CN102323401B - 葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，提供了一种葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）抗原体外检测试剂盒，包括检测板、羊抗GPI抗体、胶体金结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。本发明还提供了上述的GPI抗原体外检测试剂盒的制备方法。本发明采用双抗体夹心胶体金免疫吸附法原理检测人血清中的GPI抗原，将羊抗GPI抗体包被于硝酸纤维素膜，制成固相抗体，用以捕获人外周血清中可能存在的GPI抗原。再将胶体金标记于羊抗GPI抗体，形成胶体金结合物作为示踪物，如被测人血清中含有GPI抗原，则形成固相羊抗GPI抗体-GPI抗原-胶体金结合物。本发明可应用于类风湿性关节炎辅助诊断。
Description
技术领域
本发明生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒及其制备方法，特别是一种葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒及制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种最常见的自身免疫性疾病，在全世界大约有1.0％的人患有此病。其特征为对称性的大小关节滑膜的炎症。起初的症状包括批关节肿胀疼痛，并且在关节部位有晨僵，继而引起骨质破坏。因而，RA的早期诊断和及时开始合适的治疗对控制该病的病情非常重要。中小型医院的类风湿关节炎(RA)患者就诊人数量少，检测样品少，检测报告周期长，容易延误患者明确诊断和用药治疗。
类风湿性关节炎(RA)患者和约64％的健康人群与类风湿关节炎未控制的患者在血清中和关节腔积液内存在葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)。主要有体内T细胞系统和B淋巴细胞系统产生，分泌大量GPI抗原进入血清和关节腔内，使得血清中和关节腔内GPI浓度升高，是类风湿关节炎独特的自身免疫生理功能。在RA患者有高效价的GPI存在，常伴有严重的关节功能受限。提示预后不良或治疗过程中药物没有起到一定作用，当RA患者用药物治疗好转，血清和关节腔积液中GPI降低，关节肿痛减轻。从2001年Nature Immunology杂志首次发表文章，从鼠自然生成类风湿关节炎的k/BxNT细胞神经未稍细胞基因中得到GPI，然后从人类类风湿关节炎(RA)中也得到相同的GPI，而且在类风湿关节炎所含高浓度抗原都是一致，几乎完全为GPI同一酵素酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒及制备方法，所述的这种葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒及制备方法是采用胶体金渗滤法和层析法原理来检测人血清中的GPI浓度，解决了现有技术中检测血清中的GPI浓度的时间较长，程序复杂的技术问题。
本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原体外检测试剂盒，包括检测板、羊抗GPI抗体、由胶体金标记的羊抗GPI抗体结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。
进一步的，所述的检测板由一个塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加羊抗GPI抗体。
进一步的，所述的检测反应孔为圆形或者其它形状。
进一步的，所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的pH7.0～7.5之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1.0％。
进一步的，所述的洗涤液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH7.0～7.5之间，Tween-20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0.05％。
进一步的，在每毫升胶体金结合物中，羊抗GPI抗体的质量为0.025毫克。
进一步的，所述的阳性参考品为浓度大于0.2mg/L的GPI抗原。
进一步的，所述的阴性参考品小于0.2mg/L的GPI抗原。
本发明还提供了上述的一种葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原体外检测试剂盒的制备方法，包括一个配制羊抗GPI抗体溶液的步骤，一个制备检测板的步骤，一个制备胶体金标记的羊抗GPI抗体结合物的步骤，一个配制封闭液的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个制备阳性参考品的步骤和一个制备阴性参考品的步骤。
本发明的工作原理是：本试剂盒采用双抗体夹心免疫吸附法原理、及胶体金渗滤、胶体金层析检测技术检测人血清中的GPI抗原，将羊抗GPI抗体包被于硝酸纤维素膜，制成固相抗体，用以捕获人血清中可能存在的GPI抗原，再将羊抗GPI抗体标记于胶体金，形成胶体金结合物作为示踪物。如被测人血清中含有GPI抗原，则形成固相羊抗GPI抗体-GPI抗原-胶体金结合物，呈红色斑点反应，其颜色深浅与被测血清中含有的GPI抗原的浓度有关，但不呈比例关系。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明可以用于检测人血清样本中葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原，作为类风湿性关节炎辅助诊断使用。采用本发明的试剂盒当天能收到检测报告，检测结果准确而且方便。
附图说明
图1显示了检测板反应孔中心检测点有红色斑点，为阳性结果。
图2显示了检测板反应孔中心检测点无红色斑点，为阴性结果。
具体实施方式
实施例1.胶体金制备条件选择：
1.10.05％氯化金溶液300毫升，加热至沸；
1.2加入5.0％柠檬酸三钠3.6毫升；
1.3继续加热煮沸15分钟，停止加热，待冷至室温，用蒸馏水恢复至原体积；
1.4实验结果：
波长λ：540 535 530 525 520 510nm。
ABS值：0.528 0.715 1.481 0.902 0.699 0.601
目测胶体金溶液颜色：红色透明。
实施例2.胶体金结合物制备条件选择：
2.1胶体金标记羊抗GPI抗体pH值的选择：
选择胶体金标记羊抗GPI抗体的适宜pH值，使用1.0％无水碳酸钠溶液调节胶体金标记pH值，通过检测灵敏度比较胶体金标记羊抗GPI抗体的合适pH值范围。
实验结果：
实验结果表明，胶体金标记物的pH值范围在pH7.2～7.5、pH7.5～8.0组时灵敏度较好，但是目测观察阳性斑点时发现pH7.5～8.0组的阳性斑点色泽偏暗、偏紫，据此建议胶体金标记的pH值范围应控制在pH7.2～7.5较宜，亦即每100毫升胶体金，加1.0％无水碳酸钠溶液2.4毫升。
2.2胶体金标记羊抗GPI抗体浓度选择：
取胶体金按照每100毫升加入1.0％无水碳酸钠溶液2.4毫升，再按下表操作选择羊抗GPI抗体浓度：
室温静止2小时后观察，胶体金第3管呈红色透明，第4管即呈微紫红色。结果提示合适的每毫升胶体金标记羊抗GPI抗体量为0.025毫克。
实施例3.检测板制备条件选择：
3.1检测点包被介质pH条件的比较：
实验材料：
(1)硝酸纤维素膜，孔径为0.45μm；
(2)包被缓冲液：1.0M NaHCO3；
NaHCO3(分析纯)8.401克，放入容器，用量筒量取工艺用水倒入容器，待溶解，再取工艺用水补足体积到100毫升，混匀；
(3)检测点抗体：羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)；
实验过程：
(1)检测点抗原处理：
羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)原液，pH＝7.0～7.5，中性；
羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)原液0.05毫升加入1.0M NaHCO3
0.005毫升，混匀，pH≥8.0；
(2)包被：取检测点抗原2.0uL，点加在硝酸纤维素膜上制成检测板；
(3)测试阴性、阳性样本各10次比较检测点呈色程度；
实验结果：
检测点包被介质pH＝7.0～7.5，中性条件时阳性样品呈色结果不稳定，说明中性包被条件的包被效果不理想，据此认为检测点包被介质的pH条件以pH≥8.0为宜，宜采用1.0M NaHCO3来调整羊抗GPI抗体的pH值使包被条件为碱性。拟定包被介质采用在包被抗体中加入十分之一的1.0M NaHCO3调整pH≥8.0。
3.2检测点抗体使用浓度选择：
实验材料：
(1)硝酸纤维素膜，孔径为0.45μm；
(2)检测点抗体：羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)原液0.1毫升加入1.0M NaHCO30.01毫升，混匀，此抗体浓度为1.0mg/mL，再用100mM NaHCO3作梯度稀释成抗体浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL；
实验过程：
按抗体浓度分组，取检测点抗体，点加在硝酸纤维素膜上制成检测板；
测试阴性、阳性、灵敏度参考品各5次比较检测点呈色程度；
实验结果：
(1)包被抗体浓度：羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)；
| 样本 | 阴性参考品 | 灵敏度参考品 | 阳性参考品 |
| 序号 | 检测点 | 检测点 | 检测点 |
| 1 | - | ± | + |
| 2 | - | ± | + |
| 3 | - | ± | + |
| 4 | - | ± | + |
| 5 | - | ± | + |
(2)包被抗体浓度：羊抗GPI抗体(0.5mg/mL)：
| 样本 | 阴性参考品 | 灵敏度参考品 | 阳性参考品 |
| 序号 | 检测点 | 检测点 | 检测点 |
| 1 | - | - | + |
| 2 | - | - | + |
| 3 | - | - | + |
| 4 | - | - | + |
| 5 | - | - | + |
(3)包被抗体浓度：羊抗GPI抗体(0.25mg/mL)：
| 样本 | 阴性参考品 | 灵敏度参考品 | 阳性参考品 |
| 序号 | 检测点 | 检测点 | 检测点 |
| 1 | - | - | ± |
| 2 | - | - | ± |
| 3 | - | - | ± |
| 4 | - | - | ± |
| 5 | - | - | ± |
实验结果表明检测点羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)的包被浓度以1.0mg/mL为宜。而包被浓度0.5mg/mL时，灵敏度参考品偏阴。
实施例4.生产工艺：
4.1胶体金结合物制备工艺；
4.1.1制备胶体金；
4.1.1.10.05％氯化金溶液300毫升，加热至沸；
4.1.1.2加入5.0％柠檬酸三钠3.6毫升；
4.1.1.3继续加热煮沸15分钟，停止加热，待冷至室温，用蒸馏水恢复至原体积；
4.1.2胶体金标记；
4.1.2.1胶体金100mL；
4.1.2.2加1.0％无水碳酸钠溶液2.4毫升，校pH值6.4～7.2；
4.1.2.3加羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)2.5毫升，室温静止30分钟；
4.1.2.4搅拌加入10X Tris-HCl 20毫升调控pH 7.2～7.5；
4.1.2.5搅拌加入BSA：2克、PEG20000：1克、ProClin-300：0.2毫升；
4.2检测板制备工艺；
4.2.1装配检测板，取塑料盒底盖，放置吸水层，在吸水层上放置硝酸纤维素膜，盖上塑料盒面盖，压紧；
4.2.2检测点抗体：羊抗GPI抗体(1.0mg/mL)1.0毫升加入1.0M NaHCO3：0.1毫升，混匀；
4.2.3取检测点抗体2.0uL，点加在检测板反应孔中心的硝酸纤维素膜上制成检测板；
4.3配制封闭液及洗涤液；
4.3.1配制封闭液，1.0％牛血清白蛋白，0.02M pH7.0～7.5磷酸盐溶液；
4.3.2配制洗涤液，0.05％Tween-20，0.05M pH7.0～7.5Tris-HCl溶液；
4.4制备GPI参考品；
4.4.1阳性参考品制备，将封闭液14.85毫升加入GPI抗原(1.0mg/mL)0.015毫升，混匀，约为GPI抗原1.0mg/L；
4.4.2阴性参考品制备，将封闭液9.0毫升加入阳性参考品1.0毫升，混匀，为GPI抗原＜0.2mg/L；
4.5正常参考范围确定，以葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原测定试剂盒(ELISA)的正常参考范围GPI抗原含量＜0.2mg/L为依据，由于本法为定性检测，样品GPI抗原含量在正常参考范围内检测点不显色，故选择以GPI抗原含量约0.2mg/L的样品做灵敏度检测；
4.5.1实验方法：
1、使用前先将试剂和样品取出，在室温中放置15～30分钟，使其恢复至室温；
2、取出检测板；
3、在检测板反应孔中心加入封闭液2滴，待封闭液完全渗入；
4、用移液器在检测板反应孔中心加入待测样品40微升，待样品完全渗入；
5、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入；
6、在检测板反应孔中心加入胶体金结合物3滴，待胶体金结合物完全渗入；
7、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴，待洗涤液完全渗入，目测结果；
【检验结果判读】
使用者在进行样品检测时，可能会出现如下情况：
a.检测板反应孔中心检测点有红色斑点，为阳性结果(如图1所示)；
b.检测板反应孔中心检测点无红色斑点，为阴性结果(如图2所示)。
【参考值(参考范围)】
以葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原测定试剂盒(ELISA)的正常参考范围GPI抗原含量＜0.2mg/L为依据，样品GPI抗原含量在正常参考范围内检测板反应孔中心检测点无红色斑点，显示阴性结果；
正常参考范围：显示阴性结果(提示GPI抗原含量小于0.2mg/L)。
【检验结果的解释】
1、阴性结果，则提示该样本的GPI抗原含量＜0.2mg/L是正常范围；
2、阳性结果，则提示该样本的GPI抗原含量≥0.2mg/L是不正常范围。
【检验方法的局限性】
1、本方法只能定性测定人血清样本中葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)，仅作为辅助诊断使用；
2、反应斑点的稳定性：在30分钟内阳性斑点不会褪色，阴性结果仍无变化。
【产品性能指标】
1、物理性状
外观：整洁，标志(名称、批号、有效期等)完整，文字清晰。各液体试剂应清晰、无不溶物。封闭液为淡黄色透明液体，洗涤液为无色透明液体，胶体金结合物为红色透明液体，阳性参考品呈淡黄色透明液体，阴性参考品呈淡黄色透明液体。试剂盒内容物应准确无误；
2、特异性
检测330例GPI抗原含量小于0.2mg/L的样本，目测检测结果，检测板反应孔中心检测点不显示红色斑点，呈阴性反应结果；
3、分析灵敏度
取GPI抗原含量0.2mg/L的样品进行检测，目测检测结果，检测板反应孔中心检测点应显示红色斑点。
Claims (2)
1.一种葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒，其特征在于：包括检测板、羊抗GPI抗体、由胶体金标记的羊抗GPI抗体结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品，所述的检测板由一个塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加羊抗GPI抗体和胶体金标记的羊抗GPI抗体结合物，所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的pH7.0～7.5之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1.0%，所述的洗涤液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH在7.0～7.5之间，Tween-20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0.05%，在每毫升胶体金结合物中，羊抗GPI抗体的质量为0.025毫克，所述的阳性参考品为浓度大于0.2 mg/L的GPI抗原，所述的阴性参考品为浓度小于0.2 mg/L的GPI抗原。
2.权利要求1所述的一种葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原体外检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括一个配制羊抗GPI抗体溶液的步骤，一个制备检测板的步骤，一个制备胶体金标记的羊抗GPI抗体结合物的步骤，一个配制封闭液的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个制备阳性参考品的步骤和一个制备阴性参考品的步骤。
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|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |