CN1307238A - 多种常见性病快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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本发明是一种多种常见性病快速检测试纸条,其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹原体的单克隆抗体胶体金免疫吸附(GCISA)实验原理制成,它能定性诊断出淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹中的一种或合并存在的多种性病。这种方式试纸条具有高度的特异性和灵敏度,还具有稳定性好,重复性好,并且不用特殊仪器,费用较低廉,操作简便易学,短时间内(15分钟)就能判读结果,适合于基层医疗单位和大规模体检查使用,也适合于患者的自查。
Description
本发明涉及医学技术领域，具体地说是多种常见性病快速检测试纸条及其制备方法。
淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹的发病率占我国性病传播疾病发病率的前四位。这四种性病也是全球性的主要性传播疾性之一，发病率在逐年增加。临床实验的检测通常是：淋病患者尿道生殖道分泌物涂片、淋球菌培养和免疫荧光抗体检测；沙眼衣原体的分泌物涂片检查、直接荧光抗体检测和酶免疫法；尖锐湿疣的细胞学检查、免疫组织化学检查及分子杂交技术检查；生殖器疱疹的细胞学检查、组织培养检查和抗体血清学检查等等。目前发现除淋病和非淋菌性道炎患者的尿道生殖道分泌物可查出病原体外，尖锐湿疣患者的尿沉渣中有被病原体感染的细胞，生殖器疱疹侵入尿道因而在尿中可查见病原体。例如淋病的常规检测是采用尿道生殖道究泌物的涂片检查，在多形核白细胞内查见革兰氏双球菌即可诊断，在男性淋病的诊断中，棉拭子要进入尿道2厘米处取样，但女性分泌物应取宫颈管内的，并且阴道分泌物有50％假阳性和50％的假阴性，因而不能用于诊断，应用新的培养基对分泌物培养可增加阳性的检出率。目前采用DNA扩增技术的聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)快速检测这些性病的方法已逐步在临床上推广应用。这些常规检测必需在具备显微镜、细菌培养箱和PCR仪等条件的化验室中进行。这些检查不仅需要特定的仪器设备，而且检查费时，需要较长的时间才能观察结果，所需费用较高。众所周知，早期、快速的诊断是早期治疗和切断性病传播途径的关键步骤。由于性病的特殊性，检查常在门诊进行，迫切需要一种特异、快速、简便、经济的检测试纸条。
本发明的目的是提供一种能够快速定性诊断出淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹中的一种或合并存在的多种性病的多种常见性病的快速检测试纸条及其制备方法。
本发明是这样实现的：利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹病原体的单克隆抗体胶体金免疫吸附(GCISA)实验原理制成，它能定性诊断出淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹中的一种或合并存在的多种性病。
上述检测试纸条的制备方法按以下步骤进行：
1)制备检测用免疫原及抗原：采用淋球菌的标准菌株制备淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，将非淋球菌性尿道炎的主要病原体沙眼衣原体血清型D-K的基本颗粒作为其抗原，将尖锐湿疣的病原体人乳头瘤病毒(HPV-6,11型)颗粒作为其抗原，将生殖器疱疹的病原单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作为抗原；
2)单克隆抗体的制备与筛选：将1)中四种性病的抗原分别用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合得到一种可以产生抗体的杂交瘤，具体是免疫6周龄雌性Bab/c小鼠，免疫5次。取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法进行融合，融合后的细胞接种于甲基纤维素半固体培养基上，用间接ELISA法筛选并克隆化，经扩大培养将杂交细胞注入经产数胎的雌性Bab/c小鼠腹腔中，收集腹水，-20℃保存，抗体纯化，最终获得18株分别抗各种性病病原体的单克隆抗体细胞株，经鉴定，这18株单克隆抗体均为IgG1类，亲和常数在2×108-1×109之间；
3)制备兔抗性病病原体抗原的免疫血清，用大耳白兔，雄性，体重2千克左右，将含不同抗原的性病病原体分别用生理盐水稀释进行免疫，经试血清抗体滴度后颈动脉放血，4℃存放过夜后分离血清冻存，进行抗体纯化；
4)制备胶体金标记抗体：采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，按比例与不同性病病原体的单克隆抗体混合进行标记，胶体金标记抗体的制备是用终浓度为0.05％PEG稳定标记后的胶体金颗粒，于4℃下浓缩纯化离心1至3次，沉淀物保存于原体积3-10％的保存液中于4℃保存；
5)检测试纸条的制备：选择适当的浓度将免疫血清抗体和金标记抗体分别固定于不同的载体上，经粘合、切割等步骤制备成检测试纸。
具体将兔抗性病病原体血清IgG等量混合后，以不同含量抗体打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-5％牛血清白8蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗后，室温凉干，4℃密封保存。
或者是①将兔抗多种性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗体打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-5％牛血清白蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗数次，室温凉干，4℃密封保存，②在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多种性病的单克隆抗体标记的胶体金溶液20-60μl，室温凉干，4℃密封保存，③分别取大小适合的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和大小适合的空白硝酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在大小适合的硬纸片上，其中空白端为样品加入端。
其检测方法是胶体金酶联免疫吸附试验(GCISA)：
在聚苯乙烯塑料板每槽内加入硝酸纤维素膜免疫条带一条，加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,PH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，侵湿后加入经室温静置后的标本上清液50μl在槽内混匀，立即加入抗性病单克隆抗体标记的胶体金溶液20-60μl，室温下反应时间为3-5分钟，后用洗液(上液中Tween-20为50ul，无BSA)漂洗后观察结果，或者将样品直接加入已剪切粘接的试纸条的空白端，15分钟后判读结果。阳性对照条内呈红色圆点，阴性对照条内则不出现红色圆点。试纸的灵敏度为250ng/ml，可在常温下存储一年。
本发明的检测试纸条是一种能定性诊断多种常见性病的快速检测试纸条，使用该试纸条能够定性诊断出淋病、非淋菌性尿道炎，尖锐湿疣和生殖器疱疹中的一种或合并存在的多种性病。这种方式试纸条具有高度的特异性和灵敏度，还具有稳定性好，重复性好，并且不用特殊仪器，费用较低廉，操作简便易学，短时间内(15分钟)就能判读结果，适合于基层医疗单位和大规模体检查使用，也适合于患者的自查。从而达到早期、快速的诊断出多种常见的性病，使患者得到早期、及时和有效的治疗，并切断性病传播的可能途径。这对人民身体健康和社会的安定团结都重要意义，具有良好的市场前景的经济效益。
实施例：
1、制备检测用免疫原及抗原：
采用常规试验方法，淋球菌的标准菌株制备淋球菌外膜蛋白pIA、pIB的粗制品，将非淋球菌性尿道炎的主要病原体沙眼衣原体血清型D-K的基本颗粒作为其抗原，将尖锐湿疣的病原体人乳头瘤病毒(HPV-6,11型)颗粒作为其抗原，将生殖器疱疹的病原单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作为抗原；
2、单克隆抗体的制备与筛选：
1)免疫小鼠及制备脾淋巴细胞：将上述四种性病抗原，分别加0.4mlPBS(PH7.4)，与0.4ml完全弗氏佐剂充分混合，并将0.2ml所得乳化液注射到6周龄雌Bab/c小鼠皮下。初次免疫两周后，再将0.2ml如上法制得的乳化液注入小鼠皮下。再过两周后，同法制得乳化液0.5ml注入小鼠腹腔。又两周后在小鼠尾静脉注入0.2ml含上述性病抗原的PBS溶液。三天后从已免疫小鼠的体内分离脾脏并将其挤压使细胞分散。将如此得到的淋巴细胞悬浮于淋巴细胞培养液MEM中，离心洗涤两次(1400rpm,6min,37℃)，将淋巴细胞重新悬浮于培养液中，即可分别获得不同抗原的细胞融合的小鼠淋巴细胞。2)细胞融合：收获处于生长期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0悬浮于MEM中，并离心洗涤两次(1400rpm,6min,37℃)，然后将细胞重新悬浮于培养液中，即获得细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞。
将3.5×108个上述淋巴细胞和2.71×108个上述骨髓瘤细胞置于50ml离心管内混合后离心(1400rpm,6min,37℃)，去上清，缓慢加入MEM至10ml，离心(800rpm,6min,37C)去上清，将细胞重新悬浮于14mlHA T培养基中，并在培养板上加样后，放入二氧化碳培养箱中培养(5％二氧化碳，95％空气，湿度100％)。
3)杂交瘤细胞的筛选；按上述方法培养2至4周后，用ELISA方法检测已证实有细胞生长的培养板中的培养物上清液中是否含有抗上述抗原的抗体，结果在960个培养板上的小井中有26个产生了抗体。在这些小井中加入上述抗原后，有18个能被抗原所抑制，进而证实这18个培养小井中有产生上述抗原的杂交瘤细胞，选择出4株针对上述四种性病抗原的杂交瘤细胞株。
4)杂交瘤细胞克隆：采用有限稀释法即连续稀释至培养小井的最终细胞浓度为10个/ml，再接种于96孔培养板中，每孔0.1ml内含1个细胞，对所选的4株细胞进行再克隆，并对每个小井的培养物上清液进行抗体ELISA检测。
5)培养产生单克隆抗体：将在含有15％FCS的RPMI培养基中培养所得的4株细胞株的培养细胞移入不含FCS的RPMI培养基中培养至几乎所有细胞死亡，对其培养液进行离心得到含有单克隆抗体的上清液，并对抗体进行纯化鉴定。经鉴定，可以产生抗体的杂交瘤经筛选纯化后可得18株分别抗各种性病病体的单克隆抗体细胞株。
6)在小鼠腹腔内大量产生单克隆抗体：分别将悬浮有2×106不同抗原细胞株的PBS溶液0.5ml注入6周龄雌性Bab/c小鼠的腹腔内。约一周后小鼠体重显著增加，于注射细胞后的第7、9、11天用注射器收集腹水，离心得到腹水的上清液，并对腹水上清液进行抗体含量检测。
3、制备兔抗性病病原体抗原的免疫血清：
将含上述不同的抗原用生理盐水混合稀释至总量2ml，注射进体重2千克左右的雄性耳白兔腹腔，两周后再次免疫一次。检测兔血清中针对不同抗原的抗体滴度后，采用颈动脉放血收集血液，4℃存放过夜后分离血清冻存，对抗体进行纯化。
4、制备胶体金标记抗体：
采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，即：取1％HauCl4水溶液1ml，加重蒸馏水至100ml，迅速加入枸橼酸三钠水溶液2ml，5分钟后出现橙红色，制得胶体金16nm。按1∶1比例与多种性病的单克隆抗体溶液在磁性搅拌下混合，10分钟后再加入50g/l牛血清白蛋白水溶液至终浓度为10g/l。用终浓度为0.05％PEG稳定标记后的胶体金颗粒，于4℃下1500r/min1小时。浓缩纯化离心两次，沉淀物保存于原体积6％的保存液(0.01mol/l,PH7.2PBS溶液，含0.5mg/ml PEG和1/10000NaN3)中于4℃保存。
5、检测试纸条的制备：
将兔抗淋球菌血清IgG等量混合后，以不同含量抗体以0.5ul/点打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干。将膜置于4％牛血清白蛋白内37℃封闭3小时，取出后用缓冲液冲洗3次，室温凉干，4℃密封保存；
或者：①将兔抗多种性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗体以0.5ul打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于4％牛血清白蛋白内37℃封闭3小时，取出后用缓冲液冲洗3次，室温凉干，4℃密封保存；②在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20μl，加入抗多种性病的单克隆抗体标记的体金溶液60μl，室温凉干，4℃密封保存，③分别取0.5×2.5厘米大小的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和0.5×3厘米大小的空白硝酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在0.5×8厘米的硬纸片上，其中空白端为样品加入端。
取患者的尿道生殖道的分泌物、或尿液、或疱疹内液等样品，浸湿试纸条的样品端，阳性者试纸条内胶体金单抗区域呈红色圆点，阴性者试纸条内胶体金单抗体区域则不出现红色圆点。
Claims (7)
1、一种多种常见性病快速检测试纸条，其特征在于利用抗淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹原体的单克隆抗体胶体金免疫吸附(GCISA)实验原理制成，它能定性诊断出淋病、非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣和生殖器疱疹中的一种或合并存在的多种性病。
2、按权利要求1所述的检测试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
1)制备检测用免疫原及抗原：采用淋球菌的标准菌株制备淋球菌外膜蛋白pLA、pIB的粗制品，将非淋球菌性尿道炎的主要病原体沙眼衣原体血清型D-K的基本颗粒作为其抗原，将尖锐湿疣的病原体人乳头瘤病毒(HPV-6,11型)颗粒作为其抗原，将生殖器疱疹的病原单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)作为抗原；
2)单克隆抗体的制备与筛选：将1)中四种性病的抗原分别用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合得到一种可以产生抗体的杂交瘤；
3)制备兔抗性病病原体抗原的免疫血清；
4)制备胶体金标记抗体：采用枸橼酸三钠法制备胶体金颗粒，按比例与不同性病病原体的单克隆抗体混合进行标记；
5)检测试纸条的制备：选择适当的浓度将免疫血清抗体和金标记抗体分别固定于不同的载体上，经粘合、切割等步骤制备成检测试纸。
3、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于制备兔抗性病病原体抗原和免疫血清是：用大耳白兔，雄性，体重2千克左右，将含不同抗原的性病病原体分别用生理盐水稀释进行免疫，经试血清抗体滴度后颈动脉放血，4℃存放过夜后分离血清冻存，进行抗体纯化。
4、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于胶体金标记抗体的制备是用终浓度为0.05％PEG稳定标记后的胶体金颗粒，干4℃下浓缩纯化离心1-3次，沉淀物保存于原体积3-10％的保存液中于4℃保存。
5、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于2)中所得可以产生抗体的杂交瘤经筛选纯化后可得18株分别抗各种性病病体的单克隆抗体细胞株。
6、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于检测试纸条的制备是将兔抗性病病原体血清IgG等量混合后，以不同含量抗体打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-5％牛血清白8蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗后，室温凉干，4℃密封保存。
7、按权利要求2所述的制备方法，其特征在于检测试纸条的制备也可是①将兔抗多种性病的血清IgG等量混合后，以不同含量抗体打点在硝酸纤维素膜上，超净台内室温风干，将膜置于1-5％牛血清白蛋白内37℃封闭1-3小时，取出后用缓冲液冲洗数次，室温凉干，4℃密封保存，②在另一硝酸纤维素膜免疫条带上加入TBST(150mmol/L NaCl,25mmol/L Tris,pH7.5，含1％BSA,0.02％Tween-20)20-50μl，加入抗多种性病的单克隆抗体标记的胶体金溶液20-60μl，室温凉干，4℃密封保存，③分别取大小适合的上述两种硝酸纤维素膜免疫条带和大小适合的空白硝酸纤维素膜条带，按空白、胶体金单抗和血清抗体的顺序粘接在大小适合的硬纸片上，其中空白端为样品加入端。
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