CN110568198A - 一种n末端b型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒 - Google Patents
一种n末端b型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT‑proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT‑proBNP酶结合物、NT‑proBNP参考品、NT‑proBNP质控品、NT‑proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。该试剂盒在实际应用中，灵敏度高、准确度高、批内以及批间差较低、线性范围宽，大大提高了试剂盒的检测性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒。
背景技术
N末端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)作为心衰定量标志物，不仅反映左室收缩功能障碍，也反映左室舒张功能障碍、瓣膜功能障碍和右室功能障碍情况。NT-proBNP是心力衰竭(Heart Failure，简称HF)的定量标志物，NT-proBNP对于诊断HF具有高度准确性，并可用于指导治疗慢性HF的疗效。NT-proBNP也是急性冠脉综合征病人死亡的预测物。
目前现有技术中，N末端B型脑钠肽前体化学发光法检测试剂盒主要是板式或管式化学发光，只能实现在65分钟内判断检测结果；分析灵敏度不高于15pg/mL；批内精密度不高于15％，批间精密度不高于20％；存在着测试灵敏度、准确度偏低，批内、批间差偏高，线性范围窄等缺点，越来越满足不了现代医学检验更高层次的要求。因此针对上述问题，有必要开发一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种灵敏度高、准确度高、批内以及批间差较低、线性范围较宽的N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品、NT-proBNP质控品、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
作为一种改进的技术方案，所述包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:3000-8000，所述NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，所述NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:800-1200的比例稀释。
作为一种改进的技术方案，所述包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将300-800ul，浓度为80-120mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入30-80ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡1-5min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将1-5mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入800-1200ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入400-600ul的C2液体，混匀后置摇床上震荡20-24h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液多次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入0.5-2ml的贮存液，放入2～8℃冰箱贮存备用。
作为一种优选的技术方案，每500ul，浓度为100mg/ml的磁性微球混悬液包被NT-proBNP抗体的量为2mg，且控制摇床的震荡时间为20-24h。
作为一种改进的技术方案，所述贮存液的pH值为7.8-9.0，所述贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L所述贮存液中所述三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为1-1.5g/L，所述氯化钠的浓度为5-15g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为0.5-1.5g/L。
作为一种改进的技术方案，所述酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中所述氯化钠的浓度为10g/L，所述磷酸氢二钠的浓度为3.0g/L，所述磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，所述氯化钾的浓度为0.3g/L，所述蔗糖的浓度为100g/L，所述新生小牛血清的体积浓度为20％，所述BSA的浓度为10g/L，所述Proclin-300的体积浓度为2％。
作为一种改进的技术方案，所述NT-proBNP参考品和所述NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，所述NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml，所述NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml。
作为一种改进的技术方案，所述参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中所述氯化钠的浓度为5-12g/L，磷酸氢二钠的浓度为2-5g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.1-0.5g/L，氯化钾的浓度为0.1-0.5g/L，蔗糖的浓度为80-120g/L，Proclin-300的体积浓度为0.1-3％，牛血清白蛋白的浓度为5-15g/L。
作为一种改进的技术方案，所述NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为120-250g/L，所述磷酸氢二钠浓度为100-150g/L，所述磷酸二氢钠浓度为10-20g/L。
作为一种改进的技术方案，所述底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中所述底物液A中所述三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6-10g/L，所述鲁米诺的浓度为0.1-0.5g/L，所述对位碘酚的浓度为0.01-0.03g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为8-12g/L，所述盐酸的体积浓度为0.0001-0.001％；所述底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中所述底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6-10g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为8-12g/L，所述过氧化氢的体积浓度为0.1-1％，所述盐酸的体积浓度为0.0001-0.001％。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
(1)本发明将NT-proBNP抗体采用磁微粒进行包被，并且按照每500ul，浓度为100mg/ml的磁性微球混悬液包被NT-proBNP抗体的量为2mg，且控制摇床的震荡时间为20-24h，即磁微粒用量与抗体的加入量为25:1,包被时间为20-24h，大大提高了磁微粒对NT-proBNP抗体的包被率，进而提高了试剂盒产品的灵敏度以及线性范围。
(2)采用由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成且pH值为7.8-8.5的贮存液对包被有NT-proBNP抗体的磁微粒混悬液进行贮存，是保证磁性微球抗体结合物稳定性的有效基质；其中牛血清白蛋白和三(羟甲基)氨基甲烷的加量至关重要，牛血清白蛋白作为一种稳定剂，能够有效防止抗体的分解和非特异性吸附，可起到生理和机械保护作用；还能减轻有些抗体的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性等。三(羟甲基)氨基甲烷对贮存液pH值起到缓冲作用，稳定的pH值对保持磁珠抗体的稳定性也是至关重要的。二者的合适浓度，可以为磁珠抗体结合物提供有效的保存基质。
(3)NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，采用吖啶酯标记与过氧化酶标记相比较可进一步提高检测试剂盒的灵敏度。
本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方和各组分均是该反应体系下的最优方案，使得本发明试剂盒线性范围宽，在10-3000pg/mL之间成良好的线性关系(相关系数R为0.9999)，而且灵敏度高(最低检测限7.13pg/mL)，准确度高，批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的NT-proBNP抗体试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的NT-proBNP抗体试剂盒相比至少缩短了20分钟，大大提高了检测效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品(NT-proBNP参考品和NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml)、NT-proBNP质控品(NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml)、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:3000，NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:800的比例稀释。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将350ul，浓度为80mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入30ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡1min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将1.12mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入800ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入400ul的C2液体(C2液体由硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和纯水配制而成；每1L的C2液体中硫酸铵的浓度为300g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.5g/L，磷酸氢二钠的浓度为20g/L。)，混匀后置摇床上震荡20h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液3次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入0.5ml的贮存液(pH值为7.8，贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L贮存液中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为0.1g/L，氯化钠的浓度为0.1g/L，牛血清白蛋白的浓度为0.1g/L。)，放入2～8℃冰箱贮存备用。
其中酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中氯化钠的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为3g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为100g/L，新生小牛血清的体积浓度为20％，BSA的浓度为10g/L，Proclin-300的体积浓度为2％。
其中参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中氯化钠的浓度为5g/L，磷酸氢二钠的浓度为2g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.1g/L，氯化钾的浓度为0.1g/L，蔗糖的浓度为80g/L，Proclin-300的体积浓度为0.5％，牛血清白蛋白的浓度为5g/L。
其中NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为120g/L，所述磷酸氢二钠浓度为100g/L，所述磷酸二氢钠浓度为10g/L。
其中底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中底物液A中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6g/L，鲁米诺的浓度为0.1g/L，对位碘酚的浓度为0.01g/L，牛血清白蛋白的浓度为8g/L，盐酸的体积浓度为0.0001％。
其中底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6g/L，牛血清白蛋白的浓度为8g/L，过氧化氢的体积浓度为0.1％，盐酸的体积浓度为0.0005％。
实施例2
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品(NT-proBNP参考品和NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml)、NT-proBNP质控品(NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml)、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:5000，NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1100的比例稀释。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将400ul，浓度为100mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入50ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡1min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将1.6mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入900ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入450ul的C2液体(C2液体由硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和纯水配制而成；每1L的C2液体中硫酸铵的浓度为400g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.8g/L，磷酸氢二钠的浓度为30g/L。)，混匀后置摇床上震荡22h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液3次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入0.1ml的贮存液(pH值为8.5，贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L贮存液中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为1.2g/L，氯化钠的浓度为8g/L，牛血清白蛋白的浓度为0.8g/L。)，放入2～8℃冰箱贮存备用。
其中酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中氯化钠的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为3g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为100g/L，新生小牛血清的体积浓度为20％，BSA的浓度为10g/L，Proclin-300的体积浓度为2％。
其中参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中所述氯化钠的浓度为8g/L，磷酸氢二钠的浓度为3g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为95g/L，Proclin-300的体积浓度为1％，牛血清白蛋白的浓度为8g/L。
其中NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为150g/L，所述磷酸氢二钠浓度为120g/L，所述磷酸二氢钠浓度为15g/L。
其中底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中底物液A中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为8g/L，鲁米诺的浓度为0.2g/L，对位碘酚的浓度为0.02g/L，牛血清白蛋白的浓度为9g/L，盐酸的体积浓度为0.0005％。
其中底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为10g/L，牛血清白蛋白的浓度为8g/L，过氧化氢的体积浓度为10％，盐酸的体积浓度为0.0005％。
实施例3
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品(NT-proBNP参考品和NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml)、NT-proBNP质控品(NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml)、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:5000，NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000的比例稀释。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将500ul，浓度为100mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入50ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡1min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将2mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入1000ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入500ul的C2液体(C2液体由硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和纯水配制而成；每1L的C2液体中硫酸铵的浓度为400g/L，磷酸二氢钠的浓度为1g/L，磷酸氢二钠的浓度为35g/L。)，混匀后置摇床上震荡22h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液4次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入1ml的贮存液(pH值为8.0，贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L贮存液中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为1.2g/L，氯化钠的浓度为10g/L，牛血清白蛋白的浓度为0.8g/L。)，放入2～8℃冰箱贮存备用。
其中酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中氯化钠的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为3.0g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为100g/L，新生小牛血清的体积浓度为20％，BSA的浓度为10g/L，Proclin-300的体积浓度为2％。
其中参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中所述氯化钠的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为3.0g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为100g/L，Proclin-300的体积浓度为2％，牛血清白蛋白的浓度为10g/L。
其中NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为200g/L，所述磷酸氢二钠浓度为120g/L，所述磷酸二氢钠浓度为15g/L。
其中底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中底物液A中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为8g/L，鲁米诺的浓度为0.3g/L，对位碘酚的浓度为0.02g/L，牛血清白蛋白的浓度为10g/L，盐酸的体积浓度为0.0006％。
其中底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为80g/L，牛血清白蛋白的浓度为10g/L，过氧化氢的体积浓度为0.8％，盐酸的体积浓度为0.0008％。
实施例4
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品(NT-proBNP参考品和NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml)、NT-proBNP质控品(NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml)、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:8000，NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1200的比例稀释。
其中包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将800ul，浓度为120mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入80ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡5min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将3.84mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入1200ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入600ul的C2液体(C2液体由硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和纯水配制而成；每1L的C2液体中硫酸铵的浓度为500g/L，磷酸二氢钠的浓度为1.5g/L，磷酸氢二钠的浓度为40g/L。)，混匀后置摇床上震荡24h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液5次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入2ml的贮存液(pH值为8.8，贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L贮存液中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为100g/L，氯化钠的浓度为80g/L，牛血清白蛋白的浓度为100g/L。)，放入2～8℃冰箱贮存备用。
其中酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中氯化钠的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为3g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，氯化钾的浓度为0.3g/L，蔗糖的浓度为100g/L，新生小牛血清的体积浓度为20％，BSA的浓度为10g/L，Proclin-300的体积浓度为2％。
其中参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中所述氯化钠的浓度为12g/L，磷酸氢二钠的浓度为5g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.5g/L，氯化钾的浓度为0.5g/L，蔗糖的浓度为120g/L，Proclin-300的体积浓度为3％，牛血清白蛋白的浓度为15g/L。
其中NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为250g/L，所述磷酸氢二钠浓度150g/L，所述磷酸二氢钠浓度为20g/L。
其中底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中底物液A中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为10g/L，鲁米诺的浓度为0.5g/L，对位碘酚的浓度为0.03g/L，牛血清白蛋白的浓度为12g/L，盐酸的体积浓度为0.001％。
其中底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为10g/L，牛血清白蛋白的浓度为12g/L，过氧化氢的体积浓度为1％，盐酸的体积浓度为0.001％。
实施例5
一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)
10次平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出(M+2SD)对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。具体测定结果见表1。
表1试剂盒最低检测限的测定
结论：经测定NT-proBNP样本稀释液的平均发光值M为4954，SD为43，得出(M+2SD)对应的发光值，代入剂量-反应曲线，得出灵敏度为7.13pg/mL。
(2)试剂盒的剂量--反应曲线的线性
将浓度为3000pg/mL的高值样本按一定比例(1；1/2；1/4；1/10；1/20；1/150)稀释为6种浓度，分别为3000pg/mL、1500pg/mL、750pg/mL、300pg/mL、150pg/mL、20pg/mL。将每一浓度样本重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算得线性相关系数r为0.9999。具体结果见表2。
表2试剂盒的剂量—反应曲线的线性
由表2数据可以得出，在发明的试剂盒产品在浓度10-3000pg/mL内具有良好的剂量反应线性关系，R为0.9999。
(3)试剂盒的准确度
用浓度分别为150pg/mL(±20％)和1000pg/mL(±20％)的准确性参考品各测定3次，测定结果记为(Xi)，按式(1)分别计算相对偏差(Bi)，如果3次结果都要求，即判为合格。如果大于或等于2次的结果不符合，及判为不合格，具体结果见表3。
Bi＝(Xi-T)/T*100％
式中：Bi—相对偏差；Xi—测量浓度；T—标定浓度。
表3
由表3数据可以得出，3次结果偏差分别为0.15％，2.72％和1.56％，均小于10％，即结果符合要求。
(4)试剂盒的精密度
a、分析内精密度：用浓度分别为50pg/mL(±20％)、150pg/mL(±20％)和2000pg/mL(±20％)的重复性参考品进行检测，各检测10次，计算10次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数CV。结果见表4。
表4
结论：测定的50pg/mL、150pg/mL、2000pg/mL精密度参考品的分析内变异系数(CV)分别为：3.21％、2.08％和2.82％(均<10％)，符合要求。而且与现有技术试剂盒产品相比较，批内精密度变异系数降低。
b、分析间精密度：使用3个批号试剂检测浓度分别为50pg/mL(±20％)、150pg/mL(±20％)和2000pg/mL(±20％)的重复性参考品，各重复10次，计算30次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M×100％得出变异系数CV，具体见表5。
表5
结论：测定的50pg/mL、150pg/mL、2000pg/mL精密度参考品的分析内变异系数(CV)分别为：2.31％、2.04％和2.85％(均<15％)，符合要求；而且与现有技术试剂盒产品相比较，批间精密度变异系数降低。
为了证明本发明试剂盒的检测性能优于现有技术的试剂盒以下给出了5个对比例，为了证明本发明试剂盒的检测性能优于现有技术的试剂盒以下给出了5个对比例，检测结果见下表：
对比例1
市售的N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒产品。并将本发明实施例3中的试剂盒产品与对比例中的产品进行临床测试，测试样本为100例，其中阳性样本为60例，阴性样本20例。
| 技术指标 | 本实施例3 | 市售的NT-proBNP产品 |
| 最低检测限 | 7.13pg/mL | 15pg/mL |
| 准确度 | 偏差＜10％ | 偏差＜15％ |
| 分析内精密度 | 变异系数不大于10％ | 变异系数不大于15％ |
| 分析间精密度 | 变异系数不大于15％ | 变异系数不大于20％ |
| 线性 | 10-3000pg/mL，r≥0.9990 | 15-2000pg/mL，r≥0.9900 |
通过表中实验结果可以发现，本发明中的试剂盒产品与市售产品的性能相比较，本发明的试剂盒产品的线性范围宽，而且灵敏度高，准确度高。
对比例2
与实施例3不同的是抗体和磁微粒包被时控制摇床的震荡时间为16h和28h。其余操作相同。
由上表实验结果发现，最优包被时间为20-24h，在此范围内保证线性范围为10-3000pg/mL的r值不低于0.9990，低于或高于此范围，都会影响试剂盒的线性。
对比例3
与实施例3不同的是贮存液的pH分别为7.2和9.5,其余均相同。
由上表实验结果显示，当贮存液pH值处于7.8-8.5之间时，试剂盒检测的相对偏差小于10％，试剂盒的准确度较高，当pH值为7.2和9.5时，相对偏差大于10％，试剂盒的准确度明显降低。
对比例4
与实施例3不同的是酶结合物是用过氧化酶标记的标记的NT-proBNP单克隆抗体，其余操作均相同。
通过表中实验结果可以发现：用过氧化物酶标记的线性r值为0.9976，吖啶酯标记的线性r值为0.9999，因此选用吖啶酯作为标记物能够明显的提高试剂盒的线性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液、NT-proBNP酶结合物、NT-proBNP参考品、NT-proBNP质控品、NT-proBNP浓缩洗涤液、底物液A以及底物液B。
2.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的工作浓度为1:3000-8000，所述NT-proBNP酶结合物为吖啶酯标记的NT-proBNP单克隆抗体，所述NT-proBNP酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:800-1200的比例稀释。
3.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述包被有NT-proBNP抗体的磁性微球混悬液的制备过程为：将300-800ul，浓度为80-120mg/ml磁性微球混悬液放试管内，加入30-80ml的磷酸盐缓冲液，混匀，置摇床上震荡1-5min，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的洗涤；再将1-5mgNT-proBNP抗体加入上述磁性微球试管内，再加入800-1200ul的磷酸盐缓冲液，混匀，向抗体与磁性微球的混合物中加入400-600ul的C2液体，混匀后置摇床上震荡20-24h，磁分离后去除上清液，完成磁性微球的包被；再用磷酸盐缓冲液多次洗涤包被好的磁性微球，待最后一次洗涤完毕后弃掉磷酸盐缓冲液，再加入0.5-2ml的贮存液，放入2～8℃冰箱贮存备用。
4.根据权利要求3所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：每500ul，浓度为100mg/ml的磁性微球混悬液包被NT-proBNP抗体的量为2mg，且控制摇床的震荡时间为20-24h。
5.根据权利要求3所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述贮存液的pH值为7.8-9.0，所述贮存液由三(羟甲基)氨基甲烷、氯化钠、牛血清白蛋白和纯水配制而成；其中每1L所述贮存液中所述三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为1-1.5g/L，所述氯化钠的浓度为5-15g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为0.5-1.5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、新生小牛血清、BSA、Proclin-300和纯水配制而成，其中每1L酶结合物稀释液中所述氯化钠的浓度为10g/L，所述磷酸氢二钠的浓度为3.0g/L，所述磷酸二氢钾的浓度为0.3g/L，所述氯化钾的浓度为0.3g/L，所述蔗糖的浓度为100g/L，所述新生小牛血清的体积浓度为20％，所述BSA的浓度为10g/L，所述Proclin-300的体积浓度为2％。
7.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述NT-proBNP参考品和所述NT-proBNP质控品均由NT-proBNP标准品和参考品稀释液配置而成，所述NT-proBNP参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、3500pg/ml、5000pg/ml，所述NT-proBNP质控品的浓度分别为150pg/ml、2000pg/ml。
8.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述参考品稀释液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、蔗糖、Proclin-300、牛血清白蛋白和纯水配制而成，其中每1L参考品稀释液中所述氯化钠的浓度为5-12g/L，磷酸氢二钠的浓度为2-5g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.1-0.5g/L，氯化钾的浓度为0.1-0.5g/L，蔗糖的浓度为80-120g/L，Proclin-300的体积浓度为0.1-3％，牛血清白蛋白的浓度为5-15g/L。
9.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述NT-proBNP浓缩洗涤液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和纯水配制而成，其中每1L所述NT-proBNP浓缩洗涤液中所述氯化钠浓度为120-250g/L，所述磷酸氢二钠浓度为100-150g/L，所述磷酸二氢钠浓度为10-20g/L。
10.根据权利要求1所述的一种N末端B型脑钠肽前体磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述底物液A由三(羟甲基)氨基甲烷、鲁米诺、对位碘酚、牛血清白蛋白、HCl和纯水配制而成，其中每1L中所述底物液A中所述三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6-10g/L，所述鲁米诺的浓度为0.1-0.5g/L，所述对位碘酚的浓度为0.01-0.03g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为8-12g/L，所述盐酸的体积浓度为0.0001-0.001％；所述底物液B由三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、过氧化氢、盐酸和纯水配制而成，其中每1L中所述底物液B中三(羟甲基)氨基甲烷的浓度为6-10g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为8-12g/L，所述过氧化氢的体积浓度为0.1-1％，所述盐酸的体积浓度为0.0001-0.001％。
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