×105の細胞）、8μgリ
ポフェクタミン、32μgGHSRプラスミドDNAを使用して行なった。
【００８３】 35S-MK-677を、GHSR発現プラスミドでトランスフェクトしたCOS-7またはHEK-2
93細胞から調製した粗製膜と以下のように結合させた。トランスフェクションか
ら48時間後に、氷上でCOS-7トランスフェクタントから粗製細胞膜を調製した。6
0mmの各皿を3mlのPBSで２回洗浄し、1mlのホモジナイゼーション用バッファー(5
0mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM MgCl2、2.5mM EDTA、30μg/mlバシトラシン)で１
回洗浄した。0.5mlのホモジナイゼーション用バッファーを各皿に添加し、細胞
を掻き取って回収し、Polytron装置を用いてホモジナイズした(Brinkmann, Syos
set, NY; 設定４で10秒間のバーストを３回)。ホモジネートを20分間11,000×g
にて０℃で遠心分離し、得られた粗製膜ペレット(細胞膜と核を主に含む)を、0.
06％BSAを添加したホモジナイゼーション用バッファーに再懸濁し(0.1ml/60mmの
皿)、氷上に維持した。20℃で1時間、全量0.5ml(0.1mlの膜懸濁液、10μlの35S-
MK-677（0.05 〜1nM; 約900Ci/モルの比活性）、10μlの競合性薬剤および380〜
390μlのホモジナイゼーション用バッファーを含む)にて結合反応を行った。結
合した放射性リガンドを、0.5％ポリエチレンイミンで予め１時間処理しておい
たGF/Cフィルターを通して急速減圧濾過(Brandel 48ウェル細胞回収装置)によっ
て分離した。膜懸濁液をフィルターに添加した後、フィルターを各回３mlの氷冷
50mM Tris-HCl（pH7.4）、10mM MgCl2、2.5mM EDTAおよび0.015％Triton X-100
で３回洗浄し、フィルター上の結合放射能をシンチレーション計数法にて定量し
た。特異的結合(全体の＞90％)は、全結合と、50 nMの未標識MK-677の存在下で
行なった非特異的結合との差と定義する。競合試験は、クローン化イヌGHSRが2.
2nMのIC50値でMK-677と結合することを示した。これは天然のイヌ下垂体GHSR(1n
M)やクローン化ヒトGHSR(0.8nM)と比較して有利な値である。
【００８４】 本発明は、本明細書中で記載した特定の実施形態の範囲に限定されるものでは
ない。実際、前述の記載を参考にすれば、ここに記載した実施形態以外にも本発
明に種々の変更を行ない得ることは、当業者にとって明らかである。こうした変
更は特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【００８５】 本明細書の中で引用された種々の刊行物の開示の全体を、参照により本明細書
に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体(GHSR)をコードするcDNA配列
（配列番号１）を示す。該配列は、ATG開始コドンで始まり、TGA停止コドンで終
了する。
【図２】イヌGHSRのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ヒトGHSRのアミノ酸配列（配列番号５）、ラットGHSRのアミノ酸配
列（配列番号６）、ブタGHSRのアミノ酸配列（配列番号７）、およびイヌGHSRの
アミノ酸配列（配列番号２）の比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (72)発明者 パリハ，オクサマ，シー． アメリカ合衆国 07065 ニュージャージ ー州，ローウェイ，イースト・リンカー ン・アベニュー，126 (72)発明者 スミス，ロイ，ジー． アメリカ合衆国 07065 ニュージャージ ー州，ローウェイ，イースト・リンカー ン・アベニュー，126 (72)発明者 タン，カリーナ，ピー． アメリカ合衆国 07065 ニュージャージ ー州，ローウェイ，イースト・リンカー ン・アベニュー，126 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB07 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA13 HA11 4B063 QA05 QQ61 QR77 QR80 QX10 4B064 AG20 CA01 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90X AA90Y AA93X AB01 AC14 BA02 BA05 BD01 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
    る組換えDNA分子。
  2. 【請求項２】 配列番号１の塩基配列を含む、請求項１記載の組換えDNA分
    子。
  3. 【請求項３】 ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズす
    るDNA分子。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のDNAを含む発現ベクター。
  5. 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  6. 【請求項６】 他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号２のアミノ酸配
    列を有する、イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質。
  7. 【請求項７】 単一のアミノ酸置換を含む、請求項６記載のタンパク質。
  8. 【請求項８】 該置換が保存的置換である、請求項７記載のタンパク質。
  9. 【請求項９】 ２以上のアミノ酸置換を含み、ヒト、ラット、ブタおよびイ
    ヌの、４つの成長ホルモン分泌促進物質受容体すべてが同じアミノ酸を共有する
    位置では該置換は起こらず、且つ配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌ成長ホ
    ルモン分泌促進物質受容体と実質的に同じ生物学的活性をタンパク質が有する、
    請求項６記載のタンパク質。
  10. 【請求項１０】イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質を発現する
    方法であって、 (a)宿主細胞を、配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌ成長ホルモン分泌促
    進物質受容体タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトし、およ
    び (b)イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質が発現する条件下で、ス
    テップ(a)のトランスフェクトした細胞を培養する ことを含んでなる該方法。
  11. 【請求項１１】イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質の活性化剤
    または阻害剤を同定する方法であって、 (a)宿主細胞内で、配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌ成長ホルモン分泌
    促進物質受容体タンパク質を組換え発現させ、および (b)イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質の活性化剤または阻害剤
    候補物質の存在下または不在下で、該宿主細胞におけるイヌ成長ホルモン分泌促
    進物質受容体タンパク質の生物学的活性を測定する ことを含んでなり、 該物質の存在下での該タンパク質の生物学的活性と、該物質の不在下での該タン
    パク質の生物学的活性との差異に基づき、該物質が該タンパク質の活性化剤また
    は阻害剤であるとする、該方法。
  12. 【請求項１２】ある物質がイヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タンパク質の潜
    在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを判定する方法であって、 (a)細胞を、配列番号２のアミノ酸配列を有するイヌ成長ホルモン分泌促進物
    質受容体タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトし、 (b)トランスフェクトした細胞を、イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体タン
    パク質が発現するのに十分な時間、増殖させ、 (c)該物質の存在下および不在下で、トランスフェクトした細胞を、公知のイ
    ヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体の標識アゴニストに曝露し、および (d)該標識アゴニストとイヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合を測定
    するか、またはイヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体のアゴニストへの機能性応
    答を測定する ことを含んでなり、 公知のアゴニストとイヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体との結合量、またはイ
    ヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体の該アゴニストへの機能性応答が、該物質の
    不在下よりも存在下において少ない場合に、該物質がイヌ成長ホルモン分泌促進
    物質受容体の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるとする、該方法。
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