CN116500161A - 一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法，包括样品前处理、衍生、检测和定量计算步骤。样品前处理步骤包括将待测样品与蛋白酶溶液混合并酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液。衍生步骤包括配制不同浓度的标准样品溶液，对所述酶解后的样品溶液及标准样品溶液分别进行衍生，得到待测样品溶液及标准样品溶液。检测步骤包括采用液相色谱法对衍生步骤得到的待测样品溶液和标准样品溶液进行检测，得到检测数据。定量计算步骤包括依据检测数据制作标准曲线，计算，得到待测样品中Asn和Gln的含量。该方法可提高样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量的检测精度。

Description

一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法。
背景技术
天冬酰胺(Asn)是一种重要的氨基酸，脑功能的发展离不开Asn。在体氨循环中，Asn扮演重要角色，在氨基酸的营养液中，Asn也是不可缺少的组分。谷氨酰胺(Gln)是谷氨酸的酰基，也是二十多种非基本氨基酸中的一种，适用人群广泛，例如，Gln可以促进少年儿童大脑发育，增强记忆力，对于老年人来说，可以保持大脑活动从而防止老年痴呆症，Gln还可以为工作繁忙的白领“充电”，防止脑部疲劳，病后和术后的人群也可以使用谷氨酰胺来帮助康复。
常见的氨基酸代谢障碍配方食品中对Asn和Gln的含量均有限制，例如，尿素循环障碍配方食品中要求Asn和Gln的含量均≤1.5mg/g。但是，Asn和Gln分别会转化成天冬氨酸和谷氨酸，从而导致Asn和Gln的测定困难，目前国内外均未形成食品中Asn和Gln的标准检测方法。近几年来，由于Asn和Gln的市场应用不断扩大，在国内外的使用量都很可观，市场规模也在不断增长，产生了较大的经济效益。鉴于目前并没有检测食品中Asn和Gln含量的标准检测方法，属于食品检测领域的空缺，这会给日常监管及企业的质量控制带来极大的困难。因此，亟待一种针对食品中Asn和Gln的检测方法。
发明内容
本发明提供一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法，该方法可精确定量样本中的天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
根据第一方面，一种实施例中提供一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法，包括：
样品前处理步骤：将待测样品与蛋白酶溶液混合并酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液，蛋白酶溶液包括能用于对待测样品进行酶切的蛋白酶、酶解促进剂和溶剂；
衍生步骤：配制不同浓度的标准样品溶液，对酶解后的样品溶液及标准样品溶液分别进行衍生，得到待测样品溶液及标准样品溶液；
检测步骤：采用液相色谱法对衍生步骤得到的待测样品溶液和标准样品溶液进行检测，得到检测数据；
定量计算步骤：依据检测数据制作标准曲线，计算，得到待测样品中Asn和Gln的含量。
进一步地，蛋白酶包括灰色链霉菌蛋白酶或地衣芽孢杆菌蛋白酶；酶解促进剂包括甲醇和乙腈中的至少一种以及三羟甲基氨基甲烷缓冲试剂；溶剂包括三羟甲基氨基甲烷缓冲试剂。
进一步地，衍生步骤中的衍生方法包括线下衍生和在线衍生。
本发明提供的一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法，采用蛋白酶对待测样品进行酶切，获得游离态的天冬酰胺和谷氨酰胺，使得在后续的液相色谱检测中能够更加精准的测得样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
附图说明
图1-(A)为Agilent Eclipse AAA(4.6mm×150mm，3.5μm)氨基酸分析柱下Asn和Gln分离谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图1-(B)为Thermo AccclaimTM T3(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱下Asn和Gln分离谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图1-(C)为Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱下Asn和Gln分离谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图2为流动相PH为7.5的样品中的Asn和Gln分离色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图3为流动相PH为6.5的样品中的Asn和Gln分离色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图4为流动相PH为5.5的样品中的Asn和Gln分离色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图5为流动相PH为4.5的样品中的Asn和Gln分离色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图6为实施例1中标准样品溶液中氨基酸的色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图7为实施例1中待测样品溶液中氨基酸的色谱图，3为天冬酰胺，4为谷氨酰胺；
图8为实施例1中标准样品溶液中的天冬酰胺浓度-峰面积标准曲线图；
图9为实施例1中标准样品溶液的的谷氨酰胺浓度-峰面积标准曲线图；
图10为丹磺酰氯浓度对不同样品中Asn含量测定的折线图；
图11为丹磺酰氯浓度对不同样品中Gln含量测定的折线图；
图12为衍生温度对不同样品中Asn含量测定的折线图；
图13为衍生温度对不同样品中Gln含量测定的折线图；
图14为衍生时间对不同样品中Asn含量测定的折线图；
图15为衍生时间对不同样品中Gln含量测定的折线图；
图16为碳酸钠缓冲剂pH对不同样品中Asn含量测定的折线图；
图17为碳酸钠缓冲剂pH对不同样品中Gln含量测定的折线图；
图18为实施例2中标准样品溶液中氨基酸的色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图19为实施例2中待测样品溶液中氨基酸的色谱图，1为天冬酰胺，2为谷氨酰胺；
图20为实施例2中标准样品溶液中的天冬酰胺浓度-峰面积标准曲线图；
图21为实施例2中标准样品溶液的的谷氨酰胺浓度-峰面积标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，并非全部。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员对本发明进行的常规修改或变形而获得的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
酶解促进剂：本发明中的缓冲溶液与甲醇是为了提高待测样品的酶解效率，加入酶解促进剂后，可以提高样品酶解产生的游离的天冬酰胺(Asn)与谷氨酰胺Gln的含量。
氨基酸主要来源于蛋白质，天冬酰胺和谷氨酰胺作为常见的氨基酸，在本申请中采用酶解法将蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺进行酶切释放，将天冬酰胺和谷氨酰胺由结合态转变为游离态，然后对待测样品进行衍生化处理，然后采用液相色谱对衍生化处理后的样品中的天冬酰胺和谷氨酰胺的含量进行检测。最后采用外标法即可换算得到样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
本发明的实施例提供一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法,包括样品前处理步骤、衍生步骤、检测步骤和定量计算步骤。
样品前处理步骤包括：将待测样品与蛋白酶溶液混合并酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液，蛋白酶溶液包括能用于对待测样品进行酶切的蛋白酶、酶解促进剂和溶剂。
衍生步骤包括：配制不同浓度的标准样品溶液，对酶解后的样品溶液及标准样品溶液分别进行衍生，得到待测样品溶液及标准样品溶液。
检测步骤包括：采用液相色谱法对衍生步骤得到的待测样品溶液和标准样品溶液进行检测，得到检测数据。
定量计算步骤包括：依据检测数据制作标准曲线，计算，得到待测样品中Asn和Gln的含量。
在本发明的实施例中，采用蛋白酶对待测样品进行酶切，获得游离态的天冬酰胺和谷氨酰胺，游离的天冬酰胺和谷氨酰胺与衍生试剂发生衍生反应，使得在后续的液相色谱检测中能够更加精准的测得样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
进一步地，蛋白酶包括灰色链霉菌蛋白酶或地衣芽孢杆菌蛋白酶；酶解促进剂包括甲醇和乙腈中的至少一种以及三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲试剂；溶剂包括Tris缓冲试剂。使用Tris缓冲试剂可以调整溶液的PH，与甲醇或乙腈溶液共同作用保证样品的酶解效率，提高样品酶解产生的游离的天冬酰胺(Asn)与谷氨酰胺Gln的含量。
进一步地，衍生步骤中的衍生方法包括线下衍生和在线衍生。本发明中的衍生均为柱前衍生。
进一步地，线下衍生具体步骤包括：先将酶解后的样品溶液与PH调节剂混合，再与线下衍生试剂混合并在避光条件下反应，然后再加入反应终止试剂，静置，过滤。
进一步地，PH调节剂包括碳酸钠缓冲液；线下衍生试剂包括丹磺酰氯；反应终止试剂包括盐酸甲胺。
碳酸钠缓冲液的pH为8.0-11.0。丹磺酰氯的浓度为0.5-3.0mg/ml,线下衍生反应的温度为25-60℃，线下衍生反应的时间为0.5-3.0h。
进一步地，碳酸钠缓冲液的PH为9.5。所述丹磺酰氯的浓度为2.0mg/ml，线下衍生反应的温度为25℃，线下衍生反应的时间为2h。
氨基酸与丹磺酰氯发生衍生反应的原理如下，最终液相色谱检测的是氨基酸与丹磺酰氯反应所得的产物。
进一步地，在线衍生的衍生程序包括：先抽取样品溶液和第一衍生试剂并混合，得到初步衍生溶液，再抽取第二衍生试剂并与初步衍生溶液混合，然后用洗针液洗针，再进样、清洗。与柱前线下衍生方法相比，柱前在线衍生后进行检测的周期更短，不仅可以提高检测通量，还可以节省人力成本。
在在线衍生方法中，氨基酸与衍生试剂发生反应原理如下。
进一步地，第一衍生试剂包括硼酸钠溶液；第二衍生试剂包括临苯二甲醛。
进一步地，定量计算步骤具体包括：依据标准样品溶液的浓度以及检测步骤得到的标准样品溶液中天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积，制作浓度-面积标准曲线，然后将检测步骤得到的待测样品溶液中天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积，代入到标准样品浓度-面积参照曲线中，即可换算得到待测样品中Asn和Gln的含量。
进一步地，液相色谱中的流动相为磷酸氢二钠和甲醇。
进一步地，样品前处理步骤具体包括：称取待测样品置于容器中，然后再加入蛋白酶溶液并置于恒温培养箱中酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液。
在本发明的一些实施例中，样品前处理步骤中，在恒温培养箱中培养的时间为14-16h。
本发明实施例中的待测样品包括雀巢的早启能恩早产/低出生体重婴儿配方食品、雀巢的超启能恩婴儿乳蛋白部分水解配方食品、雀巢的蔼儿舒婴儿乳蛋白深度水解配方食品、纽迪希亚的纽康特婴儿氨基酸配方食品、美赞成的安儿宝无乳糖配方、纽迪希亚的尿素循环障碍配方奶粉、贝唯他的婴儿配方奶粉或蓝河的姆阿普的较大婴儿配方奶粉。
本发明研究了不同酶的酶解效果，酶切位点是指DNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段，目前常用来酶解蛋白质得到天冬酰胺和谷氨酰胺的蛋白酶除了灰色链霉菌蛋白酶，还包括木瓜蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和地衣芽孢杆菌蛋白酶。表1为选用不同的酶并对酶解效果进行评价的结果，样品经过酶解后进行衍生，由表1的结果表明，灰色链霉菌蛋白酶的酶解效果最佳。
表1不同酶的酶解效果(n＝3)
灰色链霉菌蛋白酶是一种广泛应用于生物学、分子生物学、生物化学等领域的蛋白酶。它能够催化蛋白质的水解反应，但是其酶切点并不固定，易受到多种因素的影响。在高温和碱性条件下，其酶解活性会显著增强。本研究选取了三种已知序列的标准蛋白，采用灰色链霉菌蛋白酶进行酶解。其结果示于表2。
表2灰色链霉菌蛋白酶酶解效率评价(n＝3)
表2结果表明，标准蛋白质经过酶解衍生，测定值与理论值偏差在3％以内，测定值占比与理论值占比非常接近，这表明灰色链霉菌蛋白酶能够比较完全地酶解卵清蛋白、牛血清白蛋白和猪胰岛素蛋白氨基酸序列中Asn和Gln左右两边的氨基酸，使得Asn和Gln游离，因此本发明优选灰色链霉菌蛋白酶对待测样品进行酶解。
在高效液相色谱(HPLC)分析中，反相色谱柱的应用较为广泛，本发明实验对比了Agilent Eclipse AAA(4.6mm×150mm，3.5μm)氨基酸色谱柱、Thermo AccclaimTM T3(4.6mm×250mm，5μm)、Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)三种不同类型的色谱柱对Asn和Gln的色谱保留行为。实验结果表明，请参考图1，Asn和Gln在三种色谱柱下均有良好的峰形，但出峰时间不同。从方法的适用性及普及性上考虑，C18柱作为反相色谱中最常用的色谱柱，它的分辨率较高，能够有效地分离样品中的杂质和目标物，同时可以应用于不同pH环境下不同种类和性质的样品分离，故最终选择Agilent Zorbax SB-C18柱作为分析柱。
在选用Agilent Zorbax SB-C18柱作为分析柱的基础上，对流动相的PH进行了探究，其结果示于图2-5中，由图2-5的结果可以得出，在流动相PH在7.5、6.5、5.5或4.5的条件下，Agilent Zorbax SB-C18色谱柱均能实现对Asn和Gln的分离，随着PH降低，Asn和Gln在色谱柱上保留更强，需要更长的洗脱时间。综合色谱分离度和分析时间，本发明的实施例最终选择在流动相PH为6.5的条件进行检测。
实施例1
样品的制备：称取雀巢早启能恩的早产/低出生体重婴儿配方食品，得到待测样品。
样品前处理：称取待测样品0.2g至15ml的玻璃水解管中，再往玻璃水解管中加入0.5ml的灰色链霉菌蛋白酶溶液、3.0mlTris缓冲溶液和0.2ml甲醇，然后将玻璃水解管放置于37℃培养箱中14h-16h，酶解后转移至50ml容量瓶中定容，过滤，取上清液，取1.0ml上清液置于10ml的容量瓶中，加水定容，得到稀释后的溶液。
衍生步骤：取1ml稀释后的溶液，然后往上清液中加入1ml Na2CO3(PH＝9.5)溶液，再加入1ml 2.0mg/ml的丹磺酰氯并在25℃避光条件下反应2h，避光反应后再加入0.1ml盐酸甲胺终止反应，静置后过滤，取上清液，得到待测样品溶液。
标准样品的制备：称取100.0mg天冬酰胺置于50ml容量瓶中，称取100mg谷氨酰胺标准品置于50ml容量瓶中，分别用水溶解并定容至50ml，得到浓度为2mg/ml的天冬酰胺标准样品储备液和2mg/ml的谷氨酰胺标准样品储备液，然后吸取天冬酰胺标准样品储备液1.0ml至10ml容量瓶中并用水定容，得到天冬酰胺的混合标准中间液，同时，吸取谷氨酰胺标准样品储备液1.0ml至另一个10ml的容量瓶中并用水定容，得到谷氨酰胺的混合标准中间液。然后再分别吸取天冬酰胺的混合标准中间液：0ml、0.05ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml分别置于7个不同的10ml的容量瓶中，用水定容，得到天冬酰胺的标准样品溶液，天冬酰胺标准样品溶液的浓度分别为0μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL；同样地，分别吸取谷氨酰胺的混合标准中间液：0ml、0.05ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml分别置于7个不同的10ml的容量瓶中，用水定容，得到谷氨酰胺的标准样品溶液，谷氨酰胺标准样品溶液的浓度分别为0μg/ml、1.00μg/ml、5.00μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml。其中，标准物质天冬酰胺和谷氨酰胺采购于阿尔塔标物公司，CAS号分别为70-47-3和56-85-9。
检测：分别取14个不同浓度的10μl标准样品溶液和10μl待测样品溶液置于15个不同的进样小瓶中，置于液相色谱仪中进行检测，得到标准样品溶液和待测样品溶液中的天冬酰胺和谷氨酰胺的色谱图(请参考图6-7)，图6仅示出了浓度为20μg/ml的混合标准样品溶液的色谱图，并对标准样品溶液和待测样品溶液中的天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积进行积分，得到峰面积数据，液相色谱仪的液相条件如下：
液相柱：C18色谱柱；
柱温：35℃；
进样量：10μl；
紫外检测器波长：347nm；
流动相及洗脱程序如下表3：
表3
时间/min 磷酸氢二钠 甲醇
0.0 70％ 30％
3.0 70％ 30％
15.0 65％ 35％
15.1 20％ 80％
17.0 20％ 80％
17.1 70％ 30％
20.0 70％ 30％
。
定量计算步骤：依据天冬酰胺标准样品的检测数据和谷氨酰胺标准样品的检测数据制作标准样品浓度-峰面积标准曲线(参考图8-9)，再将检测步骤中得到的待测样品溶液中天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积数据代入到标准曲线中，即可换算出待测样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
从图7可以看出，色谱条件可以满足样本分离，图8中所示的天冬酰胺的标准样品的标准曲线方程为y＝0.1939x+0.0343，相关系数R2为0.9999；图9中所示的谷氨酰胺的标准样品的标准曲线方程为y＝0.2020x+0.0130，相关系数R2为1。由天冬酰胺和谷氨酰胺的标准样品的标准曲线及相关系数可以看出，标准样品的标准曲线线性良好，能够对待测样品中的天冬酰胺和谷氨酰胺精准定量。
衍生试剂的浓度对反应的效果有着直接的影响，本申请还研究了丹磺酰氯浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL和3.0mg/mL时对不同样品中Asn和Gln含量测定的影响，其他步骤和条件与实施例1中相同，结果如图10-11所示，2.0mg/mL时，样品中Asn和Gln测得的含量最高，之后趋于稳定，说明衍生试剂用量在2.0mg/mL时已经反应完全，故丹磺酰氯衍生试剂的浓度为2.0mg/mL测得的样品中的Asn和Gln最准确。
丹磺酰氯作为衍生试剂的衍生反应一般在常温下即可进行，但考虑到不同地域对常温引起温度误差，故还研究了在30℃、40℃、50℃和60℃时进行衍生反应后测得的不同样品中Asn和Gln的含量，其他步骤和条件与实施例1中相同，其结果如图12-13所示，结果表明，线下衍生反应温度≤30℃时，反应效率无明显差别，在温度高于40℃以后，测得的含量逐渐降低，其原因可能在于过热的环境会破坏酰胺键的结构，进而影响Asn或Gln与丹磺酰氯的结合，即衍生反应在30℃下反应更佳。
考虑到丹磺酰氯反应速度较慢，本申请分别研究了0.5h、1h、1.5h、2.5h和3h衍生时间测得的不同样品中Asn和Gln的含量，其他步骤和条件与实施例1中相同，其结果如图14-15所示，衍生时间在1.5h之前，测得的Asn或Gln的含量随着衍生时间的延长会出现上升的趋势，这可能是因为衍生时间过短，衍生不够充分导致的，衍生时间在1.5h之后，测得的Asn或Gln的含量趋于稳定，但考虑到样品(特殊医学用途配方食品)基质复杂，为了使不同基质都能充分衍生完全，衍生时间优选2h。
丹磺酰氯在酸性环境下会发生分解，须在碱性环境下进行衍生反应。因此，本申请将碳酸钠缓冲液用作pH调节剂，并且还研究了不同pH条件下的碳酸钠缓冲液对不同样品中Asn或Gln的含量测定的影响，其结果如图16-17所示，碳酸钠缓冲液pH为9.5时，测得的样品中的Asn或Gln的含量达到峰值，即衍生效果最佳，故pH为9.5的碳酸钠缓冲液更适于丹磺酰氯与样品发生衍生反应。
实施例2
样品的制备：称取美赞成的安儿宝无乳糖配方食品，得到待测样品。
样品前处理：称取待测样品0.2g至15ml的玻璃水解管中，再往玻璃水解管中加入0.5ml的灰色链霉菌蛋白酶溶液、3.0mlTris缓冲溶液和0.2ml甲醇，然后将玻璃水解管放置于37℃培养箱中14h-16h，酶解后转移至50ml容量瓶中定容，过滤，取上清液。
标准样品的制备：称取100.0mg天冬酰胺置于50ml容量瓶中，称取100mg谷氨酰胺标准品置于50ml容量瓶中，分别用水溶解并定容至50ml，得到浓度为2mg/ml的天冬酰胺标准样品储备液和2mg/ml的谷氨酰胺标准样品储备液，然后吸取天冬酰胺标准样品储备液1.0ml至10ml容量瓶中并用水定容，得到天冬酰胺的混合标准中间液，同时，吸取谷氨酰胺标准样品储备液1.0ml至另一个10ml的容量瓶中并用水定容，得到谷氨酰胺的混合标准中间液。然后再分别吸取天冬酰胺的混合标准中间液：0ml、0.05ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml分别置于7个不同的10ml的容量瓶中，用水定容，得到天冬酰胺的标准样品溶液，天冬酰胺标准样品溶液的浓度分别为0μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL；同样地，分别吸取谷氨酰胺的混合标准中间液：0ml、0.05ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml分别置于7个不同的10ml的容量瓶中，用水定容，得到谷氨酰胺的标准样品溶液，谷氨酰胺标准样品溶液的浓度分别为0μg/ml、1.00μg/ml、5.00μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml。其中，标准物质天冬酰胺和谷氨酰胺采购于阿尔塔标物公司，CAS号分别为70-47-3和56-85-9。
检测：分别取14个不同浓度的10μl标准样品溶液和10μl待测样品溶液置于15个不同的进样小瓶中，置于液相色谱仪中进行柱前在线衍生并检测，得到标准样品溶液和待测样品溶液中的天冬酰胺和谷氨酰胺的色谱图(请参考图18-19)，图18仅示出了浓度为20μg/ml的混合标准样品溶液的色谱图，并对标准样品溶液和待测样品中的天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积进行积分，得到峰面积数据，液相色谱仪的液相条件如下：
液相柱：C18色谱柱；
柱温：35℃；
进样量：10μl；
流速：1mL/min；
紫外检测器波长：338nm；
流动相及洗脱程序如下表4：
表4
时间/min 磷酸氢二钠％ 甲醇％
0.0 80 20
18.0 75 25
19.0 20 80
22.0 20 80
22.1 80 20
26.0 80 20
衍生试剂包括：0.01mol/L硼酸钠溶液和0.2mol/L的邻苯二甲醛(OPA)溶液。0.01mol/L硼酸钠溶液的制备方法为：称取0.618g硼酸和0.4g氢氧化钠并混合，然后置于100mL容量瓶中并定容至100mL。0.2mol/L的邻苯二甲醛溶液的制备方法为：称取0.035g邻苯二甲醛，用1mL甲醇溶解，再加入130μL巯基乙醇，并用0.01mol/L硼酸钠溶液定容至50mL。位置放置在GA3。
自动衍生程序如下：
1、吸取空气1μL；
2、从样品瓶中吸取5μL；
3、从GA3号位吸取5μL硼酸钠溶液；
4、从空气中吸取6μL，排出；重复3次；
5、等待15s；
6、从GA2吸取5μLOPA溶液；
7、从空气中吸取8μL，排出；重复5次；
8、等待60s；
9、用100μL洗针液清洗针外壁；
10、进样；
11、清洗。
定量计算步骤：依据天冬酰胺标准样品的检测数据和谷氨酰胺标准样品的检测数据制作标准样品浓度-峰面积标准曲线(参考图20-21)，再将检测步骤中得到的待测样品溶液中天冬酰胺和谷氨酰胺的峰面积数据代入到标准曲线中，即可换算出待测样品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量。
从图20和图21可以看出，天冬酰胺标准样品的标准曲线方程为y＝0.3285x+0.0119，相关系数R2为0.9999；谷氨酰胺标准样品的标准曲线方程为y＝0.3389x+0.0047，相关系数R2为1。由谷氨酰胺和天冬酰胺标准样品的标准曲线及相关系数可得，标准样品标准曲线线性良好，本发明的方法可对待测样品溶液中的游离态的天冬酰胺和谷氨酰胺进行精准的定量，相较于柱前线下衍生而言，柱前在线衍生检测周期更短，在提高检测通量的同时，还可以节省人力成本。
本发明提供的检测方法均可以提高食品中天冬酰胺和谷氨酰胺的含量的检测精度，在一定程度上填补了当下Asn和Gln检测方法的空白，为食品行业监督及特医食品临床应用提供有力的数据支撑和安全保障。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种检测食品中天冬酰胺和谷氨酰胺含量的方法,其特征在于，包括：
样品前处理步骤：将待测样品与蛋白酶溶液混合并酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液，所述蛋白酶溶液包括能用于对待测样品进行酶切的蛋白酶、酶解促进剂和溶剂；
衍生步骤：配制不同浓度的标准样品溶液，对所述酶解后的样品溶液及标准样品溶液分别进行衍生，得到待测样品溶液及标准样品溶液；
检测步骤：采用液相色谱法对衍生步骤得到的待测样品溶液和标准样品溶液进行检测，得到检测数据；
定量计算步骤：依据检测数据制作标准曲线，计算，得到待测样品中Asn和Gln的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶包括灰色链霉菌蛋白酶或地衣芽孢杆菌蛋白酶；所述酶解促进剂包括甲醇和乙腈中的至少一种以及三羟甲基氨基甲烷缓冲试剂；所述溶剂包括三羟甲基氨基甲烷缓冲试剂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生步骤中的衍生方法包括线下衍生和在线衍生。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述线下衍生具体步骤包括：先将酶解后的样品溶液与PH调节剂混合，再与线下衍生试剂混合并在避光条件下反应，然后再加入反应终止试剂，静置，过滤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PH调节剂包括碳酸钠缓冲液；所述线下衍生试剂包括丹磺酰氯；所述反应终止试剂包括盐酸甲胺；
所述碳酸钠缓冲液的pH为8.0-11.0；
所述丹磺酰氯的浓度为0.5-3.0mg/ml，线下衍生反应的温度为25-60℃，线下衍生反应的时间为0.5-3.0h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳酸钠缓冲液的PH为9.5；
所述丹磺酰氯的浓度为2.0mg/ml，线下衍生反应的温度为25℃，线下衍生反应的时间为2h。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述在线衍生的衍生程序包括：先抽取样品溶液和第一衍生试剂并混合，得到初步衍生溶液，再抽取第二衍生试剂并与初步衍生溶液混合，然后用洗针液洗针，再进样、清洗。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一衍生试剂包括硼酸钠溶液；所述第二衍生试剂包括临苯二甲醛。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中的流动相为磷酸氢二钠和甲醇。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品前处理步骤具体包括：称取待测样品置于容器中，然后再加入蛋白酶溶液并置于恒温培养箱中酶解，然后过滤，取上清液，得到酶解后的样品溶液。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893611A (zh) * 2010-07-08 2010-11-24 天津春发食品配料有限公司 一种利用反相高效液相色谱分析游离氨基酸的方法
CN114577942A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法
CN115047120A (zh) * 2022-06-14 2022-09-13 贵州茅台酒股份有限公司 分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法
CN115184517A (zh) * 2022-06-30 2022-10-14 广州金域医学检验中心有限公司 一种血浆氨基酸的在线衍生化检测方法
US20230058304A1 (en) * 2021-08-03 2023-02-23 Shimadzu Corporation Amino acid analysis method

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893611A (zh) * 2010-07-08 2010-11-24 天津春发食品配料有限公司 一种利用反相高效液相色谱分析游离氨基酸的方法
US20230058304A1 (en) * 2021-08-03 2023-02-23 Shimadzu Corporation Amino acid analysis method
CN114577942A (zh) * 2022-03-08 2022-06-03 山东省食品药品检验研究院 一种测定特殊医学用途配方食品中22种氨基酸和牛磺酸的方法
CN115047120A (zh) * 2022-06-14 2022-09-13 贵州茅台酒股份有限公司 分析检测白酒大曲中二肽类物质的丹磺酰氯衍生化方法
CN115184517A (zh) * 2022-06-30 2022-10-14 广州金域医学检验中心有限公司 一种血浆氨基酸的在线衍生化检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAODONG JIA ET AL.: "Simultaneous determination of 23 amino acids and 7 biogenic amines in fermented food samples by liquid chromatography /quadrupole time-of-flight mass spectrometry", JOURNAL OF CHROMATOGRAPH A, vol. 1218, pages 2 *

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