NL8003294A

NL8003294A - Werkwijze voor het bepalen van een antigeen, antilichaam of antigeenantilichaamcomplex alsmede daarvoor bestemde meetkit.

Info

Publication number: NL8003294A
Application number: NL8003294A
Authority: NL
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1979-06-05
Filing date: 1980-06-05
Publication date: 1980-12-09
Also published as: US4690908A; FR2458809B1; US4332788A; GB2053468B; JPS6215825B2; IT1145374B; IT8048878A0; BR8003501A; NL181461C; JPS55162059A; FR2458809A1; CA1140850A; DE3021208C2; NL181461B; GB2053468A; DE3021208A1

Description

L' 4 ζ j ’ VO 573

Werkwijze voor het bepalen van een antigeen, antilichaam of antigeen-lichaamcomplex alsmede daarvoor bestaade meetk.it

Het is bekend dat het aantonen van de aanwezigheid van een antigeen of antilichaam in lichaamsvloeistoffen van grote betekenis is, voor de diagnose of genezing van ziekten of abnormale of pathologische toestanden of aandoeningen» Onlangs zi«jn bepaalde antigeen-antilichaamcom-5 plexen of conjugaten gevonden die in nauw verband staan met autoimmune ziekten, zoals systemisehe lupus erthematosus, rheumatoïde arthritis en bepaalde glcmerulaire nefritis. Het is aldus van steeds meer betekenis geworden een antigeen, antilichaam of antigeen-antilichaamcomplex of con-jugaat in lichaamsvloeistoffen te bepalen ter ondersteuning van de 10 diagnose of de genezing van fysiologische of pathologische toestanden of aandoeningen van zowel mensen als dieren.

De toegepaste uitdrukkingen "antigeen of antilichaam" en "anti-genen of antilichamen" omvatten een "antigeen-antilichaamcomplex" en "an-tigeen-antilichaamccmplexen,, tenzij specifiek anders is aangegeven. Het 15 is duidelijk dat de uitdrukkingen "antigeen-antilichaamcomplex" en "antigeen-antilichaamcomplexen" een "antigeen-antilichaamconjugaat" en "antigeen-antiliehaamconjugaten" omvatten tenzij anders aangegeven.

Een van de bekende methoden voor het bepalen van antigenen, anti-lichamen of antigeen-antilichaamcomplexen is de zogenaamde dekglaasje-20 type ("slide") methode. Deze methode omvat twee procedures. Volgens eerste procedure wordt een stof die specifiek bindbaar is aan een antigeen of antilichaam gebonden op het oppervlak van een drager, die is samengesteld uit fijnkorrelige onoplosbare deeltjes en de gebonden stof in een geschikte vloeistof gesuspendeerd. De tweede procedure bestaat uit het 25 mengen van de suspensie, die in de eerste trap is bereid, met een monsteroplossing die het te bepalen antigeen of antilichaam bevat. Met deze methode kunnen verschillende soorten antigenen of antilichamen semi-kwantitatief worden bepaald door de agglutinering of samenklontering van de suspensie waar te nemen.

30 Er zijn tevens methoden bekend voor het kwantitatief bepalen van een te bepalen antigeen of antilichaam in een monsteroplossing door de resultaten van de agglutineringsreactie spectrofotcmetrisch of elektrisch te meten, met behulp van dezelfde materialen als toegepast in de "slide"-type methode (Croatiea Cheaica Acta, k2, 1+57-^66 (1970); European Jounal ftflfl 19 Q4 -2- of Biochemistry, 20, 553-560 (1971); Japanse octrooipublikatie 24015/1978 en 69824/1978.

Van deze kwantitatieve meetmethoden kan de methode voor het spectrofotcmetrisch meten van de resultaten van de agglutinerings-5 reactie als volgt worden aangegeven: een stof die specifiek bindbaar is aan een te bepalen antigeen of antilichaam, zoals bij voorbeeld het antigeen of antilichaam dat overeenkomt met het te bepalen antigeen of antilichaam, wordt fysisch of chemisch gebonden aan fijnverdeelde, onoplosbare dragerdeeltjes waardoor gesensibiliseerde dragerdeeltjes worden 10 verkregen die dan worden gesuspendeerd in een geschikte vloeistof en in reactie gebracht met een monsteroplossing die het te bepalen antigeen of antilichaam bevat onder voorafbepaalde omstandigheden, waarbij van het reactianengsel de adsorptie of troebeling wordt gemeten voor het kwantitatief bepalen van het te bepalen antigeen of antilichaam dat in 15 de monsteroplossing aanwezig is. De uitdrukkingen "gesensibiliseerde dragerdeeltjes" of "gensensibiliseerde dragerdeeltje" hebben betrekking op de onoplosbare dragerdeeltjes die worden gesensibiliseerd doordat daaraan een stof is gebonden die specifiek bindbaar is aan het te bepalen antigeen of antilichaam.

20 De voornoemde spectrofotcmetrische methode levert echter bezwaren bij het geven van een nauwkeurige kwantitatieve bepaling van het antigeen of antilichaam.. In deze methode wordt de absorptie of troebeling van het reactiemengsel gemeten terwijl de reactie nog steeds voortgaat zodat de absorptie of troebeling daarvan de neiging heeft in sterke mate 25 tijdsafhankelijk te variëren omdat de reactie zelfs na de voorgekozen reactieperiode voortgaat. Aldus is het bij deze methode noodzakelijk, de absorptie of troebeling onmiddellijk nadat de vooraf bepaalde reactieperiode is verlopen te meten; anders zullen de variaties in de gemeten waarden zo groot zijn dat de nauwkeurigheid van de meting' achteruitgaat. 30 Deze moeilijkheden veroorzaken problemen bij de praktische toepassing van deze methode voor de feitelijke kwantitatieve meting van een antigeen of antilichaam.

Bij de gebruikelijke kwantitatieve methoden kan de reactie van een gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie en een monsteroplossing 35 dikwijls onder roeren worden uitgevoerd teneinde de reactie te versnellen. De aggregaten gevormd door de antigeen-antilichaam,reactie kunnen echter gemakkelijk worden ontleed door mechanische stoten of aanrakingen wanneer deze sterker zijn dan de in de aggregaten door de antigeen- 800 3 2 94

L J

-3- antilichaamreactie geleverde bindingskracht. Verder is de mate van ontleding van de aggregaten sterk afhankelijk van de roer omstandigheden, zodat de nauwkeurigheid of de gevoeligheid van de meting zal af nemen.

Teneinde een spectrofotometrische procedure met verbeterde gevoeligheid 5 en nauwkeurigheid wat betreft de bepaling van een antigeen of antilichaam in een monsteroplossing te verkrijgen is een onderzoek verricht gebaseerd op de veronderstelling, dat de verschillende met de gebruikelijke spec-trofotametrische technieken ondervonden problemen en moeilijkheden, zouden worden overwonnen indien men de agglutineringsreactie of de agglu-10 tineringsremmingsreaetie in een geschikt stadium van de reactie kon laten stoppen en de door de reactie gevormde aggregaten kon fixeren, waarmee verhinderd zou worden dat. zij door mechanische krachten, zoals door roeren, zouden worden ontleed. Er is nu gevonden, dat men door toepassing van een fixerende verbinding de agglutinerings- of agglutinerings-1? renmingsreactie in een gewenst stadium van de reactie kan doen ophouden en kan verhinderen dat de daarbij gevormde aggregaten worden ontleed.

Het is bijgevolg een hoofddoel van de uitvinding te voorzien in een spectrofotometrische werkwijze voor het kwantitatief met hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid bepalen van een antigeen of antilichaam. Het 20 is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een werkwijze voor de spectrofotometrische kwantificering van een antigeen of antilichaam in een monsteroplossing, waarbij de agglutineringsreactie of agglutine-ringsremmingsreactie bij een gewenste reactietoestand kan worden beëindigd .

25 Het is een verder doel van de uitvinding te voorzien in een spec trofotometrische werkwijze voor het kwantificeren van een antigeen of antilichaam in een monsteroplossing, waarbij door de agglutineringsreactie of de agglutineringsremmingsreactie gevormde aggregaten worden gefixeerd, waardoor ontleding door mechanische middelen, zoals roeren, 30 kan worden voorkomen. Het is een nog verder doel van de uitvinding te voorzien in een reagenskit of pak ten gebruike voor de spectrofotometrische kwantificering van een antigeen of antilichaam.

Het is nog een. ander doel van de uitvinding te voorzien in een reagenskit of pak van een type dat voor de werkwijze van de uitvinding 35 bruikbaar is.

Verdere doeleinden en bijzonderheden van de uitvinding zullen nu worden toegelicht aan de hand van de volgende beschrijving van de bij- 800 32 94 -k- gaande tekeningen en voorkeursuitvoeringsvormen.

Er zal nu voor een beter begrip van de uitvinding zuiver als illustratie en voorbeeld êén uitvoeringsvoorbeeld worden beschreven, onder verwijzing naar de bijgaande tekeningen, waarin: 5 Fig. 1 een diagram is dat de meetmethode van de. uitvinding ver- t -r gelijk met de gebruikelijke methode wat betreft de meetnauwkeurigheid; u ^ fig. 2 een diagram is dat de invloed van de verschillende fixerende verbindingen vergelijkt; fig. 3 een diagram is dat standaardkrcmmen in de meetmethode van 10 de uitvinding weergeeft waarbij verschillende fijne- deeltjesdragers worden gebruikt; fig. k een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van α-fetoproteïne in voorbeeld I weergeeft; fig. 5 een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van 15 menselijke chorionische gonadotrofine in voorbeeld II weergeeft; fig. 6 een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van oestriol door de agglutineringsremmingsreactie in voorbeeld III weergeeft; fig. 7 een diagram is dat een standaardkromme voor het meten van 20 de rheumatoïde factor volgens de troebelingsmethode van voorbeeld IV weergeeft; fig. 8 een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van menselijk ^-glabuline in voorbeeld V weergeeft; fig. 9 een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van 25 a-fetoproteine in voorbeeld VI weergeeft; en fig. 10 een diagram is dat een standaardkrcmme voor het meten van oestriol in voorbeeld VII weergeeft.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van een antigeen, antilichaam, of antigeen-antilichaamccmplex of conju-30 gaat alsmede een reagenskit of pak ten gebruike voor de bepaling daarvan. De immunocheaische reacties waarop de werkwijze van de uitvinding is gebaseerd, kunnen de immunochemische agglutineringsreactie en de agglutineringsremmingsreactie cmvatten. De werkwijze volgens de uitvinding die is gebaseerd op de immunochemische agglutineringsreactie omvat het uit-35 voeren van de immunochemische agglutineringsreactie van tenminste een materiaal, gekozen uit te bepalen antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen, met gesensibiliseerde dragerdeeltjes, verkregen 800 32 94 » 4 -5- door aan onoplosbare dragerdeeltjes een antigeen of antilichaam te binden dat overeenkomt met bet te bepalen antigeen of antilichaam, en de absorptie of troebeling van het reactiemengsel te meten door bestraling met licit met een passende golflengte. De werkwijze volgens de uitvinding 5 die daarentegen is gebaseerd op de agglutineringsranmingsreactie, omvat een immunochemische agglutineringsreactie waarbij een te bepalen antigeen of antilichaam de immunochemische agglutineringsreactie van de onoplosbare dragerdeeltjes met een agglutineringsmiddel remt, en het reactiemengsel op dezelfde wijze als boven vermeld, wordt gemeten.

10 Volgens de uitvinding kan de werkwijze, gebaseerd op de immunoche mische agglutineringsreactie worden uitgevoerd op de wijze als in meer bijzonderheden zal worden beschreven. De werkwijze daarentegen die is gebaseerd op de immunochemische agglutineringsremmingsreactie, kan op vrijwel dezelfde wijze als de agglutineringsreactie worden uitgevoerd, 15 tenzij anders aangegeven.

De meetmethode waarop éên uitvoeringsvorm van de werkwijze van de uitvinding is gebaseerd, omvat de volgende trappen: (1) het veroorzaken van een antigeen-antilichaamsreactie tussen (a) gesensibiliseerde dragerdeeltjes als de eerste component en (b) een antigeen, antilichaam, 20 of antigeen-antilichaamccmplex of conjugaat als de tweede component in een monster oplossing, welke eerste component is gevormd door het zodanig binden van (i) een stof gekozen uit antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaamccmplexen die overeenkomen met de antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaamccmplexen en conjugaten die moeten worden bepaald 25 aan (II) fijnverdeelde onoplosbare dragerdeeltjes dat tenminste twee eenheden van de genoemde stoffen worden gebonden aan elke fijnverdeelde drager en de tweede component in staat is de immunochemische agglutineringsreactie met de aan de gesensibiliseerde dragerdeeltjes gebonden stof te veroorzaken, waarbij aggregaten gevormd door de antigeen-antilichaam-30 reactie door toevoeging van een fixerende verbinding aan de monsteroplos-sing worden gefixeerd en (2) het bestralen'van het reactiemengsel met straling met een geschikte golflengte en het meten van de absorptie of troebeling van het reactiemengsel om daardoor de hoeveelheid of concentratie van het te bepalen antigeen of antilichaam te bepalen.

35 In de immunochemische agglutineringsreactie, die de basis van de meetmethode van de uitvinding is, wordt eerst een antigeen of antilichaam dat specifiek bindbaar is aan en bij voorbeeld overeenkomt met het te 800 32 94 -6- bepalen antigeen of antiliehaam, fysisch of chemisch gebonden aan fijn-verdeelde onoplosbare dragerdeeltjes. Een aantal procedures voor het aan fijnverdeelde dragerdeelt j es binden van een antigeen of antiliehaam dat specifiek bindbaar is met het te bepalen antigeen of antiliehaam 5 zijn bekend. In het algemeen worden fysische sorptieprocedures of chemische bindingsprocedures uitgevoerd (Japanse octrooiaanvragen 16623/1972 en 8868/1973). De drager die als’de fijne deeltjesdrager volgens de uitvinding wordt toegepast, kan elke drager zijn die gewoonlijk wordt toegepast als gesensibiliseerde dragerdeeltjes ten gebruike in reactanten 10 voor "slide"-type proeven en cmvat een organische polymeerlatex zoals bij voorbeeld polystyreenlatex, gecarboxyleerde polystyreenlatex, styreen-divinylbenzeencopolymeerlatex, gehydroxyleerde of gecarboxyleerde styreen-divinylbenzeencopolymeerlatex, polyvinylalcohollatex, polyacryl-zuuresterlatex of vinylacetaat-acrylaatcopolymeer, een anorganische 15 materiaal, zoals bij voorbeeld silica, roet of alumina, of cellen zoals bij voorbeeld bacteriën of erytrocyten.

Een suspensie van de gesensibiliseerde dragerdeeltjes kan worden bereid door de gesensibiliseerde dragerdeeltjes te suspenderen in een geschikte oplossing, die gewoonlijk wordt toegepast met het doel een sus-20 pensie van gesensibiliseerde dragerdeeltjes te leveren. De gesensibiliseerde dragerdeeltjes kunnen daarin in hoeveelheden van ongeveer 3 0,1-200 mg, bij voorkeur van ongeveer 1-50 mg per cm oplossing, worden gesuspendeerd. De oplossing waarin de gesensibiliseerde dragerdeeltjes worden gesuspendeerd, kan water of elke andere vloeistof omvatten die 25 geen nadelig effect heeft op de reactie en de omstandigheden die betrokken zijn bij de meetmethode van de uitvinding.

Een oplossing die een te bepalen antigeen of antiliehaam bevat, wordt daarna aan de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie toegevoegd, waardoor een immunologische agglutineringsreactie van het te bepalen 30 antigeen of antiliehaam met de gesensibiliseerde dragerdeeltjes wordt veroorzaakt. Een hoeveelheid zo klein als bij benadering 0,05-1,0 ml van het reactiemengsel verkregen door de immunochemische agglutineringsreactie, kan in het algemeen voor dit doel worden toegepast. Wanneer de hoeveelheid van het reactiemengsel te klein is zodat meting van de absorp-35 tie of troebeling van het reactiemengsel moeilijk zou zijn, kan een geschikt oplosmiddel, zoals een fysiologische pekeloplossing, na voltooiing van het fixeren van de immunochemische agglutineringsreactie door een 800 32 94 -7- fixerende verbinding, worden toegevoegd cm het volume van het reactiemeng-sel te vergroten, zodat de meting van de absorptie van het reactisaengsel kan worden uitgevoerd.

Temperaturen waarbij men de gesensibiliseerde dragerdeeltjessus-5 pensie laat reageren met een monsteroplossing, zijn niet bepaald kritisch en kunnen in het algemeen elke temperatuur zijn, waarbij de antigeen-antiliehaamreaetie tot stand kcmt. Tijdsduren voer de voornoemde reactie van de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie met een monsteroplossing, kunnen in het algemeen van 1 minuut tot 2k uren bedragen; een 10 traject van 3-120 minuten heeft de voorkeur voorzover gevoeligheid en nauwkeurigheid van de meting en praktische omstandigheden in aanmerking worden genemen. Cto de reactie homogeen en gemakkelijk te 'laten verlopen heeft het de voorkeur, dat het reactiemengsel geleidelijk en langzaam wordt geroerd.

15 Volgens de uitvinding worden fixerende verbindingen toegepast om de antigeen-antilichaamreactie, die de agglutinering van de gesensibiliseerde dragerdeeltj es in de suspensie met het te bepalen antigeen of antilichaam veroorzaakt, te doen stoppen. De in de uitvinding fixerende verbindingen kunnen polyfunctionele verbindingen omvatten, zoals bij 20 voorbeeld carbodiïmiden, bij voorbeeld 1-ethyl-2-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiïmide (hierna aangeduid als propylcarbodiïmide) en 1-cyclohexyl-3-(2-morfolinoëthylj-carbodiamide (hierna aangeduid als morfolinocarbodi-imide), dialdehyden, bij voorbeeld glutaaraldehyde, en succinaldehyde, acyleringsmiddelen, bij voorbeeld U-ethyl-5-fenylisoxazonium-3’-sulfo-25 naat, succinylchloride, en dergelijke, en ze omvatten tevens proteïne-denaturerende middelen, zoals tanninezuur, formaline, perchloorzuur, trichloorazijnzuur, thiocyaanzuur en thioglycolzuur en dergelijke.

De in de uitvinding toegepaste fixerende verbindingen kunnen op elk tijdstip vanaf het begin tot aan het einde van de agglutineringsreactie 30 aan het systeem worden toegevoegd. In het algemeen zal de fixerende verbinding die in de uitvinding wordt toegepast, worden toegevoegd nadat het suspensiereagens gedurende een bepaalde tijdsperiode met een monster-oplossing in reactie is gebracht, welke periode afhangen van het toegepaste systeem. De fixerende verbinding kan echter tezamen met de andere 35 bestanddelen van het systeem worden toegevoegd teneinde de reactietrap-pen te vereenvoudigen en te verkorten.

De tijdsperiode die nodig is voor het fixeren van de aggregaten 800 3 2 94 -8- en de optimale concentratie van de voor het fixeren daarvan noodzakelijke fixerende verbinding, zijn gecorreleerd en kannen verder worden gewijzigd afhankelijk van het type fixerende verbinding zodat zij in het algsaeen niet tot bepaalde waarden zijn beperkt. De tijdsperiode 5 voor de fixering kan in het bijzonder variëren van ongeveer 3-120 minuten, en de optimale concentratie van de fixerende verbindingen op het tijdstip van de fixering, is bij voorkeur bij benadering 0,1-40$ voor propylcarbodiïmide, bij benadering 0,1-5$ voor morfolinocarbodiïmide, bij benadering 0,1-20$ voer glutaaraldehyde en bij benadering 1-30$ 10 voor formaline. De concentratie van de fixerende verbinding kan echter iets kleiner zijn wanneer de fixerende verbinding tezamen met de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie en de monsteroplossing aan het systeem wordt toegevoegd.

De fixerende verbinding wordt in het algemeen aan het reactie- 15 systeem volgens de uitvinding toegevoegd in een hoeveelheid van bij bena- 3 3 dering 0,01-10 cm en bij voorkeur 0,01-3 cm met betrekking tot het te meten reactiaaengsel.

De voortgang van de reactie kan nagenoeg geheel worden gestopt door verdunning van het reactiemengsel cmdat daardoor de reactiesnelheid 20 wordt verlaagd. Wanneer een grote hoeveelheid van de fixerende verbindingen aan het reactiesystean wordt toegevoegd, kan dit tegelijk het stoppen van de reactie en de fixatie van de aggregaten tot stand brengen. Wanneer het reactiemengsel wordt verdund, kan aldus de fixerende verbinding in een concentratie worden toegevoegd die alleen voldoende is cm 25 het aggregaat te fixeren zodat daardoor niet noodzakelijkerwijze de anti-geen-antilichaamreactie wordt gestopt.

De bufferoplossing bestemd voor het verdunnen van het reactiemengsel tot een geschikte concentratie is een oplossing, die gewoonlijk wordt toegepast in de immunochemie en omvat bij voorbeeld een glycine-gebuffer-30 de pekeloplossing, een fosfaat-gebufferde pekeloplossing en een boraat-gebufferde pekeloplossing. Een geschikte hoeveelheid proteïne, zoals runderserumalbumine en/of konijnenserumglobuline, kan aan een dergelijke bufferoplossing worden toegevoegd cm de reproduceerbaarheid van de reactie te vergroten. De toevoeging van de bufferoplossing kan tevens 35 dienen cm een geschikte pH en ionensterkte van het reactiesysteem te handhaven.

Nadat de fixering van de aggregaten is voltooid, wordt van het 800 3 2 94 * m -9- reactiemengsel dat de aggregaten "bevat, de absorptie daarvan volgens gebruikelijke methoden gemeten. Hoewel alle stralen met golflengten in het gebied van 320-2^00 nm en bij voorkeur b00-900 nm kunnen worden toegepast, kan de geschikte golflengte voor de meting worden gekozen 5 binnen het voornoemde golflengtegebied cmdat de passende golflengte zal variëren afhankelijk van de typen in een monsteroplossing aanwezige bestanddelen en de soorten fijne deeltjesdragers en/of deeltjesafmetingen daarvan. De troebelheid van het reactiemengsel kan tevens op gebruikelijke wijze worden genet en in plaats van de absorptie.

10 De kwantificering van het te bepalen antigeen of antilichaam in het reactiemengsel kan worden uitgevoerd door vergelijking met een stand aardkrcmme van het te bepalen antigeen of antilichaam. Voor het uitzetten van de stand aardkrcmme van elk van de te bepalen antigenen of antilichamen kan een reeks procedures worden uitgevoerd door een referen-15 tiestof, die op- zichzelf identiek is, of wat reactiviteit betreft identiek is aan het te bepalen antigeen of antilichaam op te lossen in variërende hoeveelheden van een geschikte bufferoplossing als boven vermeld, cm een standaardproefoplossing met een gegeven hoeveelheid van de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie onder vooraf bepaalde anstan-20 digheden te geven, waarna onmiddellijk daarna de fixerende verbinding wordt toegevoegd teneinde de reactie tot stilstand te brengen zodat de gevormde aggregaten worden gefixeerd, waarna in een meetcel de absorptie of troebeling wordt gemeten van het reactiemengsel, dat verdund kan worden met een passende vloeistof of zonodig een bufferoplossing. De stan-25 daardkromme van de afhankelijkheid van de hoeveelheid of concentratie van de standaardproef en de absorptie of troebeling daarvan kan worden getrokken. De kwantificering van het te bepalen antigeen of antilichaam kan worden uitgevoerd door de gesensibiliseerde dragerdeeltjes op vrijwel dezelfde wijze en onder vrijwel dezelfde omstandigheden als in het ge-30 val van de standaardkromme voor de standaardmonsteroplossing in reactie te brengen met een onbekend monster en de absorptie of troebeling van het reactiemengsel te meten en de proefresultaten te vergelijken met de standaardkromme zoals verkregen, waardoor de kwantificering van het te bepalen antigeen of antilichaam in een onbekend monster tot stand kan 35 warden gebracht.

Ter verhoging van de meetgevoeligheid, heeft toepassing van een gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie met een enigszins hogere concen- 800 3 2 94 -10- tratie de voorkeur. Volgens de uitvinding kan een betrekkelijk hoge concentratie van de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie werden toegepast, ter verbetering van de meetgevoeligheid. Bij gebruikelijke meetmethoden wordt het reactiemengsel direct gemeten zonder dat het ver-5 dund wordt, cmdat daardoor de gevormde aggregaten kunnen werden vernietigd. Wanneer aldus de concentratie van de suspensie te hoog wordt is het moeilijk het reactiemengsel te meten zodat de toepassing van de gebruikelijke meetmethoden beperkt is tot een reactiemengsel waarin de concentratie van de suspensie kleiner is dan 0,6 gev.% (Japanse octrooi-10 publikatie 2h-015/19T8). In de uitvinding kan het reactiemengsel echter zelfs worden toegepast wanneer het zonodig verdund is, zodat de uitvinding de hoogste reactiegevoeligheid levert zelfs wanneer de concentratie van de suspensie ongeveer 1 gevr.% is. De werkwijze volgens de uitvinding gebaseerd op de immunochemische agglutineringsremmingsreactie betreft 15 het meten van veranderingen in de absorptie of troebeling, veroorzaakt door de immunochemische agglutineringsremmingsreactie waarbij het te bepalen antigeen of antilichaam de immunochemische agglutineringsreactie van de voornoemde onoplosbare dragerdeeltj es met een agglutineringsmiddel rent. Het in een bepaalde uitvoeringsvorm van de uitvinding toe te pas-20 sen agglutineringsmiddel is een middel dat de agglutinering van de gesensibiliseerde dragerdeeltjessuspensie tot stand kan brengen wanneer geen of bijna geen te bepalen antigeen of antilichaam of slechts een zeer kleine hoeveelheid aarvan in een monsteroplossing aanwezig is.

Dit omvat in het algemeen een antigeen of antilichaam dat specifiek 25 bindbaar is aan de gesensibiliseerde dragerdeeltj es en een antigeen of antilichaam dat is gebonden aan de onoplosbare fijne deeltjesdrager.

De meetmethode waarop de andere uitvoeringsvorm, van de werkwijze volgens de uitvinding is gebaseerd betreft het tot stand brengen van de antigeen-antilichaamreactie tussen gesensibiliseerde dragerdeeltjes als 30 eerste component, een te bepalen antigeen of antilichaam als tweede component, en een agglutineringsmiddel als derde component, welke eerste component wordt gevormd door een stof gekozen uit antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen die overeenkomen met de te bepalen antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaamcomplexen en conjugaten te 35 binden aan fijnverdeelde onoplosbare dragerdeeltjes zodanig dat tenminste twee eenheden van deze genoemde stoffen worden gebonden aan elke fijnverdeelde drager, welke tweede component in staat is de immunochemische 800 3 2 94 . * * -11- agglutineringsreactie met de stof- gebonden aan de gesensibiliseerde dragerdeeltjes tot stand te brengen, ter vijl de derde component tenminste een, stof is, gekozen uit antigenen, antilichamen en antigeen-antilichaam-complexen die in staat zijn de immunochemische reactie met de eerste com-5 ponent tot stand te brengen, bet fixeren van de door de antigeen-anti-lichaamreactie gevormde aggreagaten door een fixerende verbinding aan de monsteroplossing toe te voegen en bet reactionengsel te bestralen met stralen van geschikte golflengte en de absorptie of troebeling van bet reactionengsel te meten cm daardoor de hoeveelheid of concentratie van 10 het te bepalen antigeen of antilichaam te bepalen.

Aan de monsteroplossing vaaraan het agglutineringsmiddel is toegevoegd, vordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid van de fixerende verbinding toegevoegd. De toevoeging van de fixerende verbinding kan onmid-dellijk na de remming van de antigeen-antilichaamreactie vorden uitge-1-5 voerd. Het is echter mogelijk het agglutineringsmiddel tezamen met de andere ingrediënten, die voor de meetmethode van de uitvinding, gebaseerd op de immunochemische agglutineringsremmingsreactie noodzakelijk zijn toe te voegen teneinde de procedure te vereenvoudigen en te verkorten.

Wanneer de beoogde antigeen-antilichaamreactie een agglutinerings-20 reactie is, omvat de meetreagenskit op het pak volgens de uitvinding (a) een suspensie van gesensibiliseerde dragerdeeltjes, (b) een bufferoplos-sing en (c) een fixerende verbinding. Wanneer de beoogde antigeen-antilichaamreactie een agglutineringsremmingreactie is, omvat de meetreagenskit op het pak volgens de uitvinding (a) een suspensie van gesensibili-25 seerde dragerdeeltjes, (b) een bufferoplossing, (c) een agglutineringsmiddel, (d) een fixerende verbinding.

Sommige of alle van de reagentia van de meetkit-van de uitvinding kunnen gevriesdroogde reagentia zijn. In een zodanig geval kan een geschikt oplosmiddel aan de meetkit worden toegevoegd deze kan worden 30 toegepast voor het oplossen van de gevriesdroogde reagentia wanneer de kit wordt toegepast. Teneinde de meetkit van de uitvinding op een geschikte wijze toe te passen kan een proefbuis, een pipet en andere hulpmiddelen aan de kit worden toegevoegd.

Als antigenen of antilichamen die volgens de werkwijze en de meet-35 kit van de uitvinding kunnen worden bepaald kunnen proteinehormonen worden genoemd zoals menselijke chorionische gonadotrofine, insuline en menselijke groeihormonen, proteïnestoffen zoals α-fetoprotexne, hepatitis 800 3 2 94 -12- B virus (HBs), immunoglobuline, antigeen-antilichaamccmplexen, cerulo-plasmine en transferrin, alsmede haptenen zoals thyroxine, testosteron, fenitoïne en fenobarbital.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft de volgende voordelen: 5 Aangezien de antigeen-antilichaamreactie wordt gestopt hij toe voeging van het fixerende middel aan het reactiemengsel, gaat terwijl de absorptie wordt gemeten de reactie niet verder. Aldus worden variaties van de gemeten waarden verminderd en de meetnauwkeurigheid verbeterd.

Aangezien de door de reactie gevormde aggregaten, gefixeerd worden 10 door fixerende verbindingen, neemt de mechanische sterkte van de aggregaten toe en kan het desintegreren of uiteenvallen van de eenmaal gevormde aggregaten door roeren van het reactiemengsel of overbrenging van het reactiemengsel aan bij voorbeeld een cel voor het meten van de absorptie of troebeling, aanmerkelijk worden verminderd. Bijgevolg kan 15 schommeling in de meetwaarden of de verlaagde meetnauwkeurigheid, die wordt toegescbreven aan de desintegratie van de eenmaal gevormde aggregaten, worden voorkomen en kan de meting met hogere nauwkeurigheid en gevoeligheid worden uitgevoerd.

Een ander voordeel van de uitvinding is dat geen speciale meet-20 apparatuur nodig is. Aangezien een verder voorgaande reactie door toevoeging van de fixerende verbinding wordt gestopt is er bij de meetmethode volgens de uitvinding, voldoende tijd cm het reactiemengsel over te brengen naar een cel voor het meten van de absorptie daarvan. Aangezien verder de gevormde aggregaten stabiel worden gefixeerd, kan de des-25 integratie van de aggregaten door overbrenging van. het reactiemengsel effectief worden voorkomen. Bijgevolg kan de behandeling worden uitgevoerd met een gebruikelijk reactievat en is geen speciale apparatuur nodig.

Nog een verder voordeel van de meetmethode van de uitvinding be-30 staat erin dat alle meettrappen kunnen worden geautomatiseerd. Meer in het bijzonder kan, zoals eerder beschreven, de mechanische sterkte van de aggregaten worden vergroot door in de meetmethode van de uitvinding de fixerende verbinding toe te voegen, waardoor desintegratie van de eenmaal gevormde aggregaten bij overbrengen of roering van het reactiemengsel 35 aanmerkelijk wordt verminderd. Aldus kunnen alle trappen met inbegrip van de over breng- en roertrappen worden geautomatiseerd.

Nog een verder voordeel van de uitvinding is dat een kwantitatieve 800 32 94 -13- meting kan worden uitgevoerd onder toepassing van reagentia van de gebruikelijke semi-kwantitatieve meting die op een dekglaasje wordt uitgevoerd. De meetreagenskit op het pak van de uitvinding verschilt van de gebruikelijke seai-kwantitatieve meetreagenskit slechts door de aan-5 wezigheid van de fixerende verbinding. Wanneer aldus de meetkit van de uitvinding wordt toegepast wordt de reactie die tot dusver op een dek-glaasje werd uitgevoerd, uitgevoerd in een proefbuis en wordt daarbij de absorptie of troebeling gemeten volgens de voornoemde procedures, waardoor een kwantitatieve meting kan worden verricht. Indien aldus de 10 fixerende verbinding van de uitvinding wordt gecombineerd met de gebruikelijke reagenskit, kan men al naar behoefte de semi-kwantitatieve proefmeetmethode met een dekglaasje of de kwantitatieve meetmethode voor het meten van de absorptie toepassen.

Fig. 1 is een diagram dat de meetnauwkeurigheid, die bereikbaar 15 is met de werkwijze volgens de uitvinding, waarin de aggregaten worden gefixeerd door toevoeging van een fixerende verbinding aan het reaetie-mengsel, wordt vergeleken met de meetnauwkeurigheid die bereikbaar is met de gebruikelijke methode waarbij geen fixerende verbinding wordt toegepast. Meer in het bijzonder wordt-volgens de werkwijze als beschre-20 ven in voorbeeld I, een anti-a-fetoproteïne-gesensibiliseerde latex-reagens in reactie gebracht met een oplossing van een standaardmonster van α-fetoprotelne, en wordt met een 10$'s propylcarbodiïmidesuspensie als de fixerende verbinding aan het reactiemengsel toegevoegd of wordt in het geheel niet toegevoegd. In beide gevallen wordt het overbrengen 25 van het reactiemengsel naar een ander vat verschillende malen herhaald en wordt de absorptie van het reactiemengsel gemeten om veranderingen in de gaaeten waarden door de bovengenoemde verschillende malen herhaalde overbrenging te onderzoeken. Zoals blijkt uit fig. 1 gaat in de conventionele methode, waarbij geen fixerende verbinding wordt toegepast, wordt 30 de absorptie, steeds wanneer het reactiemengsel wordt overgedragen, groter. Aldus blijkt, dat de eenmaal gevormde aggregaten worden gedesintegreerd door de mechanische inwerking veroorzaakt door het overbrengen.

In tegenstelling daarmede is volgens de werkwijze van de uitvinding, waarbij een fixerende verbinding wordt toegepast, de verandering 35 van de meetwaarde door het overbrengen zeer klein en men neemt waar, dat nauwelijks desintegratie van de aggregaten optreedt.

Fig. 2 toont de resultaten van een vergelijking van het effect van 800 32 94 -11;- verschillende fixerende verbindingen. Meer in het bijzonder wordt op dezelfde wijze als boven beschreven, een anti-a-fetoproteïne antilichaam-gesensibiliseerd latexreagens in reactie, gebracht met een standaardmonster-oplossing van α-fetcproteïne, en worden verschillende fixerende verbin- 5. dingen afzonderlijk aan het reactiemengsel toegevoegd, waarbij standaard-krommen zoals in fig. 2, worden gevormd. Uit fig. 2 blijkt dat wanneer deze fixerende verbindingen worden toegepast, steilere stand aar dkranmen worden verkregen en dat een grote mate van bruikbaarheid wordt bereikt door het fixeren van aggregaten gevormd, door de antigeen-antilichaam-10 reactie.

Voorbeelden van standaardkrommen verkregen door reagentia te bereiden gesensibiliseerd ten opzichte van een anti-a-fetoproteïne anti-lichaam volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld I onder toepassing van verschillende fijne deeltjesdragers en een standaardmonster van 15 α-fetoproteïne te meten onder toepassing van deze reagentia, worden weergegeven in fig. 3.

Fig. 3 toont duidelijk dat soortgelijke stand aar dkranmen kannen worden verkregen ongeacht het type toegepaste drager.

De uitvinding zal nu in bijzonderheden worden beschreven met be-20 trekking tot de volgende voorbeelden, die niet beperkend zijn bedoeld. Voorbeeld I

Dit voorbeeld illustreert de meting van α-fetoprotexne (AFP).

(a) Een anti-AFP antilichaam werd opgelost bij een concentratie van 0,08$ in een glycine-gebufferde pekeloplossing (GBS) met een pïï van 8,2, 25 waarbij 5 ml van de oplossing werd toegevoegd aan 5 ml van een 10#'s suspensie van polystyreenlatex (een produkt van Dow Chemical Co., Midland, Michigan; gemiddelde deeltjesafmeting = 0,h8 ^um) terwijl een incubatie bij h5°C gedurende βθ minuten werd uitgevoerd cm de polystyreenlatex te sensibiliseren met het anti-AFP antilichaam. Na de sensibilisering werd 30 de bovenstaande vloeistoflaag verwijderd door centrifugale scheiding en het neerslag gesuspendeerd in 50 ml GBS dat 0,1$ runderserumalbumine (BSA) bevatte onder vorming van een anti-AFP antilichaam-gesensibili-seerde latexreagens.

(b) AFT werd geëxtraheerd uit ascitische vloeistof van een hepatama- 35 patiënt volgens de procedure van Nishi et al. (Cancer Res., 30, 2507-2523 (1979)) en het gezuiverde AFP werd opgelost in een o,1$'s op- 3 2 1 lossing van BSA bij een concentratie van 10,10, 10 of 0 ng/ml als een 800 32 94 -15- standaardmonster oplossing.

Daarna werden 25 microliter van de standaardmonsteroplossing, 50 microliter -van GBS en 25 microliter van het anti-AFP antilichaam-gesen-sibiliseerde latexreagens bereid onder (a) als boven in een testbuis 5 gedaan. De reactie werd gedurende 1*0 minuten uitgevoerd bij kamertemperatuur onder matig schudden. Na de reactie werd 0,1 ml van een ^Q%'s pro-pylcarbodiomide GBS-oplossing als fixerende verbinding aan het reactie-mengsel toegevoegd en de reactie gedurende 20 minuten onder schudden uitgevoerd. Na de reactie werd k ml van een fysiologische pekeloplossing 10 aan het reactiemengsel toegevoegd en de absorptie bij een golflengte van 500 nm gemeten met een spectrofotometer (Hitachi Model 62k van Hitachi, Limited Tokio Japan). De meting werd tweemaal uitgevoerd ten- opzichte van elke standaardoplossing. De verkregen resultaten werden uitgezet in een grafiek waarbij een standaardkronme als in fig. werd verkregen.

15 (c) De concentratie van AFP in de sera van hepatama-patiënten werd van tevoren bepaald volgens de semi-kwantitatieve methode waarbij elk serum gebaseerd op de verkregen resultaten geschikt werd verdund. 25 ml van het verdunde serum werd in een proefbuis gebracht en de absorptie gemeten volgens de procedure beschreven onder (b). De concentraties van 20 AFP in de sera van de patiënten werden bepaald uit de verkregen waarden resp. door toepassing van de standaardkromme als gevormd onder (b).

De verkregen resultaten worden weergegeven in tabel A.

TABEL A

Patiënt Monster Absorptie AFP-concentratie 25 materiaal verdunnings- (ng/ml) verhouding _ _ (aantal malen)___________ 1 serum 1 0,611 62 2 serum 1*0 0,51+1 1*250 30 3 serum 1+0 0,581 3^50 1* serum 1 0,321 298 5 serum 30 0,553 3 600

Voorbeeld II

Dit voorbeeld illustreert de meting van menselijk chorionisch 35 gonadotrofine (HCG).

(a) Volgens de procedures, beschreven in voorbeeld I - (a), werden een anti-HCG-antilichaam en een gecarboxyleerde polystyreenlatex (produkt van Dow Chemical Co.; gemiddelde deeltjesafiaeting 0,25 ^um) gemengd en ge- 800 32 94 -16- incubeerd onder vorming van een anti-ÏÏCG-antilichaam-gesensibiliseerde latesr eagens.

(b) HCG (met een specifieke activiteit van 6000 iu/mg) werd opgelost in GBS bij concentratie van 8, k, 2, 1, 0,5 en 0,25 iu/ml als standaard- 5 monster oplossingen. 25 ^ul van de standaardmonster oplos sing, 50 ^ul van een bufferoplossing en 25 ^ul van bet anti-HCG-antiliehaam-gesensibili-seerde latexreagens, bereid onder (a), weiden in een proefbuis gebracht.

De reactie werd gedurende 60 minuten uitgevoerd bij kamertemperatuur onder mild schudden. Na de reactie werd 4 ml van een 10/S's glutaaraldehyde-10 oplossing aan het. reactiemengsel toegevoegd en de reactie verder gedurende 30 minuten uitgevoerd. De absorptie bij 500 nm werd gemeten, waarbij men een standaardkranme verkreeg weergegeven in fig. 5.

(c) Menselijk serum of urine werd behandeld volgens de procedures beschreven onder (b) en de absorptie bepaald. Daarna werd de hoeveelheid 15 HCG in het serum of urinemonster bepaald gebaseerd op de standaardkranme gevormd onder (b). De verkregen resultaten worden weergegeven in tabel B. De resultaten verkregen volgens de dekglaasjeproefmethode (minimale gevoeligheid 1 iu/ml) en de radio-immuno-analysemethode (RIA-methode) worden tevens als referentie weergegeven in tabel B, 20 800 32 94 -17-

TABEL B

Patiënt Monster Absorptie HCG-concen- Dek- RIA-me-, . .. , (gem.) tratie glaasje- thode materiaal verd.ua- (iu/ml) methode (iu/ml) ning (aantal 5 _ _ malen) _ _ _ _ 1 urine 1 0,509 0,28 - 0,1+1 2 urine 1 0,1+21 0,99 + 1,02 3 urine 1 0,1+58 0,86 + 0,89 k urine 1 0,212 2,93 + 3.21 10 5 urine 10 0,339 13,67 ++ 17,36 6 serum 1 0,5½ 0,51+ - 0,66 7 serum 1 0,203 3,32 ++ 3,12 8 serum 1 0,551 0,86 + 0,91 9 serum 1 0,1)-58 0,50 - 0,57 15 10 serum 1 0,309 1,55 + 2,26

- : Ho. HCG of 1 < iu/ml HCG

+ : ca. 1 iu/ml HCG

+ : >1 ul/ml HCG

++: veel groter dan 1 iu/ml HCG.

20 Voorbeeld III

Dit voorbeeld illustreert een uitvoeringsvorm van de werkwijze gebaseerd op de agglutineringsremmingsreaetie.

(a) Volgens de procedures beschreven in voorbeeld I-(a), werd een ge-hydroxyleerd styreen-divinylbenzeencopolymeerlatex (produkt van Rhone-25 Poulence, Parijs, Frankrijk; gemiddelde deeltjes afmeting 0,33 ^um) gesensibiliseerd met een anti-oestriol-antilichaam, bereid onder toepassing van een geconjugeerd oestriol-l6.17^ü-hanisuccinaat/runderserumalbumine (hierna aangeduid als E^-BSA) ter vorming van een anti-oestriol-anti-lichaam-gesensibiliseerd latexreagens.

30 (b) E^-BSA werd opgelost in een fysiologische pekeloplossing bij een concentratie van 160, 80, 1+0, 20, 10 of 5 ng/ml als een standaardoplossing. 25 ^ul van het anti-oestriol-antiliehaam-gesensibiliseerde latexreagens bereid onder (a), 25 ^ul van een oplossing (concentratie = 100 y-ug/ml) van een oestron-17-(0-carboxymethyl)oxime/runderserumalbumine-35 complex (hierna aangeduid als E^-BSA) als agglutineringsmiddel en 25 yUl van de standaardoplossing, werd toegevoegd en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 1+0 minuten uitgevoerd. Ha de reactie werd 1+ ml j 800 32 94 -18- van een · 10%'s propylcarbodiimide-oplossing toegevoegd en de reactie gedurende 20 minuten uitgevoerd. Daarna werd de absorptie van bet reactie-mengsel gemeten en verd een standaardkramme als weergegeven in fig. 6, verkregen.

5 (c) De urine van een zwangere vrouw werd geschikt verdund met een fysiologische pekeloplossing waarvan de verdunningsverhouding werd bepaald door de resultaten van een vooronderzoek door de semi-kwantitatieve bepaling. Volgens de procedures beschreven onder (b) werd de concentratie van het oestriol in de urine kwantitatief bepaald. De verkregen resul-10 taten worden weergegeven in tabel C.

TABEL C

Hr. Aantal Monster Absorptie Oestriolcon-

Zwangere weken centratie vrouw v.d. zvan- materiaal verdunning (mg/l) 15 gerschap (aantal _ _ _ malen) _ _ 1 k urine 1 0,^55 0,08 2 16 urine 10 0,299 0,U8 3 28 urine 50 0,200 1,21 U 31 urine 500 0,53^+ 5S30 20 5 36 urine 1000 0,U83 9,80

Voorbeeld IV

(a) Een polystyreenlatex werd gesensibiliseerd met gedenatureerd immu-noglobuline (igG) volgens de procedure beschreven in voorbeeld I-(a), als een gedenatureerd IgG-gesensibiliseerd latexreagens.

25 (b) Rheumatoïde factor-positief serum als standaardmonster werd ver dund in een verdunningsverhouding van 1600, 800, UOQ, 200 en 100 maal ter bereiding van een standaardmonsteroplossing. 25 ^ul van de stamdaard-monsteroplossing, 50 ^ul bufferoplossing en 25 ^ul van het gedenatureerde IgG-gesensibiliseerde latexreagens, bereid onder (a), werden in een test-30 buis gebracht en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uitgevoerd. Na de reactie werd 0,1 ml van een 10$’s propylcarbodiimide-oplossing toegevoegd en de reactie gedurende 20 minuten uitgevoerd.

Daarna werd U ml van een fysiologische pekeloplossing aan het reactie-mengsel toegevoegd en de troebeling gemeten door een turbidcmeter 35 (Corona UT-11) waarbij de volledige uitslag als 100 werd beschouwd. Een voorbeeld van de standaardkramme wordt weergegeven in fig. 7· (c) Onder toepassing van een patiëntserum in plaats van de standaard- 800 32 94 oplossing werd de rheumatoldefactor in het serum bepaald op dezelfde wijze als beschreven onder (b). De -verkregen resultaten worden weerge geven in tabel D.

-19-

TABEL· D

5 Monster Monster Troebeling Verdunning sver houding Beoordeling

Kr. (aantal malen) van standaard RA-factor- _ _ :_ positief serum_ _ 1 serum 89,0 0 10 2 serum 66,8 TOO ++ 3 serum 89,7 0 1* serum 56,5 300 +++ 5 serum 77,9 1000 + - : negatief in rheumatoide factor 15 +, ++, +++ : Positief in rheumatoïde factor.

Voorbeeld V

(a) Volgens de procedures beschreven in voorbeeld I-(a) werd een polystyreenlatex gesensibiliseerd met een antilichaam ten opzichte van menselijk -globuline (HGG) als een anti-HGG-antilichaam-gesensibili- 20 seerd latexreagens.

(b) De standaardmonsteroplossing werd bereid door de HGG op te lossen in een buffer oplos sing in een concentratie van 80, 1*0, 20, 10 en 5 ng/ml. 25 ^ul van de standaardmonsteroplossing, 50 yul van de bufferoplossing en 0,1 ml van een 1#rs propylcarbodiïmide-oplossing werden in een proefbuis 25 gebracht en 25 yUl van het anti-HGG-antilichaam-gesensibiliseerde latexreagens, bereid onder (a), werd toegevoegd en de reactie bij kamertsn-peratuur gedurende 1*0 minuten uitgevoerd. Ha de reactie werd l*ml van een fysiologische pekeloplossing toegevoegd en de absorptie bij 500 nm garieten. Een voorbeeld van de aldus verkregen standaardkrommen wordt 30 weergegeven in fig. 8. De concentratie van HGG kon worden bepaald door toepassing van de standaardkromme van fig. 8.

Voorbeeld VI

Roet ("Show 31ack" van A.A. Chemical; gemiddelde deeltjesafmeting = 0,02-0,01* ^um) werd gesuspendeerd in GBS in een concentratie van 10%.

35 Daarna werd 0,5 ml van de suspensie gemengd met 2 ml van een oplossing van een anti-AFP-antilichaam en gedurende 20 minuten bij 56°C geincubeerd. Na de incubatie werd de bovenstaande vloeistoflaag door centrifugeren verwijderd, en het restneerslag gesuspendeerd in 5,5 cm GBS dat 0,1# BSA bevatte als een anti-AFP-antilichaam-gesensibiliseerd roetreagens.

Rrtfl T 9 Qi -2Q- (b) 25 yul van de AFP-standaardoplossing bereid in voorbeeld I-(b), 50 yul van een bufferoplossing en 25 yUl van de anti-AFP-antilichaam-gesensibiliseerd roetreagens, bereid onder (a), werden in een proefbuis gebracht en de reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uitge-5 voerd. Na de reactie werd 0,1 ml van een t0#'s propylcarbodiimide-oplossing toegevoegd en de reactie verder gedurende 20 minuten uitgevoerd. Daarna werd b ml van een fysiologische pekeloplossing aan het reactiemengsel toegevoegd en de absorptie bij 500 nm gemeten. Een voorbeeld van standaardkrommen wordt weergegeven in fig. 9· De concentratie 10 van AFP in het serum kon door de standaardkranme worden bepaald.

Voorbeeld VII

(a) Volgens de procedures beschreven in voorbeeld I-(a) werd een ge-hydroxyleerde styreen-divinylbenzeencopolymeerlatex gesensibiliseerd met E^-BSA ter bereiding van een E^-BSA-gesensibiliseerd latexreagens.

15 (b) 25 yUl van het E^-BSA-gesensibiliseerde latexreagens, bereid onder (a), 25 yul van een buff er oplos sing en 25 yUl van een standaardmonster-oplossing bereid volgens voorbeeld III-(b), werden in een testbuis gebracht en 25 yul van het anti-oestriol-antilichaam-gesensibiliseerde latexreagens bereid volgens voorbeeld III-(a), toegevoegd en de aan-20 sluitende procedures werden op dezelfde wijze uitgevoerd als volgens voorbeeld III. Er werd een stand aar dkrcmme verkregen als weergegeven in fig. 10.

Voorbeeld VIII

Volgens de procedures beschreven in voorbeeld III werden 25 yul 25 van het anti-oestriol-antilichaam-gesensibiliseerde latexreagens, 25 ^ul van de standaardmonsteroplossing, 25 ^ul van het agglutineringsmiddel en 1 ml van een buff er oplos sing in de proefbuis gebracht en de reactie bij kamertemperatuur gedurende bo minuten uitgevoerd. Na de reactie werd 0,1 ml van een 10$'s propylcarbodiÜmide-oplossing toegevoegd en de reactie 30 gedurende 20 minuten uitgevoerd. De absorptie van het reactiemengsel werd gemeten voor het uitzetten van een standaardkromme. De genoemde procedures werden op soortgelijke wijze herhaald onder toepassing van de urine van een zwangere vrouw in plaats van de standaardmonsteroplos-sing. Resultaten soortgelijk aan die verkregen in voorbeeld III, werden 35 waargenomen.

Voorbeeld IX

(a) Serratia marcescens werd opgelost in een concentratie van 10 gev.% 800 32 94 -21- in een fosfaatzuur-gebufferde pekeloplossing (pH 7S2, P3S), en een gelijke hoeveelheid van een 3%'s oplossing van formaline in PBS werd aan de suspensie toegevoegd en het mengsel bij 37°C gedurende 4 uren geroerd. Cellen -werden door centrifugeren verzameld, voldoende met gedestilleerd 5 water gewassen en gesuspendeerd in gedestilleerd water bij een concentratie van 5 gew.$. De suspensie werd gedurende 20 minuten op 120°C verhit waarbij de cellen door centrifugeren werden verzameld.

(b) De concentratie van AFP in serum van een patiënt werd bepaald op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I onder toepassing van de cel-10 len verkregen onder (a) als drager. De resultaten waren gelijk aan die, verkregen in voorbeeld I.

Voorbeeld X

Dit voorbeeld illustreert een meetreagenskit of pak voor de meting, gebaseerd op de agglutineringsreactie.

15 Een HCG-meetreagenskit met de hieronder beschreven reagentia werd samengesteld: (a) vijf ampullen die een gevriesdroogd standaardmonster van HCG in een hoeveelheid van k iu/ampul bevatten; (b) een flesje, dat 1 ,5 ml van een anti-HCG-antilichaam-gesensi-20 biliseerd latexreagens bevatte; (c) een flesje dat 3 ml van een glycine-gebufferde pekeloplossing (pH 8,2) bevatte; (d) vijf ampullen die elk een gevriesdroogd produkt gevormd door het vriesdrogen van 0,5 ml van een 2b%'s propylcarbodiïmide-oplossing 25 bevatten.

De meting met deze reagenskit werd bij voorbeeld onder toepassing van de volgende procedures uitgevoerd.

Een ampul van het standaardmonster van HCG werd opgelost in een fysiologische pekeloplossing en standaardmonsteroplossing uitgezet bij 30 concentraties van 1*, 2, 1, 0,5 en 0 iu/ml. 25 ^ul van de standaardmonsteroplossing, 50 yUl van de glycine-gebufferde pekeloplossing en 25 ^ul van het anti-HCG-antilichaam-gesensibiliseerde latex werden in een testbuis gebracht en de reactie bij kamertemperatuur onder mild schudden gedurende if-0 minuten uitgevoerd. 1,2 ml van een fysiologische pekeloplossing werd 35 toegevoegd aan een ampul van propyicarhcdiïmide als oplossing van de fixerende verbinding alvorens de voornoemde reactie werd voltooid. ïïa de reactie werd 0,1 ml van de oplossing van de fixerende verbinding aan het 800 32 94 -22- reactiemengsel toegevoegd en de fixatiereactie uitgevoerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na de fixatiereactie werd k ml van een fysiologische pekeloplossing aan het reactisnengsel toegevoegd en de absorptie bij 500 nm gemeten en een standaardkranme uitgezet. De voor-5 noemde procedures werden herhaald onder toepassing van serum of urine van een patiënt in plaats van de standaardmonsteroplossing, waarbij de concentratie van ÏÏCG in het serum of de urine werd bepaald.

Voorbeeld XI

Dit voorbeeld illustreert een meetreagenskit of pak voor een 10 meting gebaseerd op de agglutineringsramningsr eactie.

Een oestriolmeetreagenskit,. dat de volgende reagentia omvatte, werd samengesteld: (a) vier flesjes met 1_ml van een. standaardmonsteroplossing elk die E^ in concentraties van resp. 20Q, 100, 50 en 25 ng/ml in een f^sio- 15 logische pekeloplossing bevatten, (b) een flesje dat 1,7 ml van een anti-oestriol-antilichaam-ge-sensibiliseerd latexreagens bevatte, (c) zes ampullen die elk een gevriesdroogd produkt bevatten gevormd door het vriesdrogen van 0,5 ml van een 2b%'s oplossing van propyl- 20 carbodiïmide, (d) een flesje dat 3,2 ml van een oplossing van E^-BSA (5 ^ug/ml) als agglutineringsmiddel in een bufferoplossing bevatte,

O

(e) een van maatstrepen voorziene pipet (1,2 cm ), (f) 30 druppelpipetten (25 yul/druppel).

25 De meting met deze reagenskit werd bij voorbeeld onder toepassing van de volgende procedures uitgevoerd: 25 ul van het anti-oestriol-antilichaam-gesensibiliseerde latexreagens en 50 ^ul van de oplossing van E^-BSA (agglutineringsmiddel) werden in een testbuis gebracht en 25 yUl van de standaardmonsteroplossing 30 werd toegevoegd en de reactie bij kamertenperatuur onder mild schudden gedurende Uo minuten uitgevoerd. Bewerkingen zoals het toevoegen van de oplossing van de fixerende verbinding, werden volgens dezelfde procedures als beschreven in voorbeeld X uitgevoerd, waarbij de oestriol-concentratie in serum of urine werd bepaald. Aangezien de maatpipet en 35 de druppelpipetten aan de reagenskit waren vastgemaakt, bij toepassing van deze meetkit kon de meting gemakkelijk warden uitgevoerd, zelfs op een plaats waar geen meetapparatuur aanwezig was.

800 32 94

Claims

1. Werkwijze voor het door meten bepalen van een antigeen, anti-lichaam of antigeen-antilichaamcomplex of conjugaat, met het kenmerk, dat de volgende trappen worden uitgevoerd: (1) er wordt een antigeen-antilichaamreactie tot stand gebracht 5 tussen (a) gesensibiliseerde dragerdeeltjes gevormd door het binden van (i) tenminste een stof gekozen uit een antigeen, antilichaam of antigeen-antilichaamccmplex en conjugaat aan (II) een drager, samengesteld uit fijnverdeelde onoplosbare deeltjes zodanig dat tenminste twee eenheden van de genoemde stof worden gebonden aan een fijnverdeeld dragerdeeltje 10 en (b) tenminste een stof gekozen uit de groep van het te bepalen antigeen, antilichaam, antigeen-antilichaamcomplex en conjugaat die in staat is een immunologische reactie met de genoemde aan het gesensibiliseerde dragerdeeltjes gebonden stof (i), te veroorzaken; en (2) de absorptie of'' troebeling van het in trap (1) gevormde 15 reactiemengsel wordt gemeten door het reactiemengsel te bestralen met stralen met een golflengte van ongeveer 320-2it00 nm, in welkéaeetmethode de hoeveelheid of concentratie van het door de antigeen-antilichaamreactie gevormde aggregaat wordt bepaald, en aan het in het in trap (1) gevormde reactiesysteem een fixerende verbinding wordt toegevoegd.

2. Werkwijze voor het door meten bepalen van een antigeen, antilichaam of antigeen-antilichaamcomplex of conjugaat, met het kenmerk, dat de volgende trappen worden uitgevoerd: (1) er wordt een antigeen-antilichaamreactie tussen (a) gesensibiliseerd dragerdeeltjes gevormd door het binden van (I) tenminste een 25 stof gekozen uit een antigeen, antilichaam, of antigeen-antilichaamcomplex en conjugaat aan (II) een drager, samengesteld uit fijnverdeelde onoplosbare deeltjes, zodanig dat tenminste twee eenheden van de genoemde stof worden gebonden aan een fijnverdeeld dragerdeeltje en (b) tenminste een stof gekozen uit de groep van het te bepalen antigeen, antilichaam, 30 antigeen-antilichaamcomplex en conjugaat, die in staat is de antigeen-antilichaamreactie met de aan het gesensibiliseerde dragerdeeltje gebonden genoemde stof (i) te veroorzaken, en (c) een agglutineringsmiddel, dat tenminste een stof is, gekozen uit een antigeen, antilichaam, anti-geen-antilichaamcamplex en conjugaat, dat in staat is een immunochemische 35 reactie met de voornoemde gesensibiliseerde dragerdeeltjes (a) te ver- 800 32 94 -2*ί- oorzaken; en (2) de absorptie of troebeling van bet in trap (T) gevormde reactiemengsel -wordt gemeten door het reactiemengsel te bestralen met stralen met een golflengte van ongeveer 320-2^00 nm, in welke meetmethode 5 de hoeveelheid of concentratie van het door de genoemde antigeen-anti-lichaamreactie. gevormde aggregaat wordt bepaald, en aan het in het reactiesysteem van trap (1) gevormde reactiemengsel een fixerende verbinding wordt toegevoegd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de fixerende 10 verbinding aan het reactiemengsel wordt toegevoegd nadat een antigeen-antilichaamreactie in trap (1) is veroorzaakt. U. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de fixerende verbinding gelijktijdig met het inleiden van de antigeen-antilichaam-reactie in trap (1) wordt toegevoegd, waardoor de vorming van aggregaten 15 bij de genoemde reactie en de fixering van de genoemde aggregaten gelijktijdig tot stand worden gebracht.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de fixerende verbinding tenminste wordt gekozen uit polyfunctionele verbindingen en proteïne denatureringsmiddelen.

6. Werkwijze volgens conclusie 5s met het kenmerk, dat de polyfunctio nele verbinding wordt gekozen uit een carbodiïmide, een dialdehyde, een imideëster en een acyleringsmiddel.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kermerk, dat de polyfunctionele verbinding wordt gekozen uit 1-ethyl-3-(3-dimethylanri.no- 25 propyl) carbodiïmide, 1-cyclohexyl-3-(2-morf olinoëthyl) carbodiïmide, glutaar aldehyde, succinaldehyde, N-ethyl-5-fenylisaxazonium-3-sulfonaat en succinylchloride.

8. Werkwijze volgens conclusie 5* niet het kenmerk, dat het proteïne-denatureringsmiddel wordt gekozen uit tanninezuur, formaline, perchloor- 30 zuur, trichloorazijnzuur, thiocyaanzuur en thioglycolzuur.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat stof (b) wordt gebonden aan een drager samengesteld uit fijnverdeelde deeltjes.

10. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de fixerende verbinding aan het reactiemengsel wordt toegevoegd nadat een antigeen- 35 antilichaamreactie in trap (1) is veroorzaakt.

11. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de fixerende verbinding gelijktijdig met het inleiden van de antigeen-antilichaam- 800 32 94 -25- / reactie in trap (1) wordt toegevoegd waardoor de vorming van aggregaten door de genoemde reactie en de fixatie van de genoemde aggregaten gelijktijdig worden uitgevoerd.

12. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de fixerende 5 verbinding wordt gekozen uit polyfunctionele verbindingen en proteïne- denatur eringsmiddelen.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de polyfunctionele verbinding wordt gekozen uit een carbodiïmide, dialdehyde, imideëster en acyleringsmiddel. 10. k. Werkwijze volgens conclusie 1.3, met het kenmerk, dat de poly functionele verbinding wordt gekozen uit 1-ethyl-3-(2-dimethylamino-propyl) carbodiïmide, 1 -cyclohexyl-3- (2-morf olinoëthyl) carbodiïmide, glutaaraldehyde, succinaldehyde, ïï-ethyl-5-f enylisoxazonium-3-sulfonaat en succinylchloride.

15. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het protelne- denatureringsmiddel wordt gekozen uit tannine zuur, formaline, perchloor-zuur, trichloorazijnzuur, thiocyaanzuur en thioglycolzuur.

16. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de stof (b) wordt gebonden aan een drager samengesteld uit fijnverdeelde deeltjes. 20 1J. Me:etreagenskit voor een immunochemische agglutineringsreactie ter bepaling van de hoeveelheid of concentratie van een antigeen, anti-lichaam, of antigeen-antilichaamcomplex of conjugaat, met het kenmerk, dat deze als noodzakelijke bestanddeelelement omvat: (a) een suspensie van gesensibiliseerde dragerdeeltjes, gevormd 25 door het binden van tenminste een stof gekozen uit antigenen, antilichamen, en antigeen-antilichaamccmplexen en conjugaten aan een drager, samengesteld uit onoplosbare fijnverdeelde deeltjes, (b) een bufferoplossing, en (c) een fixerende verbinding.

18. Meetreagenskit voor de immunochemische agglutineringsrearnings- reactie ter bepaling van de hoeveelheid of concentratie van een antigeen, antilichaam, of antigeen-antilichaamcomplex of conjugaat, met het kenmerk, dat deze als noodzakelijke bestanddeelelement omvat: (a) een suspensie van gesensibiliseerde dragerdeeltjes, gevormd 35 door het binden van tenminste een stof gekozen uit antigenen, antilichamen, en antigeen-antiiichaamcomplexen en conjugaten aan een drager, samengesteld uit onoplosbare fijnverdeelde deeltjes, 800 32 94 -26- (b) een bufferoplossing, (c) een fixerende verbinding en (d) een agglutineringsmiddel.

19. Kit volgens conclusie 17, met bet bemerk, dat de fixerende ver- 5 binding wordt gekozen uit polyfunctionele reagentia en proteïne-denature-ringsmiddelen.

20. Kit volgens conclusie 18, met bet kenmerk, dat bet polyfunctionele reagens wordt gekozen uit een carbodiïmide, dialdehyde, imideëster en een acyleringsmiddel.

21. Kit volgens conclusie 20, met bet kenmerk, dat de polyfunctionele verbinding wordt gekozen uit 1-ethyl-3-(3-dimethylaminepropyl)carbodi-imide, 1-cyelohexy1-3-(2-mirfolinoëthyl)carbodiïmide, glutaaraldehyde, succinaldebyde, F-ethyl-5-fenylisoxazonium-3-sulfonaat en succinyl-cbloride.

22. Kit volgens conclusie 18, met bet kenmerk, dat bet proteïne-dena- tureringsmiddel werdt gekozen uit tannine zuur, formaline, per cbloor zuur, trichloorazijnzuur, tbiocyaanzuur en tbioglycolzuur.

23. Kit volgens conclusie 17, met bet kenmerk, dat tenminste een van de bestanddeelreagentia is gevriesdroogd. 20 2k. Kit volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat bet agglutinerings middel wordt gekozen uit een antigeen, antilichaam, of antigeen-anti-lichaamccmplex of conjugaat dat al of niet gebonden is aan een drager, samengesteld uit fijnverdeelde onoplosbare deeltjes.

25. Kit volgens conclusie 17, met bet kenmerk, dat de fixerende ver-25 binding wordt gekozen uit polyfunctionele reagentia en protexne-denatu- reringsmiddelen.

26. Kit volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat bet polyfunctionele reagens werdt gekozen uit een carbodiïmide, dialdehyde, imideëster en een acyleringsmiddel.

27. Kit volgens conclusie 26, met bet kenmerk, dat bet polyfunctionele reagens wordt gekozen uit 1 -ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiïmide, 1-cyclohexyl-3-(2-morfolinoëthyl)carbodiïmide, glutaaraldehyde, succinaldebyde, F-ethy1-5-f enyli soxazonium.-3-sulf onaat en succinylchloride.

28. Kit volgens conclusie 25, met bet kenmerk, dat bet proteïne- 35 denatureringsmiddel wordt gekozen uit tanninezuur, formaline, perchloor-zuur, tri cbloor azijnzuur, thiocyaanzuur en tbioglycolzuur.

29. Kit volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat tenminste een van bestanddeelreagentia is gevriesdroogd. 800 3 2 94