CN108152495A - 一种检测酪氨酸的胶体金试纸 - Google Patents

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Abstract

一种检测酪氨酸的胶体金试纸，包括预反应液及底板，在底板上依次设置样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水材料；所述层析膜上靠近胶体金结合垫的一端设置检测线，靠近吸水材料的一端设置质控线；所述胶体金结合垫为胶体金标记酪氨酸酶抗体复合物；所述检测线由酪氨酸酶抗原包被；所述质控线由羊抗鼠多克隆抗体包被；所述预反应液为酪氨酸酶溶液。本发明对尿液中微量的酪氨酸具有特异性检测功能，检测方法简单、快速，准确率高。

Description

一种检测酪氨酸的胶体金试纸
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种检测酪氨酸的胶体金免疫层析试纸及其制备和检测方法。
背景技术
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogoldfiltration assay DIGFA)，用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
对羟基苯丙氨酸(即酪氨酸)作为肿瘤标志物，已经被众多学者所认知，例如CN102004103、快速尿液单羟酚代谢物检测在恶性肿瘤中的诊断价值(检验医学与临床，2016第6期，李兴翠等)、尿液对羟基苯丙氨酸检测在恶性肿瘤早期预测中的应用价值(检验医学与临床，2015年第16期，黄学梅等)。
目前这些检测方法均为无机化学试剂检测法，无机化学检测法的优点是检测试剂制备简单。但是，尿液中的对羟基苯丙氨酸的含量是及其微量的，并且尿液中还存在多种其他多种成分会影响检测结果，因此，开发一种更为精密、特异性更高的检测方法迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种检测酪氨酸的胶体金试纸。本发明对尿液中微量的酪氨酸具有特异性检测功能，检测方法简单、快速，准确率高。
本发明的技术方案如下：
一种检测酪氨酸的胶体金试纸，包括预反应液及底板，在底板上依次设置样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水材料；所述层析膜上靠近胶体金结合垫的一端设置检测线，靠近吸水材料的一端设置质控线；
所述胶体金结合垫为胶体金标记酪氨酸酶抗体复合物；
所述检测线由酪氨酸酶抗原包被；
所述质控线由羊抗鼠多克隆抗体包被；
所述预反应液为酪氨酸酶溶液。
所述层析膜叠放在底板的中部上面；所述样品垫叠放在底板的其中一端上面，所述吸水材料叠放在底板的另一端上面；
所述层析膜两端分别与胶体金结合垫和吸水材料相交叠，且所述层析膜位于胶体金结合垫和吸水材料下方；
所述胶体金结合垫的一端与样品垫的一端相交叠，且所述胶体金结合垫位于样品垫的下方。
所述酪氨酸酶溶液为酪氨酸酶冻干粉活化后配制的水溶液，浓度为10～20ng/ml，采用逐级稀释法配制。优选的，所述底板为PVC板，所述层析膜为硝酸纤维素膜，所述吸水材料为玻璃纤维材料。
本发明有益的技术效果在于：
本发明提供的胶体金试纸使用方便，对温度和环境的要求低，检测灵敏度高，对于微量的酪氨酸也能检测出来，可以广泛的应用于家庭、医院等场合。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：胶体金试纸的准备
按照目前常规的胶体金试纸结构进行准备。胶体金试纸最下层是底板，在底板上依次设置样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水材料；层析膜上靠近胶体金结合垫的一端设置检测线，靠近吸水材料的一端设置质控线；层析膜叠放在底板的中部上面；样品垫叠放在底板的其中一端上面，吸水材料叠放在底板的另一端上面。
层析膜两端分别与胶体金结合垫和吸水材料相交叠，且层析膜位于胶体金结合垫和吸水材料下方；胶体金结合垫的一端与样品垫的一端相交叠，且胶体金结合垫位于样品垫的下方。
底板为PVC板，层析膜为硝酸纤维素膜，吸水材料为玻璃纤维材料。质控线由常规的羊抗鼠多克隆抗体IgG包被。
实施例2：酪氨酸酶抗原制备
在小烧杯中依次加入20mg的BSA，3.0mL乙酸钠缓冲液，2.0mg的市售实验级酪氨酸酶，加入150μL的37％的甲醛，混匀。取碳化二亚胺0.05mmol，溶于1mL水中，逐滴加到混合液中，在25℃下，搅拌反应过夜，用盐酸调PH＝6.0，再次加入0.02mmol碳化二亚胺，后放于4℃冰箱内24h，反应完成后将反应液装入透析袋，4℃下，pH＝7.4的PBS中透析，分装，-20℃保存备用。采用常规方法将酪氨酸酶抗原包被检测线。
实施例3：酪氨酸酶抗体制备
按照常规方法制备单克隆抗体。例如，选择6周龄雌性BALB/C小鼠，将酪氨酸酶抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射进行基础免疫、二次免疫、三次免疫。取效价高的小鼠进行脾细胞悬液制备，将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞融和，融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100％的细胞株。采用一次收集的方法收集腹水，ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该毒素抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性。采用上述步骤获得酪氨酸酶单克隆抗体，该抗体可用于胶体金标记。
实施例4：胶体金标记酪氨酸酶抗体复合物制备
取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90～95℃，加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至沸腾，冷却后避光保存。磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按10-20μg抗体/ml胶体金加入酪氨酸酶抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为0.5％，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用1/20初始胶体金体积的0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液重悬，置4℃备用。将玻璃纤维纸或其他吸水性材料浸入标记好的抗体溶液中，即得胶体金结合垫。
实施例5：预反应液的制备
采用逐级稀释法，将市售实验级酪氨酸酶与纯水配制成10～20ng/ml的水溶液。
实施例6：酪氨酸的检测
取新鲜尿液1～3滴，滴入预反应液中，常温放置5min。然后将胶体金试纸的样品垫一端浸入放置后的预反应液和新鲜尿液混合物中(以下简称样品)几秒钟，取出后观察检测线和质检线的颜色变化。
如果新鲜尿液中没有酪氨酸，则预反应液中的酪氨酸酶浓度不变，此时将胶体金试纸浸入样品中后，样品中的酪氨酸酶与胶体金标记的酪氨酸酶抗体反应形成结合物；结合物继续上移到检测线；因胶体金标记的酪氨酸酶抗体已经结合了样品中的酪氨酸酶，则检测线上的酪氨酸酶抗原无法再与胶体金标记的酪氨酸抗体结合，于是胶体金标记物不能在检测线上滞留并且显色，从而观察到检测线无色。
如果新鲜尿液中有酪氨酸，则预反应液中的酪氨酸酶对酪氨酸产生酶解作用，酪氨酸酶与酪氨酸结合为中间体，游离的酪氨酸酶的浓度减少到胶体金试纸的检测限以下。此时将胶体金试纸浸入样品中后，样品中的酪氨酸酶不足以完全结合胶体金标记的酪氨酸酶抗体；样品液体继续上移到检测线时，检测线中的酪氨酸酶抗原就会结合胶体金标记的酪氨酸酶抗体，使得胶体金滞留在检测线中，从而显示肉眼可见的红色。
无论尿液中有无酪氨酸，质控线都显红色；如果都不显色或者质控线不显红色则表明该试纸已经变质失效。酪氨酸酶来自于市售的人酪氨酸酶；其他哺乳动物如大鼠酪氨酸酶也可以替代。

Claims (4)

1.一种检测酪氨酸的胶体金试纸，包括预反应液及底板，在底板上依次设置样品垫、胶体金结合垫、层析膜、吸水材料；所述层析膜上靠近胶体金结合垫的一端设置检测线，靠近吸水材料的一端设置质控线；
其特征在于：
所述胶体金结合垫为胶体金标记酪氨酸酶抗体复合物；
所述检测线由酪氨酸酶抗原包被；
所述质控线由羊抗鼠多克隆抗体包被；
所述预反应液为酪氨酸酶溶液。
2.根据权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于：
所述层析膜叠放在底板的中部上面；所述样品垫叠放在底板的其中一端上面，所述吸水材料叠放在底板的另一端上面；
所述层析膜两端分别与胶体金结合垫和吸水材料相交叠，且所述层析膜位于胶体金结合垫和吸水材料下方；
所述胶体金结合垫的一端与样品垫的一端相交叠，且所述胶体金结合垫位于样品垫的下方。
3.根据权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于：所述底板为PVC板，所述层析膜为硝酸纤维素膜，所述吸水材料为玻璃纤维材料。
4.根据权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于：所述酪氨酸酶溶液为酪氨酸酶冻干粉活化后配制的水溶液，浓度为10～20ng/ml，采用逐级稀释法配制。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111208130A (zh) * 2020-03-17 2020-05-29 福建师范大学 一种快速检测血清中酪氨酸酶的试纸条及其制备方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0337053A1 (de) * 1988-01-13 1989-10-18 Verein der Zuckerindustrie Teststreifen zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Flüssigkeit sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
CN101762490A (zh) * 2008-12-10 2010-06-30 苏州艾杰生物科技有限公司 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN102998443A (zh) * 2011-09-14 2013-03-27 佳木斯大学 尿液中尿酸检测免疫胶体金试纸条及制造方法
WO2014124392A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 University Of Iowa Research Foundation Diagnostic tools to predict onset of preeclampsia
KR101694322B1 (ko) * 2016-05-31 2017-01-09 (주)큐브바이오 스캐너를 구비한 평판형 암 진단 키트
CN106706614A (zh) * 2016-11-21 2017-05-24 江苏华鸣生物科技有限公司 检测尿液中对羟基苯丙氨酸的试剂盒及其制备方法
CN107014806A (zh) * 2017-03-29 2017-08-04 江门市地尔汉宇电器股份有限公司 一种尿液酪氨酸的检测试纸

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0337053A1 (de) * 1988-01-13 1989-10-18 Verein der Zuckerindustrie Teststreifen zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in einer Flüssigkeit sowie Verfahren zu seiner Herstellung.
CN101762490A (zh) * 2008-12-10 2010-06-30 苏州艾杰生物科技有限公司 氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
CN102998443A (zh) * 2011-09-14 2013-03-27 佳木斯大学 尿液中尿酸检测免疫胶体金试纸条及制造方法
WO2014124392A1 (en) * 2013-02-08 2014-08-14 University Of Iowa Research Foundation Diagnostic tools to predict onset of preeclampsia
KR101694322B1 (ko) * 2016-05-31 2017-01-09 (주)큐브바이오 스캐너를 구비한 평판형 암 진단 키트
CN106706614A (zh) * 2016-11-21 2017-05-24 江苏华鸣生物科技有限公司 检测尿液中对羟基苯丙氨酸的试剂盒及其制备方法
CN107014806A (zh) * 2017-03-29 2017-08-04 江门市地尔汉宇电器股份有限公司 一种尿液酪氨酸的检测试纸

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHADATHORN INYAI ET AL.,: "Development of a rapid immunochromatographic strip test for the detection of Mulberroside A", 《PHYTOCHEMICAL ANALYSIS》 *
张改平主编: "《免疫层析试纸快速检测技术》", 31 August 2015, 郑州：河南科学技术出版社 *
李广 等: "基于金纳米颗粒生长的液晶生物传感器检测酪氨酸", 《高等学校化学学报》 *
李永进: "基于竹膜固定酪氨酸酶的L-酪氨酸光度测定法", 《理化检验(化学分册)》 *
禹邦超，周念波主编: "《酶工程》", 31 January 2014, 武汉：华中师范大学出版社 *
首都医学院等编: "《医用生物化学实验》", 31 August 1987, 天津：天津科学技术出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111208130A (zh) * 2020-03-17 2020-05-29 福建师范大学 一种快速检测血清中酪氨酸酶的试纸条及其制备方法与应用

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