CN101726594A - 快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-ⅰ型抗体的垂直流免疫印迹法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种免疫化学和生物化学分析方法，特别适用于婴儿、采血困难和不愿采血者快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体的垂直流免疫印迹法。本发明是通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将HIV-1抗原包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法。该方法使尿液样本在可控时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合度，从而提高检测灵敏度。通过本发明可快速检测尿液中的HIV-1抗体，确认HIV-1感染状况。可用于实验室诊断确认、药物治疗效果评价等，适宜基层普及使用，具有较大的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明提供一种免疫化学和生物化学分析方法——垂直流免疫印迹法，特别适用于婴儿、采血困难和不愿采血者快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体的垂直流免疫印迹法。
背景技术
自上世纪80年代被发现以来，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染尚未找到有效的预防和根治手段，早诊断、早隔离还是目前防止其进一步传播扩散的主要办法。用于检测HIV感染的方法包括核酸检测、抗体检测和病毒载量检测等，其中抗体检测因其简单、快速，被世界卫生组织和卫生部规定作为临床检测的主要方法。临床检测HIV抗体，免疫印迹法(WB)是重要的方法，主要用于确认初筛结果为HIV阳性的血清样本。目前国内未见人类免疫缺陷病毒-I型抗体尿液检测确认方法。
与血液检查相比，尿液检查有多种优点：尿液为非创伤性获得的样品，适用于婴儿、采血困难和不愿采血者；尿液中HIV病毒滴度相当低，目前尚未见经尿液感染HIV的相关报道，消除了采集样本过程中感染的风险；尿液抗体含量稳定，常温可存放55天，2～8℃可储存1年，储存和运输条件要求比血液低等。但研究表明尿液中HIV-1抗体的浓度较低，特别是血清中浓度较高的p24抗体浓度低，因此需要提高尿液检测技术。
用传统免疫印迹法检测尿液样本HIV-1抗体，被检抗体在反应缓冲液中自由水平扩散，结合时间长、效率低，且灵敏度远低于血液检测，不能作为常规检测手段。本垂直流免疫印迹法可快速检测尿液人类免疫缺陷病毒-I型抗体，且简便实用、敏感特异。
发明内容
本发明的目的是针对性地研制出一种易于基层普及使用的简便、敏感、特异的快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法。采用垂流检测方法，利用真空压力作用，使尿液样本在控制的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，同时反应液中的抗体也定向转移到膜上与抗原结合，通过设定检测流程和条件参数，从而提高抗体与抗原结合的速率，缩短反应时间，实现快速检测尿液中HIV-1抗体的目的。
本快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法，是通过采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和电转，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在可控的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，从而增加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度，以快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)的抗体来确认HIV-1感染与否。
本发明在传统免疫印迹法的基础上，采用将包被有HIV-1抗原的硝酸纤维素膜粘合于自制反应槽底的方法，通过与真空抽滤系统和支架搭建成垂直流检测装置，利用外力作用使尿液样本在一定时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加快了抗体与试剂条的反应速率的同时，确保抗体和抗原充分反应，提高检测特异性。
本垂直流免疫印迹法，是通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将HIV-1抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在可控的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，用来加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度和特异性，从而通过快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体，以确认HIV-1感染与否。
相应的，本发明提供了一种垂直流免疫印迹法快速检测尿液中HIV-1抗体的检测装置，由包被有HIV-1抗原的硝酸纤维素膜、自制反应槽、真空抽虑系统和支架共同组建而成。
使用本垂直流免疫印迹法，可以简便、灵敏、特异的检测尿液中HIV-1抗体，用于实验室的诊断确认、药物治疗效果评价、流行病学调查等，适宜基层普及使用，具有较大的推广应用价值。
具体步骤如下：
一、材料准备
1、试剂：
(1)裂解液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.8)、7％(W/V)十二烷基硫酸钠；
(2)电泳液：甘氨酸10克、三羟甲基氨基甲烷6克、十二烷基硫酸钠2克于1升蒸馏水(PH8.7)；
(3)电转液：氯化钠13克、乙二胺四乙酸二钠2克、三羟甲基氨基甲烷9.5克溶于1升蒸馏水(PH7.5)；
(4)封闭液：5％牛血清白蛋白；
(5)粘合剂：α-氰基丙烯酸乙酯瞬间粘合剂；
(6)10倍漂洗液：氯化钠80克、磷酸氢二钠28.8克、磷酸二氢钾2.4克溶于1升蒸馏水(PH7.0)；
(7)结合物：碱性磷酸酶标记兔抗人免疫球蛋白(IgG)，按1∶5000稀释；
(8)底物：1.2克5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、2.3克氯化硝基四氮唑蓝溶于1升蒸馏水。
2、载体：硝酸纤维素膜(NC膜)。
3、抗原：HIV-1抗原蛋白。
二、检测方法
1、制备HIV-1抗原NC膜
将灭活HIV-1抗原按1∶2加入裂解液，充分混合，置于56℃水浴中裂解30分钟。裂解后的抗原用4％浓缩胶、12％分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在150伏电泳60分钟后取出蛋白胶，与硝酸纤维素膜和滤纸组成“三明治”，在90伏电转55分钟后取出硝酸纤维素膜，于封闭液中封闭1小时，然后37℃烘干备用。
2、制备垂直流检测装置
将包被HIV-1抗原的硝酸纤维素膜(6cm×8cm)粘合到特制的反应槽上，粘合剂涂抹均匀，不留缝隙以免渗漏。待粘合剂彻底干燥后，将反应槽置于盒状支架上，并将支架上的塑料管与真空抽滤器相连。注意整个装置的密封性。
3、检测流程及条件参数
上述制备的反应槽，每槽加入1毫升尿液样本，置于摇床旋摇5分钟。连接垂直流反应检测装置，打开真空抽滤器，由小到大调节压差为“0.5个”工业大气压，控制抗原-抗体反应时间(约为15分钟)。抽滤完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。然后加入碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG，置于摇床旋摇30分钟。反应完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。再加入底物，置于振荡器上旋摇10分钟后弃去，观察反应结果。
4、检测结果显示及判断(见图1、图2)
采集12例HIV-1抗体阳性志愿者的血液样本和尿液样本、10例阴性志愿者血液样本和尿液样本，分别用垂直流免疫印迹法和传统免疫印迹法检测，通过观察HIV-1主要抗原蛋白阳性反应条带，如ENV带(gp41、gp120/gp160)、POL带(p31)、GAG(p24)等，最后按照世界卫生组织相关规定判断检测结果。图1为垂直流免疫印迹法检测尿液样本结果，左侧为1-12号阳性志愿者的尿液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的尿液样本检测结果。图2为传统免疫印迹法检测血液样本结果，每份血液样本与尿液样本来源对应，左侧为1-12号阳性志愿者的血液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的血液样本检测结果。
按世界卫生组织相关规定判断图1和图2所示的检测结果，垂直流免疫印迹法检测尿液样本与传统免疫印迹法检测血液样本，对22位志愿者HIV感染情况的判断结果相同(见表1)，表明垂直流免疫印迹法可简便、特异、敏感的快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体。
因此，本发明在传统免疫印迹法的基础上，采用垂直流技术，使尿液样本在可控的时间内垂直通过硝酸纤维素膜，既加速了抗原抗体反应，缩短检测时间，又增加了抗原抗体的结合度，从而提高检测灵敏性。通过本发明可快速检测尿液中的HIV-1抗体，确认HIV-1感染状况。可用于实验室的检测确认、药物治疗效果评价、流行病学调查等，适宜基层普及使用，具有较大的推广应用价值。
附图说明
图1为垂直流免疫印迹法检测尿液样本结果，左侧为1-12号阳性志愿者的尿液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的尿液样本检测结果。
图2为传统免疫印迹法检测血液样本结果，每份血液样本与尿液样本来源对应，左侧为1-12号阳性志愿者的血液样本检测结果，右侧为13-22号阴性志愿者的血液样本检测结果。
具体实施方式
以下非限制性实施例旨在更加详细地阐释本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一、材料准备
1、试剂：
(1)裂解液：1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.8)、7％(W/V)十二烷基硫酸钠；
(2)电泳液：甘氨酸10g、三羟甲基氨基甲烷6g、十二烷基硫酸钠2g溶于1升蒸馏水(PH8.7)；
(3)电转液：氯化钠13g、乙二胺四乙酸二钠2g、三羟甲基氨基甲烷9.5g溶于1升蒸馏水(PH7.5)；
(4)封闭液：5％牛血清白蛋白；
(5)粘合剂：α-氰基丙烯酸乙酯瞬间粘合剂；
(6)10倍漂洗液：氯化钠80g、磷酸氢二钠28.8g、磷酸二氢钾2.4g溶于1升蒸馏水(PH7.0)；
(7)结合物：碱性磷酸酶标记兔抗人IgG，按1∶5000稀释；
(8)底物：1.2g 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、2.3g氯化硝基四氮唑蓝溶于1升蒸馏水。
2、载体：硝酸纤维素膜(NC膜)。
3、抗原：HIV-1抗原蛋白。
二、检测方法
1、制备HIV-1抗原NC膜
将灭活HIV-1抗原按1∶2加入裂解液，充分混合，置于56℃水浴中裂解30分钟。裂解后的抗原用4％浓缩胶、12％分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在150伏电泳60分钟后取出蛋白胶，与硝酸纤维素膜和滤纸组成“三明治”，在90伏电转55分钟后取出硝酸纤维素膜，于封闭液中封闭1小时，然后37℃烘干备用。
2、制备垂直流检测装置
将包被HIV-1抗原的硝酸纤维素膜(6cm×8cm)粘合到特制的反应槽上，粘合剂涂抹均匀，不留缝隙以免渗漏。待粘合剂彻底干燥后，将反应槽置于盒状支架上，并将支架上的塑料管与真空抽滤器相连。注意整个装置的密封性。
3、检测流程及条件参数
上述制备的反应槽，每槽加入1毫升尿液样本，置于摇床旋摇5分钟。连接垂直流反应装置，打开真空抽滤器，由小到大调节压差为“0.5个”工业大气压，控制抗原-抗体反应时间(约为15分钟)。抽滤完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。然后加入碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG，置于摇床旋摇30分钟。反应完毕，加入漂洗液，置于摇床旋摇5分钟后弃去，共3次。再加入底物，置于振荡器上旋摇10分钟后弃去，观察反应结果。
4、检测结果显示及判断(见附图1)
图1中左侧为12份阳性样本检测结果；右侧为10份阴性样本检测结果。按照世界卫生组织相关规定判断检测结果。
按上述方法条件进行严格的检测确认，并与传统免疫印迹法检测血液样本的结果相比较，其HIV-1主要抗原蛋白均显示阳性反应条带，，如ENV带(gp41、gp120/gp160)、POL带(p31)、GAG(p24)等，实验结果表明：本垂直流免疫印迹法检测尿液样本与传统免疫印迹法检测血液样本的结果相符合。见表1。
表1 主要抗原蛋白灵敏度比较结果(12份阳性及不确定样本)
Claims (2)
1.一种快速检测尿液中人类免疫缺陷病毒-I型抗体的垂直流免疫印迹法，其特征是通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转，将人类免疫缺陷病毒-I型抗原包被于硝酸纤维素膜上，然后将膜粘合于自制反应槽的底部，并与真空抽滤系统结合构成垂直流免疫印迹法检测方法，使尿液样本在较短时间内垂直通过硝酸纤维素膜，加速抗原抗体反应，增加抗原抗体的结合，提高检测灵敏度及特异性，从而快速检测尿液中的人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-1)抗体，以确认HIV-1感染与否。
2.根据权利要求1所述的垂直流免疫印迹法，其特征在于可以利用垂直流免疫印迹法快速检测尿液中HIV-1抗体，用于实验室的检测确认、药物治疗效果评价、流行病学调查研究等。
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2009
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