CN100396774C - 检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药残留的免疫化学速测技术领域。公开了一种用于快速检测磺胺类药物残留的胶体金试纸条，该试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬构成。PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫上包被了抗磺胺类药物特异性单克隆抗体-胶体金标记物；硝酸纤维素膜上包被了N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物作为检测线，包被了兔抗鼠IgG作为质控线。本发明还公开一种能够分泌专门识别磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞BDRXN-2的制备，该杂交瘤细胞保藏在CCTCC，其保藏号为CCTCC-C200629。本发明的检测磺胺类药物的试纸条具有灵敏度高，特异性强，操作简便，检测快速、准确和检测费用低廉等显著优点。

Description

检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体地说，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用以快速检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条。

背景技术

我国加入WTO以来，食品安全问题越来越受到人们的关注，政府对食品安全问题的重视是前所未有的，其中食品、农副产品中农兽药残留污染是国内外最为关心的安全卫生问题。

磺胺类药物是人工合成的具有对氨基苯磺酰胺母核结构的广谱抗菌药物，它作为兽药和饲料添加剂，在食源性动物的饲养中被广泛应用，在动物疾病的防治方面具有显著的疗效。但由于磺胺类药物的不合理使用而导致其在动物源性食品中残留，并通过食物链进入人体，对人体产生一定的毒副作用，如引起结晶尿，血尿，尿痛，尿少等症状，或产生一些皮炎、发热等过敏反应以及致癌性作用。除此之外由于磺胺类的滥用导致大量耐药菌株的产生给临床用药带来了很大的困难。磺胺类药物残留已引起了国内外的高度重视。因此我国以及美国、欧盟等国家规定了动物源性食品中磺胺类药物最高残留限量(MRLs)为0.1mg/kg。为杜绝磺胺类药物超标的畜产品进入市场，必须加强对磺胺类药物残留的监测。

目前对磺胺类药物残留常用的检测方法主要有两种：一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)，一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)。

1、色谱技术对磺胺类药物检测是非常有效、准确和敏感的，但也存在如下缺点：(1)待检测样品预处理程序繁琐费时(2)需要经过专业培训的技术人员操作，操作人员要有丰富的相关经验，操作人员必须了解影响色谱分析的各种干扰因素，了解所使用的预处理方法的优缺点，才能获得可靠的分析结果；(3)需要昂贵的仪器设备辅助，推广使用受到限制。(4)仪器保养的要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高。

2、酶联免疫吸附法(ELISA)是以竞争性酶联反应为检测原理，以抗磺胺类药物抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶标结合物同时加入酶标板，反应后通过显色测OD值来判定结果。存在的缺点是：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，不利于在基层单位进行推广使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长，全程需要2h-4h；(4)检测所需费用较高，不能实现单份检测。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay GICA)是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高，操作简便，检测快速、准确的专门用于检测磺胺类药物残留的试纸条及其制备方法。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明是这样实现的：

为了实现本发明，申请人制备了一种能分泌抗磺胺类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞BDRXN-2，于2005年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC-C200629。

一种适用于检测磺胺类药物残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其具体结构是：在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有由N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白偶联物(SDL-HSA)构成的检测线(5)；有兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。

一种适用于检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)用对氨基苯甲酸甲酯与对乙酰氨基苯磺酰氯反应合成了半抗原N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)，该半抗原包含磺胺类药的共同母核结构对氨基苯磺酰胺。

2)将N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)与载体蛋白偶联，形成N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物；

3)用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白(人血清白蛋白)偶联物免疫小鼠，得到分泌抗磺胺类药的单克隆抗体的细胞BDRXN-2，其保藏号为CCTCC-C200629；

4)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

6)将步骤3)制备的抗磺胺类药单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到抗磺胺类药单克隆抗体-胶体金标记物；

7)将抗磺胺类药单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

8)将N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白偶联物(SDL-HSA)包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5)；并将兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；

9)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测磺胺类药物残留的免疫胶体金试纸条。

本发明用固化于硝酸纤维素膜检测线上的N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物作为竞争性捕获抗原，用胶体金标记抗磺胺类药单克隆抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有磺胺类药物。通过待检样品中的磺胺类药物与包被于硝酸纤维膜上的N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物共同竞争抗磺胺类药单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线条带颜色深浅或红色条带有无来判断待测样品液中是否含有磺胺类药物残留。检测时将本发明试纸条分别放入阴性标准品及待检样品中，15分钟后肉眼观察结果，若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性标准品试纸条检测线颜色或者待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带，表示样品中有磺胺类药物残留；若待测样品中试纸条检测线颜色等于或深于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带，表示为样品中没有磺胺类药物残留；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条失效。

本发明的试纸条(其结构如图2所示)由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按图示的顺序依次粘附在PVC背衬(7)上组装而成的。结合垫上包被有本发明制备的抗磺胺类药单克隆抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有检测线(5)和质控线(6)，其中检测线为本发明制备的N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白偶联物(SDL-HSA)，质控线为本发明制备的兔抗鼠IgG。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司；所述的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒购自ROCKLAND公司；所述的检测鸡蛋中磺胺嘧啶残留的ELISA试剂盒购于英国RANDOX公司。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1、本发明的检测磺胺类药物的免疫胶体金试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(15分钟)等优点。

2、本发明的试纸条可用于磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺嘧啶残留的检测，其交叉反应率分别为100％、101.1％、114.4％和64％，具有多功能和特异性好等特点。

3、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。

4、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。

5、本发明的检测试纸条储存方便，对储存温度要求不高，在4～8℃下有效保质期可达一年；在室温下有效保质期为六个月。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图；

图2：本发明检测试纸条的组装示意图；

图中1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为PVC背衬。

图3：本发明检测试纸条结果判定示意图；

图中：A：表示阴性标准品结果，B：表示没有磺胺类药物残留的样品检测结果，C、D：表示磺胺类药物残留的样品检测结果，E、F：表示试纸条失效。

图4：N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)的红外光谱；

图5：N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)的核磁共振氢谱图；

图6：N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)重水交换后的核磁共振氢谱图；

图7：N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)、人血清白蛋白(HSA)及N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白(SDL-HSA)的紫外扫描图谱。

具体实施方式

实施例1(制备实施例)

检测磺胺类药物的免疫胶体金试纸条的制备方法

1、小分子半抗原N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)的合成，该半抗原包含磺胺类药的共同母核结构对氨基苯磺酰胺。具体步骤是：

(1)准确称取对氨基苯甲酸甲酯3.2g用20mL无水吡啶将其溶解后，倒入100mL两口圆底烧瓶。

(2)搅拌状态下，将真空干燥过的6.0g对乙酰氨基苯磺酰氯缓慢加入到圆底烧瓶，加完后在油浴上回流使溶液变为红色。

(3)回流几分钟后，反应液变为非常粘稠的红色物质，再过几分钟反应液变为棕色液体，继续回流15min，反应液变为棕黄色的液体。反应液冷却至室温后，将其倾入50mL蒸馏水中。

(4)将反应液置于冰浴中冷却并持续搅拌30min，有大量灰色沉淀产生。

(5)将反应液装入离心管，8000rpm，离心30min，弃上清，沉淀用40mL 10％氢氧化钠溶液溶解后，回流1h，冷却。

(6)用6N盐酸将反应液中和至pH5左右，有大量白色沉淀出现

(7)将反应物装入离心管，8000rpm，离心30min，弃上清，用50mL蒸馏水重悬沉淀，乙酸乙酯萃取三次，1.5g Na₂SO₄干燥。

(8)蒸去大部分溶剂，直到开始有晶体析出，趁热将反应液倒入100mL烧杯中，真空干燥过夜除去溶剂。

(9)用10％乙醇重结晶，大量蒸馏水洗涤，真空干燥后保存于棕色瓶中。

(10)通过AVATAR360傅立叶红外光谱仪(由华中师范大学分析测试中心协助分析)对合成物官能团加以确认，由图4所示的红外图谱可知，IR(KBr)，υmax(cm-1)：3458～3370(N-H，＞N-H)，3198～2476(O-H)，1676(C＝O)，1604(Ar)，1507(Ar)，1441(Ar)，1313，1148(S＝O)，1092，922，830，777。结果表明，合成的N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)从官能团来看是正确的。通过Mercury 400NMR核磁共振仪(由华中师范大学分析测试中心协助分析)对N-磺胺-4-氨基苯甲酸(SDL)的分子结构加以判定，由核磁共振氢谱图可知(图5)，1H-NMR(400MHZ，DMSO-d6)：δ12.68(brs，1H，COOH)，10.43(s，1H，NH)，7.77(d，2H，8.7，ArH)，7.46(d，2H，8.7，ArH)，7.17(d，2H，8.7，ArH)，6.56(d，2H，8.7，ArH)，6.05(brs，2H，NH)。由图6可知，通过重水交换后，图5显示的一些活性氢的振动减弱或消失了，表明合成的SDL从官能团的位置(即结构)来看是正确的。

2、N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物的合成与鉴定，具体步骤是：

(1)N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白偶联物(SDL-HSA)的合成：

称取人血清白蛋白(HSA)67mg，先溶于10mLPBS，冰浴搅拌下再加入等体积的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；称取对氨基苯磺酰胺5.84mg，溶于1mL DMF。向对氨基苯磺酰胺溶液中加入三丁胺6.8μL，混匀后再加入氯甲酸异丁酯3.8μL，于4℃下磁力搅拌25min。磁力搅拌下，将HSA溶液倾入到对氨基苯磺酰胺反应液中(此时反应液会变浑浊)，用1mol/L的NaOH调节反应液pH值至8.0(反应液又变澄清)。磁力搅拌下，置4℃冰箱反应4h。将最终反应液用0.01mol/LpH7.4PBS透析两天，冻干，-26℃保存。

(2)N-磺胺-4-氨基苯甲酸-卵清蛋白(SDL-OVA)的合成：

称取卵清蛋白(OVA)90mg，先用15mL 0.01M pH7.4PBS溶解，再加入等体积的DMF；称取对氨基苯磺酰胺5.84mg，溶于1mL DMF。向对氨基苯磺酰胺溶液中加入三丁胺6.8μL，混匀后再加入氯甲酸异丁酯3.8μL，于4℃下磁力搅拌25min。磁力搅拌下，将OVA溶液倾入到对氨基苯磺酰胺反应液中(此时反应液会变浑浊)，用1mol/L的NaOH调节反应液pH值至8.0(反应液又变澄清)。磁力搅拌下，置4℃冰箱反应4h。将最终反应液用0.01mol/L pH7.4PBS透析两天，冻干，-26℃保存。

(3)N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物的鉴定

将载体蛋白、N-磺胺-4-氨基苯甲酸、N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶联物用pH7.4PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在200-800nm波长进行扫描，得到载体蛋白、N-磺胺-4-氨基苯甲酸、N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白偶的吸收曲线(图7)。三者出现不同的吸收曲线，表明N-磺胺-4-氨基苯甲酸与载体蛋白偶联成功。

3、抗磺胺类药物单克隆抗体的制备：

利用申请人所制备的N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白(SDL-HSA)偶联物免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医科院实验动物中心)，免疫程序是取含N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白(SDL-HSA)偶联物100μg的溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，21天后加强免疫，换用弗氏不完全佐剂乳化(购自Sigma公司)。最后于融合前三天，(最好与上次免疫相隔4周以上)，腹腔强化免疫，抗原量加倍(200μg)，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞购自卫生部武汉生物制品所)按1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(1∶10～1∶15)的比例于50mL离心管中混匀，1500rpm，离心10min。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL(购自sigma公司产品)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1min。然后慢慢加入37℃预温的RPMI-1640(购自sigma公司商品)基础液(配方：RPMI-164010.4g，NaHCO₃ 2g，用蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.2)10mL。具体方法为：第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3～4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL 1640液，也需慢慢加入。800rpm离心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT(购自Sigma公司商品)培养基(培养基的成分：80mL基础液，20mL灭菌小牛血清，1mL100％的HAT，1mL双抗。双抗配制：取青霉素G钠100万单位和硫酸庆大霉素1g溶于100mL三蒸水)悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO₂培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无污染，于第4天补加1滴HAT培养基，第8～10天吸去100μL培养基换HT(购自Sigma公司)培养基(培养基的成分：80mL基础液，20mL灭菌小牛血清，1mL100％的HT，1mL双抗)100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。采用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-卵清蛋白(SDL-OVA)及磺胺类药物(如磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶)作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗磺胺类药物的阳性孔。对筛选出来的阳性孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版)进行克隆、筛选。经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗磺胺类药物的单克隆杂交瘤细胞，该细胞编号为BDRXN-2，于2005年5月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC-C200629。对该细胞进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为70，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80～94之间。均高于两亲本细胞的染色体数目，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物，杂交瘤细胞的染色体数目明显多于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体。将该细胞注射Balb/C小鼠腹腔，生产单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG2b亚类。

4、抗磺胺类药物单克隆抗体的纯化

参照朱立平等《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000版中的方法：取所得的小鼠腹水5mL与适量的二氧化硅混合，加入等体积的巴比妥缓冲液(配方：氯化钠85.00g，巴比妥5.75g，巴比妥钠3.75g，叠氮钠2.00g，用蒸馏水用蒸馏水定容至2000mL)，室温振荡1h后，室温静置30min，取上清于洁净离心管中，4℃，3000rpm离心10min；取上清液8mL，加入16mL 0.06mol醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下缓缓加入辛酸132μL后，室温搅拌30min，然后转入4℃冰箱充分沉淀2h，4℃，15000rpm离心30min，得上清液22mL，加入2.2mL pH7.2、0.1M的磷酸缓冲液(PB)，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL，4℃冰箱充分沉淀2h后，4℃，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用5mL 0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，装入透析袋，对5000mL0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液充分透析后，再对2000mL蒸馏水透析，最后对3000mL三蒸去离子水透析，将充分透析好的蛋白溶液用聚乙二醇-20000(PEG-20000)浓缩至3mL，然后4℃，12000rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液，测得蛋白浓度为1.6mg/mL。经SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳(SDS-PAGE)鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度大于95％。该单克隆抗体可用于制备免疫胶体金。

5、兔抗鼠IgG抗体的制备：

利用申请人所在的微生物与免疫实验室提取的Balb/C小鼠IgG免疫健康家兔，制备高特异性、高效价的兔抗鼠IgG高免血清，对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法进行粗提，经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。利用该抗体作为质控线。

6、抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备，具体步骤是：

(1)胶体金的制备：

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每100mL0.01％氯金酸加入2mL 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

(2)抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备：

磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按1～2μg抗体/ml胶体金加入抗磺胺类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为1％，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-200001g，用三蒸水定容至1000mL，调pH至9.0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方：硼酸0.1237g，PEG-200001g，用三蒸水定容至1000mL，调pH至9.0)将沉淀重悬，置4℃备用，有效期60天。

7、结合垫的包被

将结合垫浸泡于0.01M pH 7.4磷酸缓冲液(含2％BSA，2.5％蔗糖，0.3％PVP K-30，0.02％NaN₃)中30min后，于37℃烘干。然后用Biodot点膜仪将制备好的抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合垫上，每厘米结合垫包被9μL抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物，真空干燥，真空封装，置4℃备用。

8、样品垫的处理

将样品垫浸泡于0.01M pH7.4磷酸缓冲液(含2％BSA，2.5％蔗糖，0.3％PVP K-30，0.02％NaN₃)中30min后，于37℃烘干，真空封装，置4℃备用。

9、硝酸纤维素膜的包被

用0.01M pH 7.4PBS缓冲液(含3％的甲醇)将N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白(HSA)偶联物稀释到10μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0.7μL/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端约8mm；用0.01M pH 7.4PBS缓冲液(含3％的甲醇)将兔抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被量为0.7μL/cm，质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5～8mm。37℃烘干，封装备用。

10、试纸条的组装

将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(7)上，切成3mm宽的小条，真空封装。本发明的试纸条在4～8℃保存，有效期一年；常温下保存，有效期6个月。

实施例2(应用实施例)

本发明的检测磺胺类药物的免疫胶体金试纸条的使用方法

1、样品的预处理

(1)组织样品的预处理

将待检组织样品匀浆，取2g待检组织样品加入4mL乙酸乙酯上下振荡5min，室温2000g离心5min，取300μL上层液体80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μL pH7.4的磷酸盐缓冲液(配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000mL)溶解残留物。

(2)牛奶样品的预处理

牛奶样品经3500rpm离心10min脱脂后，吸取中层牛奶2mL加入4mL乙酸乙酯上下振荡5min，室温2000g离心5min，取300μL上层液体80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μLpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。

(3)鸡蛋样品的预处理

将鸡蛋样品匀浆，取2g样品加入4mL乙酸乙酯上下振荡5min，室温2000g离心5min，取300μL上层液体80℃水浴蒸干或在氮气流下吹干，用150μL pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解残留物。

2、检测

阴性标准品(pH7.4的磷酸盐缓冲液，配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，用蒸馏水定容至1000mL)及待检样品各取120μL加入微孔板中，将胶体金试纸条插入待检样品中，15分钟后观察结果。

3、结果判定

如图3所示，若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性标准品检测线颜色，同时质控线上出现红色条带，表示待测样品中有磺胺类药物残留，即待测样品中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的浓度在20ng/g-100ng/g范围内，或待测样品中磺胺嘧啶浓度在40ng/g-160ng/g范围内；若待测样品试纸条检测线红色被完全抑制(无颜色出现)，同时质控线上出现红色条带，表示待测样品中有磺胺类药物残留，即待测样品中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的浓度大于100ng/g，或待测样品中磺胺嘧啶浓度大于160ng/g；若待测样品中试纸条检测线颜色等于或深于阴性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带，表示待测样品中没有磺胺类药物残留，即待测样品中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的浓度小于20ng/g或待测样品中磺胺嘧啶浓度小于40ng/g；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条失效。

实施例3(应用实施例)

本发明的检测磺胺类药物的免疫胶体金试纸条的应用

1、特异性试验

按实施例2所述的方法，用本发明检测试纸条分别检测浓度为10、20、40、80、100ng/mL的磺胺间甲氧嘧啶及阴性标准品，用Biodot TSR3000读条系统测其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，以磺胺间甲氧嘧啶浓度为X轴，检测线吸光值(G/Peak-ROD值)为Y轴绘制标准曲线，根据标准曲线计算磺胺间甲氧嘧啶的50％抑制浓度为18.3ng/mL。同样，计算磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧苄氨嘧啶的50％抑制率浓度分别为18.1ng/mL、16ng/mL、28.6ng/mL、342.3ng/mL、938.5ng/mL、268.5ng/mL、379.5ng/mL。以磺胺间甲氧嘧啶为标准曲线，其交叉反应率为100％，则磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧苄氨嘧啶的交叉反应率分为101.1％、114.4％、64％、5.3％、1.9％、6.8％、4.8％(表1)。

表1本发明试纸条特异性试验结果

2、敏感性试验

按实施例2所述的方法，用本发明检测试纸条分别检测浓度为10、20、40、80、100、160ng/mL的磺胺类药物标准品(磺胺间甲甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶)及阴性标准品，重复8次，用Biodot TSR3000读条系统测其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，结果见表2。根据统计学t-检验分析，10ng/mL磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶标准品的检测线G/Peak-ROD值与0ng/mL阴性标准品检测线G/Peak-ROD值差异极显著(p＜0.01)。同时当磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶标准品浓度在20ng/mL-100ng/mL范围内，或磺胺嘧啶标准品浓度在40ng/mL-160ng/mL范围内时检测线受到明显抑制(抑制率见表2)，其检测线颜色明显浅于阴性标准品试纸条检测线颜色，当磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶标准品浓度高于100ng/mL，或磺胺嘧啶标准品浓度160ng/mL时检测线无颜色出现。因此磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶浓度在10-20ng/mL范围内或磺胺嘧啶浓度在10-40ng/mL范围内时可借助BiodotTSR3000读条系统来判定结果；当磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶浓度大于20ng/mL或磺胺嘧啶浓度大于40ng/mL时，肉眼可判定结果。因此本发明检测试纸条检测磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶及磺胺嘧啶的灵敏度为10ng/mL；检测磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的肉眼判定检测限为20ng/mL，检测磺胺嘧啶的肉眼判定检测限为40ng/mL均低于中华人民共和国、美国及欧盟等制定的“磺胺类药物残留限量标准(100ng/mL)。

表2本发明试纸条敏感性试验结果

注：x表示平均值，Sx表示标准差，CV表示变异系数，抑制率＝标准品的平均吸光值/阴性标准品的平均吸光值

3、样品中的磺胺类药物模拟检测试验

(1)样品中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的模拟检测试验

分别向经高效液相色谱法检测不含磺胺类药物鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品中添加磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶标准品，分别配制成系列浓度的(0，10，20、40、80、100ng/g)磺胺间甲氧嘧啶和磺胺对甲氧嘧啶鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别其进行检测，重复8次，用BiodotTSR3000读条系统测其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，以磺胺间甲氧嘧啶标准品浓度为X轴，其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)为Y轴绘制标准曲线，根据标准曲线及添加磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的样品检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，计算其回收率(见表3)，结果显示，本发明检测试纸条检测鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶中磺胺间甲氧嘧啶及磺胺对甲氧嘧啶残留，具有良好的回收率。通过肉眼观察结果，0ng/g磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶的鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，表示样品中没有磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶残留；含20ng/g磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶的鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色明显浅于阴性标准品检测线颜色，表示样品中有磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶残留；而含100ng/g磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶的鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色无颜色出现，表示样品中有磺胺间甲氧嘧啶或磺胺对甲氧嘧啶残留超标(100ng/g)。说明本发明检测试纸条可以用来检测鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶中磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的残留。

表3.磺胺间甲氧嘧啶与磺胺对甲氧嘧啶在样品中的回收率

注：回收率是以磺胺间甲氧嘧啶(SMM)为标准曲线计算所得。

(2)样品中磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶的模拟检测试验

分别向经高效液相色谱法检测不含磺胺类药物鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品中添加磺胺二甲氧嘧啶或磺胺嘧啶标准品，分别配制成系列浓度的(0，10，20、40、80、100、160ng/g)磺胺二甲氧嘧啶和磺胺嘧啶鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条分别其进行检测，重复8次，用Biodot TSR3000读条系统测其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，以磺胺间甲氧嘧啶标准品浓度为X轴，其检测线吸光值(G/Peak-ROD值)为Y轴绘制标准曲线，根据标准曲线及添加磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶的样品检测线吸光值(G/Peak-ROD值)，计算其回收率(见表4)，结果显示，本发明检测试纸条检测鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留，具有良好的回收率，检测磺胺嘧啶残留回收率较低，但通过肉眼观察结果，0ng/g磺胺二甲氧嘧啶或磺胺嘧啶、鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色与阴性标准品检测线颜色一致，表示样品中没有磺胺二甲氧嘧啶或磺胺嘧啶残留，而含20ng/g磺胺二甲氧嘧啶鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色明显浅于阴性标准品检测线颜色，表示样品中有磺胺二甲氧嘧啶残留；含40ng/g磺胺嘧啶鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色明显浅于阴性标准品检测线颜色，表示样品中有磺胺嘧啶残留；含100ng/g磺胺二甲氧嘧啶及160ng/g磺胺嘧啶鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶样品检测线颜色无颜色出现，表示样品中磺胺二甲氧嘧啶或磺胺嘧啶残留超标(100ng/g)。说明本发明检测试纸条可以用来检测鸡肉、鸡肝脏、猪肉、鸡蛋、牛奶中磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶的残留。

表4.磺胺二甲氧嘧啶与磺胺嘧啶在样品中的回收率

注：回收率是以磺胺间甲氧嘧啶(SMM)为标准曲线计算所得。

4、样品检测

(1)动物试验——磺胺间甲氧嘧啶在鸡肉中的残留检测

选择健康“三黄”仔肉鸡(0.5kg/只)49只，随机分成2组，即对照组(14只)和试验组(35只)。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含100mg/kg磺胺间甲氧嘧啶的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。试验组连续喂药5d后停药，停药后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天每天宰杀试验组鸡5只，对照组2只，采其肌肉同时用本发明检测试纸条法(GICA)和高效液相色谱法(HPLC)测定。高效液相色谱法按照中国兽药监察所动物源食品中磺胺类药物残留检测方法——高效液相色谱法标准操作程序进行，该方法在鸡肌肉中的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条检测磺胺间甲氧嘧啶的肉眼判定检测限为20ng/g。HPLC法检测结果：49份样品中，41份样品未检出磺胺间甲氧嘧啶残留，3份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量在20-100ng/g，5份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g。GICA法检测结果：49份样品中，39份样品未检出磺胺间甲氧嘧啶残留，5份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量在20-100ng/g，5份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g。当磺胺间甲氧嘧啶残留量高于20ng/g时二者符合率为80％，当磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g时二者符合率为100％，未检出磺胺间甲氧嘧啶残留的符合率为95.1％(表5)。说明本发明的检测试纸条完全可以作为常规方法用于市场上鸡肉产品中磺胺间甲氧嘧啶残留的快速检测。

表5.本发明试纸条法与HPLC法对鸡肌肉中磺胺间甲氧嘧啶残留检测的比较

注：高效液相色谱法检测鸡肌肉中磺胺间甲氧嘧啶残留的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条的肉眼判定检测限为20ng/g，由于两种方法的检测限不同而加大了二者的符合率之间的差异。

(2)动物试验——磺胺嘧啶在鸡肉中的残留检测

选择健康“三黄”仔肉鸡(0.75kg/只)56只，随机分成2组，即对照组(16只)和试验组(40只)。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含500mg/kg磺胺嘧啶的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。试验组连续喂药7天后停药，喂药之前、喂药后1天、3天、5天、7天，停药后0天、1天、2天每天宰杀试验组鸡5只，对照组鸡2只，采其肌肉同时用本发明检测试纸条法(GICA)和高效液相色谱法(HPLC)测定。高效液相色谱法按照中国兽药监察所动物源食品中磺胺类药物残留检测方法——高效液相色谱法标准操作程序进行，该方法在鸡肌肉中的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条检测磺胺嘧啶的肉眼判定检测限为40ng/g。HPLC法检测结果：56份样品中，30份样品未检出磺胺嘧啶残留，3份样品中磺胺嘧啶残留量在40-160ng/g，23份样品中磺胺嘧啶残留量高于160ng/g。GICA法检测结果：56份样品中，27份样品未检出磺胺嘧啶残留，7份样品中磺胺嘧啶残留量在40-160ng/g，22份样品中磺胺嘧啶残留量高于160ng/g。当磺胺嘧啶残留量高于40ng/g时二者符合率为89.7％，当磺胺嘧啶残留量高于160ng/g时二者符合率为95.7％，未检出磺胺嘧啶残留的符合率为90％(表6)。说明本发明的检测试纸条完全可以作为常规方法用于市场上鸡肉产品中磺胺嘧啶残留的快速检测。

表6.本发明试纸条法与HPLC法对鸡肌肉中磺胺嘧啶残留检测的比较

注：高效液相色谱法检测鸡肌肉中磺胺嘧啶残留的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条的肉眼判定检测限为40ng/g，由于两种方法的检测限不同而加大了二者的符合率之间的差异。

(3)动物试验——磺胺间甲氧嘧啶在鸡蛋中的残留检测

选择健康“白来航”蛋鸡7只，随机分成2组，即对照组(2只)和试验组(5只)。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含100mg/kg磺胺间甲氧嘧啶的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。试验组连续喂药5天后停药，停药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天每天收集试验组鸡蛋，同时收集对照组鸡蛋。用本发明检测试纸条法(GICA)和高效液相色谱法(HPLC)对其测定。高效液相色谱法按照中华人民共和国“无公害鸡蛋标准”中磺胺类的检测方法(NY5029-2001)标准操作程序进行，该方法在鸡蛋中的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条检测磺胺间甲氧嘧啶的肉眼判定检测限为20ng/g。HPLC法检测结果：55份样品中，28份样品未检出磺胺间甲氧嘧啶残留，3份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量在20-100ng/g，24份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g。GICA法检测结果：55份样品中，23份样品未检出磺胺间甲氧嘧啶残留，11份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量在20-100ng/g，21份样品中磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g。当磺胺间甲氧嘧啶残留量高于20ng/g时二者符合率为84.4％，当磺胺间甲氧嘧啶残留量高于100ng/g时二者符合率为87.5％，未检出磺胺间甲氧嘧啶残留的符合率为82.5％(表7)。说明本发明的检测试纸条完全可以作为常规方法用于市场上鸡蛋产品中磺胺间甲氧嘧啶残留的快速检测。

表7.本发明试纸条法与HPLC法对鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留检测的比较

注：高效液相色谱法检测鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留的灵敏度为50ng/g，而本发明检测试纸条的肉眼判定检测限为20ng/g，由于两种方法的检测限不同而加大了二者的符合率之间的差异。

(4)动物试验——磺胺嘧啶在鸡蛋中的残留检测

选择健康“白来航”蛋鸡7只，随机分成2组，即对照组(2只)和试验组(5只)。对照组饲喂不含任何抗菌药物的饲料，试验组饲喂含400mg/kg磺胺嘧啶的饲料。试验期间，自由采食，自由饮水。试验组连续喂药5天后停药，停药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天每天收集试验组鸡蛋，同时收集对照组鸡蛋。用本发明检测试纸条法(GICA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对其测定。检测鸡蛋中磺胺嘧啶残留的ELISA试剂盒购于英国RANDOX公司，其检测限为5ng/g，而本发明检测试纸条检测磺胺嘧啶的肉眼判定检测限为40ng/g。以鸡蛋中磺胺嘧啶残留量低于40ng/g判为未检出样品，ELISA法检测结果：52份样品中，22份样品未检出磺胺嘧啶残留，7份样品中磺胺嘧啶残留量在40-160ng/g，23份样品中磺胺嘧啶残留量高于160ng/g。GICA法检测结果：52份样品中，26份样品未检出磺胺嘧啶残留，7份样品中磺胺嘧啶残留量在40-160ng/g，19份样品中磺胺嘧啶残留量高于160ng/g。当磺胺嘧啶残留量高于40ng/g时二者符合率为86.7％，当磺胺嘧啶残留量高于160ng/g时二者符合率为82.6％，未检出磺胺嘧啶残留的符合率为84.6％(表8)。说明本发明的检测试纸条完全可以作为常规方法用于市场上鸡蛋产品中磺胺嘧啶残留的快速检测。

表8.本发明试纸条法与ELISA法对鸡蛋中磺胺嘧啶残留检测的比较

注：ELISA检测鸡蛋中磺胺嘧啶残留的灵敏度为5ng/g，而本发明检测试纸条的肉眼判定检测限为40ng/g。以鸡蛋中磺胺嘧啶残留量低于40ng/g判为未检出样品，二者进行比较。

(5)农贸市场和超级市场中样品的检测

2005年10月、11月及2006年4月在某市的农贸市场和超级市场采集鸡肌肉样品120份，用本发明检测试纸条进行检测，检出磺胺类药物残留样品3份，检出率为2.5％，用HPLC法对其进行复核，3份样品中磺胺类药物含量分别为138ng/g(磺胺嘧啶)、56ng/g(磺胺嘧啶)，80ng/g(磺胺间甲氧嘧啶)，与试纸条检测结果一致。2006年4月和5月在某市的农贸市场和超级市场采集鸡蛋样品140份，检出磺胺类药物残留样品3份，检出率为2.1％，用HPLC法对其进行复核，3份样品中磺胺类药物含量分别为229ng/g(磺胺嘧啶)、125ng/g(磺胺嘧啶)，112ng/g(磺胺嘧啶)，与试纸条检测结果一致。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种杂交瘤细胞BDRXN-2，其保藏号为CCTCC-C200629。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞BDRXN-2分泌的能够专门识别磺胺类药物的单克隆抗体。

3.一种适用于检测磺胺类药物残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有胶体金与权利要求2所述的单克隆抗体所形成的抗磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有N-磺胺-4-氨基苯甲酸-人血清白蛋白偶联物构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备磺胺类药物残留检测试纸条中的应用。

5.权利要求3-4任一项所述的试纸条在磺胺类药物残留体外检测上的应用。

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