RU2249217C2 - Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом - Google Patents
Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2249217C2 RU2249217C2 RU2002116051/13A RU2002116051A RU2249217C2 RU 2249217 C2 RU2249217 C2 RU 2249217C2 RU 2002116051/13 A RU2002116051/13 A RU 2002116051/13A RU 2002116051 A RU2002116051 A RU 2002116051A RU 2249217 C2 RU2249217 C2 RU 2249217C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- electrode
- blood serum
- specific antibodies
- antigen
- antibodies
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области электрохимических методов анализа. Способ заключается в инкубировании в сыворотке крови антигена, иммобилизованного на поверхности графитового электрода, дальнейшем инкубировании с раствором белка, меченного металлом, и помещением в трехэлектродную ячейку, где определяют антитела по реакции окисления металла. Способ позволяет упростить метод анализа, повысить достоверность результатов диагностирования. 5 ил.
Description
Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, а именно к диагностике патологических состояний при анализе биологического объекта.
Используемые в настоящее время методы диагностики требуют сложного и дорогостоящего оборудования, т. к. они основаны на спектрофотометрической регистрации аналитического сигнала. Применяемые в этом методе в качестве метки антитела против человеческих иммуноглобулинов конъюгированы с ферментом пероксидазой хрена. Процесс конъюгирования является дорогостоящей, трудоемкой процедурой, кроме того, фермент как органическая макромолекула со специфической функцией не устойчив. В случае электрохимического способа определения необходимо привлечение дополнительных медиаторных систем, которые являются также неустойчивыми реагентами.
Известен способ определения патологических состояний, в котором используют человеческий сывороточный альбумин и ионы висмута в качестве модели для иммуноэлектрохимического анализа. Комплексообразователь, используемый для конъюгации антител и ионов висмута - диэтилтриаминпентаацетат (ДТА). Подложка - электроды, изготовленные методом трафаретной печати. На поверхность электродов наносят раствор нечеловеческого сывороточного альбумина (ЧСА), затем инкубируют 30 минут в блокирующем растворе (фосфатный буфер рН=7.2, твин-20) и стандартный раствор, содержащий 10 мг/мл ЧСА-ДТА-Висмут. Сигнал регистрируют методом инверсионной потенциометрии. Берут свободный реагент, содержащий 1,0 М раствор соляной кислоты и 20 мг/мл Hg2+, капают на рабочую поверхность. Ртуть, совместно выделенная, после покрытия образует нерастворимое соединение с висмутом. Потенциограмму регистрируют одновременно с процессом химического окисления (J. Wang and В. Tian "Thick-Film Electrochemical Immunosensor Based on Stripping Potentiometric Detection of a Metal Ion Label." Anal.Chem. 1998, 70, 1682-1685).
Недостатком такого способа является применение в процессе анализа соединений ртути, которые являются токсичными, а также высокая трудоемкость и сложность процесса.
Известен способ определения патологических состояний, при котором диагностируют Hanta-вирус в плазме крови. Анализ основан на образовании иммунокомплекса антиген-антитело с последующим взаимодействием в растворе антител против человеческих антител, меченных пероксидазой. В реакционную смесь добавляют H2O2 и KI. Последующую детекцию пероксидазной метки проводят в режиме амперометрии. Энзим служит катализатором при окислении иодида в йод в присутствии перекиси. Регистрируют ток восстановления йода (Rajesh Krishan, Andrey L. Ghindilis, Plamen Atanasov, Ebtisam Wilkins, Jim Montoya, and Frederick T.Koster "Fast Amperometric Immunoassay for Hantavirus Infection". Electroanalysis 1996, 8, №12, 1131-1134).
Недостатком такого способа является применение в анализе дорогостоящего неустойчивого фермента, а также необходимость использования дополнительных реактивов (Н2О2 и KI). Детекцию метки проводят косвенно, предварительно окислив иодид, а только затем регистрируют восстановление иода.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патологических состояний биологических объектов, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, присоединение метки к иммунокомплексу и последующую детекцию метки для оценки патологического состояния. При этом используют коллоидное золото в качестве иммуноэлектрохимической метки с гусиными иммуноглобулинами против человеческих антител (М.В. Gonzales Garsia, A. Costa Garsia "Adsorptive stripping voltammetric behaviour of colloidal gold and immunogold on carbon paste electrode". Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38, 1995, стр. 389-395).
Недостатком данного способа является следующее: применяемые в этом способе антитела - гусиные иммуноглобулины против человеческих антител являются дорогими реактивами, также этот способ неприменим ни к одной диагностически значимой, реальной системе по определению белков или макромолекул.
Предлагаемое изобретение направлено на упрощение метода анализа, снижение его стоимости, повышение достоверности результатов диагностирования, расширение спектра определяемых объектов.
Это достигается тем, что в качестве электрода используют толстопленочный графитсодержащий электрод, иммунокомплекс на котором включает антиген, антитело и метку, причем в качестве метки используют конъюгат белка неимунного происхождения и металлов, при этом о патологическом состоянии судят по реакции окисления металлов.
Указанные отличительные признаки существенны. Использование толстопленочного графитсодержащего электрода, обладающего высокой сорбционной способностью обеспечивает устойчивое формирование иммунокомплекса с последующей инкубацией в растворе белка неиммунного происхождения, меченного металлом. Применение белка неимунного происхождения конъюгированного с металлом в качестве метки существенно удешевляет и упрощает процесс диагностирования и с учетом оценки по реакции окисления металлов повышает точность и достоверность определения.
На фигуре 1 изображен общий вид разового толстопленочного графитового электрода, где 1 - подложка из стеклотекстолита, 2 - дорожка из графитовой пасты, 3 - слой изолятора или цементита, 4 - рабочая поверхность электрода. Предлагаемое изобретение характеризуется следующими примерами.
На фигуре 2 изображены анодные вольтамперограммы окисления золота, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.
На фигуре 3 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.
На фигуре 4 изображены анодные вольтамперограммы окисления серебра, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего специфические антитела к вирусу клещевого энцефалита.
На фигуре 5 изображены анодные вольтамперограммы, зарегистрированные, где 1 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, содержащего антитела к альфа-фетопротеинам, 2 - вольтамперограмма, полученная с использованием электрода, не содержащего антитела к альфа-фетопротеинам.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
В качестве подложки берут разовый толстопленочный графитовый электрод с плоской поверхностью. На подложку из стеклотекстолита 1 наносят дорожку из графитовой пасты 2. После отверждения пасты при 120°С изолируют нерабочую поверхность электрода цементитом 3. На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при температуре 37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного коллоидным золотом. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М соляная кислота. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 1,0 В (окисление золота) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенпиостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.2). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.
Пример 2.
На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Проводят инкубацию с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.3). В организме пациента обнаружено 0,002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.
Пример 3.
На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (вируса клещевого энцефалита). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в сыворотке крови пациента в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют сыворотку крови, не содержащую антитела к вирусу клещевого энцефалита. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.4). В организме пациента обнаружено 0,00002 мг/мл специфических антител против вируса клещевого энцефалита.
Пример 4.
На рабочую поверхность электрода 4 наносят раствор антигена (альфа-фетопротеина). Полученный электрод с иммобилизированным антигеном инкубируют в высокоспецифической фракции антител (иммуноглобулинов G из гипериммунных сывороток) в течение 30 минут при Т=37°С, затем промывают электроды буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку и твин-20. Затем инкубируют с раствором протеина А, меченного серебром. После чего электрод снова промывают раствором, содержащим НЛС и твин-20, и помещают в трехэлектродную ячейку, где вспомогательный электрод - стеклоуглерод, электрод сравнения - Ag-AgCl электрод, фон - 0,1 М хлорид калия. Сигнал регистрируют методом анодной вольтамперометрии при потенциале 0,05 В (окисление серебра) относительно насыщенного хлорсеребряного электрода. Измерение проводят с помощью потенциостата. Для холостого опыта используют буферный раствор при рН=7,2. Концентрация антител - 0,005 мг/мл. Скорость сканирования 100 мВ/с (фиг.5).
Использование предлагаемого способа позволяет упростить и удешевить процедуру электрохимического анализа за счет использования в качестве подложки разового графитового толстопленочного электрода, более доступного по получению и дешевого конъюгата белка не иммунного происхождения и металла, проведением в предлагаемом способе окисления металла методом анодной вольтамперометрии.
Claims (1)
- Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, отличающийся тем, что для образования иммунокомплекса инкубируют в сыворотке крови антиген, иммобилизованный на поверхности толстопленочного графитового электрода, промывают электрод буферным раствором и инкубируют с раствором белка не иммунного происхождения, меченного металлом, с последующей повторной промывкой буферным раствором и помещают в трехэлектродную ячейку, в которой определяют специфические антитела по реакции окисления металла.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002116051/13A RU2249217C2 (ru) | 2002-06-18 | 2002-06-18 | Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом |
| PCT/RU2003/000379 WO2003105660A2 (fr) | 2002-06-18 | 2003-06-17 | Procede pour determiner des etats pathologiques d'objets biologiques |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002116051/13A RU2249217C2 (ru) | 2002-06-18 | 2002-06-18 | Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002116051A RU2002116051A (ru) | 2004-12-27 |
| RU2249217C2 true RU2249217C2 (ru) | 2005-03-27 |
Family
ID=29729037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002116051/13A RU2249217C2 (ru) | 2002-06-18 | 2002-06-18 | Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2249217C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003105660A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2550955C1 (ru) * | 2013-12-11 | 2015-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий | Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0484989B1 (en) * | 1986-09-05 | 1996-04-24 | GANSOW, Otto A. | Polysubstituted diethylenetriamine chelates for forming a metal-chelate-protein conjugate |
| GB8915512D0 (en) * | 1989-07-06 | 1989-08-23 | Sec Dep For Health | Silver enhanced gold-labelled immuno assay method |
| RU2124720C1 (ru) * | 1997-02-18 | 1999-01-10 | Уральский государственный экономический университет | Способ изготовления модифицированного электрода для инверсионно-вольтамперометрического метода определения следов тяжелых и токсичных металлов |
-
2002
- 2002-06-18 RU RU2002116051/13A patent/RU2249217C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-17 WO PCT/RU2003/000379 patent/WO2003105660A2/ru active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2550955C1 (ru) * | 2013-12-11 | 2015-05-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Уральский центр биофармацевтических технологий | Способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003105660A3 (en) | 2004-06-17 |
| WO2003105660A2 (fr) | 2003-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11531003B2 (en) | Analyte detector for detecting at least one analyte in at least one fluid sample | |
| Koncki | Recent developments in potentiometric biosensors for biomedical analysis | |
| Ronkainen et al. | Electrochemical biosensors | |
| Singh et al. | Biomedical perspective of electrochemical nanobiosensor | |
| Hasanzadeh et al. | Electrochemical nanobiosensing in whole blood: Recent advances | |
| EP1021720B1 (en) | Electrochemical determination of fructosamine | |
| Radomska et al. | Creatinine biosensor based on ammonium ion selective electrode and its application in flow-injection analysis | |
| Song et al. | Boronic acid-modified thin film interface for specific binding of glycated hemoglobin (HbA1c) and electrochemical biosensing | |
| JP6397822B2 (ja) | デバイスおよびアミノアシドパシーの検出のためにデバイスを用いる方法 | |
| Buch et al. | An electrochemical immunosensor for C‐reactive protein based on multi‐walled carbon nanotube‐modified electrodes | |
| Yasukawa et al. | Highly-sensitive electrochemical immunosensing method based on dual amplification systems | |
| Weetall et al. | A simple, inexpensive, disposable electrochemical sensor for clinical and immuno-assay | |
| Robinson et al. | Bioelectrochemical enzyme immunoassay of human choriogonadotropin with magnetic electrodes. | |
| KR20160028038A (ko) | 노로바이러스 검출 센서, 및 이를 이용하는 전기화학적 센싱방법 | |
| Shumyantseva et al. | Electrochemical immunoanalysis of cardiac myoglobin | |
| US20070190590A1 (en) | Information acquisition apparatus on concentration of thioredoxins in sample, stress level information acquisition apparatus and stress level judging method | |
| RU2249217C2 (ru) | Способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом | |
| US20060134608A1 (en) | Chemically amplified electrochemical detection of affinity reaction | |
| RU2633086C1 (ru) | Способ экспресс-определения кардиомиоглобина в плазме крови с помощью электрохимического сенсора на основе углеродных нанотрубок и молекулярно импринтированного поли-о-фенилендиамина как биоаффинного реагента | |
| JP2004093478A (ja) | 生理活性物質の電気化学的分析用素子およびそれを用いる分析方法 | |
| US11375931B2 (en) | Non-invasive transdermal sampling and analysis device incorporating an electrochemical bioassay | |
| Vetcha et al. | Detection of hantavirus infection in hemolyzed mouse blood using alkaline phosphatase conjugate | |
| WO2013039455A1 (en) | Amperometric sensor | |
| JPH04118554A (ja) | 電気化学的酵素測定方法およびバイオセンサ | |
| ULUDAĞ et al. | An ultrasensitive electrochemical immunosensor platform based on disposable ITO electrode modified by 3-CPTMS for early detection of parathyroid hormone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20060417 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20120829 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170619 |