CN103175958B - 快速鉴别重组乙型肝炎疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速鉴别重组乙型肝炎疫苗的方法。该方法可以快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，包括以下步骤：(i)对待检测的重组乙型肝炎疫苗产品用处理液对该产品进行解离；(ii)将步骤(i)所得测试液加载到胶体金试纸条的加样端，或者将胶体金试纸条的加样端浸入到步骤(i)所得测试液中；(iii)测试液在毛细作用下沿膜向胶体金试纸条的另一端移动，观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况；(iv)根据胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况，判断所测重组乙型肝炎疫苗产品的质量。本发明方法可以在相当短的时间内获得结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，所述方法可以快速而有效地检测重组乙型肝炎疫苗类产品的品质，特别是可以快速判断此类产品的真伪。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，可缩写HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。HBV能够引起肝脏炎性病变。甚至肝硬化和肝癌。全球约有3.8亿HBV慢性感染者，我国是乙肝病毒感染的高发区，约有1.2亿人是乙型肝炎表面抗原(HBV Surface antigen,HBsAg)携带者。因此，接种乙型肝炎疫苗是阻断HBV传播最有效的方法。
在本发明中，提及的术语“重组乙型肝炎疫苗(酵母)”表示的含义是其属于生物制品的一种，是重组酵母(例如酿酒酵母或汉逊酵母)表达的HBsAg经纯化，加入铝佐剂而成，可以直接肌肉注射到病人体内，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的保护性抗体，用于预防乙型肝炎。
市售的重组乙型肝炎疫苗为乳白色混悬液体，规格一般按照含HBsAg的量分为10μg/ml和20μg/ml两种。接种对象主要是乙型肝炎易感者，包括新生儿、从事医疗工作的医护人员以及其他高危人群。
有资料显示，中国乙型肝炎疫苗每年的需求量约3600万份，并以每年15%的速度大幅度增长，远远高于全球10%的平均增长水平。疫苗检验的速度要能跟上市场增长的需求，而疫苗成品检测周期比较长。目前，重组乙型肝炎疫苗的检验主要依据《中国药典》2010年版三部，其中的鉴别试验可以快速鉴别疫苗的真伪。该鉴别试验采用酶联免疫法(ELISA)检查，应证明含有HBsAg。由于重组酵母表达的HBsAg与铝佐剂通过物理作用力吸附在一起很难解离下来，用ELISA的方法直接检测存在困难。根据以往的实验需要用处理液解离，再稀释到合适的浓度后进行检测。此外，卫生部要求自2010年10月1日起执行《中华人民共和国药典(2010年版)》后，HBsAg ELISA试剂盒由原来的一步法变为两步法，检验时间也由原来的2个小时左右增加到3个多小时。ELISA检测时间的延长，再加上样品前处理的时间，一个鉴别试验要用4-5个小时才能完成，操作过程繁琐且消耗时间长，不能体现鉴别试验快速检验的特点。因此，迫切需要一种检测速度快、专属性强的高效检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴别重组乙型肝炎疫苗(酵母)产品质量的方法，本发明人发现采用如本发明所述方法可以快速而有效地检测重组乙型肝炎疫苗(酵母)类产品的品质，特别是可以快速判断此类产品的真伪。此外，本发明人还发现，该方法不但适用于重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)和重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)等重组酵母表达获得的乙型肝炎疫苗，而且还适用于甲型乙型肝炎联合疫苗这种包含重组乙型肝炎疫苗(酵母)的混配物。
具体而言，本发明第一方面提供了一种快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，该方法包括以下步骤：
(i)取待检测的重组乙型肝炎疫苗产品，用处理液对该产品进行解离，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液；
(ii)将步骤(i)所得测试液加载到胶体金试纸条的加样端(本领域技术人员通常将该加样端制成加样垫的形式，因此该加样端亦可称为加样垫)，或者将胶体金试纸条的加样端浸入到步骤(i)所得测试液中；
(iii)测试液在毛细作用下沿膜向胶体金试纸条的另一端(本领域技术人员通常将该另一端制成吸水垫的形式，因此该另一端亦可称为吸水垫)移动，观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况；
(iv)根据胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况，判断所测重组乙型肝炎疫苗产品的质量。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的重组乙型肝炎疫苗选自：重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)、甲型乙型肝炎联合疫苗。上述三种疫苗均已收载于2010年版中国药典三部中；然而，尽该药典还收载了另一种乙型肝炎疫苗即重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)，然而令人遗憾的是，本发明人发现本发明方法针对这种乙型肝炎疫苗却并不适用，例如本发明方法针对该重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的最低灵敏度在50μg/ml以上，而本发明方法针对上述三种疫苗的最低灵敏度在2μg/ml以下。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的处理液是包含TritonX-100、二乙醇胺和PBS的水溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的处理液中包含0.1-0.3%的Triton X-100、2-3%的二乙醇胺和2-10mmol/L的PBS。其中所述“2-10mmol/L的PBS”是指以磷酸根离子计的摩尔浓度，在本发明中有类似表述时，亦具有类似含义。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的处理液中包含0.2%的Triton X-100、2.5%的二乙醇胺和约5.3mmol/L的PBS。根据本发明第一方面的方法，其中所述的PBS是磷酸二氢钠二水合物与磷酸氢二钠十二水合物以重量比1：7.5的比例的组合。在本发明下文具体实施方式的试验中，如未另外说明，所用到的处理液中包含：0.2%的Triton X-100、2.5%的二乙醇胺和5.3mmol/L的PBS，所述PBS是磷酸二氢钠二水合物与磷酸氢二钠十二水合物以重量比1：7.5的比例的组合。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的处理液是用10%TritonX-100、20%二乙醇胺和PBS溶液混合配制成的。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的PBS溶液是指以磷酸根离子计的摩尔浓度6.2mmol/L的PBS溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的PBS溶液是照如下方法配制的：取磷酸二氢钠二水合物0.226g与磷酸氢二钠十二水合物1.698g，加适量水溶解，加水稀释至1000ml，即得(为6.2mmol/L的PBS溶液)。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的处理液是用0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的。
在本发明第一方面方法的一个实施方案中，所述的处理液是用0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的，并且所述PBS溶液是照如下方法配制的：取磷酸二氢钠二水合物0.226g与磷酸氢二钠十二水合物1.698g，加适量水溶解，加水稀释至1000ml，即得。在使用此处理液时，发明人发现，如果向该处理液中加入浓度约0.7~0.9%的氯化钠时，出现质控线和检测线显色暗淡，并且针对重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)和重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的最低灵敏度在35μg/ml以上，因此，在一个实施方案中，本发明处理液中未添加氯化钠。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的重组乙型肝炎疫苗产品中，乙型肝炎表面抗原含量可以为5-50μg/ml的范围，例如10-20μg/ml的范围，例如为10μg/ml或20μg/ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述的解离是在室温下进行的。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)中所述的解离是照如下方式进行的：取所述待检测的重组乙型肝炎疫苗产品500μl(该体积可记为V1)，离心并弃去上清460μl，下层溶液(其体积可记为V2)中加处理液40μl(该体积可记为V3)，混匀，使进行反应(例如进行约10-30min，在本发明下文具体实施方式的试验中，如未另外说明，反应进行约15min)，得到待测样品溶液，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中所述的胶体金试纸条由加样垫(其在本发明中亦可称为加样端，测试液样品由此端添加)、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条的胶体金结合垫包被有胶体金-抗体。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条的硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中，所述硝酸纤维素膜上的所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中，所述硝酸纤维素膜上的所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；所述胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(iii)中，使测试液在毛细作用下沿膜移至胶体金试纸条的吸水垫后，在30分钟内观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(iv)中，如果胶体金试纸条检测区的质控线和检测线位置同时出现显色条带(通常而言在白色背景下显典型的鲜红色条带)，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为真品(即含有乙型肝炎表面抗原)；如果胶体金试纸条检测区仅质控线位置出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为伪劣产品(即其中不含有乙型肝炎表面抗原)。
本发明第二方面提供了一种用于快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的试剂盒，该试剂盒中包括：(a)处理液；(b)胶体金试纸条；和(c)操作方法说明书。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的重组乙型肝炎疫苗选自：重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)、甲型乙型肝炎联合疫苗。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液是溶解在一个瓶子中的包含Triton X-100、二乙醇胺和PBS的水溶液(预先配制好的，即用型)。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液中包含0.1-0.3%的Triton X-100、2-3%的二乙醇胺和2-10mmol/L的PBS。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液中包含0.2%的Triton X-100、2.5%的二乙醇胺和约5.3mmol/L的PBS。根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的PBS是磷酸二氢钠二水合物与磷酸氢二钠十二水合物以重量比1：7.5的比例的组合。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液是用10%TritonX-100、20%二乙醇胺和PBS溶液混合配制成的。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的PBS溶液是指以磷酸根离子计的摩尔浓度6.2mmol/L的PBS溶液。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的PBS溶液是照如下方法配制的：取磷酸二氢钠二水合物0.226g与磷酸氢二钠十二水合物1.698g，加适量水溶解，加水稀释至1000ml，即得(为6.2mmol/L的PBS溶液)。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液是用0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的。
在本发明第二方面试剂盒的一个实施方案中，所述的处理液是用0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液混合配制成的，并且所述PBS溶液是照如下方法配制的：取磷酸二氢钠二水合物0.226g与磷酸氢二钠十二水合物1.698g，加适量水溶解，加水稀释至1000ml，即得。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的处理液包括三个相互隔离的溶液(即分别分装在三个瓶子中的溶液)，在临用时将它们现混，所述三个溶液分别是：10%Triton X-100溶液、20%二乙醇胺溶液和PBS溶液。其中所述PBS溶液是照如下方法配制的：取磷酸二氢钠二水合物0.226g与磷酸氢二钠十二水合物1.698g，加适量水溶解，加水稀释至1000ml，即得(浓度以磷酸根离子计为6.2mmol/L)。在一个实施方案中，所述的处理液是在临用时将上述三个相互隔离的溶液(即分别分装在三个瓶子中的溶液)现混配成，混合比例是：0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的PBS溶液。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述的胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述胶体金试纸条的胶体金结合垫包被有胶体金-抗体。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述胶体金试纸条的硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述硝酸纤维素膜上的所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述硝酸纤维素膜上的所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；所述胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书记载了使用该试剂盒进行快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，该方法包括以下步骤：
(i)取待检测的重组乙型肝炎疫苗产品，用处理液对该产品进行解离，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液；
(ii)将步骤(i)所得测试液加载到胶体金试纸条的加样端，或者将胶体金试纸条的加样端浸入到步骤(i)所得测试液中；
(iii)测试液在毛细作用下沿膜向胶体金试纸条的另一端移动，观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况；
(iv)根据胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况，判断所测重组乙型肝炎疫苗产品的质量。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的重组乙型肝炎疫苗产品中，乙型肝炎表面抗原含量为10μg/ml或20μg/ml。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的解离是在室温下进行的。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的解离是照如下方式进行的：取所述待检测的重组乙型肝炎疫苗产品500μl(该体积可记为V1)，离心并弃去上清460μl，下层溶液(其体积可记为V2)中加处理液40μl(该体积可记为V3)，混匀，使进行反应(例如进行约10-30min，在本发明下文具体实施方式的试验中，如未另外说明，反应进行约15min)，得到待测样品溶液，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的步骤(iii)中，使测试液在毛细作用下沿膜移至胶体金试纸条的吸水垫后，在30分钟内观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况。
根据本发明第二方面的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的步骤(iv)中，如果胶体金试纸条检测区的质控线和检测线位置同时出现显色条带(通常而言在白色背景下显典型的鲜红色条带)，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为真品(即含有乙型肝炎表面抗原)；如果胶体金试纸条检测区仅质控线位置出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为伪劣产品(即其中不含有乙型肝炎表面抗原)。
本发明任一方面的任一实施方案可以与一个或多个其它实施方案进行任意组合，只要这种组合不会出现矛盾。当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明所提供的快速鉴别重组乙型肝炎疫苗(酵母)的方法，是采用免疫胶体金技术对处理液解离后的待测乙型肝炎疫苗进行检测，根据显色结果判断所述待测乙型肝炎疫苗的真伪。
上述过程中，所述用免疫胶体金技术对解离后的待测乙型肝炎疫苗进行检测的方法具体可为用胶体金试纸条对所述解离后的待测乙型肝炎疫苗进行检测。
在本发明一个实施方案中，所述胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；所述胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
在本发明一个实施方案中，所述根据显色结果判断所述待测乙型肝炎疫苗的真伪的方法具体为下述1)、2)：
1)若所述胶体金试纸条上质控线位置和检测线位置同时出现显色条带，则所述待测乙型肝炎疫苗(酵母)为真品；
2)若所述胶体金试纸条上仅质控线位置出现显色条带，则所述待测乙型肝炎疫苗(酵母)为伪劣产品。
在本发明一个实施方案中，所述处理液解离后的乙型肝炎疫苗(酵母)的理论浓度为62.5μg/ml或125μg/ml。
在本发明一个实施方案中，所述重组乙型肝炎疫苗(酵母)药品为标注内含乙型肝炎表面抗原含量(M，其例如为10μg/ml或20μg/ml)的重组乙型肝炎疫苗药品。
在本发明一个实施方案中，所述处理液解离的乙型肝炎疫苗是按照如下所述方法得到的：
将所述重组乙型肝炎疫苗500μl(V1)，离心并弃去上清460μl，下层溶液(V2，40μl)中加处理液40μl(V3)，在室温下进行反应(例如10-30min，通常15min即可)，得到所述处理液解离的乙型肝炎疫苗；其中，所述理论浓度(C)的计算公式如下：
C=M×V1/V2×V2/(V2+V3)。
在本发明一个实施方案中，所述处理液是用0.20ml的10%TritonX-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的6.2mmol/L的PBS混合配制成的。
在本发明一个实施方案中，所述胶体金试纸条可以根据已知方法制备，或者亦可以从市场上购得，例如可以是购自北京万泰生物药业股份有限公司的乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒(胶体金法)，产品编号为：WJ-1110。在本发明下文的具体试验中，如未另外说明，所述的胶体金试纸条是上述WJ-1110。
在本发明一个实施方案中，适用的疫苗产品中，内含乙型肝炎表面抗原含量可以为5-50μg/ml的范围，例如10-20μg/ml的范围，例如为10μg/ml或20μg/ml。
乙型肝炎表面抗原胶体金法诊断试剂条主要检验临床血液标本HBsAg是否呈阳性，很少用于生物制品的检测。本发明采用特定处理液将疫苗上的铝佐剂解离下来，再用胶体金法检测疫苗中的HBsAg。样品前处理简单，与《中国药典》2010年版三部中采用ELISA的方法检测比较，需要的辅助仪器少，检测速度快(本发明检测时间连同样品制备时间30min内就能完成，而药典方法需要在3小时以上)。另外，实验证明，本发明方法具有很好的耐用性，并且灵敏度高、准确度好、可重复性强、特异性高，不受其他生物制品的影响，检测结果可靠。本发明采用胶体金标记的抗体呈现鲜红色，在白色背景下，条带清晰，目视即可观察，极易判读；并且操作简单，仅需将试纸条插入解离后的待测样本中进行测定，不需要专业技术人员。本发明适用于乙型肝炎疫苗(酵母)快速现场检测的要求，特别是本发明方法可以在30min左右获得结果，比现行药典方法大大加快。
附图说明
图1为试纸条的结构示意图。
图2为试纸条的测试结果判断示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的试纸条为北京万泰生物药业股份有限公司生产的乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒(胶体金法)，产品编号为：WJ-1110，生产批号：Y20120603。
实施例1、快速鉴别重组乙型肝炎疫苗(酵母)的方法
一、试纸条的结构(图1)
所述胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；所述胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG；所述加样垫中部设一标记有“MAX”的线，记作“MAX线”；所述检测线、质控线与MAX线平行。
二、方法简介：
本方法基于胶体金免疫层析技术，以胶体金为显色标记物，将试纸条浸入测试液后，测试液由于毛细作用，沿膜向前移动。测试液中若含有HBsAg，达到金标抗体区域后，与金标抗体结合形成免疫复合物；溶液再继续上行，到达检测区后，如果测试液中含有HBsAg且含量足够高，与包被在检测区的抗-HBs发生特异性结合，则检测线显色；如果测试液中的HBsAg含量不足或不含有HBsAg，则检测线不显色；测试中，过剩的金标抗体必须到达质控线位置，并且质控线处包被的二抗与抗体发生免疫作用，使质控线呈现出红色条带，否则试验不成立，需要重新测定。
三、检测步骤：
1、样品前处理
不同规格的重组乙型肝炎疫苗(酵母)按下述方法处理，即为待测样品溶液。
下述中的理论浓度即为按照药品标注的HBsAg含量及稀释的倍数换算后得到的浓度。
10μg/ml规格的疫苗取500μl，室温下4000rpm离心5min，弃去上清460μl，加处理液40μl，混匀，反应15min，得到待测样品溶液；处理液解离后的疫苗理论浓度为62.5μg/ml；
20μg/ml规格的疫苗取500μl，室温下4000rpm离心5min，弃去上清460μl，加处理液40μl，混匀，反应15min，得到待测样品溶液；处理液解离后的疫苗理论浓度为125μg/ml。
其中，所述的处理液是由0.20ml的10%Triton X-100、1.25ml的20%二乙醇胺和8.55ml的6.2mmol/L的PBS混合配制而成，具体参见本发明上文。
2、检测过程：将试纸条有“MAX”标志的一端插入待测样品溶液中(深度不超过“MAX”标志)，待测样品溶液扩展至试纸条顶端，30分钟内观察结果。
3、检测结果判定：
下述检测结果中，“阳性”指重组乙型肝炎疫苗中含有HBsAg的真品；“阴性”指假冒伪劣产品。
1)阳性结果：如果在质控线和检测线位置同时显现出红色线(图2A)，则表明所测样品溶液中含有HBsAg且含量足够高，药品为真品。
2)阴性结果：如果只在质控线位置显现出红色线(图2B)，则表明所测样品溶液中HBsAg含量不足或不含有HBsAg，药品为假冒伪劣产品。
3)结果不成立：如果在质控线位置没有显现出红色线(图2C)，则无论检测区是否显现红色线，均判断为结果不成立，需要重新测定。
实施例2、本发明检测方法的准确度检测
对28批市售的重组乙型肝炎疫苗(酵母)包括甲型乙型肝炎联合疫苗(科兴生物，含酿酒酵母型重组乙型肝炎疫苗，以下表中注明的规格是以该重组乙型肝炎疫苗量计)、重组乙型肝炎疫苗(天坛生物，酿酒酵母型；华兰生物，汉逊酵母型)离心后的上清液以及处理液按照实施例1中所述方法进行检测(此方法每个样品检测耗时约0.35~0.6小时)，对这些样品还照《中国药典》2010年版三部收载的方法进行检测(例如该药典第133页“3.3.1鉴别试验”中记载的酶联免疫法检测，此方法每个样品检测耗时约4.4~4.8小时)。实验设3次重复，两种方法检测结果一致，阳性检出率100%。说明本发明方法适用于目前市售重组乙型肝炎疫苗(酵母)中HBsAg的检测。
表1：本发明方法的耐用性检测结果
此外，本发明人在另外的试验中，使用本发明实施例1的方法以及药典酶联免疫法检测对6批市售重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)进行检测，结果显示，尽管药典酶联免疫法检测均呈阳性，显示含有HBsAg，然而使用本发明方法时仅有2批样品显示含有HBsAg，并且显色不清楚，而另外4批样品显示不含有HBsAg，可见本发明方法不适用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)。
实施例3、本发明检测方法的耐用性检测
按照实施例1中所述方法，分别对重组乙型肝炎疫苗(酵母)在4℃、25℃和37℃条件测定，结果一致。说明本发明方法具有较好的耐用性。
表2：本发明方法的耐用性检测结果
发明人在另外的试验中，使用试验例2所述北京科兴生物制品有限公司的甲型乙型肝炎联合疫苗(批号201203040)以及华兰生物的汉逊酵母型重组乙型肝炎疫苗(批号201205008)，同进行实施例3方法进行耐用性检测，结果显示与表2中的结果一致，表明本发明方法对不同类型的疫苗均有良好的耐用性。
实施例4、本发明检测方法的特异性检测
按照实施例1中所述方法，检测市售的生物制品甲型肝炎灭活疫苗。实验设3次重复，结果均呈阴性。说明本发明方法特异性强，能够有效避免其他生物制品的干扰。
表3：本发明方法的特异性检测结果
实施例5、本发明检测方法的灵敏度检测
按照实施例1中所述方法，检测重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品(中国食品药品检定研究院生产，批号：20001302，规格：5.5μg/0.5ml)。对参考品进行等比稀释成5个浓度(11μg/ml、5.5μg/ml、2.75μg/ml、1.375μg/ml和0.6875μg/ml)后进行检测。结果除0.6875μg/ml的参考品疫苗呈阴性外，其余均呈阳性。说明本发明方法的最低灵敏线能达到1.375μg/ml。
表4：本发明方法的特异性检测结果
| 样品 | 含量(μg/ml) | 本方法检测结果 |
| 重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品 | 11 | + |
| 重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品 | 5.5 | + |
| 重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品 | 2.75 | + |
| 重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品 | 1.375 | + |
| 重组(酵母)乙型肝炎疫苗冻干参考品 | 0.6875 | - |
另外，使用天坛生物的重组(酵母)乙型肝炎疫苗(批号201203005)和华兰生物的重组(酵母)乙型肝炎疫苗(批号201205008)，参考上述方法进行灵敏度检测，结果两个样品的最低灵敏线均低于2μg/ml。而对另一种市售的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)产品进行同时检测，最低灵敏线在50μg/ml以上。
另外，参考以上表1中记载的方法，但是所用的处理液中加入了0.75%的氯化钠，结果该方法对重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(浓缩液)的最低灵敏线在35μg/ml以上。
另外，参考以上表1中记载的方法，但是所用的处理液中加入了2%的枸椽酸钠(处理液的pH值为7.22)，结果该方法对重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(浓缩液)的最低灵敏线在25μg/ml以上。
实施例6、本发明检测方法的重复性检测
按照实施例1中所述方法，对重组乙型肝炎疫苗(酵母)进行5次重复测定，结果一致。说明本发明方法具有较好的重复性。
表5：本发明方法的特异性检测结果
以上所公开的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明的权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (11)
1.快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，该方法包括以下步骤：
(i)取待检测的重组乙型肝炎疫苗产品，用处理液对该产品照如下方式进行解离，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液：取所述待检测的重组乙型肝炎疫苗产品500μl，离心并弃去上清460μl，下层溶液中加处理液40μl，混匀，使进行反应10-30min，即得；
(ii)将步骤(i)所得测试液加载到胶体金试纸条的加样端，或者将胶体金试纸条的加样端浸入到步骤(i)所得测试液中；
(iii)测试液在毛细作用下沿膜向胶体金试纸条的另一端移动，在移至胶体金试纸条的吸水垫后，在30分钟内观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况；
(iv)根据胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况，判断所测重组乙型肝炎疫苗产品的质量，如果胶体金试纸条检测区的质控线和检测线位置同时出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为真品；如果胶体金试纸条检测区仅质控线位置出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为伪劣产品，
其中：
所述的重组乙型肝炎疫苗选自：重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)、甲型乙型肝炎联合疫苗；
所述的处理液中包含：0.2％的Triton X-100、2.5％的二乙醇胺和5.3mmol/L的PBS，所述PBS是磷酸二氢钠二水合物与磷酸氢二钠十二水合物以重量比1：7.5的比例的组合；
所述的重组乙型肝炎疫苗产品中，乙型肝炎表面抗原含量为5-50μg/ml的范围。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(i)中所述的解离是在室温下进行的。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤(ii)中所述的胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条的胶体金结合垫包被有胶体金-抗体。
5.根据权利要求3的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条的硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向。
6.根据权利要求5的方法，其中步骤(ii)中，所述硝酸纤维素膜上的所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs。
7.根据权利要求5的方法，其中步骤(ii)中，所述硝酸纤维素膜上的所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(ii)中，所述胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；所述胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG。
9.一种用于快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的试剂盒，该试剂盒中包括：(a)处理液、(b)胶体金试纸条、和(c)操作方法说明书；其中：
所述的重组乙型肝炎疫苗选自：重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)、甲型乙型肝炎联合疫苗；
所述的处理液是溶解在一个瓶子中的水溶液；
所述的处理液中包含0.2％的Triton X-100、2.5％的二乙醇胺和5.3mmol/L的PBS，所述的PBS是磷酸二氢钠二水合物与磷酸氢二钠十二水合物以重量比1：7.5的比例的组合；
所述的胶体金试纸条由加样垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸样垫顺次连接而成；
所述胶体金试纸条的胶体金结合垫包被有胶体金-抗体；
所述胶体金试纸条的硝酸纤维素膜包被有相互分离的、依次平行排列的检测线和质控线，所述依次平行排列的方向为所述加样垫至所述吸样垫的方向；
所述硝酸纤维素膜上的所述检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗-HBs；
所述硝酸纤维素膜上的所述质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG；
所述操作方法说明书中记载的重组乙型肝炎疫苗产品中，乙型肝炎表面抗原含量为10μg/ml或20μg/ml。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中所述操作方法说明书记载了使用该试剂盒进行快速鉴别重组乙型肝炎疫苗产品质量的方法，该方法包括以下步骤：
(i)取待检测的重组乙型肝炎疫苗产品，用处理液对该产品照如下方式进行解离，得到经解离处理的重组乙型肝炎疫苗测试液：取所述待检测的重组乙型肝炎疫苗产品500μl，离心并弃去上清460μl，下层溶液中加处理液40μl，混匀，使进行反应10-30min，即得；
(ii)将步骤(i)所得测试液加载到胶体金试纸条的加样端，或者将胶体金试纸条的加样端浸入到步骤(i)所得测试液中；
(iii)测试液在毛细作用下沿膜向胶体金试纸条的另一端移动，在移至胶体金试纸条的吸水垫后，在30分钟内观察胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况；
(iv)根据胶体金试纸条检测区的质控线和检测线显色情况，判断所测重组乙型肝炎疫苗产品的质量，如果胶体金试纸条检测区的质控线和检测线位置同时出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为真品；如果胶体金试纸条检测区仅质控线位置出现显色条带，则可断定所测重组乙型肝炎疫苗产品为伪劣产品。
11.根据权利要求9的试剂盒，其中所述操作方法说明书中记载的解离是在室温下进行的。
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