CN1117283C

CN1117283C - 用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂及其制备方法

Info

Publication number: CN1117283C
Application number: CN98104891A
Authority: CN
Inventors: 宋思扬; 张伟光; 郑忠辉; 蔡海松; 黄耀坚; 林新坚; 苏文金
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2003-08-06
Anticipated expiration: 2018-04-07
Also published as: CN1231424A

Abstract

涉及一种含有抗原或抗体的医药制品，所说的试剂包含试剂1和试剂2，试剂1为胶乳试剂，由克隆于大肠杆菌中的排泄-分泌抗原P49，P45，P53抗原中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳配制而成；试剂2为抗人或家畜免疫球蛋白IgG或IgM抗体致敏的磁性颗粒。用本发明提供的试剂对人畜旋毛虫病进行检测，其操作简便，只要将试剂及样品混合孵育一定时间，即可读出结果，整个操作时间不超过25min，且灵敏度高，结果判断容易、准确。

Description

用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂及其制备方法

(1)技术领域

本发明涉及一种含有抗原或抗体的医学或兽医学制品。

(2)背景技术

旋毛虫病是由旋毛形线虫(Trichinella spiralis，简称旋毛虫)引起的一种严重的人畜共患寄生虫病，是全国寄生虫防治“八·五”计划和2000年规划的防治重点之一；也是食肉卫生检疫的必检项目之一。目前该病的检验方法主要有：

压片镜检法：剪取膈机(近肝脏的膈肌脚)，重量不少于30～50g，先撕去肌膜，将肉片向两端撸开，对光用眼观察有无一种凸出的卵圆形的针尖大小的膨状物，呈灰白色折光良好的小节结，如有，应剪取小节结压片，观察有无旋毛虫囊或幼虫；如无，则应剪取24块米粒大小肉粒，同上压片观察。该法虽简单，但漏诊、误诊率较高，阴性率仅约50％，且不易被病人接受，故该法主要用于病死后的尸检或屠宰后的卫生检疫。免疫学方法：包括简单的血清沉淀、凝集、皮内反应及补体结合等试验，但都存在着检验特异性低的明显不足。

近年来发展了胶乳凝集试验(LAT)及酶联免疫吸附检测(ELISA)等方法。胶乳凝集试验(latex agglutination test)：取2g膈肌加入胃蛋白酶消化2h，离心收集沉淀，超声处理后取上清液，加胶乳颗粒和抗旋毛虫抗体致敏，然后进行检测，检测可分玻片法或试管法。玻片法—取30μL待检液加10μL胶乳液于玻片上，放入振荡器振荡孵育5min，最后读结果，有胶乳凝块者为阳性。试管法—取100μL待检液加10μL胶乳液于试管内，于室温下搅拌孵育15min后读结果，胶乳浊度下降并在管底有凝块者为阳性。该方法较为简单，快速，其检验灵敏度是压片法的6倍，但该方法需超声破碎仪，且不定量。酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒：试剂盒材料包括旋毛虫蚴虫可溶性抗原致敏的PVC载体(ELISA板)、辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)、TMB显色底物。其检验方法为在PVC载体上每孔放0.2mL适当稀释的待检血清，于37℃下放置5min或25℃下放置10min，弃血清，常规洗涤8次后加0.2mL适当稀释的ARP-SPA，于37℃下放置5min，常规洗涤8次，蒸馏水洗涤1次，再加入0.2mLTMB，放置5～10min显色，结果如鲜蓝色为阳性，基本无色为阴性，或590nm比色，以P/N≥2.1为阳性。该方法敏，准确性和重复性好，且可定量测定，但操作程序繁琐、耗时长，需要酶标记读数。

(3)发明内容

本发明的目的旨在提供一种用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂，该试剂采用基因工程产物代替天然抗原，并在胶乳凝集试验的基础上引入磁性颗粒，将该试剂用于人畜旋毛虫的诊断，具有操作简便，灵敏度高，结果判断容易、准确等优点。

本发明所说的用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂包含试剂1和试剂2，试剂1为胶乳试剂，即旋毛虫体外排泄—分泌抗原P49，P45，P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物致敏的胶乳，由克隆于大肠杆菌中的排泄—分泌抗原P49，P45，P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳(latex)配制而成。胶乳为商品化的各种颜色的胶乳，颗粒直径最好为0.75～0.90μm。其制备方法为：1)取0.1～10mg/mL纯化后的P49，P45，P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物加上1/5～1/20体积的2％～20％的胶乳颗粒，于室温下振荡，也可以再经超声处理40～80秒以打破团块。2)加入3～4倍体积的1％～2％carbodiimide(碳化二亚胺)，于1～10℃下振荡，也可以再经超声处理40～60秒。3)加乙酸至终浓度0.5～1.5mol/L以终止反应。4)用磷酸生理盐水缓冲液(即PBS)洗涤。5)沉淀，用牛血清白蛋白—甘氨酸缓冲液重悬至胶乳浓度为0.01％～1％，1～10℃保存备用。

试剂2为抗人或家畜免疫球蛋IgG或IgM抗体致敏的磁性颗粒(magnetic beads，又称磁珠)，所说的磁性颗粒为4×10⁸粒/mL，其制备方法为：1)取磁性颗粒用无菌水洗涤一次。2)重悬于无菌水中，加入0.5～1.5倍体积浓度为100～200μg/mL的抗IgG或IgM抗体，于1～10℃下振荡。3)用磁力装置收集磁性颗粒。4)依次用磷酸生理盐水缓冲液、甘氨酸—氯化钠和含牛血清白蛋白、吐温-20及氯化钠的Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)封闭缓冲液室温洗涤，再收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的Tris贮存缓冲液中，至终浓度为4×10⁴～4×10⁷粒/mL，1～10℃保存备用。

将本发明提供的试剂用于人畜旋毛虫病的检测，其检验步骤如下，取2～20μL试剂1于0.5mL离心管中(或酶标板的孔内)，加2～20μL用甘氨酸缓冲液(即GBS，0.1mol/L甘氨酸，0.9％NaCl(pH8.2))1∶10～1∶640稀释过的待检血清，再加2～20μL试剂2及2～20μL的甘氨酸缓冲液，于37℃振荡5～30min(或室温下10～90min)，然后置于一磁体上0.5～10min，最后观察结果，上清有色者(根据所用胶乳的颜色)为阴性；上清透明者为阳性，也可在一定波长(根据所用胶乳的颜色)下读O.D，P/N≤2.1为阳性。

本发明将基因工程产物用作抗原，代替现有天然抗原的制作方法(即裂解虫体或体外培养虫体后收集体外排泄—分泌抗原)，避免天然抗原制备的生产周期长，各批次质量不均，对接触感染性材料的工作人员构成威胁等缺点，同时在胶乳凝集试验的基础上引入磁性颗粒。用本发明提供的试剂对人畜旋毛虫病进行检测，其操作简便，只要将各种试剂及样品混合在一起，孵育一定时间即可，整个操作时间不超过25min，且灵敏度高，结果判断容易、准确，由酶标仪读取O.D值即可定量测定，另外，将不同颜色的胶乳颗粒分别用不同感染因子的抗原致敏，可由一次检验而区分不同感染因子的感染。使用该试剂的检验方法即可适用于畜牧业的养殖场或屠宰场的现场检验，也可应用于医院的临床诊断。

(4)具体实施方式

实施例1，试剂1即胶乳试剂，由旋毛虫体外排泄-分泌抗原P49与胶乳配制而成。其制备方法如下。

胶乳试剂的制备

取0.2mg/mL经纯化后的P49抗原基因体外表达的产物→1/5体积的3％的胶乳颗粒(直径0.75～0.90um)→室温振荡10min→超声处理80sec以打破团块→3倍体积的1％carbodiimide→2℃振荡过夜→加乙酸(PH4.0)至终浓度0.6mol/L以终止反应→2℃下用PBS(8.4mmol/L Na₂HPO₄，1.9mmol/L NaH₂PO₄，150mmol/L NaCl PH7.2)洗涤，缓慢旋转振荡→2000rpm离心10min→缓慢吸出上清，沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸缓冲液即(0.1mmol/L glycine，0.9％ NaCl，1％BSA)重悬至胶乳浓度为0.01％，2℃保存备用。

试剂2即磁性颗粒的制备过程：

磁性颗粒(4×10⁸粒/mL)→无菌水洗涤一次→重悬于无菌水中→加入0.5倍体积200ug/mL的抗IgG抗体→2℃下缓慢振荡24h→磁力装置磁性颗粒→用0.5mL 0.1mol/LPBS(PH8.5)洗涤20min→0.5mL 0.2mol/L甘氨酸-NaOH(50mL 0.2mol/L glycine，20mL0.2N NaOH，定容至200mL)室温缓慢洗涤4h→用0.5mL含牛血清白蛋白、吐温-20及氯化钠的Tris封闭缓冲液(0.05mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，0.1％BSA，临用前加入0.1％Tween-20)室温缓冲洗涤4h→同上收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的Tris贮存缓冲液(0.05mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，0.1％BSA)中，至终浓度为4×10⁴，2℃备用。

将上述试剂用于旋毛虫病的诊断，其检验步骤如下：取2uL试剂1于0.5mL离心管中，加2uL用甘氨酸缓冲液1∶10稀释的待检血清，再加2uL试剂2和5uL甘氨酸缓冲液，37℃振荡5min，然后置于一磁性装置上0.5min后观察结果。

实施例2，试剂1的制备，取10mg/mL经纯化后的P45(或P49和P53)抗原基因体外表达的产物→1/20体积的15％的胶乳颗粒(直径0.75～0.90um)→室温振荡20min→超声处理40sec以打破团块→4倍体积的2％carbodiimide→10℃振荡过夜→超声处理60sec→加乙酸(PH4.0)至终浓度1.5mol/L以终止反应→10℃下用PBS(8.4mmol/L Na₂HPO₄，1.9mmol/L NaH₂PO₄，150mmol/L NaCl PH7.2)洗涤，缓慢旋转振荡→6000rpm离心3min→缓慢吸出上清，沉淀，用牛血清白蛋白-甘氨酸缓冲液即1％BSA-GBS(0.1mmol/Lglycine，0.9％NaCl，1％BSA)重悬至胶乳浓度为1％，10℃保存备用。

试剂2的制备过程：取磁性颗粒(4×10⁸粒/mL)→无菌水洗涤一次→重悬于无菌水中→加入1.5倍体积100ug/mL的抗IgM抗体→1℃下缓慢振荡60h→磁力装置收集磁性颗粒→用10mL 0.1mol/L PBS(PH8.5)洗涤2min→10mL 0.2mol/L甘氨酸-NaOH(50mL0.2mol/L glycine，20mL 0.2N NaOH，定容至200mL，室温缓慢洗涤0.5h→用10mL含牛血清白蛋白、吐温-20及氯化钠的Tris封闭缓冲液(0.05mol/L Tris，0.1mol/LNaCl，0.1％BSA，临用前加入0.1％Tween-20)室温缓慢洗涤0.5h→同上收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的Tris贮存缓冲液(0.05mol/L Tris，0.1mol/L NaCl，0.1％BSA)中，至终浓度为4×10⁷，10℃备用。

将上述试剂用于旋毛虫病的诊断，步骤如下：取20μL试剂1于酶标板的孔内，加20uL用GBS 1∶640稀释的待检血清，再加20uL试剂2和20uL GBS缓冲液，室温下振荡90min，然后量于一磁性装置上10min，最后观察结果。

旋毛虫P49，P45，P53抗原基因的克隆以及其产物的纯化已为公知技术，为了进一步实施本发明，以下给出其实例。

1.旋毛虫P49抗原基因的克隆：

1)旋毛虫肌幼虫的收集将感染旋毛虫40天左右的小鼠用摘眼球取血法处死后，剥皮除去内脏和脂肪，将肌肉切碎，用人工胃液(胃蛋白酶1％，活性1∶3000，盐酸0.7％)于37℃消化6h。消化后的肉汤用60目的铜筛过滤除去肉渣，滤液用生理盐水反复沉淀洗涤，即可获得纯净脱囊的旋毛虫肌幼虫，分装置液氮中保存备用。

2)旋毛虫总RNA的提取所用的玻璃器皿、塑料管等用具均用DEPC处理后再高压消毒，试剂用DEPC处理后的水配置。1g旋毛虫肌幼虫加入1mL匀浆液，用玻璃匀浆器匀浆至显微镜下看不见完整的虫体或其碎片，室温静置5min后加入200mL氯仿，4℃12000rpm离心10min，吸取上清加入等体积的异丙醇，室温放置15min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀，用70％的冰乙醇洗涤，室温晾干沉淀后溶于50μLH₂O。

3)RNA的反转录及目的基因的扩增RNA反转录按常规方法进行：设计特异的反转录引物及PCR引物并分别在3’端5’端添加BamHI和EcoRI的位点。反转录引物为5’GCGAAT TCT GCA GGA TCC AAA CTT TTT TTT TTT TTT TTT T3’；PCR上游引物为5’GCG AATTCT GCT ACT GAT GAT ACA GAA TG3’；下游引物为5’GCG AAT TCT GCA GGA TCC AAAC3’。使用的PCR条件为94℃变性5min后加入2.5单位的Taq酶(反应总体积为50uL)，94℃ 40sec、58℃ 60sec、72℃ 90sec、35个循环。

4)目的基因的克隆及筛选DNA的酶解，回收，连接，细胞转化以常规方法进行；重组子X-gal平板筛选及克隆子的质粒DNA酶切鉴定按常规方法进行。

2.P49的纯化：

①包涵体蛋白的提取纯化

1)37℃过夜培养的工程菌按1∶100接种于1000mL营养肉汤培养液中，37℃继续振荡培养3h；

2)加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度0.1mmol/L，继续振荡培养7h；

3)4℃，3538g离心15min，收集菌体；

4)用PBS(磷酸生理盐水缓冲液)(PH7.2)悬浮菌体，同上离心，弃上清；

5)用菌体裂解液悬浮菌体，量于液氮中15min，取出缓慢融化，如此冻融三次；

6)超声破碎菌体，4℃，9829g离心15min 4次，依次用洗液A(蔗糖7％，Tris·HCl(PH7.2)50mmol/L，EDTA 100mmol/L，NaCl 0.05％，曲拉通X-100 1.0％)、B(蔗糖10％，Tris·HCl(PH7.2)20mmol/L，EDTA 10mmol/L)、C(洗液B+4mol/L脲)悬浮沉淀，最后所得沉淀物即为粗提纯化的P49包涵体蛋白；

7)洗涤后的包涵体用8mol/L尿素、20mmol/L Tris·HCl溶液、1mmol/L EDTA(PH8.5)悬浮，室温静置3h；

8)4℃，22116g离心15min，取上清备用。

②离子交换层析纯化变性蛋白

1)粗提后的包涵体蛋白溶液，4℃，22116g离心30min，弃沉淀，上清用于柱层析；

2)用初始缓冲液平衡Protein-Pak^TM DEAE-8HR AP-1层析柱(10mm×100mm，Millipore)至基线稳定，逐渐增大流速至1.0mL/min；

3)将包涵体溶解液经上样孔进入柱中，每次0.1mL(约5mg)，在高级蛋白质纯化系统上进行纯化，按Millennium^TM 2010人才济济系统进行操作；

4)用NaCl连续浓度梯度(0～1mol/L)洗脱法洗脱蛋白，样品上样及洗脱流速均为1.0mL/min，时间为80min，压力为382Psi，检测波长为280nm；

5)分部收集各组分峰，进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳及ELISA(酶联免疫吸附检测)检测分析，将有活性的组分峰用真空冷冻干燥法浓缩，准备进行下一步纯化。

③分子筛纯化变性蛋白

1)用分子筛层析缓冲液平衡Sephacyral-300层析柱(10mm×200mm)至基线稳定，逐渐增大流速至1.0mL/min；

2)离子交换层析后的蛋白浓缩液经上样孔进入已平衡过的层析柱中，每次0.1mL(约5mg)，在高级蛋白质纯化系统上进行纯化，按Millennium^TM2010软件系统进行操作；

3)样品上样及洗脱流速均为1.0mL/min，时间为40min，压力为80Psi，检测波长280nm；

4)收集目的峰形溶液，用真空冷冻干燥法浓缩，进行SDS-PAGE电泳及ELISA检测分析后，分装保存于-20℃，即为纯化后的融合蛋白P49。

④融合蛋白P49的复性

1)将1mL纯化的融合蛋白P49稀释20倍，使蛋白浓度低于100ug/mL尿素浓度保持在1mol/L，加入0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)；1mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)，10℃复性12h；

2)将20mL上述溶液装入透析袋中，于4℃对250mLTE溶液透析48h，换液3～4次，至尿素完全透析出；

3)取出透析袋中的蛋白悬液，4℃，9829g离心10min去沉淀，上清于4℃用聚乙二醇(PEG)6000浓缩20倍，-20℃贮存备用。

Claims

1、用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂，其特征在于所说的试剂包含试剂1和试剂2，试剂1为胶乳试剂，由克隆于大肠杆菌中的排泄-分泌抗原P49，P45，P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物与胶乳配制而成；所说的胶乳为商品化的各种颜色的胶乳，颗粒直径0.75～0.90μm；试剂2为抗人或家畜免疫球蛋白IgG或IgM抗体致敏的磁性颗粒，所说的磁性颗粒为4×10⁸粒/mL。

2、用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂的制备方法，该试剂包含试剂1和试剂2，其特征在于所说的试剂1的制备方法为：1)取0.1～10mg/mL纯化后的P49，P45，P53中的至少一种抗原基因体外表达的产物加上1/5～1/20体积的2％～20％的胶乳颗粒，于室温下振荡，2)加3～4倍体积的1％～2％的碳化二亚胺，于1～10℃下振荡，3)加乙酸至终浓度0.5～1.5mol/L以终止反应，4)用磷酸生理盐水缓冲液洗涤，5)沉淀，用牛血清白蛋白甘氨酸缓冲液，重悬至胶乳浓度为0.01％～1％，1～10℃留存备用；

所说的试剂2的制备方法为：1)取磁性颗粒用无菌水洗涤一次，2)重悬于无菌水中，加入0.5～1.5倍体积浓度为100～200μg/mL的抗IgG或IgM抗体，于1～10℃下振荡，3)用磁力装置收集磁性颗粒，4)依次用磷酸生理盐水缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠和含牛血清白蛋白、吐温-20及氯化钠的三(羟甲基)氨基甲烷封闭缓冲液室温洗涤，再收集磁性颗粒后重悬于含牛血清白蛋白及氯化钠的三(羟甲基)贮存缓冲液中，至终浓度为4×10⁴～4×10⁷粒/mL，1～10℃保存备用。

3、如权利要求2所述的用于人畜旋毛虫病快速诊断的试剂的制备方法，其特征在于所说的试剂1制备方法中经第1)步骤后，再经超声处理40～80秒，或/和经第2)步骤后再经超声处理40～60秒。