CN109991416A - 一种免疫层析法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫层析法检测试剂盒，包括反应板、PBS缓冲液、水痘病毒抗原、羊抗鼠IgG抗体、胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液和塑料卡，所述反应板由NC膜、玻璃纤维素膜、吸水纸以及样品垫装配而成；本发明水痘病毒抗体免疫层析法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需20分钟就可判读结果，不需要辅助仪器，可直接肉眼观察结果，适用范围广，可单份检测，易于对水痘疫苗接种后效果进行评价。

Description

一种免疫层析法检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说是涉及一种免疫层析法检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
水痘是由水痘-带状疱疹病毒初次感染引起的急性传染病。主要发生在婴幼儿和学龄前儿 童，成人发病症状比儿童更严重。以发热及皮肤和黏膜成批出现周身性红色斑丘疹、疱疹、 痂疹为特征，皮疹呈向心性分布，主要发生在胸、腹、背，四肢很少。冬春两季多发，其传 染力强，水痘患者是惟一的传染源，自发病前1～2天直至皮疹干燥结痂期均有传染性，接触 或飞沫吸入均可传染，易感儿发病率可达95％以上。该病为自限性疾病，一般不留瘢痕，如 合并细菌感染会留瘢痕，病后可获得终身免疫，有时病毒以静止状态存留于神经节，多年后 感染复发而出现带状疱疹。
接种水痘疫苗是预防水痘最安全、有效的方法。水痘疫苗是经水痘病毒传代毒株制备而 成，是预防水痘感染的唯一手段。接种水痘疫苗不仅能预防水痘，还能预防因水痘带状疱疹 而引起的并发症。接种疫苗的目的是让受种者产生相关传染疾病的保护性抗体，而不易感染 相关传染疾病。当所产生的抗体达到最低保护滴度(含)以上，就会被成功保护。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种新的适用于水痘病毒抗体的检测，并用于接种水痘疫苗后 的效果评价，为临床判定提供依据的免疫层析法检测试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，包括反应板、PBS缓冲液、水痘病毒抗原、 羊抗鼠IgG抗体、胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液和塑料卡，所述反应板由NC膜、玻璃纤维素膜、吸水纸以及样品垫装配而成。
作为优选的技术方案，所述PBS缓冲液为0.05mol/L PH值在7.30～7.50的PBS缓冲液， 按照100ml量计由Na2HPO4·12H2O 1.45g、NaH2PO4·2H2O 0.148g、NaCl 0.85g加纯 化水80.00mL制得，其电导率在9000μs/cm～13000μs/cm。
作为优选的技术方案，所述胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按照100mL量计采用如下 步骤制得：
(1)取100mL胶体金于三角瓶中，加入0.1M碳酸钾溶液1.7mL，混匀，静置10min；
(2)取鼠抗人IgG单抗3mg，快速搅拌下，将鼠抗人IgG单抗逐滴加入到三角瓶中，室温静置40min；
(3)取10％牛血清白蛋白溶液10mL，快速搅拌下逐滴加入到三角瓶中，室温静置15min；
(4)将步骤(3)中所得溶液在10000rpm，4℃下离心30min，弃去上清液，再加入胶体金结合物稀释液至100mL，在2～8℃下保存备用，得胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液。
作为优选的技术方案，所述胶体金按照100mL量计由1％氯金酸溶液1mL、1％柠檬酸 三钠溶液1.4mL，其余为纯化水制得。
作为优选的技术方案，所述胶体金结合物稀释液按照100mL量计由三羟甲基氨基甲烷 0.1211g、蔗糖2g、PVP-101g、牛血清白蛋白2g、吐温-200.5mL、纯化水80mL以及适量盐酸制得，pH值控制在8.6～8.8之间。
一种免疫层析法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)检测线包被液的制备，按10mL量计，取水痘病毒抗原10mg，加入到PBS缓冲液中并定容至10mL，充分混匀15min，使水痘病毒抗原的终浓度为1.0mg/ml即得；
b)质控线包被液的制备，按10mL量计，取羊抗鼠IgG抗体20mg，加入到PBS缓冲液中， 并定容至10mL，充分混匀15min，使羊抗鼠IgG抗体的终浓度为2.0mg/mL即得；
c)用金标划线机将步骤a)与步骤b)中所得的两种包被液划到NC膜上并干燥，得划线 NC膜；
d)用胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按60μl/m2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干 燥后保存备用；
e)将划线NC膜、金标垫、吸水纸、样品垫整装后用切条机切成4mm的试纸条，并装入塑料卡中得试剂卡，将试剂卡装入铝箔袋后装盒即得试剂盒。
进一步，本试剂盒采用胶体金免疫层析法，含有水痘病毒IgG抗体的待测样品加到试纸 条的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解金标垫上的胶体金标记的鼠抗人IgG抗体后 相互反应，再移动至固定在NC膜的水痘病毒抗原区域反应形成金标记免疫复合物而被截留， 聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物检测人血清或血浆中的水痘病毒IgG抗体。
本发明的有益效果为：水痘病毒抗体免疫层析法检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵 敏度高的特点，整个操作时间仅需20分钟就可判读结果，不需要辅助仪器，可直接肉眼观察 结果，适用范围广，可单份检测，易于对水痘疫苗接种后效果进行评价。
具体实施方式
为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以 较佳的实施例详细的说明，说明如下：
一种免疫层析法检测试剂盒，包括反应板、PBS缓冲液、水痘病毒抗原、羊抗鼠IgG抗 体、胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液和塑料卡，所述反应板由NC膜、玻璃纤维素膜、吸水纸以及样品垫装配而成。
在本实施例中，PBS缓冲液为0.05mol/L PH值在7.30～7.50的PBS缓冲液，按照100ml 量计由Na2HPO4·12H2O 1.45g、NaH2PO4·2H2O 0.148g、NaCl 0.85g加纯化水80.00mL制得，其电导率在9000μs/cm～13000μs/cm。
在本实施例中，胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按照100mL量计采用如下步骤制得：
(1)取100mL胶体金于三角瓶中，加入0.1M碳酸钾溶液1.7mL，混匀，静置10min；
(2)取鼠抗人IgG单抗3mg，快速搅拌下，将鼠抗人IgG单抗逐滴加入到三角瓶中，室温静置40min；
(3)取10％牛血清白蛋白溶液10mL，快速搅拌下逐滴加入到三角瓶中，室温静置15min；
(4)将步骤(3)中所得溶液在10000rpm，4℃下离心30min，弃去上清液，再加入胶体金结合物稀释液至100mL，在2～8℃下保存备用，得胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液。
在本实施例中，胶体金按照100mL量计由1％氯金酸溶液1mL、1％柠檬酸三钠溶液1.4mL，其余为纯化水制得。
在本实施例中，胶体金结合物稀释液按照100mL量计由三羟甲基氨基甲烷0.1211g、蔗 糖2g、PVP-101g、牛血清白蛋白2g、吐温-200.5mL、纯化水80mL以及适量盐酸制得， pH值控制在8.6～8.8之间。
一种免疫层析法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a)检测线包被液的制备，按10mL量计，取水痘病毒抗原10mg，加入到PBS缓冲液中并定容至10mL，充分混匀15min，使水痘病毒抗原的终浓度为1.0mg/ml即得；
b)质控线包被液的制备，按10mL量计，取羊抗鼠IgG抗体20mg，加入到PBS缓冲液中， 并定容至10mL，充分混匀15min，使羊抗鼠IgG抗体的终浓度为2.0mg/mL即得；
c)用金标划线机将步骤a)与步骤b)中所得的两种包被液划到NC膜上并干燥，得划线 NC膜；
d)用胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按60μl/m2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干 燥后保存备用；
e)将划线NC膜、金标垫、吸水纸、样品垫整装后用切条机切成4mm的试纸条，并装入塑料卡中得试剂卡，将试剂卡装入铝箔袋后装盒即得试剂盒。
在检测时，取出试剂卡，放在水平工作台面上平置并做好样本标记，用加样器取50μl 血清或者血浆样品，直接加入到加样孔中，再滴加样本稀释液2滴。15-25分钟内判读结果， 25分钟后检验结果无效；对比检验结果：(1)、阳性：在质控区及检测区均出现紫红色条带。 (2)、阴性：只在质控区出现一条紫红色条带。(3)、无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏，实验无效。
在本实施例中，生产工艺条件的确定做了如下实验：
1.胶体金颗粒的选择
1.1原理：根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。通过调节氯 金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。
1.2制备方法
在100ml双蒸水中加入1％氯金酸溶液1ml煮沸，在搅拌条件下加入不同量的1％柠檬 酸三钠溶液，继续煮沸5分钟以制备不同大小的胶体金颗粒，自然冷却待用。用不同大小的 胶体金标记鼠抗人IgG单克隆抗体，以企业内部质控品为研究材料进行检测，结果详见表1， 表2。
表1.1％柠檬酸三钠用量的选择实验——胶体金颗粒大小的选择(1)
表2.内部质控品检测结果——胶体金颗粒大小的选择(2)
结果分析：表1、表2可以看出，2号胶体金溶液颜色紫红、透亮，无混浊及漂浮物，标记后的胶体金抗体其敏感性、特异性最好，故选择制备胶体金的工艺条件为：在100ml双蒸水中加入1％氯金酸溶液1ml煮沸，在搅拌条件下加入1.4ml的1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，自然冷却待用。
2.胶体金标记鼠抗人IgG单克隆抗体工艺的优化
2.1原理：胶体金由于静电作用形成带负电的疏水胶溶液，胶体金在弱碱环境下带负电荷， 可与鼠抗人IgG单克隆抗体的正电荷基团形成牢固的结合，形成稳定的鼠抗人IgG单克隆抗 体金标记物。
2.2胶体金标记最适pH值的选择
取若干个1.5ml离心管，分别加入1ml胶体金，用5mol/L的HCl和0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为3，4，5，6，7，8，9，10。每管加入50μg的鼠抗人IgG单克隆抗体， 混匀，室温放置10分钟。每管加入100μl 10％NaCl溶液，混匀，室温放置2小时，观察胶 体金颜色变化，记录胶体金颜色保持不变的最低pH(X)。调整pH为X-1.0、X-0.5、X、X+0.5、 X+1.0，重复以上步骤，胶体金颜色保持不变的最低pH值即为标记的最适pH值。结果详见 表3、表4。
表3.胶体金标记最适pH值的选择(1)
表4.胶体金标记最适pH值的选择(2)
结果分析：从表3、表4可以看出，当pH值为8.0时，金标记鼠抗人IgG单克隆抗体的稳定性好，故选定胶体金标记的最适pH值为8.0，即加入0.1mol/L的K2CO317μl/ml。
2.3鼠抗人IgG单克隆抗体最适标记量的选择
取若干个1.5ml离心管，分别加入1ml胶体金，用0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为8.0。每管依次分别按5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg加入鼠抗人 IgG单克隆抗体，混匀，室温放置10分钟。每管加入100μl 10％NaCl溶液，混匀，室温放 置2小时，观察胶体金颜色变化，记录胶体金颜色保持不变的最低鼠抗人IgG单克隆抗体加 入量，胶体金颜色保持不变的最低抗体加入量即为标记的鼠抗人IgG单克隆抗体最适标记量。 结果详见表5。
表5.鼠抗人IgG单克隆抗体最适标记量的选择
结果分析：从表5可以看出，当加入的鼠抗人IgG单克隆抗体浓度为30μg/ml时，金标 记鼠抗人IgG单克隆抗体不变色，故选定鼠抗人IgG单克隆抗体最适标记量为30μg/ml。
3.检测线包被浓度和胶体金标记鼠抗人IgG稀释比例的选择
按照上述确定好的金标记工艺标记鼠抗人IgG单抗，将其体积浓缩至原体积的1/10，再 以不同的稀释比例稀释浓缩液，用稀释液按60μl/m2涂金标垫，干燥备用。以不同检测线包 被浓度按0.15μl/mm的包被量包被硝酸纤维素膜(NC膜)检测线。将金标垫和划线NC膜 配对，检测内部质控血清，实验方案如表6，实验结果如表7、表8。
表6.试验设计方案
表7. 10份阳性内部质控品和最低检出限质控品检测结果
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 L2
A1 ++ +++ ± + ++ + ++ +++ ++ ++ -
A2 + ++ ± + ++ + ++ ++ + ++ -
A3 + ++ ± ± ++ + ++ ++ + + -
A4 + ++ - - ++ + ++ ++ + + -
B1 ++ +++ ± + +++ ++ +++ +++ ++ ++ ±
B2 ++ +++ ± + +++ ++ +++ +++ ++ ++ ±
B3 ++ +++ ± + +++ + ++ ++ ++ ++ ±
B4 + ++ ± ± ++ + ++ ++ + + -
C1 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ +
C2 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ +
C3 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ +
C4 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ ±
D1 ++ +++ + + +++ +++ +++ +++ ++ +++ +
D2 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ +
D3 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ +
D4 ++ +++ + + +++ ++ +++ +++ ++ ++ ±
E1 ++ +++ ++ + +++ +++ +++ +++ ++ +++ +
E2 +++ +++ +++ + ++ +++ ++ +++ ++ +++ +
E3 +++ ++ +++ + ++ +++ + ++ ++ +++ +
E4 +++ ++ +++ + ++ +++ + ++ ++ +++ +
表8. 10份阴性内部质控品检测结果
N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10
A1 - - - - - - - - - -
A2 - - - - - - - - - -
A3 - - - - - - - - - -
A4 - - - - - - - - - -
B1 - - - - - - - - - -
B2 - - - - - - - - - -
B3 - - - - - - - - - -
B4 - - - - - - - - - -
C1 - - - - - ± - - ± -
C2 - - - - - - - - ± -
C3 - - - - - - - - - -
C4 - - - - - - - - - -
D1 - - - - - ± - - + -
D2 - - - - - ± - - ± -
D3 - - - - - - - - ± -
D4 - - - - - - - - ± -
E1 - - - - - + - - + -
E2 - - - - - ± - - + -
E3 - - - - - ± - - ± -
E4 - - - - - - - - ± -
结果分析：通过表7、表8结果可以看出C3组合的灵敏度高，特异性好，故将检测线的 包被浓度定为1.0mg/ml，按0.15μl/mm的包被量包被NC膜检测线；将胶体金标记鼠抗人IgA 稀释比例定为1:10，即胶体金结合物稀释液加入至原体积的100％，原体积以胶体金体积计 算。金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μl/m2浸泡涂抹。
4.质控线包被浓度的选择
将羊抗鼠IgG抗体配成不同浓度，与水痘病毒抗原1.0mg/ml，以0.15μl/mm的包被量 分别包被在NC膜的检测线和质控线位置上，干燥后与制备好的金标垫配套使用，用内部质 控品进行检测，结果详见表9。
表9.质控线检测结果
结果分析：从表9可以看出，当C线抗体深度≥mg/ml时，反应到达最大值，所以选择质控线抗体浓度为2mg/ml。
综上所述，NC膜最终包被条件为：
包被量为0.15μl/mm；
检测线包被浓度：水痘病毒抗原为1.0mg/ml；
质控线包被浓度：羊抗鼠IgG抗体为2.0mg/ml。
5.划线NC膜和金标垫干燥条件的选择
适宜的干燥条件，不仅影响试剂盒的灵敏度，而且关系到试剂盒的稳定性。结果表明， 在干燥环境为37℃条件下，干燥3小时制备的试纸条，其敏感性，稳定性均较好，故选择37℃条件下干燥3小时为划线NC膜和金标垫生产的干燥条件。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应 该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入 要求保护的本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，包括反应板、PBS缓冲液、水痘病毒抗原、羊抗鼠IgG抗体、胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液和塑料卡，所述反应板由NC膜、玻璃纤维素膜、吸水纸以及样品垫装配而成。
2.根据权利要求1所述的一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述PBS缓冲液为0.05mol/L PH值在7.30～7.50的PBS缓冲液，按照100ml量计由Na2HPO4·12H2O 1.45g、NaH2PO4·2H2O 0.148g、NaCl 0.85g加纯化水80.00mL制得，其电导率在9000μs/cm～13000μs/cm。
3.根据权利要求1所述的一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按照100mL量计采用如下步骤制得：
(1)取100mL胶体金于三角瓶中，加入0.1M碳酸钾溶液1.7mL，混匀，静置10min；
(2)取鼠抗人IgG单抗3mg，快速搅拌下，将鼠抗人IgG单抗逐滴加入到三角瓶中，室温静置40min；
(3)取10％牛血清白蛋白溶液10mL，快速搅拌下逐滴加入到三角瓶中，室温静置15min；
(4)将步骤(3)中所得溶液在10000rpm，4℃下离心30min，弃去上清液，再加入胶体金结合物稀释液至100mL，在2～8℃下保存备用，得胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液。
4.根据权利要求3所述的一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金按照100mL量计由1％氯金酸溶液1mL、1％柠檬酸三钠溶液1.4mL，其余为纯化水制得。
5.根据权利要求4所述的一种免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金结合物稀释液按照100mL量计由三羟甲基氨基甲烷0.1211g、蔗糖2g、PVP-10 1g、牛血清白蛋白2g、吐温-20 0.5mL、纯化水80mL以及适量盐酸制得，pH值控制在8.6～8.8之间。
6.一种如权利要求1～5任一所述的免疫层析法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)检测线包被液的制备，按10mL量计，取水痘病毒抗原10mg，加入到PBS缓冲液中并定容至10mL，充分混匀15min，使水痘病毒抗原的终浓度为1.0mg/ml即得；
b)质控线包被液的制备，按10mL量计，取羊抗鼠IgG抗体20mg，加入到PBS缓冲液中，并定容至10mL，充分混匀15min，使羊抗鼠IgG抗体的终浓度为2.0mg/mL即得；
c)用金标划线机将步骤a)与步骤b)中所得的两种包被液划到NC膜上并干燥，得划线NC膜；
d)用胶体金标记鼠抗人IgG单抗溶液按60μl/m2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干燥后保存备用；
e)将划线NC膜、金标垫、吸水纸、样品垫整装后用切条机切成4mm的试纸条，并装入塑料卡中得试剂卡，将试剂卡装入铝箔袋后装盒即得试剂盒。
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