CN117054552A - 一种注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种注射用双半胱氨酸中的双半胱氨酸含量的检测方法，采用反向离子对色谱法检测，所述反向离子对色谱法的色谱条件为：色谱柱：Waters X‑Bridge C18，柱体积为4.6×150mm，粒度为5μm；流动相：体积比为10:90的甲醇‑10mmol/L磷酸氢二钠溶液；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；样品室温度为20℃；检测波长：210nm；进样体积为20μL；分析时间为15min；所述磷酸氢二钠溶液中含有7.5mmol/L四丁基硫酸氢铵，pH为8.0。本发明建立了特定的反向离子对色谱法体系对注射用双半胱氨酸进行含量检测，并对影响反向离子对色谱保留的主要因素进行了限定。

Description

一种注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的检测方法
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，具体涉及一种注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的检测方法。
背景技术
药物的含量是评价药物质量的重要指标，在评价药品优劣性方面发挥着重要作用，含量测定也是控制药品质量必不可少的重要手段。注射用双半胱氨酸是用于一次制备锝[99mTc]双半胱氨酸注射液的肾显像剂，临床上能反映肾脏的三维影像，提供肾脏功能参数，诊断多种肾脏疾病。注射用双半胱氨酸主要成分为双半胱氨酸，双半胱氨酸结构含有两个羧基，极性较大，其在普通反向色谱中的保留情况较差。同时双半胱氨酸结构中含有两个巯基，巯基在空气中易氧化形成二硫键，样品的不稳定性也大大增加了其准确检测的难度。普通的化合物双半胱氨酸通常采用化学滴定法中的碘量法(氧化还原法)进行含量测定。但是由于注射用双半胱氨酸中含有其他辅料和赋形剂，干扰氧还原反应，用碘量法无法进行含量测定；另外，实际应用中采用部颁标准中的含量测定方法高效液相色谱法时存在明显问题，在普通C18柱上、甲醇-水为60:40的流动相比例下，双半胱氨酸基本无保留，与溶剂峰及相关杂质峰无法达到基线分离，即使在原方法下调整甲醇-水比例至5:95，主成分的保留情况仍无改善趋势。这严重影响了注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸(EC)含量测定结果的准确性和可靠性，不利于该品种的质量控制和提升，所以开发稳定可靠的含量测定方法，完善质量标准，是十分迫切且必要的。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术无法准确测量注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的问题，从而提供一种注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的检测方法。
为此，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种注射用双半胱氨酸中的双半胱氨酸含量的检测方法，采用反向离子对色谱法检测，所述反向离子对色谱法的色谱条件为：
色谱柱：Waters X-Bridge C18，柱体积为4.6×150mm，粒度为5μm；
流动相：体积比为10:90的甲醇-10mmol/L磷酸氢二钠溶液；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；样品室温度为20℃；检测波长：210nm；进样体积为20μL；分析时间为15min；
所述磷酸氢二钠溶液中含有7.5mmol/L四丁基硫酸氢铵，pH为8.0。
进一步的，所述检测方法包括如下步骤：
S1：分别配制稀释剂，双半胱氨酸线性储备液，待测样品溶液；
S2：将双半胱氨酸线性储备液配制为一系列标准溶液；
S3：使用反向离子对色谱法对一系列标准溶液进行检测，然后将检测结果与一系列标准溶液的浓度进行线性回归得到标准曲线；
S4：使用反向离子对色谱法对待测样品溶液进行检测，然后将检测结果代入步骤S3中得到的标准曲线进行计算；
所述稀释剂与流动相成分相同。
优选地，所述双半胱氨酸线性储备液的配制方法为，精密称取双半胱氨酸15mg置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，然后加入稀释剂稀释至刻度既得。
所述待测样品溶液的配制方法为，取待检测注射用双半胱氨酸，加入稀释剂溶解后转移至量瓶中，取稀释剂进行洗涤，将洗涤液全部转移至量瓶，加入稀释剂稀释至刻度，混匀即得。
所述一系列标准溶液的配制方法为，分别精密移取双半胱氨酸线性储备液0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.2mL、1.3mL至10mL量瓶中，加稀释剂定容，制得双半胱氨酸浓度分别为0.105mg/mL、0.120mg/mL、0.135mg/mL、0.150mg/mL、0.180mg/mL、0.195mg/mL的一系列标准溶液。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明根据注射用双半胱氨酸的结构及性质，建立了特定的反向离子对高效液相色谱法的体系对注射用双半胱氨酸进行含量检测，以四丁基硫酸氢铵作为离子化试剂，对影响反向离子对色谱保留的主要因素，如流动相的pH值、离子对试剂的浓度等，进行了限定。同时为确保该分析方法适用于注射用双半胱氨酸的含量测定，对该分析方法的专属性、线性、准确度、精密度、进样稳定性和耐用性等项目进行了考察，以期为注射用双半胱氨酸的质量控制与提升研究提供参考。
(2)由于双半胱氨酸结构中含有2个可离子化的羧基，四丁基硫酸氢铵作为常用的四丁基铵类离子对试剂，可以与其作用生成中性离子对(RCOO-·TBA+)，增强其在非极性固定相中的保留，相较于普通的反向色谱法，双半胱氨酸在反向离子对色谱中的保留情况得到了明显改善。相比其他方法考察结果，双半胱氨酸在离子对色谱法中出峰明确，保留理想，方法简便，且重现性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中得到的标准曲线图；
图2是试验例中专属性试验的相关溶液图，其中a：稀释剂；b：空白辅料溶液；c：合成起始物溶液；d：合成中间体溶液；e：分离度溶液；
图3是试验例中专属性试验的分离度溶液图谱；
图4是试验例中专属性试验中的双半胱氨酸未破坏的图谱；
图5是试验例中专属性试验中的双半胱氨酸高温降解的图谱；
图6是试验例中专属性试验中的双半胱氨酸光照降解的图谱；
图7是试验例中专属性试验中的双半胱氨酸氧化降解的图谱；
图8是试验例中专属性试验中改变氧化降解条件的相关图谱，其中a：EC主峰；b：RRT＝0.71杂质峰；
图9是试验例中测试方法对比实验的FMOC-Cl衍生化图谱；
图10是试验例中测试方法对比实验的NPM与巯基化合物的衍生反应方程式；
图11是试验例中测试方法对比实验的NPM衍生化图谱，其中a：空白衍生后溶液；b：EC衍生后溶液；
图12是试验例中测试方法对比实验的双半胱氨酸NPM衍生产物结构式，其中a：单衍生产物；b：双衍生产物；
图13是试验例中改变pH的图谱对比，其中a：水相pH 7.0；b：水相pH 8.0；c：水相pH9.0；
图14是试验例中改变有机溶剂种类的图谱对比，其中a：甲醇作有机相；b：乙腈作有机相。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
具体实施方式中使用的仪器包括：
德国赛多利斯公司的BSA224S型万分之一电子天平；德国赛多利斯公司的QUINTIX35-1CN型十万分之一电子天平；梅特勒-托利多公司的XPR6UD5型百万分之一电子天平；美国沃特世公司的Waters e2695型高效液相色谱仪，配有2489/2998型检测器和Empower 3化学工作站；梅特勒-托利多公司的FE28-Standard型pH计；默克密理博公司的Milli Q型超纯水仪；昆山市超声仪器有限公司的KQ-300E型超声波清洗器；上海一恒科学仪器有限公司的DHG-9240A型电热鼓风干燥箱。
具体实施方式中使用的试剂包括：
甲醇(色谱纯，美国J.T.Baker公司)；乙腈(色谱纯，美国J.T.Baker公司)；四丁基硫酸氢铵(含量98％，北京沃凯生物科技有限公司)；十二水合磷酸氢二钠(分析纯，永华化学股份有限公司)；氢氧化钠(电子级，阿拉丁试剂)；磷酸(色谱纯，阿拉丁试剂)；甘露醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；过氧化氢(分析纯；上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水。
双半胱氨酸对照品(使用批号：20190401，纯度：>98％的ABX AdvanceBiochemical Compounds生产的产品，由于其纯度不足，采用多次重结晶的方式使其纯度高于99.9％后进行使用)；双半胱氨酸原料药(批号：2104002，江苏省原子医药研究所江原制药厂，纯度99.6％)；注射用双半胱氨酸(批号：2021060101、2021060102、2021060103，江苏省原子医药研究所江原制药厂，为冻干粉针剂，10ml西林瓶装，注射用双半胱氨酸含量约为1.5mg/瓶)；合成起始物半胱氨酸(Cys)及合成中间体四氢噻唑-4-羧酸(TCA)(江苏省原子医药研究所江原制药厂，纯度均大于99％)。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行，涉及的室温温度范围为10-30℃。
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：
实施例1
本实施例提供一种注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸含量的检测方法，具体步骤如下：
(1)配制稀释剂：水相：称取四丁基硫酸氢铵2.55g、十二水合磷酸氢二钠3.58g，加入1000mL超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至8，过0.22μm滤膜，超声20min，即得。
有机相：量取甲醇1000ml，超声20min，即得。
稀释剂：取水相和有机相，以90:10(v:v)的比例混合均匀，即得。
(2)配制双半胱氨酸线性储备液：精密称取双半胱氨酸15mg置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，然后加入稀释剂稀释至刻度既得；
(3)取江苏省原子医学研究所江原制药厂生产，批号为2021060101、2021060102、2021060103的3批注射用双半胱氨酸作为待测样品，具体配制待测样品溶液为：取注射用双半胱氨酸1瓶，加入稀释剂溶解后，转移至10mL量瓶中，取稀释剂进行洗涤，将洗涤液全部转移至量瓶，加入稀释剂稀释至刻度，混匀即得；
(4)配制一系列标准溶液：分别精密移取双半胱氨酸线性储备液0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.2mL、1.3mL至10mL量瓶中，加稀释剂定容，制得双半胱氨酸浓度分别为0.105mg/mL、0.120mg/mL、0.135mg/mL、0.150mg/mL、0.180mg/mL、0.195mg/mL的一系列标准溶液；
(5)使用反向离子对色谱法对一系列标准溶液进行检测，
反向离子对色谱法的色谱条件为：
色谱柱：Waters X-Bridge C18，柱体积为4.6×150mm，粒度为5μm；
流动相：体积比为10:90的甲醇-10mmol/L磷酸氢二钠溶液；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；样品室温度为20℃；检测波长：210nm；进样体积为20μL；分析时间为15min；
磷酸氢二钠溶液中含有7.5mmol/L四丁基硫酸氢铵，pH为8.0；
(6)将检测结果与一系列标准溶液的浓度进行线性回归得到标准曲线，如图1和表1所示，表1线性试验结果
(7)使用反向离子对色谱法对待测样品溶液进行检测，每批测2瓶，每瓶进2次，每批一共4组数据，然后将检测结果代入上述标准曲线进行计算，相关检测结果见下表2，以每瓶注射用双半胱氨酸中含有双半管氨酸1.5mg为100％计算。
表2三批注射用双半胱氨酸含量检测结果
可见3批制剂的EC含量均在90％～110％范围内，符合要求。
试验例
1.溶液配置
(1)空白辅料溶液配制
称取甘露醇20mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL，用稀释剂溶解并稀释定容，摇匀，即得。
(2)对照品溶液配制
精密称取双半胱氨酸对照品1.5mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，加入稀释剂稀释至刻度，混匀，即得(0.15mg/mL)。平行配制2份，记为STD-A和STD-B。
(3)供试品溶液配制
取注射用双半胱氨酸1瓶，加入适量稀释剂溶解后，转移至10mL量瓶中，取稀释剂多次洗涤，将洗涤液全部转移至量瓶，加入稀释剂稀释至刻度，混匀，即得供试品溶液。
(4)合成杂质和分离度溶液配制
称取合成起始物适量，加适量稀释剂超声溶解后定容，混匀，制得浓度为1.5mg/mL的合成起始物储备液。取该储备液1mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂稀释定容，混匀，即得合成起始物溶液。
称取合成中间体适量，加适量稀释剂超声溶解后定容，混匀，制得浓度为1.5mg/mL的合成中间体储备液。取该储备液1mL，置于10mL量瓶中，加稀释剂稀释定容，混匀，即得合成中间体溶液。
称取双半胱氨酸原料药1.5mg，甘露醇20mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，加入合成起始物、中间体储备液各1mL，加稀释剂定容，混匀，即得分离度溶液。
2.专属性实验
(1)将稀释剂、空白辅料溶液、合成起始物溶液、合成中间体溶液和分离度溶液分别进样考察，记录色谱图。
相关溶液图谱见图2，结果表明，稀释剂、空白辅料、合成起始物和合成中间体均在双半胱氨酸出峰处(RT＝6.6min)无干扰；分离度溶液图谱见图2和图3所示，可以看到，双半胱氨酸与合成中间体(RT＝5.9min)之间的分离度为2.4，双半胱氨酸与其后未知杂质(RT＝8.1min)之间的分离度为4.0，均大于2.0，
综上所述稀释剂、空白辅料、合成起始物和合成中间体均对双半胱氨酸的检测无干扰，且分离度高，该测定方法可行。
(2)取双半胱氨酸原料药，按表3所列强制降解条件和溶液配制方法，进行强制降解并制备强制降解溶液。取各条件下强制降解溶液，进样考察(用二极管阵列检测器)，记录色谱图，计算物料平衡和主峰降解度。
结果表明，各破坏条件下主成分的降解率均在5％～15％之间，物料平衡均在90％～110％范围内，降解前后物料守恒，结果见表4，相关图谱见图4、5、6、7；主成分和降解出的主要杂质使用二极管阵列检测器分析，峰纯度角均小于纯度阈；各个杂质与主成分之间分离度均大于2.0，且均不干扰主成分的测定。
表3强制降解条件及溶液制备方法
表4强制降解试验结果
实验过程中发现双半胱氨酸对氧化剂较为敏感，提高氧化剂的浓度或用量，EC主峰减小，而保留时间约为4.67min的色谱峰(RRT＝0.71)明显增大，0.3％H2O2和0.03％H2O2的图谱见图8。推测该杂质为EC结构中的巯基氧化所生成，巯基易氧化形成二硫键。这一情况在注射用双半胱氨酸的检测和使用的过程中应特别注意，避免其与氧化剂接触，现配现用，尽量减少其在空气中暴露的时间。
3.系统适用性实验
取平行配制的2份对照品溶液，记为STD-A和STD-B，连续进样，各进样3针，记录色谱图进样考察，记录色谱图。
结果见表5，连续进样3针STD-A和3针STD-B(共6针)响应因子的RSD为1.01％，保留时间的RSD为0.14％；6针双半胱氨酸主峰拖尾因子均不大于2.0，理论塔板数均不低于5000，表明系统适用性良好。
表5系统适用性试验结果
4、准确度实验
通过加样回收率试验来考察，称取空白辅料甘露醇20mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL，分别精密加入双半胱氨酸1.05mg、1.50mg、1.95mg，加稀释剂稀释定容，制成加样70％、100％、130％三种浓度水平的EC回收率供试品溶液，每个浓度水平下平行配制3份。同时配制对照品溶液，进样分析，记录主峰面积，按外标法计算EC回收率溶液的浓度。
具体结果见表6，双半胱氨酸在该测定方法下的回收率在93.31％～103.04％范围内，9份溶液的回收率RSD为3.79％。
表6回收率试验结果
5、精密度实验
(1)系统精密度
称取空白辅料甘露醇20mg，精密称取双半胱氨酸原料药1.50mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，用稀释剂稀释定容，制成EC精密度供试品溶液(0.15mg/mL)，取该溶液连续进样6次，记录主峰保留时间和峰面积。
结果见表7，双半胱氨酸保留时间的RSD为0.18％，峰面积的RSD为0.48％，表明系统精密度良好。
表7系统精密度试验结果
(2)重复性
平行配制6份EC精密度供试品溶液，同时配制对照品溶液，进样分析，记录EC主峰面积，按外标法计算EC浓度，并计算回收率及其RSD。
结果见表8，平行配制的6份精密度供试品溶液，EC的回收率在98.27％～99.39％，RSD为0.44％，在可接受范围内，表明该方法的重复性较好。
(3)中间精密度
由不同的实验人员，重复性试验操作，使用不同高效液相仪器，在不同时间，进样检测，记录EC主峰面积，并计算12份精密度供试品溶液的回收率及其RSD。
结果详见表8，第2名实验人员所配制6份精密度供试品溶液的回收率在99.16％～100.87％，RSD为0.64％；两名实验人员所配制12份EC精密度供试品溶液回收率的RSD为0.72％，结果表明本方法的中间精密度良好。
表8重复性和中间精密度试验结果
6、进样稳定性实验
配制对照品溶液和供试品溶液各一份，放置于进样盘内(控温20℃)，于0h、1h、2h、3h、4h、8h进样检测，每个时间点下进样2次，记录色谱图，取峰面积的平均值，计算与0h的相对偏差，以相对偏差不大于2.0％为稳定性可接受。
结果见表9，对照品溶液在进样盘中(控温20℃)至少可以稳定3h，供试品溶液至少可以稳定2h。
表9进样稳定性试验结果
7、滤膜吸附性实验
配制供试品溶液和对照品溶液，考察供试品的滤膜吸附性。取供试品溶液一部分直接进样，一部分过0.45μm尼龙滤膜，分别弃去初滤液1mL、2mL、3mL，取续滤液进样，每份溶液进样2次，记录色谱图，按外标法计算EC含量。
结果见表10，过滤后所测得的EC含量与直接进样相比，偏差均不大于2.0％，尼龙滤膜对双半胱氨酸基本无吸附。
表10滤膜吸附性试验结果
8、耐用性实验
称取空白辅料甘露醇20mg，精密称取双半胱氨酸原料药1.50mg，置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，用稀释剂稀释定容，制成EC耐用性供试品溶液(0.15mg/mL)，并配制对照品溶液。在实施例1的色谱条件的基础上，分别考察检测波长变化±2nm、流速变化±0.2mL/min、柱温变化±5℃对双半胱氨酸含量测定的影响，每个条件下EC耐用性供试品溶液重复进样2次，记录色谱图，并计算回收率及其RSD。
相关结果见表11、表12和表13，结果表明，各条件下的系统适用性均符合要求，各参数改变条件下测得的EC平均回收率在100.13％～101.33％，各条件下EC回收率的RSD(n＝6)均小于1.0％，表明检测波长变化±2nm、流速变化±0.2mL/min、柱温变化±5℃对EC含量测定无明显影响，该方法耐用性较好。
表11耐用性(波长变化±2nm)试验结果
表12耐用性(流速变化±0.2mL/min)试验结果
表13耐用性(柱温变化±5℃)试验结果
9、测试方法对比实验
(1)碘量法
碘量法是现有的常用的双半胱氨酸的含量测定方法，具体为：取待测样品50mg，精密称定，加2.0mol/L盐酸溶液10ml溶解后，精密加入碘滴定液(0.05mol/L)10ml，密塞，置暗处15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示剂2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/l)相当于2.6836mg的C8H16N2O4S2。
由于注射用双半胱氨酸中含有其他辅料和赋形剂(如甘露醇)，会干扰氧还原反应，用碘量法无法进行含量测定。
(2)FMOC-Cl柱前衍生化色谱法实验
双半胱氨酸的结构中有氨基与巯基，理论上也可与FMOC-Cl发生衍生化反应，尝试建立FMOC-Cl柱前衍生化色谱法测定注射用双半胱氨酸的含量。以氯甲酸-9-芴甲酯(FMOC-Cl)为衍生试剂，对双半胱氨酸及其合成中间体、起始物的氨基端进行衍生，再经HPLC检测，具体方法如下：
取注射用双半胱氨酸样品，加水，配制成1.5mg/ml注射用双半胱氨酸溶液；取上述溶液250μl，加入250μl硼酸盐缓冲液(pH 8.5)，混匀后加入FOMC-Cl乙腈溶液(2.5mg/ml)500μl，立即涡旋反应120s；加入500μl终止液(20％醋酸溶液)和500μl乙腈/水(v/v，1:1)，继续涡旋120s。以0.45μm滤膜过滤，取续滤液进样检测，色谱条件如下表14所示。
表14FMOC-Cl柱前衍生化色谱法色谱条件
空白辅料溶液配制：以水代替注射用双半胱氨酸溶液，按上述方法衍生化，作为空白辅料溶液进样检测。
对比衍生化后的空白辅料溶液，双半胱氨酸衍生化后主要7个新的色谱出峰，见图9。给出衍生反应的可能产物结构(EC与不同量FMOC产物)根据FMOC-Cl用量考察结果，当FMOC-Cl与双半胱氨酸的摩尔比在4:1以上时，g色谱峰面积有稳定的趋势，响应相对较高，且与相邻干扰峰分离较好。结合制剂样品的质谱数据，该色谱峰对应的质谱信号主要为m/z1157[M+H]+、m/z 1179[M+Na]+，推测为FMOC-Cl与双半胱氨酸按4:1反应所得衍生产物。初步选定该衍生产物进行定量，但经实验后发现，在目标浓度范围内(0.12mg/mL～0.18mg/mL)，EC浓度与目标衍生产物的线性不佳，r＝0.9945不满足要求；且目标衍生产物稳定性不足2小时，无法满足分析与定量要求。
(3)NPM柱前衍生化色谱法实验
双半胱氨酸的结构中有2个游离巯基，理论上可与马来酰亚胺类试剂如N-苯基马来酰亚胺(NPM)发生迈克尔加成，形成相应的衍生产物。该类衍生化反应具有选择性高、快速的特点，同时反应条件相对温和，衍生产物在反向柱上的保留增加，且紫外响应也会增强，可结合高效液相色谱法间接测定含量，反应方程式见图10。参考NPM与半胱氨酸、乙酰半胱氨酸衍生化的相关文献，尝试建立NPM柱前衍生化色谱法测定注射用双半胱氨酸的含量。初步控制NPM与双半胱氨酸的摩尔比在5:1，衍生化方法为：精密移取0.6mg/mL的采用0.1mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂的双半胱氨酸原料药溶液1mL，加入pH 6.0磷酸盐缓冲液1mL，混匀，加入NPM乙腈溶液(1mg/mL)2mL，室温下反应15min，加入乙腈/水1:1(v/v)稀释至5mL，摇匀后过滤，取续滤液进样分析。色谱条件如下：色谱柱采用Waters ACQUITY UPLCBEH C18(1.7μm，2.1×100mm)，检测器为二极管阵列检测器，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，以0.1％甲酸/水-乙腈(80:20)为流动相等度洗脱。相关结果见图11，在虚线框部分为空白衍生后溶液和EC衍生后溶液在图谱上的不同之处，与空白对比，EC衍生后主要在1.5～4.5min内、9.8min和10.8min处有新的出峰。理论上NPM与双半胱氨酸的衍生产物结构主要有两种，单衍生产物和双衍生产物，见图12。利用LC-MS鉴定可能的衍生产物，质谱结果显示可能的衍生产物峰质谱信号均以m/z 614、m/z 615[M+H]+为主，与双衍生产物(分子量614)一致，已确认空白中无单衍生及双衍生产物的质谱信号，考虑可能为不同的异构体。双半胱氨酸与NPM的衍生效率不高，对pH、衍生条件进行了调整，衍生效率仍无明显提升，且衍生产物有多种形式，这也会导致无法准确定量。
由于注射用双半胱氨酸相比双半胱氨酸原料药增加了辅料和赋形剂，因此无法NPM柱前衍生化色谱法检测注射用双半胱氨酸中双半胱氨酸的含量。
10、离子对色谱条件对结果的影响
(1)流动相pH影响
用磷酸和氢氧化钠溶液分别调节水相pH为7.0、8.0、9.0，考察了双半胱氨酸在不同流动相pH下的出峰情况，相关结果见图13。流动相pH对双半胱氨酸的保留和峰形影响较大，当水相pH为7.0时，EC保留时间为3.97min，色谱峰明显拖尾，且与其他杂质峰无法达到基线分离。当水相pH为9.0时，EC保留时间为8.54min，主峰形较差，前段基线明显抬高，影响积分。而EC在水相pH为8.0时，出峰时间适宜，峰形及与他杂质峰的分离情况均较好。
(2)有机溶剂种类考察
本实验对比了EC在甲醇和乙腈作有机相时的出峰情况，相关结果见图14。虽然乙腈的截止波长较甲醇小，有利于降低基线噪声，提高检测的灵敏度，但乙腈的洗脱能力过强，保留时间过短，明显不利于EC的保留，会影响后期检测的准确度。
选择有机相与水相的比例为10:90，在提高保留时间的同时，避免继续提高水相比例对色谱柱寿命产生不利影响。
(3)离子对试剂浓度考察
本实验考察了离子对试剂的浓度对EC的保留及峰形的影响，相关结果见表15。在研究范围内，EC保留时间的差别并不明显，但在5mmol/L的浓度下，主峰后杂质无法有效检出。考虑离子对浓度过高时需要较长的平衡和冲洗时间，缩短色谱柱的使用寿命，所以在保证主成分保留及峰形的前提下，选择离子对试剂浓度为7.5mmol/L较为合适。
表15离子对试剂浓度考察结果
(4)缓冲盐浓度考察
本实验考察了缓冲盐(磷酸氢二钠)浓度分别为5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L时，EC的保留及峰形情况，相关结果见表16。在考察范围内，双半胱氨酸的保留时间随缓冲盐浓度的增加有减小的趋势，综合保留时间、峰形和分离情况，选择缓冲盐浓度为10mmol/L。
表16缓冲盐浓度考察结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种注射用双半胱氨酸中的双半胱氨酸含量的检测方法，其特征在于，采用反向离子对色谱法检测，所述反向离子对色谱法的色谱条件为：
色谱柱：Waters X-Bridge C18，柱体积为4.6×150mm，粒度为5μm；
流动相：体积比为10:90的甲醇-10mmol/L磷酸氢二钠溶液；
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；样品室温度为20℃；检测波长：210nm；进样体积为20μL；分析时间为15min；
所述磷酸氢二钠溶液中含有7.5mmol/L四丁基硫酸氢铵，pH为8.0。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：分别配制稀释剂，双半胱氨酸线性储备液，待测样品溶液；
S2：将双半胱氨酸线性储备液配制为一系列标准溶液；
S3：使用反向离子对色谱法对一系列标准溶液进行检测，然后将检测结果与一系列标准溶液的浓度进行线性回归得到标准曲线；
S4：使用反向离子对色谱法对待测样品溶液进行检测，然后将检测结果代入步骤S3中得到的标准曲线进行计算；
所述稀释剂与流动相成分相同。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述双半胱氨酸线性储备液的配制方法为，精密称取双半胱氨酸15mg置于10mL量瓶中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL溶解，然后加入稀释剂稀释至刻度既得。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液的配制方法为，取待检测注射用双半胱氨酸，加入稀释剂溶解后转移至量瓶中，取稀释剂进行洗涤，将洗涤液全部转移至量瓶，加入稀释剂稀释至刻度，混匀即得。
5.根据权利要求2-4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述一系列标准溶液的配制方法为分别精密移取双半胱氨酸线性储备液0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.2mL、1.3mL至10mL量瓶中，加稀释剂定容，制得双半胱氨酸浓度分别为0.105mg/mL、0.120mg/mL、0.135mg/mL、0.150mg/mL、0.180mg/mL、0.195mg/mL的一系列标准溶液。
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